ES2824176T3 - Anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la conexina 26 - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, caracterizado por que es una inmunoglobulina recombinante que tiene la estructura de scFv-Fc, en donde scFv se refiere a un anticuerpo monocatenario que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2, y Fc se refiere a una región constante.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la conexina 26
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la medicina biotecnológica, en particular, la presente invención proporciona el anticuerpo monocatenario o plásmido que expresa el anticuerpo, que es capaz de reconocer específicamente la Conexina 26, expresada en la cóclea humana y en el tejido cutáneo, e inhibir los hemicanales de la Conexina 26, y el uso de anticuerpos en la preparación de un medicamento y un kit de diagnóstico para el tratamiento de la sordera, de enfermedades cutáneas y de tumores causados por mutaciones producidas en la Conexina 26. La presente invención también proporciona el kit de diagnóstico preparado utilizando el anticuerpo. El kit comprende el anticuerpo monoclonal como principio activo.
Antecedentes
La unión gap es una unión intercelular formada por canales de iones. Los canales de unión gap conectan el citoplasma intercelular, permitiendo que moléculas más pequeñas de menos de 1,8 KD, tales como iones, metabolitos y segundos mensajeros11, pasen libremente. En vertebrados, una vía de unión gap compuesta por Conexina, actúa como mediadora en el intercambio de iones, moléculas pequeñas y moléculas de señalización entre células adyacentes y es muy importante en la etapa temprana del desarrollo de los mamíferos. Los canales de unión gap pueden estar compuestos por muchas proteínas de conexina diferentes y mostrar diferentes características de permeabilidad, que dependen de la composición de la conexina. Las células adyacentes utilizan la comunicación intercelular mediada por uniones gap o una vía independiente de gap para transmitir señales de desarrollo y regular la proliferación, migración y diferenciación celular durante el desarrollo. Las proteínas de la familia de las Conexinas se expresan de manera generalizada en las células de los vertebrados. Los hexámeros de este miembro de la familia se encuentran en la membrana celular formando uniones gap o hemicanales y actúan como mediadores en el intercambio de material entre las células y la matriz extracelular. Los genes que codifican las proteínas conexinas en el genoma constituyen la familia de genes de conexina[3].
Hasta el momento, se han descubierto 21 tipos de genes de conexina en el genoma humano y 20 tipos de genes de conexina en el genoma del ratón[3]. Muchas funciones celulares importantes, incluidas la regulación, la diferenciación y el desarrollo del crecimiento celular, están mediadas por canales de unión gap y comunicaciones de hemicanales de conexina[4-6]. Las mutaciones en los genes de conexina están asociadas a muchas enfermedades humanas, incluyendo anomalías cardiovasculares, neuropatía periférica, cataratas y sordera. Los canales y hemicanales de Conexina 26 (Cx26) y Conexina 30 (Cx30), intervienen en el ciclo de iones de potasio del oído interno, y la deleción de Cx26 y Cx30 causa una importante pérdida auditiva y la muerte celular concomitante en el órgano de Corti en desarrollo que se encuentra en la cóclea [4,7,8]. La Cx26 y Cx30 se expresan a través de dos genes adyacentes (GJB2 y GJB6), aunque la Cx26 y Cx30 están conectadas con células no sensibles en el oído interno para formar politopos. Ambas proteínas se expresan conjuntamente en el oído interno[9]. El locus DNFB1 se encuentra en el cromosoma 13q11 - q12[10]. El cincuenta por ciento de la sordera hereditaria está relacionado con el DFNB1, con hasta un 79 % en el Mediterráneo[10,11]. Las mutaciones por deleción en Cx26 y Cx30 tienen un efecto importante en la formación orgánica de las espirales cocleares[12-14]. En algunos casos, las mutaciones puntuales en las conexinas pueden causar una apertura o cierre aberrante de los hemicanales, lo que producirá sordera y enfermedades cutáneas[15]. Se espera que los anticuerpos que reconocen específicamente la Cx26 y restauran su función, traten la sordera y las enfermedades cutáneas causadas por mutaciones de conexina.
En los últimos años, los anticuerpos monoclonales han jugado un papel importante en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, especialmente enfermedades que expresan antígenos específicos. La detección de la reacción de los anticuerpos monoclonales y antígenos, puede utilizarse como regla de oro para el diagnóstico de enfermedades. Los anticuerpos monoclonales también juegan un papel importante como fármacos en enfermedades autoinmunitarias y tumorales.
Las enfermedades causadas por mutaciones de conexina tienen una incidencia relativamente baja y relativamente pocos fármacos de tratamiento. Por otra parte, no se dispone de ningún fármaco de anticuerpos dirigido a los canales de conexina para tratar la sordera o las enfermedades cutáneas debido a las dificultades en la administración de fármacos de anticuerpos. No hay kits para el diagnóstico clínico, por lo que los anticuerpos monocatenarios, capaces de reconocer y unirse a la conexina, serán una herramienta importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal. Se han descrito algunos anticuerpos policlonales y monoclonales contra la conexina-26[16,17]
Referencias:
1. D.A. Goodenough, D.L. Paul, Gap junctions, Cold Spring HarbPerspectBiol 1 (2009) a002576.
2. A.L. Harris, Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules, ProgBiophysMolBiol 94 (2007) 120-143.
3. G. Sohl, K. Willecke, Gap junctions and the connexin protein family, Cardiovasc Res 62 (2004) 228-232.
4. C.J. Wei, X. Xu, C.W. Lo, Connexins and cell signaling in development and disease, Annu Rev Cell Dev Biol 20 (2004) 811-838.
5. A.B. Belousov, J.D. Fontes, Neuronal gap junctions: making and breaking connections during development and injury, Trends in Neurosciences 36 (2013) 227-236.
6. I. Fasciani, A. Temperan, L.F. Perez-Atencio, A. Escudero, P. Martinez-Montero, J. Molano, J.M. Gomez-Hernandez, C.L. Paino, D. González Nieto, L.C. Barrio, Regulation of connexinhemichannel activity by membrane potential and the extracellular calcium in health and disease, Neuropharmacology (2013).
7. D.W. Laird, Life cycle of connexins in health and disease, Biochem J 394 (2006) 527-543.
8. R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-caused genetic diseases and corresponding mouse models, Antioxid Redox Signal 11 (2009) 283-295.
9. F. Ceriani, F. Mammano, A rapid and sensitive assay of intercellular coupling by voltage imaging of gap junction networks, Cell Commun Signal 11 (2013) 78.
10. F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Front Biosci 16 (2011) 3252-3274.
11. L. Zelante, P. Gasparini, X. Estivill, S. Melchionda, L. D'Agruma, N. Govea, M. Mila, M.D. Monica, J. Lutfi, M. Shohat, E. Mansfield, K. Delgrosso, E. Rappaport, S. Surrey, P. Fortina, Connexin26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans, Hum Mol Genet 6 (1997) 1605-1609.
12. M. Cohen-Salmon, F.J. del Castillo, C. Petit, ConnexinsResponsiblbe for Hereditary Deafness - The Tale Unfolds, en: E. Winterhager (Ed.), Gap Junctions in Development and Disease, Springer-Verlag, Berlín, 2005, págs. 111-134.
13. M. Leibovici, S. Safieddine, C. Petit, Mouse models for human hereditary deafness, Curr Top Dev Biol 84 (2008) 385-429.
14. R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-Caused Genetic Diseases and Corresponding Mouse Models, Antioxidants & Redox Signaling 11 (2009) 283-295.
15. F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Frontiers in Bioscience-Landmark 16 (2011) 3252-3274.
16. Choung Y. H. et al. (2002) Functional study of GJB2, in hereditary hearing, 1671.
17. Thonnissen, E. et al. (2002), HUMAN GENETICS, vol. 111, no.°2, 190 - 197. mono-and polyconal.
Sumario
Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monocatenario, que se una especialmente al antígeno humano de Conexina 26 y, por tanto, pueda utilizarse en la preparación de medicamentos que tratan enfermedades causadas por mutaciones en la Conexina 26 o kits de diagnóstico relevantes para la Conexina 26. Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, caracterizado por que es una inmunoglobulina recombinante que tiene la estructura de scFv-Fc, en donde scFv se refiere a un anticuerpo monocatenario que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2, y Fc se refiere a una región constante. Preferentemente, la región constante comprende una región constante CH2 y una región constante CH3.
De acuerdo con la presente divulgación, el anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, reconoce específicamente la parte 41-75 de aminoácidos de la región extracelular de la Conexina 26. La presente divulgación también proporciona un anticuerpo modificado genéticamente, caracterizado por que tiene un 30 % o más de secuencias homólogas a un anticuerpo monocatenario del anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26. De acuerdo con la presente divulgación, el anticuerpo modificado genéticamente comprende uno de un fragmento Fab, un fragmento F(ab'), un fragmento Fd, un fragmento Fv y un fragmento Fc, una combinación de dos o más de los fragmentos anteriores, o un derivado de al menos uno de los fragmentos anteriores con otras proteínas o cadenas peptídicas. De acuerdo con la presente divulgación, la secuencia de la región CDR 3 de cadena pesada del anticuerpo modificado genéticamente es DFSWRGYYMDV, la secuencia de la región CDR3 de cadena ligera es QQYGSSPRT.
La presente invención también proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, en donde su secuencia es la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica el anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 como se ha descrito anteriormente. La presente divulgación también proporciona el uso del anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 o el anticuerpo modificado genéticamente, en la fabricación de un medicamento o kit para el tratamiento de la sordera, enfermedades cutáneas o tumores causados por mutaciones de la Conexina 26.
La presente invención también proporciona un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 según la invención, para su uso en el tratamiento de la sordera, enfermedades cutáneas o tumores. El anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 de la presente invención, se denomina Anti-Cx26-scFvll-Fc. Los resultados muestran que el anticuerpo monocatenario, obtenido mediante rondas
de exploración de fagotecas, puede unirse selectivamente a conexinas e inhibir específicamente el hemicanal formado por las mismas. El anticuerpo Anti-Cx26-scFvll-Fc es un anticuerpo humano monocatenario recombinante, que es diferente de los anticuerpos de IgG habituales en aplicaciones clínicas. El Anti-Cx26-scFvll-Fc tiene una estructura de anticuerpo, características bioquímicas y funciones biológicas diferentes a las de la IgG. Nuestros experimentos demostraron que el anticuerpo monocatenario Anti-Cx26-scFvll-Fc tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kd, reconoce y se une al epítopo del antígeno diana del dominio extracelular de conexina, reconoce específicamente células que sobreexpresan la conexina 26, y que el anticuerpo y la conexina 26 están localizados conjuntamente en la superficie celular. Los experimentos funcionales muestran que el Anti-Cx26-scFvll-Fc puede inhibir la actividad del hemicanal de la Conexina 26. La tinción inmunohistoquímica de este anticuerpo solo, puede diagnosticar con mayor precisión la expresión de la Conexina 26 humana en diversos tejidos. Resumiendo, el anticuerpo monocatenario Anti-Cx26-scFvll-Fc tiene aplicaciones potenciales en el tratamiento de la sordera, en enfermedades cutáneas y tumores, y en reactivos de diagnóstico de Conexina 26.
La secuencia de aminoácidos 41-56 de la región extracelular de la Conexina 26 humana se utiliza como antígeno, su secuencia de aminoácidos es KEVWGDEQADFVCNTL. El anticuerpo se obtiene mediante tecnología de exploración y fagotecas de presentación de anticuerpos monocatenarios. A través del análisis bioquímico y la identificación por inmunofluorescencia, se confirmó que el anticuerpo proporcionado por la presente invención reconocía específicamente la conexina 26 e inhibía su formación de actividad hemicanal. Los experimentos con animales muestran que el anticuerpo tiene un efecto inhibidor significativo sobre la actividad hemicanal de secciones de tejido coclear de ratón. Por lo tanto, el anticuerpo puede utilizarse en el tratamiento de enfermedades asociadas a la conexina.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Exploración de anticuerpos monocatenarios y verificación de secuencias.
A. Se utilizó ELISA de fagos para detectar la actividad de unión al antígeno después de enriquecer el anticuerpo.
B. Ensayo ELISA de la unión entre el antígeno y el anticuerpo monoclonal seleccionado
Figura 2. Identificación de la estructura y actividad bioquímica del anticuerpo monocatenario
A. Diagrama estructural de la inmunoglobulina scFv-Fc.
B. El peso molecular del anticuerpo monocatenario es de aproximadamente 58 KDa analizado mediante transferencia de tipo Western
C. Ensayo de estabilidad térmica del anticuerpo scFv II-Fc
D. La espectrometría de masas muestra que el dímero Anti-Cx26-scFv II-Fc, tiene un peso molecular de 105140,3
Figura 3. Análisis de afinidad de unión entre el anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc y el antígeno Cx26.
A. ELISA para analizar la afinidad de unión del anticuerpo/proteína Cx26
B. Ensayo mediante SRP para analizar la afinidad de unión del anticuerpo con la proteína Cx26, los resultados mostraron que el anticuerpo anti-Cx26-scFv II-Fc se une a la proteína Cx26 con una KD de 7,3E10-8 M
Figura 4. El análisis de inmunofluorescencia del anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc y la proteína Cx26-GFP para determinar las localización conjunta. Los resultados mostraron que estas dos proteínas se localizaban conjuntamente.
Figura 5. Los anticuerpos anti-Cx26-scFv II-Fc bloquean el análisis de actividad hemicanal de Cx26 mediante técnicas de pinzamiento zonal después de que la despolarización haya activado los canales de iones de Cx26.
Descripción detallada
A continuación, la presente invención también se describe con referencia a realizaciones específicas.
Ejemplo 1. Exploración y purificación del anticuerpo monocatenario
1, Materiales:
(1) polipéptido de antígeno biotinilado (secuencia: KEVWGDEQADFVCNTL, SEQ ID NO: 5, en lo sucesivo denominado antígeno) sintetizado en Genscript. (2) fagoteca de presentación de anticuerpos humanos de laboratorio. (3) perlas magnéticas de estreptavidina adquiridas en Thermo Scientific. (4) microplaca ELISA de alta adsorción adquirida en Corning Corporation. (5) anticuerpo Anti-M13 HRP adquirido en Thermo Scientific. (6) fago auxiliar adquirido en Life Technologies (Cat. N.° 18311019). (7) bacterias XL1-Blue disponibles en Agilent Technologies (Cat.
NO. 200228). (8) solución ABTS, solución de revelado, adquirida en Thermo Scientific, Cat. NO. 002024.
2, Método:
Doscientos (200) microlitros de la fagoteca de presentación de anticuerpos humanos que expresan anticuerpos monocatenarios humanos (que contienen 1 x 1011 partículas de fago) se mezclaron con 5 microgramos de antígeno, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se añadieron a 50 microlitros de las perlas magnéticas de estreptavidina. Las perlas magnéticas de estreptavidina capturaron los fagos unidos al antígeno, los fagos no unidos se eliminaron mediante aclarado con PBST, y después los fagos unidos de manera estable se eluyeron con tampón de glicina-HCl (pH 2,2). Bacterias XL1-Blue (Agilent Technologies Cat. 200228) se inocularon en 200 ml de medio SB y cuando la Do alcanzó 0,6, los fagos eluídos se añadieron a las bacterias XL1-Blue y se incubaron a 37°°C durante 30 minutos, y después se incubaron durante la noche a 30°°C. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se añadieron 30 microlitros de fago auxiliar (que contenía 1 x 1011 partículas de fago auxiliar). La siguiente ronda de exploración se realizó después de la amplificación. Las etapas de selección anteriores se repitieron durante 3-4 rondas. Después, el caldo XL1-Blue que contenía fagos se diluyó minuciosamente y se sembró en placas de 10 cm con 100-500 clones en cada placa, y se escogieron los monoclones. El ensayo ELISA de fagos se llevó a cabo después de cada ronda de selección de la fagoteca.
El ensayo ELISA de fagos comprende las siguientes etapas: inocular, en 200 microlitros de medio SB, en una placa de 96 pocillos, las bacterias monoclonales XL1-Blue que contienen los fagos, agitar a 37°°C con una velocidad de 200 rpm durante 4-6 horas, añadir 1 microlitro de fago auxiliar cuando la DO esté próxima a 0,6 y agitar a 30°°C durante la noche, centrifugar al día siguiente para recoger el sobrenadante a 3000 g para su uso, recubrir durante la noche con el antígeno una microplaca de 96 pocillos de baja permeabilidad, añadir a la microplaca el fago preparado en el sobrenadante, incubar durante 2 horas a temperatura ambiente, y después, añadir el anticuerpo Anti-M13 HRP e incubar durante 30 minutos, lavar tres veces con PBST y añadir 50 microlitros de ABTS como solución de revelado.
El resultado del ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA, por las siglas del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) muestra que, a medida que avanza la selección, la señal de la inmunoadsorción enzimática aumenta continuamente mientras que la señal del antígeno de control (Acro Biosystems, número de catálogo CD0-H82F2) sigue siendo baja. Después de la cuarta ronda de selección, la intensidad de la señal del antígeno fue varias veces la del antígeno de control, lo que indica que después de 4 rondas de selección, los fagos capaces de expresar el anticuerpo de unión específico de antígeno se habían enriquecido. Se escogió el monoclonal de la biblioteca de la tercera y cuarta ronda, y el clon con resultados ELISA más del doble que los del clon de control, se seleccionó como un clon positivo. La secuencia del clon positivo se analizó y mediante análisis de comparación se determinaron diferentes secuencias de anticuerpos y situaciones de enriquecimiento.
3, Resultados:
Como se muestra en la FIG. 1A, el antígeno peptídico CB se exploró frente a la fagoteca de presentación de anticuerpos humanos. Después de 4 rondas de selección, la lectura del ensayo ELISA del grupo seleccionado, se incrementó continuamente en comparación con la del grupo de control. Se escogieron 700 anticuerpos monoclonales y se analizaron mediante ensayo ELISA, y el clon con resultados ELISA más del doble que los del grupo de control, se seleccionó como clon positivo, como se muestra en la Figura 1B. Se llevó a cabo un análisis de secuenciación de 150 clones positivos. Después del análisis de comparación y alineación, la secuencia de enriquecimiento eficaz se determinó basándose en que los que tienen mayores repeticiones tienen la afinidad de unión más fuerte del anticuerpo. El clon positivo seleccionado en la presente invención se repitió 84 veces en las 150 secuencias de clones, por tanto, tiene una alta afinidad.
Se secuenció el clon positivo seleccionado y la secuencia de ácido nucleico del clon positivo seleccionado fue la SEQ ID NO: 3.
Ejemplo 2. Purificación de anticuerpos monocatenarios y detección de propiedades bioquímicas
1. Materiales:
(1) Los colorantes Sypro Orange se adquirieron en Thermo Scientific. (2) El vector de expresión pFUSE, pFUSE-hlGg1-FC2, se adquirió en la empresa Invivogen, n.° de catálogo pfuse-hglfc2. (3) Las columnas HP de Proteína A HiTrap se adquirieron en GE. (4) El purificador de proteínas AKTApurifier100 se adquirió en GE. (5) El instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real se adquirió en la empresa BioRad. (6) El kit de extracción de plásmidos se adquirió en la empresa Qiagen. (7) Kit de ensayo de proteína BCA (kit de ensayo de proteína BCA Pierce™, Pierce # 23253). (8) Las enzimas de restricción BamH1 y BgIII se adquirieron en NEB.
2. Métodos:
La secuencia positiva obtenida en el Ejemplo 1 (es decir, la SEQ ID NO: 3) se sintetizó mediante el método de síntesis de genes (Nanjing GenScript Ltd.) y se añadió con los sitios de restricción BamH1 y BgIII en ambos extremos de la secuencia. La secuencia de ácido nucleico obtenida, se insertó en el vector de expresión pFUSE-hlGg1-FC2 (Invivogen Corporation, con referencia a los procedimientos descritos en el manual de instrucciones), después de la digestión enzimática en los sitios de restricción BamH1 y Bglll con referencia a los procedimientos descritos en el manual de instrucciones de NEB, para obtener un plásmido de expresión de anticuerpos eucariotas de Anti-Cx26-scFvll-Fc, que es un anticuerpo monocatenario que tiene un segmento Fc. El reactivo 293Fectin (Invitrogen Corporation, Cat. N.° 12347500) se mezcló con el plásmido de expresión de anticuerpos eucariotas con una relación de volumen frente a masa de 30 microlitros: 15 microgramos. La mezcla obtenida se añadió a 30 ml de células en suspensión 293Freestyle (disponibles en Thermo Corporation) y se incubó con agitación a 1200 rpm y a 37 °C durante la noche. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación, y la proteína del anticuerpo (Anti-Cx26-scFvII-Fc) se purificó en un purificador de proteínas AKTApurifier100, utilizando columnas HP de Proteína A HiTrap. Al final, la concentración de anticuerpos se analizó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Cat. n.° 23252) con referencia a los procedimientos descritos en el manual de instrucciones.
El anticuerpo purificado se analizó mediante transferencia de tipo Western: para la electroforesis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), se cargaron 5 microgramos de la muestra de anticuerpos purificados, aplicando un voltaje de electroforesis de 110 V durante 60 minutos, se transfirieron a una membrana de acetato de celulosa y después se hibridaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-ser humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (Thermo Scientific). La membrana se aclaró y después, para la obtención de imágenes, se añadió reactivo de revelado (Pierce, Cat. n.° 35055).
El anticuerpo purificado se sometió a un ensayo de termoestabilidad con las siguientes etapas: diluir el anticuerpo purificado a 0,1 mg/ml, añadir colorante Sypro Orange con una relación de volumen de 1:2000 y sellar, cargar en el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real (BioRad) con un programa de calentamiento de 25°°C a 90°°C, 0. 5°°C por minuto y detectar los valores de fluorescencia.
El anticuerpo purificado se analizó mediante LC-MS, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, con las siguientes etapas: mezclar 5 microgramos del anticuerpo purificado con 1 microlitro de enzima PNGasa (disponible en NEB Inc., Catálogo n.° P0709S) a 37°°C durante una hora, y cargar en un instrumento de LC/MS TOF Agilent 6230 para la espectrometría de masas de alta resolución.
3. Resultados:
La secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) obtenida en el Ejemplo 1, se insertó en el vector de expresión pFUSE-hlGg1-FC2 después de la digestión enzimática, para obtener la secuencia de ADN de scFv II (SEQ ID NO: 4) que contenía la región Fc. La secuencia de ADN de scFv II es capaz de codificar un anticuerpo monocatenario completamente humano (Anti-Cx26-scFvII-Fc, SEQ ID NO: 6) que inhibe específicamente la Conexina 26, es decir, el anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, que es una inmunoglobulina recombinante que tiene la estructura de scFv-Fc, mostrada en la Figura 2A, en donde scFv se refiere a un anticuerpo monocatenario que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2, la secuencia de la región CDR 3 de cadena pesada es DFSWRGYYMDV, la secuencia de la región CDR3 de cadena ligera es QQYGSSPRT y Fc se refiere a la región constante. La región constante comprende una región constante CH2 y una región constante CH3. El anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, reconoce específicamente la parte 41-75 de aminoácidos de la región extracelular de la Conexina 26.
El resultado de la transferencia de tipo Western se muestra en la Fig. 2B. La banda obvia a 58 kd muestra que el anticuerpo puede reconocer específicamente la proteína Cx26. La Tf (temperatura de fusión) del anticuerpo es de 65°°C, calculada utilizando los resultados del ensayo de estabilidad térmica, como se muestra en la Figura 2 C, por tanto, el anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc descrito tiene alta estabilidad. Los resultados de la LC-MS, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, mostrados en la FIG. 2D, muestran que el peso molecular del anticuerpo es de 105140 Daltons.
Ejemplo 3. Ensayo ELISA para analizar la unión del anticuerpo monocatenario con la conexina 26
1, Materiales:
1. La solución de fijación de antígenos CBS se adquirió en Thermo Scientific. 2. El anticuerpo secundario anti-Fc humano conjugado con HRP (horseradish peroxidase, peroxidasa de rábano picante), se adquirió en Thermo Scientific. 3. La solución ABST del sustrato revelador se adquirió en ThermoScientific. 4. La placa de fondo plano de 96 pocillos se adquirió en Corning Corporation.
2, Métodos:
A la placa de 96 pocilios, se añadieron 50 |jl por pocilio del antígeno polipeptídico Cx26 (sintetizado por GenScript, diluido con la solución de fijación de antígenos CBS, SEQ ID NO: 5) y 0,05 ug por pocillo del antígeno, se incubó durante la noche a 4° C, y después se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 min. La placa de 96 pocillos se aclaró tres veces con PBS, se bloqueó con solución p BsT que contenía leche al 5 % a 37°°C durante 60 minutos y se aclaró tres veces con PBS. Se añadió el anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc obtenido en el Ejemplo 2 y se incubó a 37°°C durante 60 minutos. Después de aclarar y secar la placa de 96 pocillos, se añadió a la misma el anticuerpo secundario anti-Fc humano y se incubó durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. La placa de 96 pocillos se aclaró tres veces con PBS, se añadió el sustrato revelador y finalmente se realizó la lectura con un lector de microplacas.
3, Resultados:
Como se muestra en la FIG. 3A, los valores de DO de los pocillos de control negativo fueron inferiores a 0,2 y los valores de DO de los pocillos positivos fueron superiores a 0,4. Basándose en los resultados del ensayo ELISA, se seleccionaron 150 pocillos de colonias positivas.
Ejemplo 4. Detección de la combinación del anticuerpo monocatenario y la conexina 26 mediante SRP 1, Materiales:
1. El instrumento Octet RED y su microplaca de detección (microplaca CM5) se adquirieron en Pall Corporation.
2. El anticuerpo humano anti-IgG se adquirió en Thermo Scientific.
2, Método experimental:
La afinidad y la cinética del anticuerpo y el antígeno se detectaron mediante el método de cinética de ciclos múltiples. La inmovilización del anticuerpo se realizó mediante el método de captura. En primer lugar, el anticuerpo humano anti-IgG se acopló a la microplaca CM5, y después de diluirse en serie, la muestra de anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc fluyó a través de la superficie de la microplaca. A continuación, el anticuerpo a detectar se capturó con el anticuerpo anti-Fc humano acoplado. Después, se añadió el antígeno polipeptídico (sintetizado por Nanjing Genscript Co.Ltd, secuencia: SEQ ID NO: 5), el antígeno se unió con el anticuerpo y la señal se detectó y se registró. Por último, para una nueva ronda de ensayo, el anticuerpo y las muestras de antígeno en la superficie de la microplaca CM5, se eluyeron mediante un reactivo de regeneración (solución de glicina, pH 1,7).
3, Resultados:
Como se muestra en la Figura 3B, la detección mediante SRP de la interacción entre el anticuerpo y la conexina 26, mostró que la KD resultante del anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc con la proteína Cx26 era de 7,3E10-8 M.
Ejemplo 5. Detección de inmunofluorescencia celular de la proteína Cx26 reconocida específicamente por el anticuerpo
1, Materiales:
(1) Las células HeLa DH se adquirieron en la empresa Sigma. (2) El plásmido indicador Cx26-Venus-YFP se adquirió en Addgene, Cat. n.° 69016. (3) El anticuerpo secundario de cabra anti-ser humano conjugado con el colorante fluorescente Alexa Fluor 594, se adquirió en Thermo Scientific. (4) El microscopio confocal de fluorescencia se adquirió en la empresa Leica.
2, Métodos:
El plásmido Cx26-Venus-YFP se transfectó en células HeLa DH con 293Fectin (Thermo) con referencia a los procedimientos descritos en el manual de instrucciones. El plásmido Cx26-Venus-YFP puede expresar la proteína Cx26 humana en la membrana celular con fluorescencia verde. Después de fijar con formol al 2 %, las células se mantuvieron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de aclarar, las células se bloquearon con BSA al 2 % en PBS durante 30 min, y después se incubaron durante 4 a 5 horas en la solución de anticuerpo Anti-Cx26-scFvll-Fc, que se obtuvo diluyendo 1 mg/ml de solución de anticuerpo Anti-Cx26-scFvll-Fc con BSA/p Bs al 1 % con una relación de dilución de 1:500. Después de aclarar, las células se añadieron con el anticuerpo secundario de cabra anti-ser humano conjugado con colorante fluorescente Alexa Fluor 594, que se diluyó en una solución de BSA/PBS al 1 % con una relación de dilución de 1:1000. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min., se añadió DAPI (1 jg/ml) y se incubaron durante 5 minutos, se aclararon, se montaron en un microscopio confocal láser de barrido y se detectaron.
3, Resultados:
Como se muestra en la Figura 4, el anticuerpo Anti-Cx26-scFv II-Fc se localiza conjuntamente con las proteínas
Claims (4)
1. Un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, caracterizado por que es una inmunoglobulina recombinante que tiene la estructura de scFv-Fc, en donde scFv se refiere a un anticuerpo monocatenario que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2, y Fc se refiere a una región constante.
2. El anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 según la reivindicación 1, en donde la región constante comprende una región constante CH2 y una región constante CH3.
3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26, en donde, según la reivindicación 1, su secuencia es la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
4. Un anticuerpo completamente humano que inhibe específicamente la Conexina 26 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, para su uso en el tratamiento de la sordera, enfermedades cutáneas o tumores.
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