CN110891977A

CN110891977A - 特异性结合mrs的单克隆抗体

Info

Publication number: CN110891977A
Application number: CN201880046730.1A
Authority: CN
Inventors: 金圣勋; 权南勋
Original assignee: Wen Koute
Current assignee: Wen Koute
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN110891977B; KR102104551B1; EP3623387A4; WO2018208121A3; US20210130491A1; JP6959684B2; EP3623387A2; JP2020520250A; US11518817B2; KR20180124778A; WO2018208121A2

Abstract

本发明涉及抗MRS单克隆抗体技术领域，更具体地，涉及以与由SEQ ID NO：1表示的人源甲硫氨酰‑tRNA合成酶蛋白的氨基酸的第861‑900位氨基酸表示的片段特异性结合的抗体或其片段，其制备方法以及包含其的用于诊断癌症的组合物。本发明的抗体或其片段与人源MRS特异性结合，与包含相同的ARS家族的其他蛋白质没有交叉反应性，因此可进行MRS检测，适用于MRS相关的癌的诊断。

Description

特异性结合MRS的单克隆抗体

技术领域

本申请要求于2017年5月11日提交的韩国专利申请No.10-2017-0058896的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

本发明涉及特异性结合MRS的单克隆抗体，更具体地，是与由SEQ ID NO：1表示的人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的第861至900个氨基酸表示的片段特异性结合的抗体或其片段，；及其制备方法和用于诊断该癌症的组合物。

背景技术

氨酰基-tRNA合成酶(ARS)是一种将特定氨基酸附着于与其相应tRNA的酶。对于高等生物，它由23种酶组成，其中包括三种与多种合成酶复合物形成有关的酶，如AIMP1(p43)、(AIMP2)p38和(AIMP3)p18，以及根据不同类型氨基酸的20种酶。除了构成多合成酶复合物的那些酶以外，还有一些以游离形式存在。然而，最近据报道，一些酶除了具有基本功能之外，在特定环境中还具有多种不同的活性功能，MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)就是其中之一。MRS是将甲硫氨酸与用于翻译的启动因子和延伸因子tRNA^Met结合在一起的必不可少的酶。由于Met-tRNA^Met是启动蛋白质聚合反应和多肽延伸所必需的，因此它不仅在翻译方面，并且潜在地调控其他生物学过程中处于重要的地位。例如，MRS调节tRNA的特异性以响应氧化应激，并允许将更多的甲硫氨酸插入正在合成的多肽链中，从而通过增加甲硫氨酸来消除活性氧的种类(Lee等人，2014；Wiltrout等人，2012)。最近，还发现MRS与多种疾病有关。在紫外线照射下，MRS的酶活性因S662位置以GCN2依赖性方式磷酸化而受到抑制，翻译的起始反应也受到抑制(Kang等，2012；Kwon等，2011)。当MRS磷酸化后，它会与AIMP3分离，AIMP3是一种与MRS结合的肿瘤抑制物，释放的AIMP3进入细胞核以修复DNA。在这种情况下，MRS可以看作是通过紫外线照射来调节DNA损伤反应和翻译抑制的连接子(Kwon等，2011)。

另一方面，尽管包括MRS在内的ARS作为生物标志物很重要，但是ARS的蛋白质结构在许多方面是相似的，因此从动物免疫获得的抗体显示出还与其他ARS相结合的交叉反应性，并且在许多情况下，甚至没有产生高敏感性的抗体。考虑到本发明的抗体的优异敏感性和在不同的ARS之间没有交叉反应性，可以预期该抗体是具有高的研究性、诊断性以及工业上利用度的抗体。

发明的详细说明

技术问题

据此，本发明人在研究与MRS特异性结合的抗体时，发现通过使用杂交瘤细胞的抗体生产方法制得的抗体与其他ARS之间不具有交叉反应性，可以与MRS特异性结合，从而完成了本发明。

从而，本发明的目的在于，提供一种抗体或其片段，该抗体或其片段与由SEQ IDNO：1表示的人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的第861至900个氨基酸表示的片段特异性结合。

本发明的另一目的在于，提供编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的重组表达载体以及利用所述重组表达载体转化的细胞。

本发明的另一目的在于，提供一种制备与人MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)结合的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

(a)将产生所述抗体的细胞注入小鼠的腹腔；

(b)从腹腔膨胀的小鼠收集腹膜液；和

(c)从腹膜液中分离与MRS特异性结合的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于，提供一种特异性检测人源MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)蛋白的方法，该方法包括使所述抗体或其片段与生物样品接触的步骤以及检测该抗体或片段的步骤。

本发明的另一目的在于，提供用于诊断癌症的组合物，其包含所述抗体或其片段作为活性成分。

本发明的另一目的在于，提供一种由所述抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种用于诊断癌症的组合物，该组合物实质上由所述抗体或其片段组成。

本发明的另一目的在于，提供所述抗体或其片段在制备癌症诊断剂中的应用。

本发明的另一目的在于，提供一种将有效量的所述抗体或其片段施用于需要其的对象为特征的癌诊断方法。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供一种抗体或其片段，该抗体或其片段与由SEQ IDNO：1表示的人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的第861至900个氨基酸表示的片段特性结合。

为了达到本发明的另一目的，本发明提供一种编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的重组表达载体以及利用所述重组表达载体转化的细胞。

为了达到本发明的另一目的，本发明提供一种与人MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)结合的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(a)将产生所述抗体的细胞注入小鼠的腹腔内；

(b)从腹腔膨胀的小鼠收集腹膜液；和

(c)从腹膜液中分离与MRS特异性结合的单克隆抗体。

为了达到本发明的另一目的，本发明提供一种人源MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)蛋白的特异性检测方法，该方法包括使本发明的所述抗体或其片段与样品接触的步骤，以及检测所述抗体或其片段的步骤。

为了达到本发明的另一目的，本发明提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含所述抗体或其片段作为活性成分。

另外，本发明提供一种由所述抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。

另外，本发明提供一种用于诊断癌症的组合物，其实质上由所述抗体或其片段组成。

为了达到本发明的另一目的，提供第一项的抗体或其片段在制备癌症诊断剂中的应用。

为了达到本发明的另一目的，提供一种癌诊断方法，该方法包括将有效量的所述抗体或其片段施用于需要其的对象。

下文将详细描述本发明。

本发明提供一种抗体或其片段，该抗体或其片段与由SEQ ID NO：1所表示的人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的第861至900个氨基酸表示片段特异性结合。

在本发明中，“MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)”是ARS中的一种，它是启动转录并将甲硫氨酸(Met)转移至tRNA的最重要的酶。MRS增加了核内核糖体RNA的合成，并与各种信号传导剂(例如mTORC1、GCN2、CDK4和VEGFR)相互作用。当紫外线破坏DNA时，MRS从与氨酰-tRNA合成酶相互作用的多功能蛋白3(AIMP3)中释放，该蛋白与受损的DNA结合并调节转录。

在本发明中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由一个重链可变区(以下缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由一个轻链可变区(在下文中缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个CL域组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布着称为框架区(FR)的更为保守的区域。VH和VL分别由从氨基端到羧基端按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排列的三个CDR和四个FR组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和传统互补系统的第一成分(C1q)的宿主组织或因子的免疫球蛋白的结合。

本发明的1E8抗体和8A12抗体特异性结合于包含人源MRS蛋白的第861至第900个氨基酸的片段。优选地，作为与人源MRS蛋白结合的本发明的1E8抗体和8A12抗体所结合的区域，只要它是包含由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列的连续区域，就对特定序列没有特别限制，通常可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的由40至900个氨基酸，更优选40至80个氨基酸，具体地为40、41、42、43、44、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸构成的片段。最优选地，可以是源自人MRS蛋白的由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列。

在本发明的一个实施例中，制备对应于MRS蛋白的598至900aa(SEQ ID NO：46)，660至860aa(SEQ ID NO：47)，660至900aa(SEQ ID NO：48)，730至900aa(SEQ ID NO：49)位置的片段，对每个片段进行克隆并实施免疫印迹。结果，抗体识别出SEQ ID NO：46、48和49的片段，但是没有识别出SEQ ID NO：47的片段。由此确认了本发明的1E8抗体和8A12抗体与人源MRS蛋白的861至900个氨基酸片段(SEQ ID NO：39)特异性结合(参见图6b)。

本发明提供的“与人源MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)蛋白特异性结合的抗体或其片段”的特征在于包含

轻链可变区(VL)，其包括：包含由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)；包含由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)；包含由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)，及

重链可变区(VH)，其包括：包含由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)；包含由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：23表示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)；包含由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)。

根据本发明的与人源MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)蛋白特异性结合的抗体或其片段优选包含如下重链可变区和轻链可变区的CDR结构的抗体，下述(i)和(ii)分别表示各实施例的1E8抗体和8A12抗体的CDR组合：抗体或其片段特征在于包括选自

(i)轻链可变区(VL)，其包括：包含由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)，包含由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)以及包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)；及重链可变区(VH)，其包括：包含由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)，包含由SEQ ID NO:11表示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)以及包含由SEQ ID NO:13表示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)；

(ii)轻链可变区(VL)，其包括：包含由SEQ ID NO:15表示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)，包含由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)，包含由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)；及重链可变区(VH)，其包括：包含由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)，包含由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)以及包含由SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)；的重链可变区以及轻链可变区。

最优选地，根据本发明的抗体或其片段的特征在于，所述轻链可变区包含由SEQID NO:27(IE8VL)或SEQ ID NO:31(8A12VL)表示的氨基酸序列，所述重链可变区包含由SEQID NO:29(IE8VH)或SEQ ID NO:32(8A12VH)表示的氨基酸序列

本发明的抗体只要具有上述CDR组合或VH和VL的组合，就没有种类的限制。具体而言，抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD，可优选为IgG抗体。

本发明的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体，只要其具有与人源MRS蛋白特异性结合的上述CDR组合或VH和VL的组合即可。然而，优选单克隆抗体，其是具有实质上相同的重链和轻链的氨基酸序列的抗体群。

本发明的抗体可以源自任何动物，包括哺乳动物、鸟类等，包括人。优选地，所述抗体可以是人、小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。更优选地，可以是人源或嵌合抗体，该嵌合抗体包含一部分源自人的抗体和另一部分源自不同物种的动物的抗体。即本发明包括嵌合抗体，人源化抗体和人抗体，优选可以是人抗体。

人抗体是具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库中分离或从用一种或多种人免疫球蛋白转染且不表达内源性免疫球蛋白的动物中分离的抗体(参照美国专利5,939,598号)。

另外，在本发明中，抗体的片段是指保留了整个抗体的抗原特异性结合能力的抗体的片段，优选地，所述片段保持亲本抗体对MRS蛋白结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或其以上。具体而言，可以是Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、scFv等形式。

Fab(fragment antigen-binding、抗原结合片段)是抗体的抗原结合片段，由重链和轻链组成，重链和轻链均由一个可变域和一个恒定域组成。F(ab’)2是通过用胃蛋白酶水解抗体产生的片段，F(ab')2具有其中两个Fab通过重链铰链上的二硫键相连。F(ab’)是重链铰链附加在通过还原F(ab’)2片段的二硫键而分离的Fab上的单体抗体片段。Fv(可变片段)是仅由重链和轻链的各个可变区构成的抗体片段。单链可变片段(scFv)是重组抗体片段，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性肽接头彼此连接。双抗体是指其中scFv的VH和VL由于通过非常短的接头彼此连接而不能彼此结合，其分别以相同形式与另一scFv的VL和VH结合而形成二聚体。为了本发明的目的，抗体的片段的结构或形式不受限制，只要抗体的片段保持与人源MRS蛋白的结合特异性即可。

另外，本发明的上述抗体或其片段可以与酶、荧光物质、放射性物质和蛋白质偶联，但不限于此。此外，将这种材料与抗体偶联的方法是本领域众所周知的。

本发明提供编码所述抗体或其片段的多核苷酸。

多核苷酸在本文中也可以描述为寡核苷酸或核酸，并且包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)，使用核苷酸类似物合成的所述DNA或RNA的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)及其混合物。所述多核苷酸可以是单链或双链。

所述多核苷酸是指编码由重链和轻链组成抗体的核苷酸序列，所述重链和轻链具有结合至所述MRS蛋白的抗体的CDR组合或VH和VL组合。对本发明的多核苷酸的序列没有特别限制，只要其编码本发明的抗体或其片段即可。对于编码上述根据本发明的抗体的上述CDR序列的多核苷酸的序列没有特别限制，但是优选地可以包括由SEQ ID NO：4(轻链CDR1)、SEQ ID NO：6(轻链CDR2)、SEQ ID NO：8(轻链CDR3)、SEQ ID NO：10(重链CDR1)、SEQID NO：12(重链CDR2)、SEQ ID NO：14(重链CDR3)、SEQ ID NO：16(轻链CDR1)、SEQ ID NO：18(轻链CDR2)、SEQ ID NO：20(轻链CDR3)、SEQ ID NO：22(重链CDR1)、SEQ ID NO：24(重链CDR2)或SEQ ID NO：26(重链CDR3)表示的碱基序列。

另外，在本发明的抗体中，编码上述VH和VL的多核苷酸的序列没有特别限制，但是优选可以包含由SEQ ID NO：28(VL)，SEQ ID NO：30(VH)，SEQ ID NO：32(VL)或SEQ ID NO：34(VH)表示的碱基序列。

编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸可以通过本领域众所周知的方法获得。例如，可以基于编码所述抗体的重链或轻链的部分或全部的DNA序列或相应的氨基酸序列，采用本领域众所周知的寡核苷酸的合成技术，例如聚合酶链反应(PCR)等来合成。

本发明提供重组表达载体，其包含编码所述抗体或其片段的多核苷酸。

在本发明中，“重组”可以与“遗传操纵(genetic manipulation)”互换使用，是指使用诸如修饰、剪切和连接等分子克隆实验技术，以制造在自然状态下不存在的形状的基因。

在本发明中，“表达”是指在细胞中产生蛋白质或核酸。

在本发明中，“重组表达载体”是能够在合适的宿主细胞中表达目的蛋白质或核酸(RNA)的载体，是指包含必需调控元件的基因构建体，该调控元件通过可操作地连接有表达多核苷酸(基因)插入物。“可操作地连接”是指核酸表达控制序列与编码目的蛋白质或RNA的核酸序列以执行一般功能的方式功能性连接，意思是连接使得基因可以由表达调控序列表达。“表达调控序列”是指调控在特定宿主细胞中可操作地连接的多核苷酸序列的表达的DNA序列。这样的调控序列包括用于进行转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译的终止序列、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子序列等。

对本发明的重组表达载体的种类没有特别限制，只要是克隆领域中常用的载体即可，其实例包括但不限于哺乳动物表达载体、质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体。所述质粒包括大肠杆菌来源的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))，枯草芽孢杆菌来源的质粒(pUB110和pTP5)和酵母来源的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)等。所述病毒可以是动物病毒，例如逆转录病毒、腺病毒或痘苗病毒、昆虫病毒如杆状病毒等。

因此，根据本发明的重组表达载体是指可操作地连接编码抗体或其片段的多核苷酸使其在适当的宿主细胞中表达的基因构建体，所述抗体或其片段由能够与人源MRS蛋白特异性结合的上述CDR或VH和VL的组合的重链以及轻链组成。

编码根据本发明抗体的重链和轻链的多核苷酸可以分别包含在不同的重组表达载体中，也可以包含在一个重组表达载体中。

本发明提供利用所述重组表达载体转化的细胞。

对本发明的细胞没有特别限制，只要它是可用于表达编码包含在本发明的重组表达载体中的抗体或其片段的多核苷酸的细胞即可。用本发明的重组表达载体转化的细胞(宿主细胞)可以是原核的(例如大肠杆菌)、真核的(例如酵母或其他菌类)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞)、昆虫细胞或由此衍生的杂交瘤。优选地，细胞可以源自包括人类的哺乳动物。

术语“转化(transformation)”是指通过引入外源多核苷酸来修饰宿主细胞的基因型的改变，是指将外源多核苷酸引入宿主细胞中而与用于转化的方法无关。引入宿主细胞的外源多核苷酸可以通过向宿主细胞的基因组整合来维持或不整合的情况下被维持，这两者均在本发明的范围内。

可以通过本领域已知的方法将能够表达本发明的与人源MRS蛋白特异性结合的抗体或其片段的重组表达载体导入细胞中来转化以产生抗体或其片段，所述方法为瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪以及将核酸导入至细胞内的公知的方法，但不限于此。

本发明提供一种与人MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)结合的单克隆抗体的制造方法，该方法包括：(a)将通过所述重组表达载体经转化的细胞注射至小鼠的腹腔内的步骤；(b)从腹腔膨胀的小鼠收集腹膜液的步骤；以及(c)从所述腹膜液中分离与MRS特异性结合的单克隆抗体的步骤。

本发明的转化细胞可以是表达本发明的抗体或其片段的杂交瘤细胞。

在本发明的一实施例中，针对骨髓瘤细胞和MRS免疫的小鼠B细胞进行PEG处理来融合，在37℃、5％CO₂的条件下以HT培养基在培养箱培养3小时(参照实施例1-3)。

本发明提供了一种人源MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶)蛋白的特异性检测方法，该方法包括使所述抗体或其片段与试样接触的步骤，以及检测所述抗体或其片段的步骤。

由于本发明的抗体或其片段与人源MRS蛋白特异性结合，因此适用于为了检测并定量例如特定细胞、组织或血清中的MRS蛋白的诊断分析。

本发明的检测方法可以包括用于在将本发明的抗体或其片段与试样接触之前，利用本发明的抗体或其片段来制备用于检测MRS的存在与否和其浓度的试样的步骤(步骤(1))。

本领域技术人员可以适当地选择利用抗体检测蛋白质的已知方法，制备适合于所选方法的试样。使用抗体检测蛋白质的方法可以为，但不限于例如western印迹法、免疫印迹法、斑点印迹法、免疫组织化学染色法、免疫细胞化学染色法、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、放射免疫测定法、竞争结合分析和免疫沉淀等。例如，为了进行免疫印迹，可以通过在试样或细胞的裂解物中添加适于电泳的缓冲液并煮沸等方法来制备，以及为了免疫组织化学染色和免疫细胞化学染色，可以进行诸如将细胞或组织切片进行固定和封闭的预处理。

然后，实施将本发明的抗体或其片段与前述步骤中制备的试样接触的步骤(步骤(2))。

根据本发明的抗体包含如上所述的CDR或VH和VL的组合，作为与人源MRS蛋白特异性结合的抗体或其片段其，其特定种类和序列组成如先前所述。

为了“检测”所述抗体或其片段，可以用一般的可检测基元(moiety)进行标记，例如，可以使用文献中记载的技术用放射性同位素或荧光标记来标记(Current Protocolsin Immunology,Volumes 1and 2,1991,Coligen,et al.,Ed.Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,Pubs)。另外，还可以使用各种酶-底物标记，酶标记的实例包括：萤光素酶，如蝇萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号US4,737,456)，萤光素，2,3-二氢邻苯二甲酸，苹果酸脱氢酶，尿酸酶，过氧化物酶，如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。在文献中记载了将酶与抗体缀合的技术(O'Sullivan et al.,1981,Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(J.Langone&H.Van Vunakis,eds.),Academic press,N.Y.,73:147-166)。可以使用各种已知技术将标记直接或间接缀合至抗体。例如，抗体可以与生物素缀合，并且与上面引用的三类广泛类别有关的任何标记可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素可以选择性地与抗生物素蛋白结合，因此，该标记可以以这种间接方式与抗体偶联。或者，为了获得标记与抗体的间接缀合，可以将抗体与小半抗原(例如，地高辛)缀合，并且可以将上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如，抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标志物与抗体的间接缀合。

在本发明中，“接触”为一般意义上的用法，是指将两种以上的物质混合、结合或相互抵接的意思。所述接触可以在体外(in vitro)或在另一个容器中进行，也可以在原位(insitu)、生物体内、个体中、组织中或细胞中进行。

接下来，实施在实施上述步骤(2)之后的试样中检测本发明的检测抗体或其片段的步骤(步骤(3))。

所述“检测”以在试样中形成的本发明的抗体或其片段和抗原的复合物为对象，意味着MRS蛋白的存在与否的感知或所述蛋白质水平的测定(包括定性或定量测定两者)。因此，在实施上述步骤(2)之后，在检测步骤(步骤(3))之前，可以进一步包含去除与人源MRS蛋白未形成复合物的多余抗体或其片段的步骤。

当上述步骤(2)中所使用的抗体或其片段包含例如用荧光、放射性同位素、酶等直接标记等的检测基元的情况下，则可以通过本领域已知的方法检测相应的基元。作为一例，可以例如通过闪烁计数来测量放射活性，可以使用荧光计对荧光进行定量。

此外，当上述步骤(2)中所使用的抗体或其片段本身不包含上述检测基元时，可以使用标记有荧光、放射性、酶等可以使用本领域已知的二抗来间接检测。所述二抗结合至本发明的抗体或其片段(一抗)。

本发明提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含所述抗体或其片段作为活性成分。

本发明提供一种由所述抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。

本发明提供一种用于诊断癌症的组合物，其实质上由所述抗体或其片段组成。

在本发明中，对癌症的种类没有特别限制，只要其为本领域中已知的恶性肿瘤即可，优选可以是肺癌、胰腺癌或胆道癌。

可以通过检测生物试样中的MRS蛋白来进行本发明的癌症诊断。

在本发明中，术语“诊断”是指检查病理状态的存在或特征。在本发明中，所述诊断是确定癌等的发病与否、发病可能性(危险性)的过程。

在本发明中，“癌”可以是胆道癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤。更优选地，该癌症可以是肺癌，胰腺癌或胆道癌。

在本发明中，术语“检测”如上所述，并且生物试样包括血液和生物来源的其他液体试样，固体组织样品诸如活检标本和组织培养物或源自其的细胞。更具体地，例如但不限于组织、提取物、细胞裂解物、全血、血浆、血清、唾液、眼液、脑脊髓液、汗液、尿液、奶、腹水、关节液、腹膜液等。所述试样可以取自动物，优选为哺乳动物，最优选为人。所述试样可在用于检测之前进行预处理。例如，预处理可以包括过滤、蒸馏、萃取、浓缩、抑制性组分的失活、试剂的添加等。另外，可以从试样中分离核酸和蛋白质来用于检测。

本发明的抗体或其片段可作为诊断试剂盒来提供，所述试剂盒的种类没有特别限制，只要在本领域中已知的提供具有抗体或特定结合结构域的肽作为组合部分的分析试剂盒即可。实例包括免疫印迹、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、奥克通尼免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析、补体固定测定、FACS或蛋白质芯片的试剂盒等。

本发明的抗体或其片段可以在试剂盒，即在用于执行诊断分析的诊断试剂盒的与说明书一起按照预定量包装的组合中使用。如果抗体被酶标记，则试剂盒可包含酶所需的辅因子作为底物前体，以提供底物和生色团或荧光团。另外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。可以广泛改变各种试剂的相对量，以提供可以充分优化分析灵敏度的试剂在溶液中的浓度。试剂可以以常用的冻干粉形式包含赋形剂，该赋形剂在溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。

在本发明的一实施例中，使用大肠杆菌制备MRS-AIMP3蛋白，并将该MRS-AIMP3蛋白注射到小鼠腹腔内以进行免疫反应，之后提取血液和B细胞。接下来，对上述获得的B细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理并融合来制备杂交瘤细胞，通过ELISA和免疫印迹进行筛选以选择仅识别MRS的杂交瘤细胞。最后获得了“1E8”和“8A12”克隆(参照实施例1)。

在本发明的另一实施例中，将所述杂交瘤细胞施用到小鼠腹腔内。然后，当小鼠腹腔充满腹水时，通过注射器提取腹水，离心后仅分离上清液。然后将蛋白A填充到柱中并洗涤，然后将腹水液用磷酸盐缓冲液稀释并加载到蛋白A柱上，并洗脱各部分(参照实施例2)。

在本发明的另一实施例中，将从杂交瘤细胞获得的1E8抗体和8A12抗体以1：5000稀释，并利用经si-MRS处理的H460细胞的细胞洗脱液实施免疫印迹，其结果确认到1E8抗体和8A12抗体均与MRS结合，这两个种类抗体经si-MRS的处理后这些抗体可以特异性识别MRS(参照实施例3-1和图1)。

在本发明的另一实施例中，将96孔板用His-MRS、全MRS、无标记DX2、34S-DX2、34S-AIMP2、His-CRS、His-AIMP1、His-GRS、His-WRS和His-KRS包被，利用1E8抗体和8A12抗体实施了ELISA。其结果确认到1E8抗体(图2a)和8A12抗体(图2b)仅与MRS结合并反映，不与其他ARS蛋白和AIMP蛋白反应(参照实施例3-2，图2a和图2b)。

在本发明的另一实施例中，利用1E8抗体以及8A12抗体与MRS+AIMP3蛋白实施了表面等离振子共振(SPR)实验，其结果是1E8抗体(图3a和3b)和8A12抗体(图4a和4b)结合至MRS+AIMP3蛋白，但不结合于相同的AIMP3蛋白，由此确认到MRS抗体的亲和力较高(参照实施例3-3、图3a、3b、图4a和4b)。

在本发明的另一个实施例中，在盖玻片上培养Panc-1细胞后，将1E8抗体和8A12抗体以1：200稀释并处理，然后将二抗以1：200稀释并处理来使其反应后，用DAPI染色并通过荧光显微镜观察，其结果确认到本发明中获得的1E8抗体和8A12抗体与Panc-1细胞的表面相结合(参照实施例4和图5)。

在本发明的另一实施例中，从MRS蛋白制备六个不同长度和位置的片段，将其克隆到载体中，并转染到H640细胞并培养。然后，从细胞收集蛋白质，并利用1E8抗体和8A12抗体进行免疫印迹。结果确认到IE8抗体和8A12抗体均与5(598-900aa)6(298-900aa)片段结合(参照图6a)。随后，将MRS蛋白的598～900aa部分制备为四个片段，并与上述相同的方式进行免疫印迹。结果确认到1E8抗体和8A12抗体均与5(598～900aa)，8(600～900aa)，9(730～900aa)片段结合(参照实施例5，图6a和图6b)。

本发明提供所述抗体或片段在制备癌症诊断剂中的用途。

本发明提供一种癌诊断方法，该方法包括将有效量的本发明的抗体或其片段施用于需要的对象的步骤。

本发明的术语“有效量”是指当施用于对象时显示癌的改善、治疗、预防、检测或诊断效果的量，并且术语“对象”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人的动物，也可以为来自动物的细胞、组织、器官等。所述对象可以是需要所述效果的患者。

本发明的术语“诊断”概括性指识别癌或癌相关疾病的状况、疾病的存在或特征的过程，包括确认癌或癌相关疾病的发病与否、发病可能性(危险性)的过程，但不限于此。

本发明的“包括”与“包含”或“由...表征”相同使用，在组合物或方法中，不排除未提及的追加成分要素或方法步骤。术语“由...组成”表示排除未特别记载的追加要素、步骤或成分等。术语“基本上由……组成”是指在组合物或方法的范围内，除了所记载的成分要素或步骤之外，还包括基本不影响其基本特性的成分要素或步骤等。

本发明的效果

因此，本发明的抗体或其片段与人源MRS特异性结合，与包括相同的ARS家族的其它蛋白质没有交叉反应性，从而可以进行MRS检测，因此可以用于与MRS相关的癌的诊断。

附图说明

图1显示了实施免疫印的迹结果，以通过使用经si-MRS处理的H460细胞的细胞洗脱液来确认MRS抗体(1E8、8A12)与MRS结合与否。

图2a和2b为显示了实施ELISA的结果的图，以确认MRS抗体(1E8、8A12)对ARS(氨酰基-tRNA合成酶)蛋白的交叉活性。

图3a和3b显示了实施表面等离子体共振(SPR)实验的结果，以确认MRS抗体(1E8)对MRS+AIMP3蛋白的抗体亲和力。

图4a和4b显示了表面等离子体共振(SPR)实验的结果，以确认MRS抗体(8A12)对MRS+AIMP3蛋白的抗体亲和力。

图5显示了实施免疫荧光染色实验结果的图像(绿色：MRS，蓝色：细胞核)，以使用MRS抗体(1E8和8A12)来确认与Panc-1细胞的结合。

图6a显示了将MRS以及具有不同序列的6个MRS片段转染至H460细胞后，提取蛋白质实施免疫印迹的实验结果。

图6b显示了将MRS以及具有不同序列的4个MRS片段转染至H460细胞后，提取蛋白质实施免疫印迹的实验结果。

具体实施方式

在下文中，详细地说明本发明。

然而，以下实施例仅用于举例说明本发明，而无意限制本发明的范围。

实验方法

细胞培养

将293T、H460和Panc-1细胞分别在DMEM培养基中培养，使用了传5至9代的细胞。将不同细胞在含有10％FBS(胎牛血清，Hyclone，GE lifesciences)和1％青霉素(Hyclone，GElifesciences)的RPMI-1640(Hyclone，GE lifesciences)和DMEM(Hyclone，GElifesciences)培养基中孵育。将细胞在5％CO₂的条件下于37℃孵育。

动物模型

从Orient Bio Co(大韩民国京畿道城南市)购买体重25～30g的10周龄BALB/c小鼠。在动物房中于恒定条件(温度：20±2℃，湿度：40％～60％，照度：12小时亮/暗周期)下充分适应后，将它们用于本研究。动物实验遵循首尔国立大学动物保护与使用委员会的指导方针。

实施例

选择产生抗MRS单克隆抗体的细胞

1-1.MRS-AIMP3蛋白的合成

为了在大肠杆菌表达和纯化MRS-AIMP3(与氨酰基tRNA合成酶复合物相互作用的多功能蛋白3)共纯化的蛋白，进行以下实验。

将MRS(甲硫氨酰-tRNA合成酶，SEQ ID NO：1)和AIMP3(NM_004280.4，SEQ ID NO：49)转化至BL21DE3菌株并在LB培养基中培养后，将单个菌落在含有氨苄青霉素的5ml LB培养基中孵育，直到OD600值达到0.6～0.8。然后，向其中加入1mM IPTG，然后在37℃下孵育3小时，并离心10分钟，仅收集细胞。用细胞液进行SDS-PAGE，并用考马斯染色确认了其表达。

随后，收集其中通过IPTG诱导过表达的细胞液并离心以获得细胞。用1ml DPBS将细胞重悬后，使用超声仪裂解细胞，然后离心裂解的细胞，分离了共纯化的MRS-AIMP3蛋白。

1-2.利用小鼠的免疫实验

为了获得产生杂交瘤细胞所需的免疫小鼠，将实施例1-1中获得的共纯化的MRS-AIMP3蛋白的第一次注射，施用于四只8-10周龄的小鼠的腹腔内。两周后，将相同剂量的共纯化的MRS-AIMP3蛋白第二次注射入小鼠腹腔，以提高第一次免疫后小鼠的免疫力。之后一周后，即细胞融合实验前三天，将共纯化的MRS-AIMP3蛋白加强注射入小鼠的尾静脉。

将这些免疫后小鼠用乙醚麻醉，并用肝素化注射器从心脏抽血。将收集的血液在4℃下放置过夜，然后离心分离出血清。血清正确分离后保存在-80℃。

1-3.杂交瘤细胞的制备

首先，准备好骨髓瘤细胞用于细胞融合。培养骨髓瘤细胞并调节细胞密度至2.5～5.0×10⁴/ml。细胞融合前24小时，将骨髓瘤细胞稀释1/3来制备。用乙醚麻醉实施例1-2中的免疫小鼠，并收集脾脏。分离B细胞，用SF-DMEM2(DMEM+2×AA)洗涤并洗脱细胞。收集细胞悬浮液，置于管中并使重块儿沉降。将上清液转移到新管中，并以1500rpm离心5分钟。将离心的脾细胞的上清液去除并轻敲之后，用SF-DMEM2填充。将B细胞和骨髓瘤细胞分别离心并洗涤后，再洗涤一次。去除洗涤过的骨髓瘤细胞的上清液并轻敲之后，填充SF-DMEM2。另外，在除去洗涤过的B细胞的上清液并轻敲之后，将红细胞(RBC)添加到1ml的LB(裂解缓冲液)，然后填充SF-DMEM2。然后，分别将B细胞和骨髓瘤细胞离心，并除去离心的B细胞和骨髓瘤细胞的上清液之后，轻敲并用10ml SF-DMEM2填充。通过分别计数在e管中稀释100倍的B细胞和骨髓瘤细胞来确定细胞浓度[B细胞的浓度(1×10⁸、8×10⁷、5×10⁷)和骨髓瘤细胞的浓度(1×10⁷、8×10⁶、5×10⁶)。B细胞和骨髓瘤细胞的比例确定为10：1。将确定浓度的B细胞和骨髓瘤细胞一起置于管并离心。去除离心细胞的上清液，然后通过将其倒置于酒精垫上半干燥30秒至1分钟并轻敲。在此，通过在其中经1分钟缓慢加入PEG(2ml)并轻敲使其反应，并且添加SF-DMEM2的同时摇动管后进行离心。离心后，除去上清液，在未轻敲的状态下逐滴加入HT培养基【HT50×(HTσ1小瓶+SF-DMEM1 101)1ml，FBS 10ml，SF-DMEM1(DMEM+1×AA)30ml】，逐步增加滴入速度，使体积达到50ml。将该悬浮液再次在37℃，5％CO₂的培养箱中培养3小时。

1-4.产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选和克隆

为了在实施例1-3中制备的融合细胞群中，筛选良好地识别MRS但不识别AIMP3的细胞，为了检查否产生抗体，进行了以下实验。

首先，在细胞融合后第8至9天更换培养基，并在cDMEM2中从96孔至24孔培养直至生长良好。更换培养基后第5～7天，取出变色的孔中的上清液并填充cDMEM2，然后进行ELISA试验。ELISA试验后，筛选孔并转移至24孔进行孵育。在24孔中孵育后，重复ELISA试验。具体地，确认了24孔中的融合细胞的浓度，在96孔板中以0.5细胞/孔的浓度将融合细胞稀释在15ml培养基中。以每孔150μl分配融合细胞稀释液。通过显微镜检查包含单个细胞的孔。收集细胞已生长到一定程度的孔的上清液，并通过ELISA和免疫印迹检查以进行了第一次筛选。根据第一次筛选结果，将筛选出的融合细胞转移至24孔中，进行培养，离心分离，然后收集上清液，并通过ELISA和免疫印迹进行了第二次筛选。通过ELISA确认在24孔中生长的融合细胞的吸光度(OD值)，仅选择那些吸光度值大于1.0的融合细胞并将其转移至25T/C培养瓶中，孵育并离心，并收集上清液，通过ELISA和免疫印迹进行了第三次筛选。然后将基于第三次筛选结果筛选的融合细胞转移到75T/C培养瓶中进行培养，并通过ELISA确认吸光度，以选择仅能很好地识别MRS但不能识别AIMP3的细胞。最后，确定“1E8”和“8A12”的克隆细胞。

实施例2：抗MRS的单克隆抗体的生产和纯化

2-1.杂交瘤细胞的培养和抗MRS单克隆抗体的生产

从实施例1中选择的最终的融合细胞(杂交瘤细胞，“1E8”和“8A12”)，可以分别通过以下两种方法获得：

1)将500μl的姥鲛烷注射入7至8周龄的雌性小鼠的腹腔中。收集在75T/C培养瓶中培养的融合细胞，离心并除去上清液后移入磷酸盐缓冲液中并吹打。施用姥鲛烷7-10天后，将实施例1-4中选择的融合细胞分别以8×10⁵～4×10⁷的浓度注射到小鼠的腹腔内。1-2周后，当小鼠腹腔充满腹水时，使用18G针抽出腹水。将腹水保持在4℃过夜，并在第二天离心以除去包括黄色脂肪层的物质，并仅分离上清液。分出分离的上清液，并在-20℃下保存。

为了从腹水液中纯化抗体，在柱中填充了适量存储在存储溶液(20％乙醇)中的蛋白A，用20％乙醇冲洗，然后使用结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)(5个柱床体积)。将腹水液在磷酸盐缓冲液中以适当的量稀释，然后加到蛋白A柱上。与3个柱床体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)结合后，用3个柱床体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸缓冲液，pH 3.0～2.5)洗脱0.5mL级分。用35μl中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和每个级分。在70％的乙醇中于冷藏温度下放置过夜后，将其再次存储在存储溶液(20％的乙醇)中冷冻直至下次使用。通过SDS-PAGE确认级分的纯度，并在Amersharm GE柱上脱盐。

2)使用Cellstack-5(Corning，NY)在860mL的最大培养基中培养所述杂交瘤细胞。在无血清培养基(Thermo)中补充5mM GlutaMAX(Gibco)和1×胆固醇脂质浓缩物(Gibco)，并以1.4～2.0×10⁵细胞/mL的初始浓度接种细胞。分配4～5天后，以2000rpm离心10分钟除去细胞以回收上清液。检查上清液的pH后，使用制备的20x结合溶液(1M磷酸氢二钾)(pH9.0)将pH调节至7.6。然后使用0.22um的过滤器过滤以获得中和的抗体培养液。

2-2.抗MRS单克隆抗体的纯化

通过以下方法纯化实施例2-1或2-2中获得的抗体培养液。在柱中装入适量的蛋白质A，并向其中加入10个柱体积的蒸馏水，然后加入等量的1×结合溶液(50mM磷酸氢二钾)(pH 9.0)。然后，将获得的抗体培养液过柱以使抗体与蛋白A结合，然后用1x结合液(50mM磷酸氢二钾)(pH 9.0)洗涤。接下来，用2个柱体积的洗脱溶液(0.2M柠檬酸)(pH 3.0)过柱，得洗脱液，用1M Tris中和之后，在280nm处的吸光度检查测定并确认了抗体的浓度。用25ml生理盐水平衡GE PD-10层析柱，然后离心(1000g，2分钟)。然后，将2.5ml的从蛋白A柱获得的抗体洗脱液加入至柱并离心(1000g，2分钟)，用盐水交换了抗体溶液。然后在280nm处的吸光度测定了抗体浓度，将其等分并保存在-80℃。

2-3.抗MRS单克隆抗体的序列分析及克隆

在上述实施例中获得的1E8抗体和8A12抗体的序列由YBIO公司和韩国AbClon公司分析。从实施例1中获得的杂交瘤细胞中提取RNA以合成相应cDNA。接下来，使用VL、CL、VH或CH特异性引物进行PCR。预期大小的PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，通过测序分析测得序列。通过Kabat编号确认了CDR部位，并从所识别的序列合成Fab，通过ELISA方法证明该抗体对MRS具有高结合能力。

另外，确认到各抗体的序列与在将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后通过腹水纯化获得的抗体的蛋白质序列经质谱分析的结果一致。

将获得的1E8Fab序列和8A12Fab序列克隆到小鼠IgG重链(pFUSE-mIgG2a-Fc，InvivoGen)和小鼠轻链序列载体(pFUSE2-CLIg-mK，InvivoGen)。接下来，用PEI(Polysciences，23966-2)将所述载体共转染到自由式293F细胞中，以使每种抗体的轻链和重链同时表达。将共转染的293F细胞在37℃，8％CO₂下孵育7天。然后获得细胞并离心后获得了上清液，并使用制备的20×结合溶液(1M磷酸氢二钾，pH 9.0)将上清液的pH调节至7.6。然后，用0.22μm的过滤器过滤上清液以获得中和的抗体培养液。用实施例2-2中所述的方法从抗体培养液中收集抗体。确认到由此获得的1E8IgG全抗体如下形成：由SEQ ID NO：35氨基酸序列构成的轻链和由SEQ ID NO：36氨基酸序列构成的重链形成，以及8A12IgG全抗体如下形成：由SEQ ID NO：37氨基酸序列的轻链和由SEQ ID NO：38氨基酸序列的重链形成。

实施例3：抗体对MRS的结合特异性

3-1.利用MRS抗体的免疫印迹实验

为了确认在以上实施例中获得的1E8和8A12抗体的MRS结合能力，如下进行实验：

对如上的实验方法中所记载的方法培养的H460细胞，用si-MRS处理72小时。然后收获H460细胞，裂解之后，实施免疫印迹。将1E8抗体和8A12抗体按1：5000(0.2μg/ml)稀释，用作一抗。同时使用了市售的抗MRS抗体(Abcam，Ab50793)，以微管蛋白作对照。

如图1所示，其结果是，与未处理组相比，在si-MRS处理组中发现1E8抗体和8A12抗体均检测出微量MRS。由此证明1E8抗体和8A12抗体与MRS特异性结合。另外，还发现在相同浓度下1E8抗体和8A12抗体比市售的MRS抗体相比敏感性更高。

3-2.利用MRS抗体的ELISA实验

为了检测在以上实施例中获得的1E8和8A12抗体与其他氨酰基-tRNA合成酶(ARS)蛋白的交叉活性(cross activity)，进行了如下实验。

对96孔板(Corning 3690平底型，96孔半面积板)的每个孔以1μg/ml的浓度包被不同的ARS蛋白(His-MRS、全MRS、无标记DX2、34S-DX2、34S-AIMP2、His-CRS、His-AIMP1、His-GRS、His-WRS、His-KRS)。将浓度为500ng/ml的1E8和8A12抗体添加到包被有ARS蛋白的96孔板上，反应1小时。其后加入偶连有HRP的抗小鼠IgG二抗并反应1小时。进行ELISA并在450nm处测定吸光度。以TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)为底物。

结果如图2a与图2b所示，1E8和8A12抗体都仅与MRS结合并反应，不与其他ARS蛋白和AIMP蛋白反应。基于此，确认到1E8和8A12抗体与其他ARS蛋白和AIMP蛋白没有交叉活性，仅检测MRS。

3-3.利用表面等离子体共振确认抗体亲和力

为了确认实施例2中纯化的抗体的亲和力，如下进行实验：

使用实施例1中获得的1E8和8A12抗体和MRS+AIMP3蛋白进行了表面等离子体共振(SPR)实验。

将MRS+AIMP3以及AIMP3蛋白涂覆于CM5芯片，并注入多种浓度的1E8或8A12抗体，以测定与该蛋白的结合反应程度。分析试样或缓冲液以30μl/min的流速注入8分钟，并洗涤20分钟。

结果如图3a、3b、4a和4b所示，确认到1E8和8A12抗体与MRS+AIMP3蛋白结合，但与相同的AIMP3蛋白未结合。另外，确认到测定到1E8抗体对MRS具有5.42nM的KD值(图3a和3b)，8A12抗体对MRS具有1.56nM的KD值(图4a和4b)

实施例4：抗MRS抗体反应性的测定

为了检测在实施例2中获得的1E8抗体和8A12抗体的免疫活性，进行如下实验：

用20mM EDTA处理培养的Panc-1细胞以使细胞分离，离心。然后将盖玻片置于6孔板中，加入1ml培养基，并加入1.0×10⁶细胞/ml的细胞并在37℃下培养。然后，除去培养基，用甲醇固定细胞，接着用0.2％PBST(PBS+吐温20)处理，并用2％山羊血清(Abchem)封闭1小时。随后，将1E8和8A12抗体以1：200的比例稀释处理，并在4℃反应过夜。作为二抗，将小鼠IgG alexa 488(Abchem)按1：200稀释处理，并在室温下使其反应1小时。用0.2％PBST洗涤后，用DAPI(分子探针)染色，通过荧光显微镜(Nikon)进行观察。

如图5所示，其结果是实施例2中得到的1E8抗体和8A12抗体与Panc-1细胞表面结合。

实施例5：鉴定抗MRS抗体的结合位点

为了鉴定在实施例2中获得的1E8抗体和8A12抗体的结构域，进行了以下实验：

在MRS蛋白中，以GST，催化结构域和tRNA结合结构域为基准，分别制备了不同长度和位置的6个片段，并将MRS蛋白和每个MRS片段克隆到pcDNA3载体(EV)中。每个MRS片段的位置示于下表1中。此时，由于Myc蛋白与MRS蛋白的N末端连接，因此将Myc蛋白用作对照。

然后，按照制造商的说明，使用Turbofect(Thermo)将2μg克隆的载体DNA转染到H460细胞中。24小时后收集细胞并进行免疫印迹，将1E8抗体和8A12抗体以1：5000(0.2μg/mL)的比例稀释，作为一抗。

如图6A所示，其结果是1E8抗体和8A12抗体均能识别MRS片段5和6。

通过该观察，确认到抗体结合至598～900aa。

根据此结果，从MRS蛋白的598～900aa部分制备了不同长度和位置的4个片段，并将每个片段克隆到pcDNA3载体(EV)中。然后，以与上述相同的方式进行了免疫印迹。

如图6b所示，其结果显示1E8抗体和8A12抗体均识别了片段5、8和9，但未识别片段7。

根据该发现，确认到抗体结合到MRS蛋白的861～900aa位置。

表1

工业适用性

如上所述，本发明的抗体或其片段与人源MRS特异性结合，与包括相同的ARS家族在内的其他蛋白质没有交叉反应性，因此可用于检测MRS，能够适用于诊断与MRS相关的癌。

序列表

<110> 温口特

<120> 特异性结合MRS的单克隆抗体

<130> P19114441WP

<150> KR 10-2017-0058896

<151> 2017-05-11

<150> PCT/KR2018/005442

<151> 2018-05-11

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 900

<212> PRT

<213> 人类MRS蛋白(NP_004981.2)

<400> 1

Met Arg Leu Phe Val Ser Asp Gly Val Pro Gly Cys Leu Pro Val Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Glu Val Leu Ile Ser Thr

20 25 30

Val Gly Pro Glu Asp Cys Val Val Pro Phe Leu Thr Arg Pro Lys Val

35 40 45

Pro Val Leu Gln Leu Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ala

50 55 60

Ile Cys Arg Tyr Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Glu Gln Asp Asp Leu

65 70 75 80

Thr Asn Gln Trp Leu Glu Trp Glu Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ala Leu

85 90 95

Ser Ala Ala Leu Tyr Tyr Leu Val Val Gln Gly Lys Lys Gly Glu Asp

100 105 110

Val Leu Gly Ser Val Arg Arg Ala Leu Thr His Ile Asp His Ser Leu

115 120 125

Ser Arg Gln Asn Cys Pro Phe Leu Ala Gly Glu Thr Glu Ser Leu Ala

130 135 140

Asp Ile Val Leu Trp Gly Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gln Asp Pro Ala

145 150 155 160

Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ser Ala Leu His Ser Trp Phe Gln Thr Leu

165 170 175

Ser Thr Gln Glu Pro Cys Gln Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Gln

180 185 190

Gln Gly Val Leu Ala Leu Arg Pro Tyr Leu Gln Lys Gln Pro Gln Pro

195 200 205

Ser Pro Ala Glu Gly Arg Ala Val Thr Asn Glu Pro Glu Glu Glu Glu

210 215 220

Leu Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Met Ala Val Thr Ala Trp

225 230 235 240

Glu Lys Gly Leu Glu Ser Leu Pro Pro Leu Arg Pro Gln Gln Asn Pro

245 250 255

Val Leu Pro Val Ala Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Thr Ser Ala Leu

260 265 270

Pro Tyr Val Asn Asn Val Pro His Leu Gly Asn Ile Ile Gly Cys Val

275 280 285

Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn

290 295 300

Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Thr Glu Thr

305 310 315 320

Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro Gln Glu Ile Cys Asp Lys Tyr

325 330 335

His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg Trp Phe Asn Ile Ser Phe Asp

340 345 350

Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Gln Asp

355 360 365

Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly Phe Val Leu Gln Asp Thr Val

370 375 380

Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala Arg Phe Leu Ala Asp Arg Phe

385 390 395 400

Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp

405 410 415

Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile Asn Ala Val Glu Leu Lys Lys

420 425 430

Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys Pro Val Val Gln Ser Ser Gln

435 440 445

His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu Glu Lys Arg Leu Glu Glu Trp

450 455 460

Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp Trp Thr Pro Asn Ala Gln Phe

465 470 475 480

Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr

485 490 495

Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp

500 505 510

Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile

515 520 525

Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu

530 535 540

Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala Lys Asp Asn Val Pro Phe His

545 550 555 560

Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr

565 570 575

Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu Tyr Leu Asn Tyr Glu Asp Gly

580 585 590

Lys Phe Ser Lys Ser Arg Gly Val Gly Val Phe Gly Asp Met Ala Gln

595 600 605

Asp Thr Gly Ile Pro Ala Asp Ile Trp Arg Phe Tyr Leu Leu Tyr Ile

610 615 620

Arg Pro Glu Gly Gln Asp Ser Ala Phe Ser Trp Thr Asp Leu Leu Leu

625 630 635 640

Lys Asn Asn Ser Glu Leu Leu Asn Asn Leu Gly Asn Phe Ile Asn Arg

645 650 655

Ala Gly Met Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly Gly Tyr Val Pro Glu Met

660 665 670

Val Leu Thr Pro Asp Asp Gln Arg Leu Leu Ala His Val Thr Leu Glu

675 680 685

Leu Gln His Tyr His Gln Leu Leu Glu Lys Val Arg Ile Arg Asp Ala

690 695 700

Leu Arg Ser Ile Leu Thr Ile Ser Arg His Gly Asn Gln Tyr Ile Gln

705 710 715 720

Val Asn Glu Pro Trp Lys Arg Ile Lys Gly Ser Glu Ala Asp Arg Gln

725 730 735

Arg Ala Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala Val Asn Ile Ala Ala Leu Leu

740 745 750

Ser Val Met Leu Gln Pro Tyr Met Pro Thr Val Ser Ala Thr Ile Gln

755 760 765

Ala Gln Leu Gln Leu Pro Pro Pro Ala Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn

770 775 780

Phe Leu Cys Thr Leu Pro Ala Gly His Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro

785 790 795 800

Leu Phe Gln Lys Leu Glu Asn Asp Gln Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg

805 810 815

Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser Pro Lys Pro Ala Val Val Glu

820 825 830

Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu

835 840 845

Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala

850 855 860

Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys

865 870 875 880

Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly

885 890 895

Lys Lys Lys Lys

900

<210> 2

<211> 2703

<212> DNA

<213> 人类MRS mRNA (NM_004990.3)

<400> 2

atgagactgt tcgtgagtga tggcgtcccg ggttgcttgc cggtgctggc cgccgccggg 60

agagcccggg gcagagcaga ggtgctcatc agcactgtag gcccggaaga ttgtgtggtc 120

ccgttcctga cccggcctaa ggtccctgtc ttgcagctgg atagcggcaa ctacctcttc 180

tccactagtg caatctgccg atattttttt ttgttatctg gctgggagca agatgacctc 240

actaaccagt ggctggaatg ggaagcgaca gagctgcagc cagctttgtc tgctgccctg 300

tactatttag tggtccaagg caagaagggg gaagatgttc ttggttcagt gcggagagcc 360

ctgactcaca ttgaccacag cttgagtcgt cagaactgtc ctttcctggc tggggagaca 420

gaatctctag ccgacattgt tttgtgggga gccctatacc cattactgca agatcccgcc 480

tacctccctg aggagctgag tgccctgcac agctggttcc agacactgag tacccaggaa 540

ccatgtcagc gagctgcaga gactgtactg aaacagcaag gtgtcctggc tctccggcct 600

tacctccaaa agcagcccca gcccagcccc gctgagggaa gggctgtcac caatgagcct 660

gaggaggagg agctggctac cctatctgag gaggagattg ctatggctgt tactgcttgg 720

gagaagggcc tagaaagttt gcccccgctg cggccccagc agaatccagt gttgcctgtg 780

gctggagaaa ggaatgtgct catcaccagt gccctccctt acgtcaacaa tgtcccccac 840

cttgggaaca tcattggttg tgtgctcagt gccgatgtct ttgccaggta ctctcgcctc 900

cgccagtgga acaccctcta tctgtgtggg acagatgagt atggtacagc aacagagacc 960

aaggctctgg aggagggact aaccccccag gagatctgcg acaagtacca catcatccat 1020

gctgacatct accgctggtt taacatttcg tttgatattt ttggtcgcac caccactcca 1080

cagcagacca aaatcaccca ggacattttc cagcagttgc tgaaacgagg ttttgtgctg 1140

caagatactg tggagcaact gcgatgtgag cactgtgctc gcttcctggc tgaccgcttc 1200

gtggagggcg tgtgtccctt ctgtggctat gaggaggctc ggggtgacca gtgtgacaag 1260

tgtggcaagc tcatcaatgc tgtcgagctt aagaagcctc agtgtaaagt ctgccgatca 1320

tgccctgtgg tgcagtcgag ccagcacctg tttctggacc tgcctaagct ggagaagcga 1380

ctggaggagt ggttggggag gacattgcct ggcagtgact ggacacccaa tgcccagttt 1440

atcacccgtt cttggcttcg ggatggcctc aagccacgct gcataacccg agacctcaaa 1500

tggggaaccc ctgtaccctt agaaggtttt gaagacaagg tattctatgt ctggtttgat 1560

gccactattg gctatctgtc catcacagcc aactacacag accagtggga gagatggtgg 1620

aagaacccag agcaagtgga cctgtatcag ttcatggcca aagacaatgt tcctttccat 1680

agcttagtct ttccttgctc agccctagga gctgaggata actatacctt ggtcagccac 1740

ctcattgcta cagagtacct gaactatgag gatgggaaat tctctaagag ccgcggtgtg 1800

ggagtgtttg gggacatggc ccaggacacg gggatccctg ctgacatctg gcgcttctat 1860

ctgctgtaca ttcggcctga gggccaggac agtgctttct cctggacgga cctgctgctg 1920

aagaataatt ctgagctgct taacaacctg ggcaacttca tcaacagagc tgggatgttt 1980

gtgtctaagt tctttggggg ctatgtgcct gagatggtgc tcacccctga tgatcagcgc 2040

ctgctggccc atgtcaccct ggagctccag cactatcacc agctacttga gaaggttcgg 2100

atccgggatg ccttgcgcag tatcctcacc atatctcgac atggcaacca atatattcag 2160

gtgaatgagc cctggaagcg gattaaaggc agtgaggctg acaggcaacg ggcaggaaca 2220

gtgactggct tggcagtgaa tatagctgcc ttgctctctg tcatgcttca gccttacatg 2280

cccacggtta gtgccacaat ccaggcccag ctgcagctcc cacctccagc ctgcagtatc 2340

ctgctgacaa acttcctgtg taccttacca gcaggacacc agattggcac agtcagtccc 2400

ttgttccaaa aattggaaaa tgaccagatt gaaagtttaa ggcagcgctt tggagggggc 2460

caggcaaaaa cgtccccgaa gccagcagtt gtagagactg ttacaacagc caagccacag 2520

cagatacaag cgctgatgga tgaagtgaca aaacaaggaa acattgtccg agaactgaaa 2580

gcacaaaagg cagacaagaa cgaggttgct gcggaggtgg cgaaactctt ggatctaaag 2640

aaacagttgg ctgtagctga ggggaaaccc cctgaagccc ctaaaggcaa gaagaaaaag 2700

taa 2703

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<400> 3

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR1

<400> 4

aagtccagtc agagcctttt atatagtagc aatcaaaaga actacttggc c 51

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR2

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR2

<400> 6

tgggcatcca ctagggaatc t 21

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR3

<400> 7

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR3

<400> 8

cagcaatatt atagctatcc gacg 24

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<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR1

<400> 9

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR1

<400> 10

agtgattatg cctggaac 18

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<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR2

<400> 11

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 12

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR2

<400> 12

tacataagct acagtggtcg cactagctac aaatcatctc tcaaaagt 48

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR3

<400> 13

Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR3

<400> 14

gactatggta acttcgtagg ttacttcgat gtc 33

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR1

<400> 15

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR1

<400> 16

aaggcgagtc aggacattaa tagctattta agc 33

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<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR2

<400> 17

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR2

<400> 18

cgtgcaaaca gattggtaga t 21

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg Thr

1 5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR3

<400> 20

ctacagtatg atgagtttcc tcggacg 27

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR1

<400> 21

Ser Glu Tyr Ala Trp Thr

1 5

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR1

<400> 22

agtgagtatg cctggacc 18

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR2

<400> 23

Tyr Ile Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Leu Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR2

<400> 24

tacataaact acaatggcaa cactaactta aatccatctc tcaaaagt 48

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR3

<400> 25

Ser Leu Trp Pro Arg Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR3

<400> 26

tcactttggc ccaggggctg gtttgcttac 30

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL

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gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

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tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180

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ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

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<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH

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Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH

<400> 30

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaatc cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtcg cactagctac 180

aaatcatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctggagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagactat 300

ggtaacttcg taggttactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Met

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL

<400> 32

gacattctga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatgtatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggccaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttcctcggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH

<400> 33

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Glu

20 25 30

Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Leu Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Trp Pro Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 34

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH

<400> 34

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc agtgagtatg cctggacctg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataaact acaatggcaa cactaactta 180

aatccatctc tcaaaagtcg aatctctatc attcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac aactgaggac acagccacat attactgtgc aagatcactt 300

tggcccaggg gctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 35

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8轻链

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Arg Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 36

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8重链

<400> 36

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile

210 215 220

Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp

260 265 270

Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His

275 280 285

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Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys

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Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

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Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu

355 360 365

Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp

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Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val

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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu

405 410 415

Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His

420 425 430

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro

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Gly Lys

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180 185 190

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Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

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Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

275 280 285

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290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

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275 280 285

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Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn

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Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp

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Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val

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Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala

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Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu

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Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala

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Lys Asp Asn Val Pro Phe His Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu

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Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu

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305 310 315 320

Arg Phe Tyr Leu Leu Tyr Ile Arg Pro Glu Gly Gln Asp Ser Ala Phe

325 330 335

Ser Trp Thr Asp Leu Leu Leu Lys Asn Asn Ser Glu Leu Leu Asn Asn

340 345 350

Leu Gly Asn Phe Ile Asn Arg Ala Gly Met Phe Val Ser Lys Phe Phe

355 360 365

Gly Gly Tyr Val Pro Glu Met Val Leu Thr Pro Asp Asp Gln Arg Leu

370 375 380

Leu Ala His Val Thr Leu Glu Leu Gln His Tyr His Gln Leu Leu Glu

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Lys Val Arg Ile Arg Asp Ala Leu Arg Ser Ile Leu Thr Ile Ser Arg

405 410 415

His Gly Asn Gln Tyr Ile Gln Val Asn Glu Pro Trp Lys Arg Ile Lys

420 425 430

Gly Ser Glu Ala Asp Arg Gln Arg Ala Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala

435 440 445

Val Asn Ile Ala Ala Leu Leu Ser Val Met Leu Gln Pro Tyr Met Pro

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85 90 95

Leu Gln Pro Tyr Met Pro Thr Val Ser Ala Thr Ile Gln Ala Gln Leu

100 105 110

Gln Leu Pro Pro Pro Ala Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn Phe Leu Cys

115 120 125

Thr Leu Pro Ala Gly His Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro Leu Phe Gln

130 135 140

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Gly Gln Ala Lys Thr Ser Pro Lys Pro Ala Val Val Glu Thr Val Thr

165 170 175

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180 185 190

Gln Gly Asn Ile Val Arg Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn

195 200 205

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50 55 60

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65 70 75 80

Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser

85 90 95

Pro Lys Pro Ala Val Val Glu Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln

100 105 110

Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg

115 120 125

Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val

130 135 140

Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys

145 150 155 160

Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly Lys Lys Lys Lys

165 170

<210> 49

<211> 174

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人类AIMP3蛋白

<400> 49

Met Ala Ala Ala Ala Glu Leu Ser Leu Leu Glu Lys Ser Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ser Lys Gly Asn Lys Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Gln Ile Pro Val

20 25 30

Leu Gln Thr Asn Asn Gly Pro Ser Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ile Ala

35 40 45

Ala His Leu Val Lys Gln Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Leu Gly Ser Thr

50 55 60

Ala Glu Glu Lys Ala Ile Val Gln Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Val Thr

65 70 75 80

Gln Val Asp Gly His Ser Ser Lys Asn Asp Ile His Thr Leu Leu Lys

85 90 95

Asp Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Asp Lys Val Tyr Leu Thr Gly Tyr Asn

100 105 110

Phe Thr Leu Ala Asp Ile Leu Leu Tyr Tyr Gly Leu His Arg Phe Ile

115 120 125

Val Asp Leu Thr Val Gln Glu Lys Glu Lys Tyr Leu Asn Val Ser Arg

130 135 140

Trp Phe Cys His Ile Gln His Tyr Pro Gly Ile Arg Gln His Leu Ser

145 150 155 160

Ser Val Val Phe Ile Lys Asn Arg Leu Tyr Thr Asn Ser His

165 170

Claims

1.一种抗体或其片段，其特征在于，与由SEQ ID NO：1表示的人源甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的由第861至900位氨基酸表示的片段特异性结合。

2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包括：

轻链可变区，包括：包含由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列的轻链互补决定区1；包含由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列的轻链互补决定区2；包含由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列的轻链互补决定区3，以及

重链可变区，包括：包含由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列的重链互补决定区1；包含由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：23表示的氨基酸序列的重链互补决定区2；包含由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列的重链互补决定区3。

3.如权利要求2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区和轻链可变区选自：

轻链可变区，包括：包含由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的轻链互补决定区1，包含由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的轻链互补决定区2和包含由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列的轻链互补决定区3；及重链可变区，其包括：包含由SEQ ID NO:9表示氨基酸序列的重链互补决定区1，包含由SEQ ID NO:11表示氨基酸序列的重链互补决定区2和包含由SEQ IDNO:13表示氨基酸序列的重链互补决定区3；以及

轻链可变区，其包括：包含由SEQ ID NO:15表示氨基酸序列的轻链互补决定区1，包含由SEQ ID NO:17表示氨基酸序列的轻链互补决定区2，包含由SEQ ID NO:19表示氨基酸序列的轻链互补决定区3；及重链可变区，其包括：包含由SEQ ID NO:21表示氨基酸序列的重链互补决定区1，包含由SEQ ID NO:23表示氨基酸序列的重链互补决定区2和包含由SEQ IDNO:25表示氨基酸序列的重链互补决定区3。

4.如权利要求2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:31表示的氨基酸序列，所述抗体重链可变区包含由SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:33表示的氨基酸序列。

5.如权利要求2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD，所述片段选自双功能抗体、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和scFv等。

6.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其片段。

7.一种重组表达载体，其包含如权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种细胞，其用如权利要求7所述的重组表达载体转化而得。

9.一种细胞，其表达如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其片段。

10.一种与人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)结合的单克隆抗体的制备方法，该方法包括：

(a)将如权利要求8或权利要求9所述的细胞注射于小鼠的腹腔内；

(b)从腹腔膨胀的小鼠收集腹膜液；和

(c)从腹膜液中分离与MRS特异性结合的单克隆抗体。

11.一种人源甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的特异性检测方法，该方法包括使权利要求1所述的抗体或其片段与试样接触的步骤，以及检测所述抗体或其片段的步骤。

12.一种用于诊断癌症的组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其片段作为活性成分。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述癌症选自胆道癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤。

14.如权利要求1所述的抗体或其片段在制备癌症诊断剂中的用途。

15.一种用于癌症的诊断方法，该方法包括向有需求的对象施用有效量的权利要求1所述的抗体或其片段。