CN110964103B - 一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法 - Google Patents
一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法，犬源抗犬细小病毒抗体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重链可变区或氨基酸序列为SEQ ID NO：2的轻链可变区；重链可变区的DNA分子核苷酸序列为SEQ ID NO：3；轻链可变区的DNA分子核苷酸序列为SEQ ID NO：4。相比较免疫动物生产单克隆抗体，本发明噬菌体展示技术具有生产快速，操作简便，效率更高，且可以进行犬源化抗体的生产，具有更高的利用价值；本发明通过构建噬菌体展示抗体库，可以在体外模拟抗体生成的过程，筛选针对任何抗原的抗体。
Description
技术领域
本发明属于抗体工程技术领域，尤其涉及一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法。具体涉及一种犬源抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
背景技术
目前，最接近的现有技术：犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。对于犬细小病毒感染，目前市场尚无特效治疗产品，多采用对症治疗、支持疗法、特异性疗法如高免血清、单克隆抗体等。
犬细小病毒单克隆抗体可抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制,又可参与犬体内的其它抗病毒保护机制,如免疫调理,抗体依赖细胞介导的细胞毒作用和抗体依赖补体介导的细胞毒作用,从而进一步激活犬体内的细胞免疫系统,发挥更大的杀灭病毒的作用。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)传统鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果。
(2)传统鼠源单克隆抗体需要动物，制备成本高，生产周期长。
(3)传统鼠源单克隆抗体杂交瘤需要单细胞克隆，过程繁琐，而且单克隆抗体的的反应强度不高。
解决上述技术问题的难度：1.相对于传统的鼠免疫杂交瘤技术，采用犬的天然噬菌体文库筛选出来的抗体是犬源化的，能够有效的降低免疫原性的风险，这个在需要长期定期注射给药的慢性病如类风湿疾病治疗中是十分关键的一个因素。
2.相对于单克隆抗体需要体内免疫小鼠，一些犬鼠同源性较高保守的蛋白，毒性较大的蛋白，抗原不稳定的蛋白，有变构的蛋白以及多透膜的蛋白并不适用于体内筛选，犬的噬菌体文库为体外筛选的模式能够进行更多靶点分子的抗体发现。
3.相对基于免疫的体内抗体发现技术，动物免疫，后期的杂交瘤融合，单克隆筛选等繁琐细胞培养过程，噬菌体展示其淘选，筛选过程在大肠杆菌中进行，扩增过程非常简单，抗体发现的时间周期短，实验出现意外的风险低，试剂耗材和人力成本更低。
4.免疫后的动物能够抽取其B细胞进行免疫噬菌体文库的建立，综合体内免疫和噬菌体体外筛选的两方面优势。
5.对现有的抗体的基因序列进行随机或者定点突变构建突变文库，进行犬源化或者亲和力成熟，筛选出亲和力更强的抗体或者条件激活抗体等。
6.以现有的抗体为导标(Guided selection)，利用天然噬菌体文库筛选出与该抗体作用于靶点一样表位的多个新序列抗体，能够取得和导标抗体体内药效一致的新序列抗体。
解决上述技术问题的意义：全国城镇宠物犬数量为5503万只，宠物犬消费市场为1244亿元，其中宠物药品的支出增长4.0％，是一个相对广阔的市场。而犬细小病毒是危害犬类的最主要的烈性传染病之一，目前市场并没有一种广为消费者接受的抗犬细小病毒的抗体，一种高效、低价的抗犬细小病毒的抗体不仅仅是广大市场的需要，而且对犬细小病毒的研究、预防和我国养犬业的发展都是有非常重要的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法。
本发明是这样实现的，一种犬源抗犬细小病毒抗体，所述犬源抗犬细小病毒抗体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重链可变区或氨基酸序列为SEQ ID NO：2的轻链可变区。
本发明的另一目的在于提供一种编码所述抗犬细小病毒抗体的DNA分子，所述DNA分子为核苷酸序列为SEQ ID NO：3的编码重链可变区DNA分子或核苷酸序列为SEQ ID NO：4的编码轻链可变区DNA分子。
本发明的另一目的在于提供一种扩增所述抗犬细小病毒抗体的引物基因，所述引物基因为犬重链可变区引物或为犬轻链可变区引物；
所述引物基因为犬重链可变区引物DNA序列为SEQ ID NO：5；
所述引物基因为犬轻链可变区引物DNA序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。
本发明的另一目的在于提供一种基于所述抗犬细小病毒抗体构建的犬源抗犬细小病毒单链抗体文库。
本发明的另一目的在于提供一种所述犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的构建方法，所述犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的构建方法包括：
步骤一，犬外周血淋巴细胞总RNA的提取；
步骤二，犬重链可变区VH和轻链可变区VL的扩增；
步骤三，单链抗体文库的构建。
进一步，步骤一具体包括：
将冻存管中的PBMC移至1.5mL离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清；留有50μL-100μL的上清在离心管底部，重悬管底细胞。加入1mL Trizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体分为下层含有DNA和蛋白质的有机相，和上层含有RNA的透明层。离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清；加入1mL75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清；将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，注意不要让RNA太干，用至少30μL DEPC水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及A260与A280比值，-80℃保存。
进一步，步骤二具体包括：
以提取的总RNA为模板，采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使总RNA反转录成cDNA；PCR扩增VH基因和VL基因；配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化VH和VL片段；用Linker接头的引物通过SOE-PCR基因工程方法将重链可变区基因VH分别与轻链可变区基因VL、轻链可变区基因VL组装成scFv基因，形成VL-linker-VH的形式；配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scFv基因片段；将纯化后的scFv基因产物与噬菌体载体pComb3XSS进行酶切与连接。
进一步，步骤三具体包括：将20μL的的连接产物与80μL电转感受态XLI-Blue在2.5KV，800Ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mLSOC培养基进行冲洗，将液体吸至50mL离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min；分别将10μL、50μL和100μL的菌液涂在含有Amp+的平板，鉴定电转效果。在离心管中加入9mL含有Amp+LB液体培养基，以1：1000加入葡萄糖，220rpm/min，37℃，摇菌至OD600＝0.5；加入20μL辅助噬菌体M13K07进行拯救，感染30min后摇菌1h；将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有Amp+、Kana的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm,离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存；多次建库，建立scFv噬菌体抗体原始文库。
进一步，步骤三后还需进行犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的筛选，包括：
第一步，溶液的配置:
封闭液：0.05g BSA溶于100mL PBS，充分溶解后，保存在4℃冰箱中；
洗涤缓冲液PBST：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，去离子水950mL，定容至1000mL。加入100μL吐温20；
终止液：0.5g BSA，0.75g甘氨酸溶于100mL ddH2O中，用1M盐酸调节pH至2.2，保存在4℃冰箱中；
中和缓冲液：Tris 12.2g，ddH2O 50mL，充分溶解后，冻存在4℃冰箱中；
第二步，噬菌体抗体的制备：
将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mL OD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。
进一步，第二步后还需进行：
步骤1，噬菌体抗体文库的淘筛：
(1)包被：用0.1M NaHCO3将纯化后的犬细小病毒稀释成1μg/mL、2μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜；包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；
(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；
(3)洗涤：每孔加入100μL PBST，共洗涤3次；每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；
(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；
(5)洗涤：重复步骤(3)；
(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min。每400μL洗脱液加入75μL Tris-HCL进行中和。将20μL此液体加入到180μL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量；并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；
(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mL LB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖；待菌液OD600＝0.5时加入辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+、Kana的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，得到第一轮富集后的犬源抗犬细小病毒单链抗体文库；
(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量；并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱；
步骤2，Phage ELISA方法鉴定抗犬细小病毒犬源噬菌体单链抗体：
(1)包被：将纯化后犬细小病毒用0.1M NaHCO3稀释成5μg/mL包被96孔酶标板，将BSA设为空白对照，M13K07为阴性对照；
(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μL封闭液，37℃孵育2h；
(3)洗涤：每孔加入200μL PBST，洗3次，拍干；
(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与PBST进行1:1混合，每孔200μL加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；
(5)洗涤：同步骤(3)；
(6)敷二抗：按1:5000稀释HRP标记抗M13抗体，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同步骤(3)；
(8)显色：每孔加入50μL TMB显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；
(9)终止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，酶标仪检测OD450数值，OD450阳性/OD450对照>2.5的则视为阳性；将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到犬源化的抗犬细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：相比较免疫动物生产单克隆抗体，噬菌体展示技术具有生产快速，操作简便，效率更高，且可以进行犬源化抗体的生产，具有更高的利用价值。噬菌体展示技术将抗体可变区的基因插入噬菌体基因组中，表达的抗体展示到噬菌体的表面，构建噬菌体展示抗体库，可以在体外模拟抗体生成的过程，筛选针对任何抗原的抗体。
相对于杂交瘤技术，通过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体，可以不经过免疫，缩短抗体生产的周期。也可以筛选在体内免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗体，适用范围广。噬菌体展示抗体库技术不受种属的限制，可以构建各种物种的抗体库。从犬天然库中筛选到的抗体，可以不经过犬源化过程，直接用于抗体药物研究。
本发明提供的犬源化抗犬细小病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的犬源化抗犬细小病毒的基因工程抗体提供支持。对推动犬源化抗体药物的发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的实验结果示意图；
图中：(A)犬VH扩增结果；(B)犬VL扩增结果；(C)犬VH-VLκscFv扩增结果；(D)犬VH-VLλscFv扩增结果；(E)噬菌体单链抗体原始文库阳性率鉴定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
传统鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的一种犬源抗犬细小病毒抗体，所述犬源抗犬细小病毒抗体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重链可变区或氨基酸序列为SEQ ID NO：2的轻链可变区。
本发明提供一种编码所述抗犬细小病毒抗体的DNA分子，所述DNA分子为核苷酸序列为SEQ ID NO：3的编码重链可变区DNA分子或核苷酸序列为SEQ ID NO：4的编码轻链可变区DNA分子。
本发明提供一种扩增所述抗犬细小病毒抗体的引物基因，所述引物基因为犬重链可变区引物或为犬轻链可变区引物。
所述引物基因为犬重链可变区引物DNA序列为SEQ ID NO：5。
所述引物基因为犬轻链可变区引物DNA序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。
如图1所示，本发明实施例提供的犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的构建方法包括：
S101，犬外周血淋巴细胞总RNA的提取。
S102，犬重链可变区VH和轻链可变区VL的扩增。
S103，单链抗体文库的构建。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的构建
1.犬外周血淋巴细胞的分离
从某犬场采集发病耐过犬细小的犬，对其进行疫苗免疫。每次免疫间隔2周，共免疫3次。犬群3次免疫后2周，采集犬外周血。取新鲜血液5-10mL与全血及组织稀释液混合均匀，比例为1:1-1:2。在15mL的离心管中加入细胞分离液，并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血。水平离心机以转速400g-800g，时间15min-25min进行离心，离心后，离心管内液体应分为四层，由上至下分别为：第一层：血浆层；第二层：淋巴细胞层；第三层：分离液和第四层：红细胞层。用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15mL离心管中，加入10mL的清洗液进行混匀，以250g，10min离心。重复2-3次，弃上清。将管底的淋巴细胞用含有90％胎牛血清、10％DMSO和1％双抗的冻存液进行重悬，分装到2mL的冻存管中，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞。
2.犬外周血淋巴细胞总RNA的提取
将冻存管中的PBMC移至1.5mL离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清。留有50μL-100μL的上清在离心管底部，重悬管底细胞。加入1mL Trizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min。加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体可分为下层含有DNA和蛋白质的有机相，和上层含有RNA的透明层。离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清。加入1mL75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清。将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，注意不要让RNA太干，用至少30μL DEPC水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及A260与A280比值，-80℃保存。
3.犬重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的扩增
以提取的总RNA为模板，采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使总RNA反转录成cDNA。以其为模板，PCR扩增VH基因和VL基因。配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化VH和VL片段。用Linker接头的引物通过SOE-PCR基因工程方法将重链可变区基因VH分别与轻链可变区基因VL(Lamda)、轻链可变区基因VL(Kappa)组装成scFv基因，形成VL-linker-VH的形式。配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scFv基因片段。将纯化后的scFv基因产物与噬菌体载体pComb3XSS进行酶切与连接。
4.单链抗体文库的构建
将20μL的的连接产物与80μL电转感受态XLI-Blue在2.5KV，800Ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mLSOC培养基进行冲洗，将液体吸至50mL离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min。分别将10μL、50μL和100μL的菌液涂在含有Amp+(100μg/mL)的平板，鉴定电转效果。在离心管中加入9mL含有Amp+(100μg/mL)LB液体培养基，以1：1000加入葡萄糖(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌至OD600＝0.5。加入20μL辅助噬菌体M13K07进行拯救，感染30min后摇菌1h。将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm,离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存。按此方法多次建库，建立scFv噬菌体抗体原始文库。
实施例2犬源抗犬细小病毒单链抗体文库的筛选
主要溶液的配置:
封闭液：0.05g BSA溶于100mL PBS，充分溶解后，保存在4℃冰箱中。
洗涤缓冲液PBST：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，去离子水950mL，定容至1000mL。加入100μL吐温20。
终止液：0.5g BSA，0.75g甘氨酸溶于100mL ddH2O中，用1M盐酸调节pH至2.2，保存在4℃冰箱中。
中和缓冲液：Tris 12.2g，ddH2O 50mL，充分溶解后，冻存在4℃冰箱中。
1.噬菌体抗体的制备
将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mL OD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖(1mol/L)继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS(pH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。
2.噬菌体抗体文库的淘筛
(1)包被：用0.1M NaHCO3将纯化后的犬细小病毒稀释成1μg/mL、2μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜。包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；
(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；
(3)洗涤：每孔加入100μL PBST，共洗涤3次。每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；
(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；
(5)洗涤：重复步骤(3)；
(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min。每400μL洗脱液加入75μL Tris-HCL进行中和。将20μL此液体加入到180μL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量。并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；
(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mL LB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖(1mol/L)。待菌液OD600＝0.5时加入辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，得到第一轮富集后的犬源抗犬细小病毒单链抗体文库。
(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量。并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。
3.Phage ELISA方法鉴定抗犬细小病毒犬源噬菌体单链抗体
(1)包被：将纯化后犬细小病毒用0.1M NaHCO3稀释成5μg/mL包被96孔酶标板，将BSA设为空白对照，M13K07为阴性对照；
(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μL封闭液，37℃孵育2h；
(3)洗涤：每孔加入200μL PBST，洗3次，拍干；
(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与PBST进行1:1混合，每孔200μL加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；
(5)洗涤：同步骤(3)；
(6)敷二抗：按1:5000稀释HRP标记抗M13抗体，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同步骤(3)；
(8)显色：每孔加入50μL TMB显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；
(9)终止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，酶标仪检测OD450数值，OD450阳性/OD450对照>2.5的则视为阳性。将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到犬源化的抗犬细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。
重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1：
EVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCVAS GSTFSTYHMSWVRQAPGKGLQWVAQ INSGGSSASYADAVKGRFIISGDNAKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYC AALAGSYPFNGFAYWGQGTLVTVSS。
轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2：
SSVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKAS QSLLHSSGNTDLYWFHQKPGQSPQRLIY GASKRDPGVPDRFSGSGSGTDFTPRISRVEADDAGVYFC GQSILVPYTFTQEPRWNSK。
重链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：3。
gaggtgcagctggtgcagtctgggggagacctggtgaagcctggggggtccctgagactttcctgtgtggcctctggatccaccttcagtacctaccacatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggcttcagtgggtcgcacagattaacagtggtggaagtagcgcaagctatgcagacgctgtgaagggccgattcatcatttccggagacaacgccaagaacacgctgtatcttcagatgaaccgcctgagagccgaggacacggccgtgtattattgtgcggctctggctggcagctaccccttcaatggctttgcttactggggccagggcaccctggtcactgtctcctca。
轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：4。
agctctgtcatgacacagaccccactgtccctgtccgtcagccctggagagccggcctccatctcctgcaaggccagtcagagcctcctgcacagtagtgggaacaccgatttgtattggttccaccagaagccaggccagtctccacagcgtttgatctatggggcctccaagagagaccctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcaccccgagaatcagcagagtggaggctgatgatgctggagtttatttctgcgggcaaagtatactggtaccttatactttcacccaggaaccaaggtggaactcaaag。
SEQ ID NO：5包括：扩增犬重链可变区上游引物
GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTCCAGCTGG TGCAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGTTGCAGCTGGTAGAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTGGGGAATTCCCTCTGGTGTGGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGG TGCAGCTGGT GGAGGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTACGTTTGGTGGAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGCAGCTGATGGAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTGTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGATGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGAGCAGTTGGTGAAATCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGAGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCATGCAATGGGTCCGTCAGGCT
扩增犬重链可变区下游引物
CCTGGCCGGCCTGGCCAGAGGTTTGGAGGGGATGGACTCTCCTGGCCGGCCTGGCCCCAAGGGGAGCAGAAGTGACGATTCCTGGCCGGCCTGGCCAAACCGAGGGGGCCGTGGTGGAGGCCTGGCCGGCCTGGCCACACAGACAGGTCCTGGCTGGTGGCCTGGCCGGCCTGGCCACACACTGGGGCTGGTTTTGGACT。
SEQ ID NO：6包括：扩增犬轻链(Kappa)上游引物
GGGCCCAGGCGGCC GATATTGTCATGACACAGACCCCAGGGCCCAGGCGGCCGATGTTGTCATGACACAGACCCCAGGGCCCAGGCGGCCGATATTGTCATGACACAGGCCCCAGGGCCCAGGCGGCCGATATTGTCATGACACAGGCCCCAGGGCCCAGGCGGCCGATATCGTCATGACACAGACCCCAGGGCCCAGGCGGCC GATATTGCCATGACACAGACCCCAGGGCCCAGGCGGCC GATATTGTCATGGCACAGGCCCCAGGGCCCAGGCGGCCGATATTGTCTTGACACAGATTCCAGGGCCCAGGCGGCCGATATGGTCATGACACAGACCCCAGGGCCCAGGCGGCC GGTATTGTCATGACACAGGCCCCAGGGCCCAGGCGGCCGAAATAGTCTTGACCTAGTCTCCAGGGCCCAGGCGGCCGACATTATGCTGACCCAGTCTCCAGGGCCCAGGCGGCCGACATCACGATGACTCAGTGTCCAGGGCCCAGGCGGCC GAAATTGCAGATTGTCAAATGGATGGGCCCAGGCGGCCGAGATTGTGCCAACCTAGTCTCTAGGGCCCAGGCGGCCGAAATCGTGATGACMCAGTCTCCA
扩增犬轻链(Kappa)下游引物
GGAAGATCTAGAGGAACCACCCTCCAGCTTGGTTCCCTGGCTGAAGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTCCACCTTGGTTCCTGCTCCGAAGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTCCAGTTTGGTCCCTTGGCCAAGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTCCAGGTGTGTCCCTTTGCCAAAGGAAGATCTAGAGGAACCACCAGACGGCTGGCTGGGCATCATTC。
SEQ ID NO：7包括：扩增犬轻链(lamda)上游引物
GGGCCCAGGCGGCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCGGCCGGGCCCAGGCGGCCCAGCCTGTGCTGACCCAGCCACCCGGGCCCAGGCGGCCCAGACTGTGGTAACCCAGGAGCCAGGGCCCAGGCGGCCCAGGCTGTGGTGACTCAGGAACCCGGGCCCAGGCGGCCTTGCCCGTGCTGACCCAGCCTCCAGGGCCCAGGCGGCCTCCTATGTGCTGACACAGCTGCCA
扩增犬轻链(lamda)下游引物
GGAAGATCTAGAGGAACCACCCCAAGGGGGAGGACTTGGGCTGACGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTGAGGGGGAGGCCTTGGGCTGAC。
噬菌体抗体库构建的基本原理是利用免疫或者非免疫的发病耐过的动物，采集外周血或者脾脏，分离其外周血淋巴细胞(PBMC)，克隆出编码重链(H链)和轻链(L链)的抗体基因，将H链和L链的基因随机组合，连接克隆到噬菌体质粒中，形成重组的抗体文库，并将表达质粒转化到大肠杆菌，同时加入辅助噬菌体(Helper Phage)进行拯救，以融合的形式将有功能的蛋白表达在噬菌体的衣壳表面，从而建立了完整的噬菌体单链抗体库技术。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
如图2所示，(A)犬VH扩增结果；(B)犬VL扩增结果；(C)犬VH-VLκscFv扩增结果；(D)犬VH-VLλscFv扩增结果；(E)噬菌体单链抗体原始文库阳性率鉴定结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种犬源抗犬细小病毒的抗体、抗体文库及构建方法
<141> 2019-11-21
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Ala Gly Ser Tyr Pro Phe Asn Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ser Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Asp Leu Tyr Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Asp Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Pro Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Phe Cys Gly Gln Ser
85 90 95
Ile Leu Val Pro Tyr Thr Phe Thr Gln Glu Pro Arg Trp Asn Ser Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 363
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatc caccttcagt acctaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcacag attaacagtg gtggaagtag cgcaagctat 180
gcagacgctg tgaagggccg attcatcatt tccggagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
cttcagatga accgcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc ggctctggct 300
ggcagctacc ccttcaatgg ctttgcttac tggggccagg gcaccctggt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 4
<211> 336
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agctctgtca tgacacagac cccactgtcc ctgtccgtca gccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca aggccagtca gagcctcctg cacagtagtg ggaacaccga tttgtattgg 120
ttccaccaga agccaggcca gtctccacag cgtttgatct atggggcctc caagagagac 180
cctggggtcc cagacaggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac cccgagaatc 240
agcagagtgg aggctgatga tgctggagtt tatttctgcg ggcaaagtat actggtacct 300
tatactttca cccaggaacc aaggtggaac tcaaag 336
<210> 5
<211> 659
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
<210> 6
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Claims (2)
1.一种犬源抗犬细小病毒抗体，其特征在于，所述犬源抗犬细小病毒抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.一种编码权利要求1所述抗犬细小病毒抗体的DNA分子，其特征在于，所述犬源抗犬细小病毒抗体的重链可变区的编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，所述犬源抗犬细小病毒抗体轻链可变区的编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
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