KR102104551B1 - Mrs에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항 MRS 모노클로날 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861번째 내지 900번째 아미노산으로 표시되는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편, 이를 생산하는 방법 및 이를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 유래 MRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 MRS 검출이 가능하므로 MRS와 관련된 암을 진단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

MRS에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체{Monoclonal antibodies specifically binding to MRS protein}

본 발명은 MRS에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산으로 표시되는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편, 이를 생산하는 방법 및 이를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효소외에 AIMP1(p43), (AIMP2)p38, (AIMP3)p18 등 multisynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multisynthetase complex에 참여하는 효소외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능 외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보고 되었는데 MRS(methionyl-tRNA synthetase)가 그중의 하나이다. MRS는 번역을 위한 개시자(initiator) 및 연장자(elongator) tRNA^Met에 메치오닌을 결합하는 필수적인 효소이다. Met-tRNA^Met는 단백질 중합 반응의 개시 및 폴리펩티드의 연장에 반드시 필요하기 때문에, 번역 뿐 아니라 잠재적으로 다른 생물학적 과정을 조절하는 결정적인 위치에 있다. 예를 들어, MRS는 산화 스트레스에 반응하여 tRNA에 대한 특이성을 조절하고 합성 중인 폴리펩티드 사슬에 더 많은 메치오닌이 삽입되도록 하여, 증가한 메치오닌이 활성산소종을 제거할 수 있도록 한다(Lee et al., 2014; Wiltrout et al., 2012). MRS는 또한 다양한 질환에서 관여하는 것으로 최근 밝혀지고 있다. UV를 조사하면, MRS의 효소 활성은 S662 위치가 GCN2 의존적으로 인산화되면서 억제되고 번역의 개시 반응이 저해된다(Kang et al., 2012; Kwon et al., 2011). MRS가 인산화되면, MRS에 결합하고 있는 종양억제자인 AIMP3와 분리되며, 분리되어 나온 AIMP3는 DNA를 복구하기 위하여 핵 안으로 이동한다. 이러한 맥락에서 MRS는 UV 조사에 의한 DNA 손상 반응과 번역 억제를 조정하는 링커의 역할을 하는 것으로 볼 수 있다(Kwon et al., 2011).

한편, MRS를 비롯한 ARS들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응을 보이고 아예 고 감도의 항체가 생성되지 않은 경우가 많다. 본 발명의 항체는 우수한 감도와 ARS간 교차반응이 없는 점에서 연구용 뿐만 아니라 진단용 및 산업상 이용가능성이 높은 항체라 예상된다.

이에 본 발명자들은 MRS에 특이적으로 결합하는 항체를 연구하던 중, 하이브리도마 세포를 이용한 항체 생산 방법으로 만들어진 항체가 다른 ARS간 교차 반응이 없고, MRS에 특이적으로 결합하는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산으로 표시되는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

(a) 상기 항체를 생산하는 세포를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계;

(b) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계; 및

(c) 상기 복수액으로부터 MRS에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 MRS(methionyl-tRNA synthetase)에 결합하는 단일클론항체의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 특이적 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산으로 표시되는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 상기 항체를 생산하는 세포를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계;

(b) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계; 및

(c) 상기 복수액으로부터 MRS에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 MRS(methionyl-tRNA synthetase)에 결합하는 단일클론항체의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 특이적 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산으로 표시되는 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명에서 ‘MRS(methionyl-tRNA synthetase)’는 ARSs의 한 종류로 전사(translation)를 시작하고 메티오닌(Met)을 tRNA로 이동시키는데 가장 중요한 효소이다. MRS는 핵 내에서 리보솜 RNS(ribosomal RNA)합성을 증가시키고 mTORC1, GCN2, CDK4, 및 VEGFR와 같은 다양한 신호전달 물질과 상호작용을 한다. 자외선으로 DNA 손상을 주면 MRS는 아미노아실-트랜스리보핵산 합성 효소-상호작용 다기능 단백질 3 (aminoacyl-tRNA synthetases-interacting multifunctional protein 3, AIMP3)에서 분리되어 AIMP3가 손상된 DNA에 결합하여 전사를 조절한다.

본 발명에서 ‘항체(antibody)’란 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 당단백질을 가리킨다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, HCVR 또는 VH로 약기) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하 LCVR 또는 VL로 약기) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 일컬어지는 더욱 보존된 영역이 산재된 초가변성 영역 (상보성 결정 영역(CDR)이라 일컬어짐)으로 더욱 세분될 수 있다. VH 및 VL의 각각은 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역 체계의 다양한 세포 (예, 효과기 세포) 및 전통적인 상보 체계의 첫 번째 성분(C1q)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체는 인간 유래 MRS 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산을 포함하는 단편에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는 인간 유래 MRS 단백질에 결합하는 본 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체가 결합하는 부위로, 서열번호 39로 표시되는 아미노산을 포함하는 연속되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며, 통상 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하여 40 내지 900개, 더욱 바람직하게는 40 내지 80개, 구체적으로는 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개의 아미노산 서열로 이루어지는 단편일 수 있다. 가장 바람직하게는 인간 MRS 단백질에서 유래된 것인 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 MRS 단백질의 598-900 aa(서열번호 46), 660-860 aa(서열번호 47), 660-900 aa(서열번호 48), 730-900 aa(서열번호 49) 위치의 단편을 제작하여, 각 단편을 클로닝한 후, 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 서열번호 46, 48, 49번의 단편은 항체가 인식하였으나, 서열번호 47의 단편은 인식하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체는 인간 유래 MRS 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산 단편(서열번호 39)에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 6b 참조).

본 발명에서 제공하는 ‘인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편’은

서열번호 3 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 5 또는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 7 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL) 및

서열번호 9 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 11 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 13 또는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VH);을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 인간 유래 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은, 바람직하게 아래와 같은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 CDR 구성을 포함하는 항체로서, 하기 (i) 및 (ii)는 각각 실시예의 1E8 및 8A12 항체의 CDR 조합을 나타낸다:

(i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역;

(ii) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역; 으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.

가장 바람직하게 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그 단편은, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 27(1E8 VL) 또는 서열번호 31(8A12 VL)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 29(1E8 VH) 또는 서열번호 33(8A12 VH)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 항체는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 그 종류가 제한되지 않는다. 구체적으로는 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

본 발명의 항체는 인간 유래 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있고, 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있지만, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있다. 보다 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체일 수 있다.

인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가 포함된다(미국특허 제 5,939,598호 참조).

또한 본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 MRS 단백질 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다.

Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미하며, 본 발명의 목적상 항체의 단편은 인간 유래 MRS 단백질에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않는다.

또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double stranded)이 될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 MRS 단백질에 결합하는 항체의 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서, 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게, 서열번호 4(경쇄 CDR1), 서열번호 6(경쇄 CDR 2), 서열번호 8(경쇄 CDR3), 서열번호 10(중쇄 CDR 1), 서열번호 12(중쇄 CDR 2), 서열번호 14(중쇄 CDR 3), 서열번호 16(경쇄 CDR1), 서열번호 18(경쇄 CDR2), 서열번호 20(경쇄 CDR3), 서열번호 22(중쇄 CDR1), 서열번호 24(중쇄 CDR2) 또는 서열번호 26(중쇄 CDR 3)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 28(VL), 서열번호 30(VH), 서열번호 32(VL) 또는 서열번호 34(VH)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.

본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 '재조합(recombinant)'은 '유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.

본 발명에서 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 '재조합 발현 벡터'란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작동가능하게 연결된(operably linked)'이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현조절서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 mammalian expression vector, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 인간 유래 MRS 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 전술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있고, 하나의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있다.

본 발명은 상기의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.

상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

본 발명에 따른 인간 유래 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다.

본 발명은 (a) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계; (b) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계; 및 (c) 상기 복수액으로부터 MRS에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 MRS(methionyl-tRNA synthetase)에 결합하는 단일클론항체의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환된 세포는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 발현하는 하이브리도마 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 골수종 세포(myeloma cell)와 MRS에 대해 면역화된 마우스의 B 세포에 PEG를 처리하여 융합하였고, HT 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양기에서 3시간 동안 배양하였다(실시예 1-3 참조).

본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 특이적 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 유래 MRS 단백질과 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 MRS 단백질을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.

본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키기 전에, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 MRS의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계((1) 단계)를 포함할 수 있다.

통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), 면역세포화학염색(immunocytochemistry), 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며, 면역조직화학염색 및 면역세포화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹(blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.

다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료와 접촉시키는 단계((2) 단계)를 수행한다.

본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 인간 유래 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서, 그 구체적 종류와 서열 구성에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출'을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴(biotin)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘(avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서, 2개 이상의 물질을 혼합, 결합, 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 다른 컨테이너(container) 상에서 수행될 수 있고, 또한 인 시투(in situ), 생체 내, 개체 내, 조직 내, 세포 내에서 수행 될 수 있다.

다음으로는 상기(2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계((3) 단계)를 수행한다.

상기 ‘검출’은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서, MRS 단백질의 존재 유무의 감지 또는 상기 단백질의 수준을 측정(정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기 (2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계((3) 단계) 전에, MRS 인간 유래 단백질과 복합체를 형성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광, 방사성 동위원소, 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출 가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또한 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능, 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편(1차 항체)에 결합한다.

또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 암은 당업계에 악성 종양으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 폐암, 췌장암 또는 담도암일 수 있다.

본 발명에 따른 암의 진단은 생물학적 시료 중에서 MRS 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘진단’은, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 진단은 암 등의 발병 여부, 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.

본 발명에서 상기 ‘암’은 담도암, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐암, 췌장암 또는 담도암일 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘검출’에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 진단 키트로서 제공될 수 있으며, 상기 키트는 당업계에 항체 또는 특정 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사성면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케이트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩용 키트 등을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 상기 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트에서 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 대장균을 이용하여 MRS-AIMP3 단백질을 제조하였고, MRS-AIMP3 단백질을 마우스 복강 내에 주사하여 면역화한 뒤, 혈액 및 B 세포를 추출하였다. 그 다음 상기에서 획득한 B 세포와 골수종 세포에 PEG를 처리하여 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하였고, ELISA 및 웨스턴 블랏으로 스크리닝 하여 MRS만 인식하는 하이브리도마 세포를 선택하였다. 그 다음 최종적으로 "1E8" 및 "8A12" 클론을 확보하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 상기 하이브리도마 세포를 마우스 복강 내에 투여하였다. 그 다음 마우스의 복강에 복수가 가득찼을 때 주사를 이용하여 복수를 추출하였고, 원심분리한 뒤 상층액만 분리하였다. 그 다음 protein A를 컬럼에 채우고 세척한 다음, 복수액을 인산염 완충액으로 희석시킨 후 protein A 컬럼에 로딩하였고, 각 분획을 용출하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 하이브리도마 세포에서 획득한 1E8 항체 및 8A12 항체를 1:5000으로 희석하였고, si-MRS를 처리한 H460 세포의 세포 용출액을 이용하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 1E8 항체 및 8A12 항체가 MRS에 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, 두 종류의 si-MRS 처리를 통해 해당 항체들이 MRS를 특이적으로 인식함을 확인하였다(실시예 3-1 및 도 1 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 96 웰 플레이트에 His-MRS, MRS full, DX2 tag free, 34S-DX2, 34S-AIMP2, His-CRS, His-AIMP1, His-GRS, His-WRS, His-KRS를 코팅한 뒤, 1E8 항체 및 8A12 항체를 이용하여 ELISA를 실시한 결과, 1E8 항체(도 2A) 및 8A12 항체(도 2B)가 MRS에만 결합하여 반응하고 다른 ARS 단백질 및 AIMP 단백질에는 반응하지 않는 것을 확인할 수 있었다(실시예 3-2 및 도 2 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 1E8 항체 및 8A12 항체와 MRS+AIMP3 단백질을 이용하여 SPR(Surface plasmon resonance, 표면 플라즈몬 공명) 실험을 실시한 결과, 1E8 항체(도 3) 및 8A12 항체(도 4)가 MRS+AIMP3 단백질에는 결합하나 동일한 AIMP3 단백질에는 결합하지 않아 MRS 항체의 친화성이 높은 것을 확인할 수 있었다(실시예 3-3, 도 3 및 도 4 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 커버글라스에 Panc-1 세포를 배양한 뒤 1E8 항체 및 8A12 항체를 1:200으로 희석하여 처리한 다음, 2차 항체를 1:200으로 희석하여 처리하여 반응시킨 후, DAPI로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 본 발명에서 획득한 1E8 항체 및 8A12 항체가 Panc-1 세포의 표면에 결합하는 것을 확인할 수 있었다(실시예 4 및 도 5 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, MRS 단백질로부터 각 길이와 위치가 상이한 6개의 단편을 제작하여, 벡터에 클로닝 한 다음, H640 세포에 형질감염시켜 배양하였다. 그 다음 세포로부터 단백질을 수득하여 1E8 항체 및 8A12 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 1E8 항체 및 8A12 항체가 모두 5번(598-900 aa), 6번 단편(298-900 aa)에 결합하는 것을 확인하였다(도 6a 참조), 그 다음 MRS 단백질의 598-900 aa 부분을 4개의 단편으로 제작하여 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 1E8 항체 및 8A12 항체가 5번(598-900 aa), 8번(660-900 aa), 9번(730-900aa) 단편에 결합하는 것을 확인하였다(실시예 5, 도 6a 및 도 6b 참조).

따라서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 유래 MRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 MRS 검출이 가능하므로 MRS와 관련된 암을 진단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 si-MRS를 처리한 H460 세포의 세포 용출액을 사용하여, MRS 항체(1E8, 8A12)의 MRS 결합 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MRS 항체(1E8, 8A12)의 ARS(aminoacyl-tRNA synthetase) 단백질에 대한 교차 활성을 확인하기 위하여 ELISA를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 MRS 항체(1E8)의 MRS+AIMP3 단백질에 대한 항체 친화력을 확인하기 위하여 SPR(Surface plasmon resonance) 실험을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MRS 항체(8A12)의 MRS+AIMP3 단백질에 대한 항체 친화력을 확인하기 위하여 SPR(Surface plasmon resonance) 실험을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 MRS 항체(1E8 및 8A12)를 이용하여 Panc-1 세포에 결합하는 것을 확인하기 위한 면역형광염색 실험을 실시한 결과를 이미지로 나타낸 것이다(초록색: MRS, 파란색: 세포핵).
도 6a는 MRS 및 다른 서열을 갖는 6개의 MRS 단편으로 H460 세포를 트랜스펙션 시킨 후, 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 실험을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 MRS 및 다른 서열을 갖는 4개의 MRS 단편으로 H460 세포를 트랜스펙션 시킨 후, 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 실험을 실시한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

세포 배양

293T, H460, Panc-1 세포를 각각 DMEM 배지에서 배양하여 passage 5 내지 9인 세포를 사용하였다. 각 세포는 10% FBS(Fetal bovine serum, Hyclone, GE lifesciences), 1% 페니실린 (Hyclone, GE lifesciences)을 포함하는 RPMI-1640 (Hyclone, GE lifesciences)및 DMEM (Hyclone, GE lifesciences)배지에서 배양하였다. 각 세포는 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다.

동물 모델

몸무게 25 내지 30g의 10주령 BALB/c 마우스들을 Orient Bio Co.(Sungnam, KyungKiDo, Republic of Korea)로부터 구입하였고, 동물사의 일정한 조건(온도: 20±2℃, 습도: 40~60%, 명암: 12시간 light/dark cycle)하에서 충분하게 적응시킨 후에 본 연구에 이용하였다. 동물 실험은 서울대학교의 대학 동물 관리 및 사용 위원회 지침을 준수하였다.

< 실시예 1>

MRS에 대한 단일클론 항체를 생산하는 세포 선별

<1-1> MRS- AIMP3 단백질 제조

대장균(E. coli ) 상에서 MRS-AIMP3(Aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 3) co-purified 단백질의 발현 및 정제를 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

BL21DE3 strain을 이용하여 MRS(methionyl-tRNA synthetase, 서열번호 1)와 AIMP3(NM_004280.4, 서열번호 49)를 형질전환하여 LB 배지에서 배양한 뒤 단일 콜로니를 암피실린(ampicilin)을 포함하는 5ml LB 액체 배지에서 OD 600값이 0.6 내지 0.8이 되도록 배양하였다. 이후 1mM의 IPTG를 넣어준 다음 37℃에서 3시간 동안 배양하였고, 그 다음 10분 동안 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 세포액으로 SDS-PAGE를 실시하여 쿠마시 용액(coomassie stain)을 이용하여 발현을 확인하였다.

이 후, IPTG로 과발현을 유도하였던 세포액을 모아 원심분리를 실시하여 세포를 획득하였다. 1ml DPBS로 세포를 풀어준 후 초음파분쇄기를 이용하여 세포 용해하였고, 그 다음 용해된 세포로 원심분리를 실시하여 MRS-AIMP3 co-purified 단백질을 분리하였다.

<1-2> 마우스를 이용한 면역화 실험

하이브리도마 세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 획득한 MRS-AIMP3 co-purified 단백질을 8~10주령 마우스 4마리에 복강 내에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 동일한 용량의 MRS-AIMP3 co-purified 단백질을 마우스의 복강 내에 2차 주사하였다. 그 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 MRS-AIMP3 co-purified 단백질을 마우스의 꼬리 정맥에 부스터(booster) 주사하였다.

상기 면역화된 마우스를 에테르로 마취시킨 후 헤파린 처리된 주사기로 심장에서 채혈한 후, 혈액을 4℃에서 하룻밤 정치시키고 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 적당히 나누어 -80℃에 보관하였다.

<1-3> 하이브리도마 세포( hybridoma cell) 제조

먼저, 세포융합을 위해 골수종 세포(myeloma cell)를 준비하였다. 골수종 세포를 배양하고, 세포 밀도를 2.5~5×10⁴/㎖로 하였다. 세포융합 24시간 전에 골수종 세포를 1/3로 희석하여 준비하였다. 상기 실시예 1-2에서 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 비장을 채취하여 B 세포를 분리한 뒤, SF-DMEM2(DMEM + 2×AA)로 세척하고 세포를 용출시켰다. 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한(tapping) 후 SF-DMEM2를 채웠다. B 세포와 골수종 세포를 각각 원심분리하고 세척한 다음, 세척과정을 1회 더 반복하였다. 세척한 골수종 세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 또한, 세척한 B 세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후, LB(lysis buffer) 1㎖에 적혈구(RBC, red blood cell)를 넣어 처리한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 그 다음, B 세포와 골수종 세포를 각각 원심분리하고, 원심분리된 B 세포와 골수종 세포의 상층액을 제거한 다음 탭핑하고 SF-DMEM2 10㎖를 채웠다. B 세포와 골수종 세포를 각각 e-튜브에서 100배로 희석하고 계수하여 농도를 결정하였다[B 세포의 농도(1×10⁸, 8×10⁷, 5×10⁷), 골수종 세포의 농도(1×10⁷, 8×10⁶, 5×10⁶)]. B 세포와 골수종 세포는 10:1의 비율로 결정하였다. 결정된 농도의 B 세포와 골수종 세포를 튜브에 함께 넣고 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초~1분 동안 반건조시키고 탭핑하였다. 여기에 PEG(2㎖)를 1분 동안 천천히 넣으면서 피펫팅하여 반응시키고 SF-DMEM2를 넣으면서 튜브를 흔들어준 다음 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 탭핑하지 않은 상태에서 HT 배지[HT50×(HT(sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10㎖) 1㎖, FBS 10㎖, SF-DMEM1(DMEM + 1×AA) 30㎖]를 방울방울 떨어뜨리고, 조금씩 속도를 올리면서 50㎖가 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3시간 동안 배양하였다.

<1-4> 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별 및 클로닝

상기 실시예 1-3에서 제조한 융합세포군 중에서 MRS를 잘 인식하면서, AIMP3를 인식하지 않는 세포를 선별하고, 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 실시하였다.

먼저, 세포융합 후 8~9일째에 배지를 교환하고, 96 웰에서부터 24 웰까지 잘 자랄 때까지 cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 교환한 후 5~7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 cDMEM2로 채운 후 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 구체적으로는, 24 웰의 융합세포 농도를 확인하고, 96 웰 플레이트에 0.5 cell/well이 되도록 15㎖의 배양액에 융합세포를 희석하였다. 융합세포 희석액을 각 웰당 150㎕씩 분주하였다. 현미경으로 검경하여 1개의 세포가 들어있는 웰을 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24 웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1.0이 넘는 융합세포만 선택하여 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 MRS를 잘 인식하면서 AIMP3를 인식하지 않는 세포를 선택하였고, 최종적으로 "1E8" 및 "8A12" 클론을 확보하였다.

< 실시예 2>

MRS에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제

<2-1> 하이브리도마 세포의 배양 및 MRS에 대한 단일클론항체의 생산

상기 실시예 1에서 선택한 최종 융합세포(하이브리도마 세포, "1E8" 및 "8A12")로부터, 각각 다음의 두 가지 방법을 통해 수득될 수 있다.

1) 7~8 주령의 암컷 마우스 복강(abdominal cavity)에 프리스탄(pristane) 500㎕를 주사하였다. 75T/C 배양 플라스크에서 배양한 융합세포를 수거하여 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 인산염 완충액에 넣고 피펫팅하였다. 프리스탄 투여 7~10일 후 상기 실시예 1-4에서 선택한 융합세포를 각각 8×10⁵~ 4×10⁷으로 마우스의 복강 내에 주사하였다. 1~2주 후에 마우스의 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 4℃에서 하룻밤 두었다가 다음날 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다.

상기 복수액으로부터 항체 정제를 위하여, 저장액(20% 에탄올)에 저장되어 있는 Protein A를 적당량 컬럼에 채우고 20% 에탄올을 흘려 내린 후, 5 Bed Volume의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 세척하였다. 복수액을 인산염 완충액으로 적당량 희석시킨 후 Protein A 컬럼에 로딩하였다. 3 Bed Volume의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 결합한 후, 3 Bed Volume의 용출 완충액(0.1M glycine buffer, pH 3.0~2.5)으로 0.5㎖씩 분획을 용출하였다. 각 분획을 35㎕의 중화 완충액(1M Tris-HCl, pH 9.0)으로 중화시켰다. 70% 에탄올로 냉장온도에서 하룻밤 정치시킨 후, 다시 저장액(20% 에탄올)에서 다음 사용시까지 냉장 보관하였다. SDS-PAGE를 통해, 분획의 순도를 확인하였고, Ammersharm GE 컬럼으로 탈염(desalting)하였다.

2) 상기 하이브리도마 세포를 Cellstack-5(Corning, NY)을 사용하여, 최대 860mL의 배양액에서 배양하였다. 무혈청 배지(Thermo)에 5mM GlutaMAX(Gibco)와 1x Cholesterol lipid concentrate(Gibco)를 첨가하였으며, 초기 세포 농도를 1.4~2.0 X 10⁵ cell/mL로 접종하였다. 분주 4 ~ 5일 후, 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액을 회수하였다. 상층액의 pH를 확인한 후 제조된 20X 결합 용액 (1M Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)을 사용하여 pH 7.6을 맞추었다. 이후 0.22um 필터를 사용하여 여과하여 중화된 항체배양액을 수득하였다.

<2-2> MRS에 대한 단일클론항체의 정제

상기 실시예 2-1 또는 2-2에서 수득한 항체배양액을 다음과 같은 방법으로 정제하였다. Protein A를 적당량 컬럼에 채우고 10 컬럼 부피의 증류수를 흘려준 뒤, 동량의 1X 결합용액 (50mM Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)을 흘려주었다. 그 다음, 상기 수득한 항체 배양액을 흘려주어 항체를 Protein A에 결합시킨 후, 1X 결합용액 (50mM Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)으로 washing하였다. 그 다음, 2 컬럼 부피의 용출 용액(0.2M Citric acid)(pH 3.0)을 흘려주어 용출액을 수득하였으며, 1M Tris 로 중화한 뒤 280nm 흡광도에서 항체의 농도를 측정하여 확인하였다. GE PD-10 컬럼을 생리식염수 25 ml로 평형시킨 후, 원심분리(1000 g, 2분) 하였다. 그 다음 상기 protein A 컬럼에서 수득한 항체 용출액 2.5 ml를 컬럼에 넣고, 원심분리(1000g, 2분) 하여, 항체의 용액을 생리 식염수로 교환하였다. 그 다음, 280nm 흡광도에서 항체 농도를 측정한 뒤, 분주하여 -80℃에 보관하였다.

<2-4> MRS에 대한 단일클론항체의 서열정보분석 및 클로닝

상기 실시예에서 수득한 1E8 항체 및 8A12 항체의 서열은 YBIO Inc. 및 앱클론(AbClon Inc., Korea)에서 실시하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 하이브리도마 세포에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음, VL, CL, VH, CH 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 예상되는 크기의 PCR product를 아가로즈 겔(agarose gel)에서 정제하여 시퀀싱(sequencing)을 통해 서열을 확인하였다. Kabat numbering을 통해 CDR 부위를 확인하였으며, 확인된 서열로 Fab를 합성하여, ELISA 방법을 이용하여 상기 항체가 MRS에 높은 결합력을 갖는 것을 확인하였다.

또한 각 항체의 서열들은, 상기 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입한 뒤 복수 정제를 통해 얻어진 항체의 단백질 서열을 mass spectrometry 방법으로 분석한 결과와 일치하는 것을 확인하였다.

상기 수득한 1E8 Fab 서열 및 8A12 Fab 서열을 mouse IgG heavy chain (pFUSE-mIgG2a-Fc, InvivoGen)및 mouse light chain 서열 벡터(pFUSE2-CLIg-mK, InvivoGen)에 클로닝 하였다. 그 다음, 상기 벡터를 freestyle 293F 세포에 PEI (Polysciences, 23966-2)를 이용하여. 공동형질전환시켜 각 항체의 경쇄 및 중쇄가 동시에 발현되도록 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37℃, 8% CO₂ 조건에서 7일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 수득하여 원심분리한 뒤, 상층액을 수득하였고, 상층액의 pH를 확인한 후 제조된 20X 결합용액(1M potassium phosphate dibasic, pH 9.0)을 이용하여 상층액의 pH를 7.6으로 조정하였다. 그 다음, 0.22㎛ 필터로 상층액을 여과하여 중화된 항체배양액을 수득하였다. 항체배양액으로부터 상기 실시예 2-2에 기재된 방법으로 항체를 수득하였다. 이렇게 수득된 1E8 IgG의 전체 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어졌으며, 8A12 IgG의 전체 항체는 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 것을 확인하였다.

< 실시예 3>

MRS에 대한 항체의 결합 특이성

<3-1> MRS 항체를 이용한 웨스턴 블랏 실험

상기 실시예에서 획득한 1E8 및 8A12 항체의 MRS 결합능력을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

상기 실험방법에 기재된 방법에 따라 배양한 H460 세포에 si-MRS를 72시간 동안 처리하였다. 그 다음 H460 세포를 수득한 뒤, 용해시킨 후, H460 세포 용해물로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 1차 항체로 1E8 항체와 8A12 항체를 1:5000(0.2 ㎍/ml)으로 희석하여 사용하였고, 시중에서 유통되고 있는 MRS 항체(Abcam, Ab50793)을 사용하였으며, 대조군으로는 튜블린(Tublin)을 사용하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 1E8 항체와 8A12 항체는 모두 si-MRS를 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 약하게 MRS를 검출하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 1E8 항체 및 8A12 항체는 MRS에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 동일한 농도에서 시중에서 유통되고 있는 MRS 항체에 비해, 1E8 항체 및 8A12 항체가 더 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.

<3-2> MRS 항체를 이용한 ELISA 실험

상기 실시예에서 획득한 1E8 및 8A12 항체가 다른 ARS(aminoacyl-tRNA synthetase) 단백질에 대한 교차 활성(cross activity)을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

96 웰 플레이트(Corning 3690 flat bottom, 96-well half-area plates)에 다른 ARS 단백질(His-MRS, MRS full, DX2 tag free, 34S-DX2, 34S-AIMP2, His-CRS, His-AIMP1, His-GRS, His-WRS, His-KRS)을 각각 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 1E8 및 8A12 항체를 500 ng/ml 농도로 ARS 단백질이 코팅된 96웰 플레이트에 넣은 뒤 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 HRP-conjugated anti-mouse IgG 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰고, ELISA를 실시하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질로는 TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)을 사용하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 1E8 및 8A12 항체가 MRS에만 결합하여 반응하고, 다른 ARS 단백질과 AIMP 단백질에는 반응하지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해, 1E8 및 8A12 항체는 다른 ARS 단백질과 AIMP 단백질에 대하여 교차 활성이 없으며, MRS만 검출하는 것을 확인할 수 있었다.

<3-3> 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 항체 친화성 확인

상기 실시예 2에서 정제한 항체의 친화성을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 실시하였다.

1E8 및 8A12 항체와 실시예 1에서 획득한 MRS+AIMP3 단백질을 이용하여 SPR(Surface plasmon resonance, 표면 플라즈몬 공명) 실험을 실시하였다.

MRS+AIMP3 및 AIMP3 단백질을 CM5 chip에 코팅하고, 1E8 혹은 8A12 항체를 다양한 농도로 흘려보내면서 단백질과의 결합 반응 정도를 측정하였다. 분석시료나 버퍼는 30μl/min의 유속으로 8분 동안 주입하였고, 20분 동안 세척하였다.

그 결과 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 1E8 및 8A12 항체가 MRS+AIMP3 단백질에는 결합하나 동일한 AIMP3 단백질에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 1E8 항체는 MRS에 대하여 5.42nM KD value를 가지며(도 3), 8A12 항체는 MRS에 대하여 1.56nM KD value를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

< 실시예 4>

항 MRS 항체 반응성 측정

상기 실시예 2에서 획득한 1E8 항체 및 8A12 항체의 면역활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

배양된 Panc-1 세포에 20mM EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 뒤, 원심분리를 실시하였다. 그 다음 6 웰 플레이트에 커버글래스를 넣고, 1ml의 배양배지를 넣고, 1.0 ×10⁶ cells/ml의 세포를 넣고, 37℃에서 배양하였다. 그 다음 배지를 제거하고, 메탄올(methanol)로 세포를 고정한 뒤, 0.2% PBST(PBS+tween 20)을 처리한 뒤, 2% 염소 혈청(Abchem)으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 그 다음 1E8 항체 및 8A12 항체를 1:200으로 희석하여 처리하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 2차 항체로 mouse IgG alexa 488(Abchem)을 1:200으로 희석하여 처리하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.2% PBST로 세척한 뒤 DAPI(molecular probes) 로 염색하였고, 형광현미경(Nikon)으로 관찰하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2에서 획득한 1E8 항체와 8A12 항체가 Panc-1 세포의 표면에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

항 MRS 항체의 결합부위 확인

상기 실시예 2에서 획득한 1E8 항체 및 8A12 항체의 도메인을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

MRS 단백질에서 GST, catalytic domain, tRNA binging domain 부위를 기준으로 각각 길이와 위치가 상이한 6개의 단편을 제작하였으며, pcDNA3 vector(EV)에 MRS 단백질 및 각각의 MRS 단편(MRS fragment)을 클로닝 하였다. 각 MRS 단편의 위치는 하기 표 1에 나타내었다. 이때, Myc 단백질이 MRS N-말단에 결합되어 있어 Myc 단백질을 대조군으로 사용하였다.

그 다음 H460 세포에 클로닝한 벡터 DNA 2 ㎍을, 제조사의 지침에 따라 Turbofect(Thermo)를 사용하여 트랜스펙션(transfection) 시켰다. 24시간 후 세포를 수득하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 1차 항체로 1E8 항체 및 8A12 항체를 1:5000(0.2㎍/mL)으로 희석하여 사용하였다.

그 결과 도 6a에 나타난 바와 같이, 1E8 항체와 8A12 항체 모두 MRS 단편 5번과 6번을 인식하는 것으로 나타났다.

이를 통해, 598-900 aa에 항체가 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 토대로 MRS 단백질의 598-900 aa 부분에서 각각 길이와 위치가 상이한 4개의 단편을 제작하였으며, pcDNA3 vector(EV)에 각각의 MRS 단편(MRS fragment)을 클로닝 하였다. 그 다음 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다.

그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, 1E8 항체와 8A12 항체가 모두 5, 8, 9번 단편을 인식하였으나, 7번 단편은 인식하지 못하는 것으로 나타났다.

이를 통해, MRS 단백질의 861-900 aa 위치에 항체가 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.

MRS 단편	위치	서열정보	서열번호
1	1-266 aa	MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEVLISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGNYLFSTSAICRYFFLLSGWEQDDLTNQWLEWEATELQPALSAALYYLVVQGKKGEDVLGSVRRALTHIDHSLSRQNCPFLAGETESLADIVLWGALYPLLQDPAYLPEELSALHSWFQTLSTQEPCQRAAETVLKQQGVLALRPYLQKQPQPSPAEGRAVTNEPEEEELATLSEEEIAMAVTAWEKGLESLPPLRPQQNPVLPVAGERNV	40
2	267-417 aa	LITSALPYVNNVPHLGNIIGCVLSADVFARYSRLRQWNTLYLCGTDEYGTATETKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNISFDIFGRTTTPQQTKITQDIFQQLLKRGFVLQDTVEQLRCEHCARFLADRFVEGVCPFCGYEEARGDQ	41
3	267-597 aa	LITSALPYVNNVPHLGNIIGCVLSADVFARYSRLRQWNTLYLCGTDEYGTATETKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNISFDIFGRTTTPQQTKITQDIFQQLLKRGFVLQDTVEQLRCEHCARFLADRFVEGVCPFCGYEEARGDQCDKCGKLINAVELKKPQCKVCRSCPVVQSSQHLFLDLPKLEKRLEEWLGRTLPGSDWTPNAQFITRSWLRDGLKPRCITRDLKWGTPVPLEGFEDKVFYVWFDATIGYLSITANYTDQWERWWKNPEQVDLYQFMAKDNVPFHSLVFPCSALGAEDNYTLVSHLIATEYLNYEDGKFSKS	42
4	1-597 aa	MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEVLISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGNYLFSTSAICRYFFLLSGWEQDDLTNQWLEWEATELQPALSAALYYLVVQGKKGEDVLGSVRRALTHIDHSLSRQNCPFLAGETESLADIVLWGALYPLLQDPAYLPEELSALHSWFQTLSTQEPCQRAAETVLKQQGVLALRPYLQKQPQPSPAEGRAVTNEPEEEELATLSEEEIAMAVTAWEKGLESLPPLRPQQNPVLPVAGERNVLITSALPYVNNVPHLGNIIGCVLSADVFARYSRLRQWNTLYLCGTDEYGTATETKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNISFDIFGRTTTPQQTKITQDIFQQLLKRGFVLQDTVEQLRCEHCARFLADRFVEGVCPFCGYEEARGDQCDKCGKLINAVELKKPQCKVCRSCPVVQSSQHLFLDLPKLEKRLEEWLGRTLPGSDWTPNAQFITRSWLRDGLKPRCITRDLKWGTPVPLEGFEDKVFYVWFDATIGYLSITANYTDQWERWWKNPEQVDLYQFMAKDNVPFHSLVFPCSALGAEDNYTLVSHLIATEYLNYEDGKFSKS	43
5	598-900 aa	RGVGVFGDMAQDTGIPADIWRFYLLYIRPEGQDSAFSWTDLLLKNNSELLNNLGNFINRAGMFVSKFFGGYVPEMVLTPDDQRLLAHVTLELQHYHQLLEKVRIRDALRSILTISRHGNQYIQVNEPWKRIKGSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVMLQPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFLCTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQRFGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQALMDEVTKQGNIVRELKAQKADKNEVAAEVAKLLDLKKQLAVAEGKPPEAPKGKKKK	44
6	298-900 aa	SRLRQWNTLYLCGTDEYGTATETKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNISFDIFGRTTTPQQTKITQDIFQQLLKRGFVLQDTVEQLRCEHCARFLADRFVEGVCPFCGYEEARGDQCDKCGKLINAVELKKPQCKVCRSCPVVQSSQHLFLDLPKLEKRLEEWLGRTLPGSDWTPNAQFITRSWLRDGLKPRCITRDLKWGTPVPLEGFEDKVFYVWFDATIGYLSITANYTDQWERWWKNPEQVDLYQFMAKDNVPFHSLVFPCSALGAEDNYTLVSHLIATEYLNYEDGKFSKSRGVGVFGDMAQDTGIPADIWRFYLLYIRPEGQDSAFSWTDLLLKNNSELLNNLGNFINRAGMFVSKFFGGYVPEMVLTPDDQRLLAHVTLELQHYHQLLEKVRIRDALRSILTISRHGNQYIQVNEPWKRIKGSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVMLQPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFLCTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQRFGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQALMDEVTKQGNIVRELKAQKADKNEVAAEVAKLLDLKKQLAVAEGKPPEAPKGKKKK	45
7	660-860 aa	FVSKFFGGYVPEMVLTPDDQRLLAHVTLELQHYHQLLEKVRIRDALRSILTISRHGNQYIQVNEPWKRIKGSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVMLQPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFLCTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQRFGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQALMDEVTKQGNIVRELK	46
8	660-900 aa	FVSKFFGGYVPEMVLTPDDQRLLAHVTLELQHYHQLLEKVRIRDALRSILTISRHGNQYIQVNEPWKRIKGSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVMLQPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFLCTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQRFGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQALMDEVTKQGNIVRELKAQKADKNEVAAEVAKLLDLKKQLAVAEGKPPEAPKGKKKK	47
9	730-900 aa	GSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVMLQPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFLCTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQRFGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQALMDEVTKQGNIVRELKAQKADKNEVAAEVAKLLDLKKQLAVAEGKPPEAPKGKKKK	48

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 유래 MRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 MRS 검출이 가능하므로 MRS와 관련된 암을 진단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Monoclonal antibodies specifically binding to MRS protein <130> NP17-0039P <150> KR 10-2017-0058896 <151> 2017-05-11 <160> 49 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 900 <212> PRT <213> Homo sapiens MRS protein (NP_004981.2) <400> 1 Met Arg Leu Phe Val Ser Asp Gly Val Pro Gly Cys Leu Pro Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Glu Val Leu Ile Ser Thr 20 25 30 Val Gly Pro Glu Asp Cys Val Val Pro Phe Leu Thr Arg Pro Lys Val 35 40 45 Pro Val Leu Gln Leu Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ala 50 55 60 Ile Cys Arg Tyr Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Glu Gln Asp Asp Leu 65 70 75 80 Thr Asn Gln Trp Leu Glu Trp Glu Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ala Leu 85 90 95 Ser Ala Ala Leu Tyr Tyr Leu Val Val Gln Gly Lys Lys Gly Glu Asp 100 105 110 Val Leu Gly Ser Val Arg Arg Ala Leu Thr His Ile Asp His Ser Leu 115 120 125 Ser Arg Gln Asn Cys Pro Phe Leu Ala Gly Glu Thr Glu Ser Leu Ala 130 135 140 Asp Ile Val Leu Trp Gly Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gln Asp Pro Ala 145 150 155 160 Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ser Ala Leu His Ser Trp Phe Gln Thr Leu 165 170 175 Ser Thr Gln Glu Pro Cys Gln Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Gln 180 185 190 Gln Gly Val Leu Ala Leu Arg Pro Tyr Leu Gln Lys Gln Pro Gln Pro 195 200 205 Ser Pro Ala Glu Gly Arg Ala Val Thr Asn Glu Pro Glu Glu Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Met Ala Val Thr Ala Trp 225 230 235 240 Glu Lys Gly Leu Glu Ser Leu Pro Pro Leu Arg Pro Gln Gln Asn Pro 245 250 255 Val Leu Pro Val Ala Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Thr Ser Ala Leu 260 265 270 Pro Tyr Val Asn Asn Val Pro His Leu Gly Asn Ile Ile Gly Cys Val 275 280 285 Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn 290 295 300 Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Thr Glu Thr 305 310 315 320 Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro Gln Glu Ile Cys Asp Lys Tyr 325 330 335 His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg Trp Phe Asn Ile Ser Phe Asp 340 345 350 Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Gln Asp 355 360 365 Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly Phe Val Leu Gln Asp Thr Val 370 375 380 Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala Arg Phe Leu Ala Asp Arg Phe 385 390 395 400 Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp 405 410 415 Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile Asn Ala Val Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys Pro Val Val Gln Ser Ser Gln 435 440 445 His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu Glu Lys Arg Leu Glu Glu Trp 450 455 460 Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp Trp Thr Pro Asn Ala Gln Phe 465 470 475 480 Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr 485 490 495 Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp 500 505 510 Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile 515 520 525 Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu 530 535 540 Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala Lys Asp Asn Val Pro Phe His 545 550 555 560 Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr 565 570 575 Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu Tyr Leu Asn Tyr Glu Asp Gly 580 585 590 Lys Phe Ser Lys Ser Arg Gly Val Gly Val Phe Gly Asp Met Ala Gln 595 600 605 Asp Thr Gly Ile Pro Ala Asp Ile Trp Arg Phe Tyr Leu Leu Tyr Ile 610 615 620 Arg Pro Glu Gly Gln Asp Ser Ala Phe Ser Trp Thr Asp Leu Leu Leu 625 630 635 640 Lys Asn Asn Ser Glu Leu Leu Asn Asn Leu Gly Asn Phe Ile Asn Arg 645 650 655 Ala Gly Met Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly Gly Tyr Val Pro Glu Met 660 665 670 Val Leu Thr Pro Asp Asp Gln Arg Leu Leu Ala His Val Thr Leu Glu 675 680 685 Leu Gln His Tyr His Gln Leu Leu Glu Lys Val Arg Ile Arg Asp Ala 690 695 700 Leu Arg Ser Ile Leu Thr Ile Ser Arg His Gly Asn Gln Tyr Ile Gln 705 710 715 720 Val Asn Glu Pro Trp Lys Arg Ile Lys Gly Ser Glu Ala Asp Arg Gln 725 730 735 Arg Ala Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala Val Asn Ile Ala Ala Leu Leu 740 745 750 Ser Val Met Leu Gln Pro Tyr Met Pro Thr Val Ser Ala Thr Ile Gln 755 760 765 Ala Gln Leu Gln Leu Pro Pro Pro Ala Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn 770 775 780 Phe Leu Cys Thr Leu Pro Ala Gly His Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro 785 790 795 800 Leu Phe Gln Lys Leu Glu Asn Asp Gln Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg 805 810 815 Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser Pro Lys Pro Ala Val Val Glu 820 825 830 Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu 835 840 845 Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala 850 855 860 Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys 865 870 875 880 Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly 885 890 895 Lys Lys Lys Lys 900 <210> 2 <211> 2703 <212> DNA <213> Homo sapiens MRS mRNA (NM_004990.3) <400> 2 atgagactgt tcgtgagtga tggcgtcccg ggttgcttgc cggtgctggc cgccgccggg 60 agagcccggg gcagagcaga ggtgctcatc agcactgtag gcccggaaga ttgtgtggtc 120 ccgttcctga cccggcctaa ggtccctgtc ttgcagctgg atagcggcaa ctacctcttc 180 tccactagtg caatctgccg atattttttt ttgttatctg gctgggagca agatgacctc 240 actaaccagt ggctggaatg ggaagcgaca gagctgcagc cagctttgtc 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Ser Ala Thr Ile Gln Ala Gln Leu Gln Leu 165 170 175 Pro Pro Pro Ala Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn Phe Leu Cys Thr Leu 180 185 190 Pro Ala Gly His Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro Leu Phe Gln Lys Leu 195 200 205 Glu Asn Asp Gln Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg Phe Gly Gly Gly Gln 210 215 220 Ala Lys Thr Ser Pro Lys Pro Ala Val Val Glu Thr Val Thr Thr Ala 225 230 235 240 Lys Pro Gln Gln Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu Val Thr Lys Gln Gly 245 250 255 Asn Ile Val Arg Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn Glu Val 260 265 270 Ala Ala Glu Val Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys Lys Gln Leu Ala Val 275 280 285 Ala Glu Gly Lys Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly Lys Lys Lys Lys 290 295 300 <210> 45 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRS fragment 6(298-900 aa) <400> 45 Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Ala Thr Glu Thr Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro 20 25 30 Gln Glu Ile Cys Asp Lys Tyr His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg 35 40 45 Trp Phe Asn Ile Ser Phe Asp Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln 50 55 60 Gln Thr Lys Ile Thr Gln Asp Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly 65 70 75 80 Phe Val Leu Gln Asp Thr Val Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala 85 90 95 Arg Phe Leu Ala Asp Arg Phe Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly 100 105 110 Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile 115 120 125 Asn Ala Val Glu Leu Lys Lys Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys 130 135 140 Pro Val Val Gln Ser Ser Gln His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu 145 150 155 160 Glu Lys Arg Leu Glu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp 165 170 175 Trp Thr Pro Asn Ala Gln Phe Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val 195 200 205 Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala 210 215 220 Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu 225 230 235 240 Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala 245 250 255 Lys Asp Asn Val Pro Phe 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Ala Gln Leu Gln Leu Pro Pro Pro Ala 465 470 475 480 Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn Phe Leu Cys Thr Leu Pro Ala Gly His 485 490 495 Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro Leu Phe Gln Lys Leu Glu Asn Asp Gln 500 505 510 Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser 515 520 525 Pro Lys Pro Ala Val Val Glu Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln 530 535 540 Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg 545 550 555 560 Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val 565 570 575 Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys 580 585 590 Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly Lys Lys Lys Lys 595 600 <210> 46 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRS fragment 7(660-860 aa) <400> 46 Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly Gly Tyr Val Pro Glu Met Val Leu Thr 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gln Arg Leu Leu Ala His Val Thr Leu Glu Leu Gln His 20 25 30 Tyr His Gln Leu Leu Glu Lys Val Arg Ile Arg Asp Ala Leu Arg Ser 35 40 45 Ile Leu Thr Ile Ser Arg His Gly Asn 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Leu 1 5 10 15 Ser Lys Gly Asn Lys Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Gln Ile Pro Val 20 25 30 Leu Gln Thr Asn Asn Gly Pro Ser Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ile Ala 35 40 45 Ala His Leu Val Lys Gln Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Leu Gly Ser Thr 50 55 60 Ala Glu Glu Lys Ala Ile Val Gln Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Val Thr 65 70 75 80 Gln Val Asp Gly His Ser Ser Lys Asn Asp Ile His Thr Leu Leu Lys 85 90 95 Asp Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Asp Lys Val Tyr Leu Thr Gly Tyr Asn 100 105 110 Phe Thr Leu Ala Asp Ile Leu Leu Tyr Tyr Gly Leu His Arg Phe Ile 115 120 125 Val Asp Leu Thr Val Gln Glu Lys Glu Lys Tyr Leu Asn Val Ser Arg 130 135 140 Trp Phe Cys His Ile Gln His Tyr Pro Gly Ile Arg Gln His Leu Ser 145 150 155 160 Ser Val Val Phe Ile Lys Asn Arg Leu Tyr Thr Asn Ser His 165 170

Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 메티오닐-tRNA 합성효소(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900 번째 아미노산으로 이루어진 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역; 또는
   서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역; 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 또는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
   
6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
   
8. 제7항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
   
9. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 세포.
   
10. (a) 제8항의 세포를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계;
    (b) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계; 및
    (c) 상기 복수액으로부터 MRS에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 MRS(methionyl-tRNA synthetase)에 결합하는 단일클론항체의 생산방법.
    
11. 제1항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 유래 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 특이적 검출 방법.
    
12. 제1항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 암은 담도암, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
14. (a) 제9항의 세포를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계;
    (b) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계; 및
    (c) 상기 복수액으로부터 MRS에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는 인간 MRS(methionyl-tRNA synthetase)에 결합하는 단일클론항체의 생산방법.

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