CN105566495B - 一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv‑Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，Fc指的是恒定区。本发明用人连接蛋白26胞外区第41‑56氨基酸序列为抗原，序列为KEVWGDEQADFVCNTL。通过单链抗体噬菌体展示库及筛选技术获得，通过对该抗体的生化分析和免疫荧光鉴定，确定本发明提供的抗体能特异性识别连接蛋白26，并抑制其形成的半通道活性。动物试验表明，该抗体对鼠耳蜗组织切片的半通道活性有显著抑制作用。因此，该抗体可用于连接蛋白突变相关疾病治疗。

Description

一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供特异识别人耳蜗、皮肤组织表达的连接蛋白26(Connexin26)抗原，并能阻遏该连接蛋白26形成的半通道的单链抗体及表达该抗体的质粒载体，以及所述单链抗体在制备用于治疗连接蛋白26突变引起的耳聋、皮肤和肿瘤的药物和诊断试剂盒中的应用，本发明还提供利用该抗体制备诊断试剂盒，其包含所述单克隆抗体作为活性成分。
背景技术
离子通道间隙连接是一种细胞与细胞之间的连接。它连接细胞的胞质，允许小于1.8KD的较小分子如离子、代谢产物和第二信使等自由通过[1，2]。在脊椎动物，由连接蛋白(Connexin)组成的间隙连接通道介导相邻细胞之间离子、小分子营养物质交换及信号分子传播。哺乳动物发育早期已有多种连接蛋白表达，不同连接蛋白组成的间隙连接通道具有不同通透特征，相邻细胞利用间隙连接介导的细胞间通讯或者不依赖间隙连接通道的途径传递发育信号，调节发育过程中的细胞增殖、迁移和分化。连接蛋白是一个广泛表达于脊椎动物细胞的蛋白质家族。该家族成员组成的六聚体定位于细胞膜上，形成间隙连接通道或半通道，介导细胞之间、细胞与细胞外基质之间的物质交换。基因组中编码连接蛋白蛋白家族的基因组成连接蛋白基因家族[3]。
目前为止在人类基因组中已发现21种连接蛋白基因，小鼠基因组中发现20种连接蛋白基因[3]，由间隙连接通道和连接蛋白半通道介导的细胞间通讯对许多细胞功能具有重要的作用，包括调节细胞生长，分化和发育[4-6]。连接蛋白基因的突变与许多人类疾病相关联，包括心血管异常，周围神经病变，白内障和耳聋。连接蛋白26(Cx26)、连接蛋白30(Cx30)参与内耳钾离子循环，并且Cx26和Cx30的缺失引起正在发育中的耳蜗中柯蒂氏器极重度耳聋并伴随细胞死亡[4，7，8]。Cx26和Cx30由两个相邻基因(GJB2和GJB6)表达，Cx26、Cx30在内耳与非感应细胞连接形成多胞体，两种蛋白在内耳共表达[9]。DNFB1位于染色体13q11-q12[10]。50％的习语前失聪都与DFNB1有关，地中海人甚至高达79％[10，11]。Cx26和Cx30的缺失突变对耳蜗螺旋器的器官形成产生深远影响[12-14]。连接蛋白的点突变会导致连接蛋白形成的半通道一直处于常开或者常闭状态，导致失聪和皮肤疾病的发生[15]。特异识别Cx26并恢复其功能的抗体有望恢复连接蛋白突变导致的失聪和皮肤疾病。
近年来单克隆抗体在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，特别是针对表达特异性抗原的疾病，单克隆抗体与抗原的反应检测可以作为疾病诊断的″金″标准，单克隆抗体作为药物也在自身免疫性疾病和抗肿瘤疾病中发挥重要的作用。
与其他常见疾病不同的是，连接蛋白突变导致的疾病由于发病率相对较低，治疗药物相对较少，另外在耳聋疾病中，由于抗体药物的给药方式存在困难，一直没有针对该靶点的抗体药物上市。用于临床诊断的试剂盒也没有，所以能够识别、结合连接蛋白的单链抗体将成为诊治结直肠癌的重要工具。
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发明内容
本发明的目的是提供一种单链抗体，所述单链抗体可与人源连接蛋白26抗原特异性结合，从而可以用于制备治疗连接蛋白26突变导致的疾病药物或连接蛋白26相关诊断试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO：2，Fc指的是恒定区。
优选地，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区。
优选地，所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体特异识别连接蛋白26的胞外区第41-75氨基酸部分。
本发明还提供了一种基因工程抗体，其特征在于，其与上述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体的单链抗体具有30％以上的同源序列。
优选地，所述的基因工程抗体包含Fab片段，F(ab)‘片段，Fd片段，Fv片段和Fc片段中的一种，上述各片段中两种以上的组合，或上述各片段中的至少一种与其它蛋白或肽链形成的衍生物。
优选地，所述的基因工程抗体的重链CDR 3区序列为DFSWRGYYMDV，轻链CDR3区序列为QQYGSSPRT。
本发明还提供了一种编码特异性抑制连接蛋白26的全人抗体的核酸序列，其序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
优选地，所述的核苷酸序列编码上述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体。
本发明还提供了上述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体或基因工程抗体在制备用于治疗与连接蛋白26突变导致的耳聋、皮肤病或者肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗耳聋、皮肤病或者肿瘤的药物，其包含上述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体或基因工程抗体作为活性成份。
本发明的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体命名为Anti-Cx26-scFvII-Fc，经过检测单链抗体对连接蛋白选择性结合，并可特异性抑制该连接蛋白形成的半离子通道，是经过多轮噬菌体库筛选获得。与目前临床应用常见IgG类抗体不同，Anti-Cx26-scFvII-Fc为重组单链抗体，因此具有不同于IgG的抗体结构、生化特性和生物学功能。我们的实验证明，Anti-Cx26-scFvII-Fc单链抗体分子量大约100Kd，识别、结合靶抗原表位为连接蛋白胞外区结构，特异识别过表达连接蛋白26的细胞系，且抗体与连接蛋白26在细胞表面共定位。功能实验显示Anti-Cx26-scFvII-Fc能够抑制连接蛋白26半离子通道的活性。单独使用该抗体的免疫组化染色即可较为准确地诊断各种组织中人源连接蛋白26的表达情况。综上Anti-Cx26-scFvII-Fc单链抗体在耳聋、皮肤病和肿瘤的治疗方面和连接蛋白26诊断试剂方面有潜在的应用价值。
本发明用人连接蛋白26胞外区第41-56氨基酸序列为抗原，序列为KEVWGDEQADFVCNTL。通过单链抗体噬菌体展示库及筛选技术获得，通过对该抗体的生化分析和免疫荧光鉴定，确定本发明提供的抗体能特异性识别连接蛋白26，并抑制其形成的半通道活性。动物试验表明，该抗体对鼠耳蜗组织切片的半通道活性有显著抑制作用。因此，该抗体可用于连接蛋白突变相关疾病治疗。
附图说明
图1.单链抗体的筛选和序列验证。
A.抗体富集后抗体库酶联免疫反应检测抗原结合活性
B.挑取抗体单克隆与抗原结合酶联免疫反应检测
图2.单链抗体的结构及生化活性鉴定。
A.scFv-Fc型免疫球蛋白结构示意图。
B.Western blot检测单链抗体分子量大小约为58KDa
C.scFv II-Fc抗体热稳定性检测
D.质谱分析双链结构Anti-Cx26-scFv II-Fc分子量大小为105140.3
图3.Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体与抗原亲和力检测。
A.酶联免疫反应鉴定抗体scFvⅡ-Fc与抗原亲和力
B.SRP法检测抗体与Cx26蛋白相互作用，结果显示Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体与Cx26的结果活性KD为7.3E10-8M
图4.免疫荧光检测Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体与Cx26-GFP蛋白，结果显示两个蛋白共定位。
图5.去极化激活Cx26离子通道后，利用膜片钳技术检测Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体阻碍Cx26离子半通道的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1、单链抗体的筛选和单链抗体的表达纯化
1、所用材料：
(1)生物素化抗原多肽，(序列为：KEVWGDEQADFVCNTL，序列表SEQ ID NO：5，下称抗原)，合成自金斯瑞公司。(2)全人单链抗体噬菌体展示库，实验室自有。(3)链霉亲和素化的磁珠购自赛默飞公司。(4)高吸附酶联免疫反应微孔板购自康宁公司。(5)Anti-M13HRP抗体购自赛默飞公司。(6)辅助噬菌体购自Life Technologies，货号18311019。(7)XL1-Blue细菌购自Agilent Technologies，货号200228。(8)显影液ABTS溶液购自赛默飞公司，货号002024。
2、实验方法：
表达全人单链抗体的噬菌体展示库200微升(含有噬菌体粒1×1011个)与5微克抗原混合后室温孵育30分钟，再加入50微升的链霉亲和素化的磁珠。与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素化的磁珠捕获，未结合的噬菌体经PBST漂洗后去除，用盐酸甘氨酸(pH 2.2)溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。接种XL1-Blue细菌(Agilent Technologies，货号200228)200毫升，待OD达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体与XL1-Blue细菌37℃静置30分钟，后在30摄氏度条件下过夜扩增，离心收集细菌后，加入30微升辅助噬菌体(含有辅助噬菌体粒1×1011个)扩增后进行下一轮淘选。重复上述筛选步骤3-4轮，将侵染噬菌体的XL1-Blue菌液经过充分稀释后涂10cm平板，每个板上有100-500个克隆，挑取单克隆，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的各轮噬菌体库进行验证。
噬菌体酶联免疫反应步骤为，将侵染噬菌体的XL1-Blue单克隆菌接种进200微升的96孔板中，200rpm 37℃摇4-6小时，检测OD接近0.6后，加入1微升的辅助噬菌体，继续30℃摇过夜。第二天3000g离心取上清待用。取96低透平底微孔板，包被抗原过夜，第二天加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2小时，再加入Anti-M13 HRP抗体孵育30分钟，后用PBST洗3次，加入50微升显影液ABTS。
由抗原的酶联免疫反应结果可以看出随着淘选的进行，酶联免疫反应的信号不断升高，而对照抗原(AcroBiosystems公司，货号CD0-H82F2)的信号仍然比较低，在第四轮淘选后，抗原的信号强度是对照抗原的多倍，说明经过4轮淘选，能够表达与抗原特异性结合抗体的噬菌体不断的被富集。从淘选后的第三、四轮库中挑取单克隆，最后确定酶联免疫反应读值是对照两倍以上的克隆作为阳性克隆，阳性克隆测序分析，经过比对分析，确定不同的抗体序列和富集情况。
3、实验结果：
如图1A所示，多肽抗原CB在全人抗体噬菌体展示库中进行筛选，经过4轮淘选后，酶联免疫反应的信号与对照组相比不断升高，从淘选后的库中挑取700个单克隆进行酶联免疫反应验证，最后确定酶联免疫反应读值是对照两倍以上的克隆作为阳性克隆，如图1B所示，150个阳性克隆测序分析，经过比对分析，重复次数越多，说明该抗体序列的亲和力越强，依此确定有效富集序列。本发明中所选的阳性克隆在150个克隆序列中重复84次，说明亲和力较强。
挑取的克隆经测序，所选的阳性克隆的核酸序列为SEQ ID NO：3。
实施例2、单链抗体纯化和生化特性检测
1、所用材料：
(1)Sypro Orange染料购自赛默飞公司。(2)pFUSE表达载体pFUSE-hIGg1-FC2购自Invivogen公司，货号pfuse-hglfc2。(3)HiTrapProteinA HP columns购自GE公司。(4)蛋白纯化仪购自GE公司。(5)实时定量PCR仪购自BioRad公司。(6)质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。(7)BCA蛋白定量试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay kit，Pierce#23253)。(8)BamH1和BglII限制性内切酶购自NEB公司。
2、实验方法：
将实施例1得到的阳性序列(即SEQ ID NO：3)由全基因合成(南京金斯瑞生物公司)并在序列两端加入BamH1和BglII酶切位点，将得到的核酸序列经过参照NEB说明书在BamH1和BglII酶切后插入pFUSE-hIGg1-FC2表达载体(Invivogen公司，操作步骤请参照说明书)，将获得具有Fc段的单链抗体Anti-Cx26-scFvII-Fc的真核抗体表达质粒。利用293Fectin转染试剂(Invitrogen公司，货号12347500)与上述获得的真核抗体表达载体质粒按照体积质量比30微升：15微克的比例混合后加入30毫升的293Freestyle悬浮细胞(购自赛默飞公司)后，37℃1200rpm摇过夜，离心后收集上清，采用HiTrap Protein A HPcolums在蛋白纯化仪上进行抗体蛋白纯化(Anti-Cx26-scFvII-Fc)，最后用BCA法蛋白定量试剂盒(Pierce，货号23252)参照说明书检测抗体浓度。
将所得的纯化抗体进行Westem blot检测，具体为：将5微克纯化抗体样品进行SDS-PAGE电泳，电泳电压110V，60分钟，后转印到醋酸纤维素膜上，用羊抗人辣根过氧化物酶二抗(购自赛默飞)杂交，洗膜加入显影液(Pierce公司，货号35055)成像。
将所得的纯化抗体进行热稳定性检测，具体为：将纯化抗体稀释至0.1毫克/毫升，按照体积比1∶2000加入Sypro Orange染料后密封，实时定量PCR仪(BioRad)设置程序温度由25℃升至90℃，0.5℃每分钟。同时检测荧光值。
将所得的纯化抗体进行LC-MS质谱分析，具体为：将纯化的抗体5微克与1微升蛋白质脱糖酶(购自NEB公司，货号P0709S)混合37℃一小时后，上样到高分辨质谱用仪器Agilent 6230TOF LC/MS检测。
3、实验结果：
将实施例1得到的抗体的核酸序列(SEQ ID NO：3)经过酶切插入pFUSE-hIGg1-FC2表达载体，得到含有Fc段的scFv II DNA序列(SEQ ID NO：4)，其能够编码特异性抑制连接蛋白26的全人单链抗体(Anti-Cx26-scFvII-Fc，序列为Seq ID NO6)，即所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，如图2A所示，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其重链CDR 3区序列为DFSWRGYYMDV，轻链CDR3区序列为QQYGSSPRT，Fc指的是恒定区，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区。所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体特异识别连接蛋白26的胞外区第41-75氨基酸部分。
Western blot实验结果如图2B所示，胶图在58Kd处出现明显条带，说明抗体能特异识别Cx26蛋白。热稳定性结果计算出该抗体的Tm值为65℃，如图2C所示，说明Anti-Cx26-scFvII-Fc抗体具有高稳定性。如图2D所示，LC-MS质谱分析结果显示该抗体蛋白的分子量为105140道尔顿。
实施例3、酶联免疫反应检测单链抗体与连接蛋白26的结合
1、所用材料：
1.CBS抗原固定溶液购自赛默飞公司。2.Anti-Human Fc HRP二抗购自赛默飞公司。3.显影底物ABST溶液购自赛默飞公司。4.检测用96孔底透板购自Coming公司。
2、实验方法：
96孔底透板每孔加入50微升CBS抗原固定溶液稀释的Cx26抗原多肽(金斯瑞公司合成，序列请见Seq ID NO5)，抗原每孔0.05微克，4℃过夜孵育，室温震荡孵育30分钟，PBS漂洗三次，含5％牛奶的PBST溶液，37℃条件下封闭60分钟。PBS漂洗三次，加入实施例2所得的Anti-Cx26-scFvII-Fc抗体，37℃条件下孵育60分钟。漂洗干燥后，加入Anti-Human Fc二抗，室温震荡孵育30分钟，PBS漂洗三次，最后加底物显色，酶标仪读值。
3、实验结果：
如图3A所示，阴性对照孔酶联免疫反应读值OD值均在0.2以下，而阳性孔OD值在0.4以上。根据结果获得150个阳性克隆孔。
实施例4、SRP法检测单链抗体与连接蛋白26的结合
1、所用材料：
1.Octet RED仪器及其检测芯片CM5芯片购自Pall公司。2.Anti-human IgG抗体购自赛默飞公司。
2、实验方法：
通过多循环动力学的方法检测抗体与抗原亲和力与动力学。抗体固定采用捕获法进行，先将Anti-human IgG抗体偶联在CM5芯片上，然后将待测的Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体样品稀释梯度后流过芯片表面，待测抗体就会被已经偶联的抗人Fc抗体所捕获。随后再注入抗原多肽(由南京金斯瑞公司合成，序列为Seq ID NO：5)，抗原与抗体结合后信号被检测并记录。最后用再生试剂(pH1.7的甘氨酸溶液)将CM5芯片表面的抗体和抗原样品全部洗脱，并进行新一轮检测。
3、实验结果：
如图3B所示，SRP法检测抗体与Cx26蛋白相互作用，显示Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体与Cx26的结果活性KD为7.3E10-8M。
实施例5、细胞免疫荧光检测抗体特异识别Cx26蛋白
1、所用材料：
(1)HeLa DH细胞购自西格玛公司。(2)Cx26-Venus-YFP报告基因质粒购买自Addgene公司，货号69016。(3)荧光二抗Alexa Fluor 594goat anti-human购自赛默飞公司。(4)荧光共聚焦显微镜购自徕卡公司。
2、实验方法：
HeLa DH细胞用293Fectin(赛默飞)参照说明书步骤转染质粒Cx26-Venus-YFP，该质粒可在细胞膜上表达人源Cx26蛋白且伴随绿色荧光，用2％甲醛固定细胞，室温条件下放置10分钟。漂洗后，加入含2％BSA的PBS溶液封闭细胞30分钟，1毫克/毫升Anti-Cx26-scFvII-Fc抗体溶液用1％BSA/PBS以稀释比1∶500稀释后孵育细胞4～5小时，漂洗后，加入荧光Alexa Fluor 594 goat anti-human二抗在溶液1％BSA/PBS中以1∶1000浓度稀释，室温条件下孵育60分钟后，加入DAPI(1微克/毫升)孵育5分钟，漂洗后，封片，激光共聚焦显微镜观察及拍照。
3、实验结果：
如图4所示，Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体与Cx26-GFP两个蛋白共定位。
实施例6、膜片钳技术检测抗体抑制Cx26半通道活性
1、所用材料：
(1)HeLa DH细胞购自西格玛公司。(2)Cx26-Venus-YFP报告基因质粒购买自Addgene公司，货号69016。(3)全自动膜片钳系统购自美国MDC公司。
2、实验方法：
HeLa DH细胞用293Fectin(赛默飞)参照说明书步骤转染质粒Cx26-Venus-YFP，膜片钳采用全细胞式记录单个细胞膜离子电流，细胞处理上清中加入940nM的Anti-Cx26-scFv II-Fc抗体，对照组Zn2+浓度100uM，不加抗体作为空白对照组，加大电压至40毫伏使细胞去极化导致Cx26半通道开放，记录加入抗体的实验组，阳性对照组和空白对照组的半通道电流，降低电压至负40毫伏使细胞处于超极化状态，并同时记录各组的半通道电流。
3、实验结果：如图5所示，抗体Anti-Cx26-scFv II-Fc可有效抑制Cx26半通道活性，是非特异抑制剂Zn2+的一百倍。

Claims (5)

1.一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，Fc指的是恒定区。
2.如权利要求1所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区。
3.如权利要求1所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体特异识别连接蛋白26的胞外区第41-75氨基酸部分。
4.一种基因工程抗体，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：6。
5.一种编码特异性抑制连接蛋白26的全人抗体的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
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