JP5886212B2 - ｉＰＳ細胞とその製造法 - Google Patents

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Description

本発明は、ｉＰＳ細胞(induced pluripotent stem cells)とその作製方法に関する。また、本発明は、ｉＰＳ細胞誘導剤、ｉＰＳ細胞誘導用培地及びｉＰＳ細胞誘導用キットに関する。
ｉＰＳ細胞は、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称され、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの分化多能性を有する細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器、血液、骨髄、組織などを再生する上で極めて有効な手段として期待されている。
しかしながら、ＥＳ細胞から得られた血液、骨髄、組織、臓器などの生体材料は、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要があり、さらに倫理上の問題も指摘されている。一方、ｉＰＳ細胞は本人の体細胞を用いて作製できることから免疫拒絶の問題はなく、倫理上の問題もない。
山中伸弥教授らのグループは、いわゆるYamanaka factorsである４種類のリプログラミング因子（Oct3/4, Sox2, Klf4 , c-Myc）の遺伝子をマウスの線維芽細胞に導入し iPS細胞を作製したが（非特許文献１、２）、医療に応用するには以下の課題がある。
１．バクテリアDNAなどの外来遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる恐れがある。
２．従来の方法によりできたiPS細胞は、一定の頻度で癌化し、安全面での問題がある。
３．外来遺伝子の過剰発現でできたiPS細胞では、多能性以外の影響が予想できない。
Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００６，１２６：６６３−６７６． Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１３−３１７．
本発明は、癌化のおそれがなく、安全なｉＰＳ細胞を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み、研究を行ったところ、驚くべきことにコネキシン抑制因子とＴＧＦβシグナリング抑制因子を細胞に作用させることで、遺伝子の導入を行うことなくｉＰＳ細胞が樹立できることを見出した。
本発明は、以下のｉＰＳ細胞およびその製造方法、ｉＰＳ細胞誘導剤、ｉＰＳ細胞誘導用培地、ｉＰＳ細胞誘導用キットを提供するものである。
項１． 少なくとも１種のコネキシン抑制因子と少なくとも１種のＴＧＦβシグナリング抑制因子を細胞に作用させることを特徴とするｉＰＳ細胞を作製する方法。
項２． コネキシン抑制因子がコネキシン４３抑制因子である項１に記載の方法。
項３． 前記コネキシン抑制因子が、コネキシンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド、抗体もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターであることを特徴とする、項１または２に記載の方法。
項４． 前記ＴＧＦβシグナリング抑制因子がTGF-βレセプターＩ阻害剤である項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５． 前記TGF-βレセプター阻害剤がSB-431542、A-83-01またはALK5 Inhibitorである項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６． 少なくとも１種のコネキシン抑制因子を含むｉＰＳ細胞。
項７． コネキシン抑制因子がコネキシン４３抑制因子である項６に記載のｉＰＳ細胞。
項８． 前記コネキシン抑制因子が、コネキシンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド、抗体もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターであることを特徴とする、項６または７に記載のｉＰＳ細胞。
項９． コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導剤。
項１０． コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導用培地。
項１１． コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導用キット。
本発明の方法によれば、外来遺伝子(特に癌遺伝子)の導入の必要がなく、ウイルスを使わないのでiPS細胞以外の形質を改変せず、癌化や感染の恐れが極めて低く安全であり、ヒトへの実用化にとって非常に大きな利点を持つｉＰＳ細胞を作製することができる。
本発明によるiPS細胞は、以下の４点を確認している。
１． 多能性細胞マーカー因子の発現が遺伝子レベル、タンパク質レベルで保たれている。
２． マウス皮下へ移植することにより、テラトーマが形成され、腺管、軟骨、神経など三胚葉全ての細胞が分化誘導できる。
３． 胚葉体を形成し、分化誘導条件により、内皮細胞、神経細胞、心筋細胞へとそれぞれ分化可能で、分化誘導できた心筋細胞が生理的に機能する。
４． キメラマウスの作製が可能である.
また、本発明のiPS細胞は、Germ Lineの作製が可能である。
従って、本発明により提供されるｉＰＳ細胞は、再生医療などに使用する生体材料を作製するために非常に優れたものである。
本発明の実施例で得られた細胞についての結果を示す。a. siPSCsの形態がマウスESに類似している。b. siPSCsのALP活性が認められた。c. 各種抗多能性マーカー抗体(Nanog, Oct4, Sox2, SSEA1)による免疫染色により、発現をタンパク質レベルで確認できた。d. RT-PCRにより、各種抗多能性マーカー遺伝子の発現が遺伝子レベルで確認された。e. SCIDマウスの皮下に移植することにより、Teratomaが形成され、腺、軟骨・筋肉、神経・上皮が確認できた。 EGFPマウス心筋由来のsiPSCsの形態 siPSCs細胞のキメラマウス作製。a. siPSCs-#1からできたキメラマウス。b. siPSCs-#2からできたキメラマウス。 TGF-シグナリングの伝達を示す概略図である。
本明細書において、「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称される分化多能性を獲得した細胞のことである。本発明で得られたｉＰＳ細胞は、内胚葉、外胚葉、中胚葉の全てに分化することができ(図１参照)、キメラマウス（図３）及びGerm Lineを作製可能である。
「コネキシン（Ｃｘ）」は、ギャップ結合に関与するタンパク質の総称であり、分子量によりＣｘ４３（４３ｋＤａ）などと命名されている。コネキシンの具体例としては、Ｃｘ２６、Ｃｘ３０、Ｃｘ３１、Ｃｘ３２、Ｃｘ３６、Ｃｘ３７、Ｃｘ４０、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５、Ｃｘ５０などが挙げられる。現在２０種を超えるコネキシンが知られており、今後発見されるコネキシン類も本発明で抑制対象のコネキシンに含まれる。コネキシンの種類と発現に関しては、総説（Oyamadaら, BBA, 2005, 1719:6-23）に詳述されており、その記載は本明細書に参考として援用される。コネキシンの種類と発現部位を以下の表にまとめる。
Figure 0005886212
 上記表は、各組織で主に発現されるコネキシンであり、本発明では、対象細胞で主に発現されるコネキシンを抑制することが好ましい。例えば心室筋では、Ｃｘ４３が多量に発現されており、Ｃｘ４３を抑制するのが好ましい。一方、心室筋ではＣｘ４５も発現されており、Ｃｘ４５を抑制してもよく、Ｃｘ４３とＣｘ４５を同時に抑制してもよい。好ましい抑制対象のコネキシンは、多くの細胞タイプで発現されているコネキシン26，32、43、45などであり、特にコネキシン43が好ましい。コネキシン４３のアミノ酸配列は公知であり、以下に例示される。
Figure 0005886212
 iPS細胞の動物種によって、対応するコネキシン抑制因子を使用することができる。
コネキシンの抑制因子としては、細胞内でのコネキシン遺伝子の発現抑制(転写又は翻訳の抑制)、細胞内のコネキシン(タンパク質)との複合体形成による機能抑制などが挙げられ、具体的にはコネキシンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド、抗体、もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターが挙げられ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、もしくはリボザイムが好ましく、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡがより好ましい。これらは、コネキシンの種類、細胞の由来などにより配列が相違するので、適切な配列を選択する。適切な配列のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチドもしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターは、当業者により容易に設計もしくは選択できる。例えばヒト(サルも同じ配列)に対するコネキシン４３の好ましいｓｉＲＮＡは、以下のものである。
センス： 5’-CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3’ (配列番号１)
アンチセンス： 5’-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3’ (配列番号２)
コネキシンの抑制因子としては、硫酸基を有するグリコサミノグリカン（特開2003-119146、その記載は本明細書に参考として援用する）を使用することもできる。
１つの実施形態において、「コネキシンの抑制因子」は、コネキシン、コネキシンヘミチャネル（コネクソン）、またはコネキシンの細胞増殖活性に影響を及ぼすか調整する化合物である。コネキシンの抑制因子には、アンチセンス化合物（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、ＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡ化合物、抗体およびその結合フラグメント、ならびにペプチドおよびポリペプチド（「ペプチド模倣物」およびペプチドアナログが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。好ましいコネキシンの抑制因子はコネキシン４３の抑制因子である。例示的コネキシンの抑制因子を、本明細書中でさらに説明する。
１つの実施形態において、本発明のコネキシンの抑制因子は、細胞内および細胞外への分子の輸送を調整するか影響を及ぼすことができる（例えば、遮断、阻害、または下方制御）。
一部のコネキシンの抑制因子は、例えば、ｍＲＮＡの転写または翻訳の下方制御によってコネキシン発現を下方制御するか、コネキシンタンパク質、コネキシンヘミチャネル、または細胞増殖活性を減少または阻害することができる（Asazuma-Nakamuraら, Exp Cell Res., 2009, 315:1190-1199; Nakanoら, Invest Ophthalmol Vis Sci., 2007, 49:93-104; Zhangら, Oncogene, 2001, 20:4138-4149.）。
コネキシンの抑制因子の例には、コネキシンｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現または機能を減少または阻害するか、コネキシン、コネキシンヘミチャネル、または細胞増殖活性を減少させる薬剤が含まれる。コネキシンの抑制因子には、抗コネキシンポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチドおよび他のポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはリボザイム機能性を有するポリヌクレオチドなど）など）、抗体およびその結合フラグメント、ならびにペプチドおよびポリペプチド（ヘミチャネルまたは細胞増殖活性を調整するペプチド模倣物およびペプチドアナログが含まれる）が含まれる。
抗コネキシンポリヌクレオチド
抗コネキシンポリヌクレオチドには、コネキシンアンチセンスポリヌクレオチドおよびコネキシン発現を下方制御させることができる機能を有するポリヌクレオチドが含まれる。他の適切な抗コネキシンポリヌクレオチドには、ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。
アンチセンスポリヌクレオチドおよび他の抗コネキシンポリヌクレオチドの合成（ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムポリヌクレオチドならびに修飾骨格および混合骨格を有するポリヌクレオチドなど）は、当業者に公知である。例えば、Ｓｔｅｉｎ Ｃ．Ａ．およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．（編），Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）を参照のこと。抗体および結合部位ならびにペプチドおよびポリペプチド（ペプチド模倣物およびペプチドアナログが含まれる）の合成方法は、当業者に公知である。例えば、Ｌｉｈｕ Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１；９５（１８）：１０８３６−１０８４１（Ｓｅｐｔ １ １９９８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）”Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
１つの態様によれば、コネキシン発現の下方制御は、一般に、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）、より詳細には、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用に基づく。これらのポリヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ）は、下方制御すべきコネキシンタンパク質をターゲティングする。典型的には、ポリヌクレオチドは一本鎖であるが、二本鎖でもよい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および／または翻訳を阻害することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、コネキシン遺伝子またはｍＲＮＡ由来の転写および／または翻訳の特異的インヒビターであり、他の遺伝子またはｍＲＮＡ由来の転写および／または翻訳を阻害しない。本産物は、（ｉ）コーディング配列に対して５’側および／または（ｉｉ）コーディング領域、および／または（ｉｉｉ）コーディング配列に対して３’側のいずれかで、コネキシン遺伝子またはｍＲＮＡに結合することができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、一般に、コネキシンｍＲＮＡに対してアンチセンスである。かかるポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成することができ、それにより、コネキシンｍＲＮＡ代謝の１つまたは複数の態様（転写、ｍＲＮＡプロセシング、核からのｍＲＮＡ輸送、翻訳、またはｍＲＮＡ分解が含まれる）の干渉によってコネキシン発現を阻害することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、コネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成して二重鎖を形成し、それにより、ｍＲＮＡの翻訳の直接的阻害および／または不安定化を生じ得る。かかる二重鎖は、ヌクレアーゼによる分解に感受性を示し得る。
アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全部または一部とハイブリッド形成することができる。典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡのリボゾーム結合領域またはコーディング領域とハイブリッド形成する。ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全部またはある領域と相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全部または一部の正確な相補物であり得る。しかし、絶対的に相補的である必要はなく、生理学的条件下で約２０℃、３０℃、または４０℃を超える融点を有する二重鎖を形成するのに十分に相補的であるポリヌクレオチドは、本発明で用いるのに特に有用である。
したがって、ポリヌクレオチドは、典型的には、ｍＲＮＡと配列が相補的なホモログである。ポリヌクレオチドは、中〜高ストリンジェンシー条件下（約５０℃〜約６０℃で０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなど）でコネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドであり得る。
一定の態様のために、適切なポリヌクレオチドは、典型的には、約６〜４０ヌクレオチド長である。好ましくは、ポリヌクレオチドは、約１２〜約３５ヌクレオチド長、より好ましくは、約１８〜約３２ヌクレオチド長であり得る。別の態様によれば、ポリヌクレオチドは、少なくとも約４０、例えば、少なくとも約６０または少なくとも約８０ヌクレオチド長、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００、約２０００、または約３０００までまたはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。
ポリヌクレオチドによってターゲティングされるコネキシンタンパク質は、下方制御されるべき部位に依存するであろう。コネキシンは、ある局面ではヒトまたは動物中に天然に存在するか、コネキシンの発現または活性が減少されるべき組織中に天然に存在するコネキシンである。コネキシン遺伝子（コーディング配列が含まれる）は、一般に、１つまたは複数の本明細書中に記載の特定のコネキシンのコーディング配列と相同性（コネキシン４３コーディング配列との相同性など）を有する。コネキシンは、典型的には、αまたはβコネキシンである。好ましくは、コネキシンはαコネキシンであり、ｉＰＳの原料となる細胞中で発現する。
しかし、いくつかのコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関して、他よりも遍在する。最も広範囲なものの１つは、コネキシン４３である。コネキシン４３をターゲティングするポリヌクレオチドは、特に、本発明での使用に適切である。他の態様では、他のコネキシンをターゲティングする。
抗コネキシンポリヌクレオチドには、コネキシンアンチセンスポリヌクレオチドおよびコネキシン発現を下方制御させることができる機能を有するポリヌクレオチドが含まれる。他の適切な抗コネキシンポリヌクレオチドには、ＲＮＡｉポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。
１つの好ましい態様では、アンチセンスポリヌクレオチドは、１つのコネキシンタンパク質のみのｍＲＮＡをターゲティングする。最も好ましくは、このコネキシンタンパク質はコネキシン４３である。別の態様では、コネキシンタンパク質は、コネキシン２６、３０、３１．１、３２、３６、３７、４０、または４５である。他の態様では、コネキシンタンパク質は、コネキシン３０．３、３１、４０．１、４７である。これらはヒトのコネキシンタンパク質の例示であるが、他の動物種の場合には、対応するコネキシンのｍＲＮＡをターゲティングする。
個別のコネキシンタンパク質をターゲティングするポリヌクレオチドを組み合わせて使用することも意図される（例えば、１、２、３、４、またはそれを超える異なるコネキシンをターゲティングすることができる）。例えば、コネキシン４３および１つまたは複数のコネキシンファミリーの他のメンバー（コネキシン２６、３０、３０．３、３１．１、３２、３６、３７、４０、４０．１、４５、４７）をターゲティングするポリヌクレオチドを、組み合わせて使用することができる。
あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、１つを超えるコネキシンタンパク質に対するポリヌクレオチドを含むことができる組成物の一部であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドが指向されるコネキシンタンパク質の１つはコネキシン４３である。オリゴデオキシヌクレオチドが指向される他のコネキシンタンパク質には、例えば、コネキシン２６、３０、３０．３、３１．１、３２、３６、３７、４０、４０．１、４５、および４７が含まれ得る。種々のコネキシンに指向する適切な例示的ポリヌクレオチド（およびＯＤＮ）を、配列番号３〜１４に示す。
各アンチセンスポリヌクレオチド特定のコネキシンに特異的あり得るか、１、２、３、またはそれを超える異なるコネキシンをターゲティングすることができる。特異的ポリヌクレオチドは、一般に、コネキシン間で保存されないコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡ中の配列をターゲティングするのに対して、非特異的ヌクレオチドは種々のコネキシンの保存配列をターゲティングするであろう。
本発明で用いるポリヌクレオチドは、適切には、非修飾ホスホジエステルオリゴマーであり得る。かかるオリゴデオキシヌクレオチドは、長さが変化し得る。３０量体のポリヌクレオチドが特に適切であることが見出されている。
本発明の多数の態様は、オリゴデオキシヌクレオチドを参照して記載されている。しかし、他の適切なポリヌクレオチド（ＲＮＡポリヌクレオチドなど）をこれらの態様で使用することができることが理解される。
アンチセンスポリヌクレオチドを、化学修飾することができる。これにより、ヌクレアーゼ耐性を増強することができ、その細胞侵入能力を増強することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用することができる。他のデオキシヌクレオチドアナログには、メチルホスホナート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデート、およびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、ならびにその２’−Ｏ−アルキルアナログおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれる。あるいは、混合骨格オリゴヌクレオチド（「ＭＢＯ」）を使用することができる。ＭＢＯは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび修飾オリゴデオキシ−またはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメントを含む。ＭＢＯは、ホスホロチオアート結合のセグメントおよび他の修飾オリゴヌクレオチドのセグメント（非イオン性で、ヌクレアーゼまたは２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドに非常に高い耐性を示すメチルホスホネートなど）を有する。修飾骨格および混合骨格オリゴヌクレオチドの調製方法は、当該分野で公知である。
本発明で使用されるアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキシンタンパク質に依存するであろう。１つの実施形態では、適切なコネキシンアンチセンスポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド（配列番号３〜１４）が含まれ得る。
本明細書中に記載の組み合わせポリヌクレオチドの調製に適切なポリヌクレオチドには、例えば、コネキシンＣｘ４３に対するポリヌクレオチドならびにコネキシン２６、３０、３１．１、３２、および３７のポリヌクレオチドが含まれる。
本発明で使用されるアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は標的コネキシンタンパク質に依存するにもかかわらず、コネキシン４３について、以下の配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドが特に適切であることが見出された：
GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (配列番号3);
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (配列番号4);
GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (配列番号5).
例えば、コネキシン２６、３１．１、および３２の適切なアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の配列を有する。
5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (connexin 26) (配列番号6);
5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (connexin 31.1) (配列番号11);
5' TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (connexin 32) (配列番号14).
本発明の方法で有用な他のコネキシンアンチセンスポリヌクレオチド配列には、以下が含まれる。
5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (connexin 37) (配列番号 7);
5' CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3' (connexin 37) (配列番号 8);
5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (connexin 30) (配列番号 9);
5' TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (connexin 30) (配列番号 10);
5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3' (connexin 31.1) (配列番号 12);
5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (connexin 31.1) (配列番号 13).
コネキシンタンパク質に対するポリヌクレオチド（ＯＤＮが含まれる）を、任意の都合のよい従来のアプローチによって、そのヌクレオチド配列に関して選択することができる。例えば、コンピュータプログラムＭａｃ ＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（Ｏｌｉｇｏｓ ｅｔｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用することができる。一旦選択されると、ＯＤＮを、ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。
ポリヌクレオチドホモログ
例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡ中の配列の相補物のホモログであり得る。かかるポリヌクレオチドは、典型的には、（相同配列の）例えば少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約１００を超える連続ヌクレオチドの領域にわたって、関連配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％相同である。
当該分野の任意の方法に基づいて相同性を計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載のように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を計算するか、配列を整列させることができる（典型的には、そのデフォルト設定に関して）。
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の数の閾値スコアＴに適合するか満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードの同定によって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定する工程を含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上記参照）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含むＨＳＰを見出すための検索開始のシード（ｓｅｅｄ）として作用する。ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方の方向に伸長する。各方向でのワードヒットの伸長を、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、量Ｘによってその達成された最大値から低下した場合、１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアが０以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達する場合。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定づける。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス（Ｗ），ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計分析を行う。例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の１つの基準は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これにより、２つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の適合が偶然に起こる確率の指標が得られる。例えば、第１の配列と第２の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、一方の配列は別の配列に類似すると見なされる。
相同配列は、典型的には、少なくとも約２、５、１０、１５、２０、またはそれを超える変異（置換、欠失、または挿入であり得る）によって関連配列と異なる。これらの変異を、相同性計算に関する上記のいずれかの領域にわたって測定することができる。
相同配列は、典型的には、バックグラウンドを有意に超えるレベルで元の配列と選択的にハイブリッド形成する。選択的ハイブリッド形成を、典型的には、中〜高ストリンジェンシー条件（例えば、約５０℃〜約６０℃で０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を使用して行う。しかし、かかるハイブリッド形成を、当該分野で公知の任意の適切な条件下で行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照のこと）。例えば、高ストリンジェンシーが必要である場合、適切な条件には、６０℃で０．２×ＳＳＣが含まれる。より低いストリンジェンシーが必要である場合、適切な条件には、６０℃で２×ＳＳＣが含まれる。
ペプチドおよびポリペプチドコネキシンの抑制因子
結合タンパク質（ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、および抗体フラグメントなどが含まれる）はまた、適切な抑制因子である。
結合タンパク質には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントが含まれる）；単鎖抗体；単鎖Ｆｖｓ；および単鎖結合分子（例えば、結合ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むもの）、特定の抗体または他の結合分子と接触する抗原決定基（すなわち、一般にエピトープと呼ばれる分子の一部）に結合することができる組換え抗体および抗体フラグメントが含まれる。これらの結合タンパク質（抗体および抗体フラグメントなどが含まれる）は、キメラまたはヒト化することができるか、投与される被験体で免疫原性が低くなるように作製することができるか、合成することができるか、組換え的に産生することができるか、発現ライブラリー中で産生することができる。当該分野で公知であるか後に発見される任意の結合分子（本明細書中で参照され、そして／または当該分野でより詳細に記載される結合分子など）が想定される。例えば、結合タンパク質には、抗体などだけでなく、標的（例えば、コネキシンまたは関連分子）に結合するリガンド、受容体、ペプチド模倣物、または他の結合フラグメントもしくは分子（例えば、ファージディスプレイによって産生される）が含まれる。
結合分子は、一般に、所望の特異性（結合特異性が含まれるが、これに限定されない）および所望の親和性を有するであろう。親和性は、例えば、約１０４Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上のＫａであり得る。さらに約１０８Ｍ−１を超える親和性（約１０９Ｍ−１以上、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１、および約１０１２Ｍ−１の親和性など）が適切である。本発明の結合タンパク質の親和性を、従来技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら，１９４９ Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０に記載の技術）を使用して容易に決定することができる。
ハイドロパシープロットから得たデータの使用により、コネキシンが４つの膜貫通領域および２つの短い細胞外ループを含むことが提案されている。コネキシンの第１および第２の細胞外領域の配置を、スプリットギャップ結合上の対応するエピトープの免疫局在性のために使用される抗ペプチド抗体産生の報告によってさらに特徴づけた。Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ Ｄ．Ａ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７：１８１７−１８２４（１９８８）；Ｍｅｙｅｒ Ｒ．Ａ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１９：１７９−１８９（１９９２）。
コネキシンの抑制因子には、コネキシン（例えば、コネキシン４５、４３、２６、３０、３１．１、および３７）の膜貫通領域（例えば、第１〜第４）に対応するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。コネキシンの抑制因子は、コネキシン４５の膜貫通領域の一部に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを含むことができる。コネキシンの抑制因子には、アクセッション番号：AAA60458の約５〜２０個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチド、アクセッション番号：AAA60458の約８〜１５個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチド、またはアクセッション番号：AAA60458の約１１〜１３個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。他の実施形態は、アクセッション番号：AAA60458の少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドであるコネキシンの抑制因子に関する。本明細書中に提供した一部のコネキシンの抑制因子では、アクセッション番号：AAA60458の４６〜７５位および１９９〜２２８位のアミノ酸に対応するコネキシン４５の細胞外ドメインを使用して、特定のペプチド配列を構築することができる。本明細書中に記載の一部のペプチドは、アクセッション番号：AAA60458の４６〜７５位および１９９〜２２８位の領域に対応するアミノ酸配列を有する。ペプチドは、アクセッション番号：AAA60458の一部と同一のアミノ酸配列を有する必要はなく、ペプチドが結合活性または機能活性を保持するように保存的にアミノ酸を変化させることができる。あるいは、ペプチドは、細胞外ドメイン以外のコネキシンタンパク質領域（例えば、４６〜７５位および１９９〜２２８位に対応しないアクセッション番号：AAA60458の一部）をターゲティングすることができる。
また、適切なコネキシンの抑制因子は、コネキシン４３の膜貫通領域の一部に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。コネキシンの抑制因子には、アクセッション番号：NP_034418の約５〜２０個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチド、アクセッション番号：NP_034418の約８〜１５個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチド、またはアクセッション番号：NP_034418の約１１〜１３個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。他のコネキシンの抑制因子には、アクセッション番号：NP_034418の少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０個の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。他のコネキシンの抑制因子は、アクセッション番号：NP_034418の３７〜７６位および１７８〜２０８位のアミノ酸に対応するコネキシン４３の細胞外ドメインを含む。コネキシンの抑制因子には、アクセッション番号：NP_034418の３７〜７６位および１７８〜２０８位の領域に対応するアミノ酸配列を有する本明細書中に記載のペプチドが含まれる。ペプチドは、アクセッション番号：NP_034418の一部と同一のアミノ酸配列を有する必要はなく、ペプチドが結合活性または機能活性を保持するように保存的にアミノ酸を変化させることができる。あるいは、ペプチドは、細胞外ドメイン以外のコネキシンタンパク質領域（例えば、３７〜７６位および１７８〜２０８位に対応しないアクセッション番号：NP_034418の一部）をターゲティングすることができる。
抗コネキシンペプチドは、ペプチドが機能的に活性なコネキシンの抑制因子であるような保存的アミノ酸置換を有するコネキシン細胞外ドメインの一部に対応する配列を含むことができる。例示的な保存的アミノ酸置換には、例えば、非極性アミノ酸の別の非極性アミノ酸との置換、芳香族アミノ酸の別の芳香族アミノ酸との置換、脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸との置換、極性アミノ酸の別の極性アミノ酸との置換、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸との置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸との置換、イオン性アミノ酸の別のイオン性アミノ酸との置換が含まれる。
コネキシン４３にターゲティングされるペプチドの例を、以下の配列番号15〜23に示す。
FEVAFLLIQWI (配列番号15)
LLIQWYIGFSL (配列番号16)
SLSAVYTCKRDPCPHQ (配列番号17)
VDCFLSRPTEKT (配列番号18)
SRPTEKTIFII (配列番号19)
LGTAVESAWGDEQ (配列番号20)
QSAFRCNTQQPG (配列番号21)
QQPGCENVCYDK (配列番号22)
VCYDKSFPISHVR (配列番号23)
Cx32、Cx40、Cx43にターゲティングされるペプチドの例を、以下の配列番号24〜37に示す。
Cx32にターゲティングされるペプチド(配列番号34は、Cx32/Cx43)
ESVWGDEKSSFI (配列番号 24)
ICNTLQPGCNSV (配列番号 25)
SVCYDHFFPISH (配列番号 26)
RLVKCEAFPCPNTVDCFVSRPTEKT (配列番号 27)
VKCEAFPCPNTV (配列番号 28)
VDCFVSRPTEKT (配列番号 29)
VCYDHFFPISHVR (配列番号 30)
VWGDEKSSFICNTLQPGY (配列番号 31)
DEKSSFICNTLQPGY (配列番号 32)
SRPTEKTVFTV (配列番号 33)
SRPTEKT (配列番号 34)
ICNTLQPGCNSV (配列番号 35)
Cx40にターゲティングされるペプチド
FLDTLHVCRRSPCPHP (配列番号 36)
Cx43にターゲティングされるペプチド
KRDPCHQVDCFLSRPTEK (配列番号 37)
配列番号38〜65は、本明細書中に記載の使用のためのヒトコネキシン(huCx)26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 43, 45, 46, 46.6に対する抑制因子を示す。
huCx26 KEVWGDEQADFVCNTLQPGCKNVCYDHYFPISHIR (配列番号38)
huCx30 QEVWGDEQEDFVCNTLQPGCKNVCYDHFFPVSHIR (配列番号 39)
huCx30.3 EEVWDDEQKDFVCNTKQPGCPNVCYDEFFPVSHVR (配列番号 40)
huCx31 ERVWGDEQKDFDCNTKQPGCTNVCYDNYFPISNIR (配列番号 41)
huCx31.1 ERVWSDDHKDFDCNTRQPGCSNVCFDEFFPVSHVR (配列番号 42)
huCx32 ESVWGDEKSSFICNTLQPGCNSVCYDQFFPISHVR (配列番号 43)
huCx36 ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR (配列番号 44)
huCx37 ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR (配列番号 45)
huCx40.1 RPVYQDEQERFVCNTLQPGCANVCYDVFS PVSHLR (配列番号 46)
huCx43 ESAWGDEQSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVR (配列番号 47)
huCx46 EDVWGDEQSDFTCNTQQPGCBNVCYBRAFPISHIR (配列番号 48)
huCx46.6 EAIYSDEQAKFTCNTRQPGCDNVCYDAFAPLSHVR (配列番号 49)
huCx40 ESSWGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIR (配列番号 50)
huCx45 GESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVR (配列番号 51)
huCx26 MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKT (配列番号 52)
huCx30 MYVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKT (配列番号 53)
huCx30.3 LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKK (配列番号 54)
huCx31 LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTEKK (配列番号 55)
huCx31.1 LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNIVDCFISKPSEKN (配列番号 56)
huCx32 MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKT 配列番号 57)
huCx36 LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT (配列番号 58)
huCx37 LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT (配列番号 59)
huCx40.1 GALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTSKS (配列番号 60)
huCx43 LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKT (配列番号 61)
huCx46 IAGQYFL YGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKT (配列番号 62)
huCx46.6 LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKT (配列番号 63)
huCx40 IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKN (配列番号 64)
huCx45 LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKT (配列番号 65)
配列番号18〜19、66〜79は、コネキシン抑制因子(ペプチド)を構成するコネキシンファミリーメンバー（ヒトコネキシン(huCx)26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 43, 45, 46, 46.6）の細胞外ドメインを提供する。かかるコネキシン抑制因子は、この配列番号18〜19、66〜79中のペプチド配列の約８〜約１５または約１１〜約１３アミノ個の連続アミノ酸を含むことができる。ペプチドまたはそのフラグメントに対して保存的にアミノ酸を変化させることができる。
huCx43 LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKTIFII(配列番号66)
huCx26 MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV(配列番号 67)
huCx30 YVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKTVFTI(配列番号 68)
huCx30.3 LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKKVFTY(配列番号 69)
huCx31 LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTEKKTY(配列番号70)
huCx31.1 LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNrVDCFISKPSEKNIFTL(配列番号 71)
huCx32 MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV(配列番号 72)
huCx36 LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII(配列番号 73)
huCx37 LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII(配列番号 74)
huCx40.1 GALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTEKSLLML(配列番号 75)
huCx46 IAGQYFLYGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKTIFII(配列番号 76)
huCx46.6 LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKTVFLL(配列番号 77)
huCx40 IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYSRPTEKNVFIV(配列番号 78)
huCx45 LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLLC配列番号 79)
下記の配列番号80〜92とその部分ペプチドは、コネキシン４０の細胞外ループ（Ｅ１およびＥ２）に関して示したコネキシン４０のペプチドインヒビターを提供する。
E1
LGTAAESSWGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIRFWVLQ (配列番号80)
LGTAAESSWGDEQA (配列番号81)
DEQADFRCDTIQP (配列番号82)
TIQPGCQNVCTDQ (配列番号83)
VCTDQAFPISHIR (配列番号84)
AFPISHIRFWVLQ (配列番号85)
E2
MEVGFIVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKNVFIV (配列番号86 )
MEVGFIVGQYF (配列番号87 )
IVGQYFIYGIFL (配列番号88)
GIFLTTLHVCRRSP (配列番号89)
RRSPCPHPVNCY (配列番号90)
VNCYVSRPTEKN (配列番号91)
SRPTEKNVFIV (配列番号92)
配列番号93〜105は、コネキシン４５の細胞外ループ（Ｅ１およびＥ２）に関して示したコネキシン４５のペプチドインヒビターを提供する。
El
LTAVGGESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVRFWVFQ (配列番号93)
LTAVGGESIYYDEQS (配列番号 94)
DEQSKFVCNTEQP (配列番号 95)
TEQPGCENVCYDA (配列番号 96)
VCYDAFAPLSHVR (配列番号 97)
APLSHVRFWVFQ (配列番号 98)
E2
FEVGFLIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLL (配列番号 99)
FEVGFLIGQYF (配列番号 100)
LIGQYFLYGFQV (配列番号 101)
GFQVHPFYVCSRLP (配列番号 102)
SRLPCHPKIDCF (配列番号 103)
IDCFISRPTEKT (配列番号 104)
SRPTEKTIFLL (配列番号 105)
コネキシン４５の抑制因子(ペプチド)の例は以下である：
YVCSRLPCHP (配列番号 106),
QVHPFYVCSRL (配列番号 107),
FEVGFLIGQYFLY (配列番号 108),
GQYFLYGFQVHP (配列番号109),
GFQVHPFYVCSR (配列番号 110),
AVGGESIYYDEQ (配列番号111),
YDEQSKFVCNTE (配列番号 112),
NTEQPGCENVCY (配列番号 113),
CYDAFAPLSHVR (配列番号 114),
FAPLSHVRFWVF (配列番号 115)
LIGQY (配列番号 116),
QVHPF (配列番号 117),
YVCSR (配列番号 118),
SRLPC (配列番号 119),
LPCHP (配列番号 120)
GESIY (配列番号 121),
YDEQSK (配列番号122),
SKFVCN (配列番号 123),
TEQPGCEN (配列番号 124),
VCYDAFAP (配列番号125),
LSHVRFWVFQ (配列番号126)
コネキシン抑制因子としての抗体、ペプチドは市販品を用いることができる。例えばCx43抗体としては、Cat. No：Sigma, C-6219; Zymed, 13-8300; Santa Cruz, sc-6560が挙げられ、Cx43を抑制するペプチドとしては、Cat. No：Santa Cruz, sc-6560 P; BD Transduction Laboratories, 610063; Abcam, ab56616が挙げられる。
ＴＧＦβシグナリング抑制因子は、当該分野で知られているＴＧＦ−βアンタゴニストを含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤として定義される。例えば、ＴＧＦ−β receptor Iに結合して、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β受容体に結合するのを防ぐ薬剤は、ＴＧＦ−βシグナリング抑制因子として作用する。
他の非限定的な例には、Daschら（J. Immunol.(1989) 142:1536）およびLucasら（J. Immunol. (1990) 145:1415）により記載されたものといったような、ヒトＴＧＦ−βに特異的な遮断（中和）抗体（ＮＡb）、可溶性ＴＧＦ−β受容体、膜結合性ＴＧＦ−β受容体、前駆体ＴＧＦ−βを成熟ＴＧＦ−βへと活性化することを担うプロテアーゼを不活性化するプロテアーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体（Ｉ型、II型またはIII型）に特異的であって、その受容体へのＴＧＦ−β結合を予防する抗体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
TGF-βシグナリングの伝達を図４を参照して説明する。
リガンドTGF-βがTGF-βリセプターII（TβRII）に結合することにより、TβRIIが活性化される。活性化されたTβRIIがTGF-βリセプターI（TβRI）と重合し、２つのTβRIと２つのTβRIIからなる四量体を形成し、TβRIのC末端のリン酸化が起こる。リン酸化されたTβRIが活性型となり、そのC末端にTGF-βシグナリングのメディエターであるSmad2及びSmad3が供給されリン酸化される。リン酸化されたSmad2及びSmad3が細胞質に局在するSmad4と結合し、核内移行が起こり、標的遺伝子に結合し、標的遺伝子の発現を制御する。
本発明のＴＧＦβシグナリング抑制因子は、このシグナル伝達のいずれかを抑制するものである。従って、ＴＧＦβシグナリング抑制因子は、TGF-βの発現抑制、TβRI若しくはTβRIIの発現抑制、TGF-βのTβRIIへの結合阻害、２つのTβRIと２つのTβRIIからなる四量体の形成抑制、TβRIのC末端のリン酸化阻害、TβRIのC末端の脱リン酸化、TβRIのユビキチン化、Smad2及びSmad3のリン酸化阻害、Smad2及びSmad3の発現抑制、Smad2及びSmad3のユビキチン化、リン酸化されたSmad2及びSmad3の脱リン酸化、リン酸化されたSmad2及びSmad3とSmad4との結合阻害などの機能を有する物質は本発明において、ＴＧＦβシグナリング抑制因子として機能し得る。
TGF-βシグナリング抑制因子は、市販品を使用することができる。市販品は、（１）レセプターの抑制と（２）レセプター以降のsignal transductionの抑制に分けられる。
（１）Receptor Ｉ(ALK 5) inhibitor:
SB425342; A-83-01; ALK5 inhibitor.
（２）Signal transduction inhibitor:
Inhibitor Smad: Smad7がTβR Ｉに結合し、Smad2及びSmad3のTβR Ｉへの結合を妨害する。
Signaling mediator inhibition: siRNAかantisense oligo DNAによって、Smad2, Smad3及びSmad4の発現を抑制する。
TGF-βシグナリング抑制因子は、市販のReceptor Ｉ(ALK 5) inhibitor （SB425342、A-83-01、ALK5 inhibitorなど）、Signal transduction inhibitorの機能を模倣する物質を広く包含する。
TGF-βシグナリング抑制因子は、ＴＧＦβ、TβRI、TβRIIに対する抗体を包含する。抗体は、コネキシン抑制因子について説明したように、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントが含まれる）；単鎖抗体；単鎖Ｆｖｓ；および単鎖結合分子（例えば、結合ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むもの）、特定の抗体または他の結合分子と接触する抗原決定基（すなわち、一般にエピトープと呼ばれる分子の一部）に結合することができる組換え抗体および抗体フラグメントが含まれる。
TGF-βシグナリング抑制因子は、ＴＧＦ−β前駆体の成熟型ＴＧＦ−βへの変換を抑制する物質、可溶型のＴＧＦ−β受容体を包含する。
ＴＧＦ−βは、一般的には、潜伏関連タンパク質と呼ばれるタンパク質と非共有結合したＴＧＦ−βから成る潜伏前駆体として分泌される（ＬＡＰ；Harpelら（1992）Prog. Growth Factor Res. 4: 321）。この潜伏複合体は、活性サイトカインを放出するために、炭水化物基の酵素的切断および一時的酸性化を必要とする。精製ＬＡＰはそれ自体で、活性ＴＧＦ−βを高親和性で結合して、潜伏複合体を形成する。プレ−プロ−ＴＧＦ−βに対応し、成熟型のＴＧＦ−βの直前で終わって、Ｓer３３置換のためのＣys３３を含む、２７８のアミノ酸ペプチドをコードするＤＮＡが述べられており（Derynckら（1985）Nature 316: 701）、またＴＧＦ−βを結合して、それを潜伏した状態にすることが見い出されている。
可溶型のＴＧＦ−β受容体もまたＴＧＦ−βを結合して、膜結合性ＴＧＦ−β受容体への結合を防ぐ。ＴＧＦ−β受容体は、Wangら（Cell (1991) 67: 797）およびLinら（Cell (1992) 68: 775）により記載されている。可溶型のＴＧＦ−β受容体は、当業界で知られている方法により調製され得る。例えば、ＴＧＦ−β受容体の膜貫通ドメインを欠く欠失突然変異体を調製することができ、これは、可溶性ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現するであろう（Miyazonoら（Adv. Immunol. (1994) 55: 181）。
TGF-βシグナリング抑制因子として機能する他の型のＴＧＦ−βアンタゴニストもまた当業界で知られている。例えば、Yamaguchiら（Nature (1990) 346: 281）は、ＴＧＦ−βを結合して、この増殖因子の活性を調整する、小さなコンドロイチン−デルマタン硫酸プロテオグリカンであるデコリンを論じている。OhtsukiおよびMassague（Mol. Cell. Biol. 12:261-265, 1992）は、ＴＧＦ−βの幾つかの生物活性を遮断するプロテインキナーゼ阻害剤を開示している。プロテアーゼ阻害剤の薬物としての設計および使用は、当業界で十分知られている（Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; SandlerおよびSmith編; 1989, Oxford University Press; Proteinase Inhibitors Medical and Biological Aspects; Katunuma, UmezawaおよびHolzer編, 1983, Springer-Verlag）；このように、クルザインヴァン(cruzain van)の阻害剤を製造すると、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして有用である。
またさらなる他のＴＧＦ−βアンタゴニストおよびそれらの製造方法は、現在開発中のより多くのものと共に、当該分野で十分知られている。有効なＴＧＦ−βアンタゴニストはいずれも、本発明において有用であり得ることから、使用する特異的ＴＧＦ−βアンタゴニストは、限定的なものではない。そのようなアンタゴニストの例には、１つまたはそれ以上のイソ型のＴＧＦ−βに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（米国特許第５,５７１,７１４号およびＷＯ９７／１３８４４）、ＴＧＦ−β受容体、そのフラグメント、その誘導体、およびＴＧＦ−β受容体に対する抗体（米国特許第５,６９３,６０７号、同第６,００８,０１１号、同第６,００１,９６９号および同第６,０１０,８７２号、並びにＷＯ９２／００３３０、ＷＯ９３／０９２２８、ＷＯ９５／１０６１０およびＷＯ９８／４８０２４）；潜伏関連ペプチド（ＷＯ９１／０８２９１）、大きな潜伏ＴＧＦ−β（ＷＯ ９４／０９８１２）、フェチュイン（米国特許第５,８２１,２２７号）、デコリン、並びにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカンおよびエンドグリンといったような他のプロテオグリカン（米国特許第５,５８３,１０３号、同第５,６５４,２７０号、同第５,７０５,６０９号、同第５,７２６,１４９号、同第５,８２４,６５５号、同第５,８３０,８４７号、同第６,０１５,６９３号、並びにＷＯ９１／０４７４８、ＷＯ９１／１０７２７、ＷＯ９３／０９８００およびＷＯ９４／１０１８７）が含まれる。
そのようなアンタゴニストのさらなる例には、ソマトスタチン（ＷＯ９８／０８５２９）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５,５２０,９２６号）、プロラクチン（ＷＯ９７／４０８４８）、インスリン様増殖因子II（ＷＯ９８／１７３０４）、ＩＰ−１０（ＷＯ９７／００６９１）、アルギニン(arg)-グリシン(gly)-アスパラギン酸(asp)含有ペプチド（米国特許第５,９５８,４１１号およびＷＯ９３／１０８０８）、植物、真菌類および細菌類の抽出物（欧州特許出願第８１３８７５号、特開平８−１１９９８４号および米国特許第５,６９３,６１０号）、アンチセンスオレゴヌクレオチド（米国特許第５,６８３,９８８号、同第５,７７２,９９５号、同第５,８２１,２３４号および同第５,８６９,４６２号、並びにＷＯ９４／２５５８８）、並びにＳＭＡＤおよびＭＡＤ（欧州特許出願ＥＰ ８７４０４６、ＷＯ９７／３１０２０、ＷＯ９７／３８７２９、ＷＯ９８／０３６６３、ＷＯ９８／０７７３５、ＷＯ９８／０７８４９、ＷＯ９８／４５４６７、ＷＯ９８／５３０６８、ＷＯ９８／５５５１２、ＷＯ９８／５６９１３、ＷＯ９８／５３８３０およびＷＯ９９／５０２９６、並びに米国特許第５,８３４,２４８号、同第５,８０７,７０８号および同第５,９４８,６３９号）、並びにＳkiおよびＳno（G. Vogel, Science, 286:665 (1999)およびStroscheinら, Science, 286:771-74 (1999)）、並びにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する上記分子のいずれかのフラグメントおよび誘導体を含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する他のタンパク質が含まれる。
ＴＧＦ−β受容体およびＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合フラグメント、とりわけ、可溶性フラグメントは、本発明の方法において有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−β受容体およびそれらをコードする核酸は、当業界で十分知られている。ＴＧＦ−β１型受容体をコードする核酸配列は、ＧenＢankのアクセス番号Ｌ１５４３６およびDonahoeらの米国特許第５,５３８,８９２号に開示されている。ＴＧＦ−β２型受容体の核酸配列は、ＧenＢankのアクセス番号ＡＷ２３６００１；ＡＩ３５７９０；ＡＩ２７９８７２；ＡＩ０７４７０６；およびＡＡ８０８２５５の下、公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型受容体の核酸配列もまた、ＧenＢankのアクセス番号ＮＭ００３２４３；ＡＩ８８７８５２；ＡＩ８１７２９５；およびＡＩ６８１５９９の下、公的に入手可能である。好ましい態様において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、その受容体、またはＦ(ab)２フラグメント、Ｆvフラグメント、一本鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する他の“抗体”型といったようなそのフラグメントへのＴＧＦ−β結合を遮断する抗体である。その抗体は、キメラ化またはヒト化され得る。
さらに、ＴＧＦβ１レセプターＩＩ型に対するＲＮＡｉとして作用するＲＮＡ配列（特開2005-253344）、ＴＧＦβＩＩ型受容体発現のサイレンシングのためのｓｉＲＮＡ（特表2007-502284）、ＴＧＦ−βインヒビターとしてのピリミジニルイミダゾール（特表2008-511631）およびピリミジニルピラゾール（特表2008-511630）などが挙げられる。
好ましいＴＧＦβシグナリング抑制因子は、SB-431542、A-83-01、ALK5 Inhibitorである。
ＴＧＦβシグナリング抑制因子は、細胞の培養液中に添加することができる。濃度としてはＴＧＦβシグナリング抑制因子の有効量が例示され、例えばSB-431542の場合には、1〜100μM、好ましくは10μM程度である。
コネキシン抑制因子は、有効量以上を培養液中に添加することにより細胞に取り込ませることができる。例えばsiRNAの場合、10〜1000nM、好ましくは100nM程度を培養液中に添加することができる。上記以外のＴＧＦβシグナリング抑制因子、コネキシン抑制因子の使用量は、当業者であれば容易に決定できる。
ｉＰＳ細胞の原料となる細胞としては、全ての体細胞が挙げられ、例えば心筋細胞、繊維芽細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などが挙げられる。この体細胞はコネキシンを発現している細胞がよく、コネキシンを高発現している細胞がさらに好ましい。
ｉＰＳ細胞は、哺乳動物細胞（ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ）あるいはトリ、アヒル、アフリカツメガエルなどの動物細胞から得ることができる。
コネキシン抑制因子とＴＧＦβシグナリング抑制因子は、同時に作用させてもよく、逐次的に作用させてもよい。好ましくはこれらは同時に作用させる。
コネキシン抑制因子とＴＧＦβシグナリング抑制因子を作用させて得られたiPS細胞は、常法に従い非iPS細胞を除去することで、iPS細胞の集団を分離精製することができる。
本発明のｉＰＳ細胞は、コネキシン抑制因子とＴＧＦβシグナリング抑制因子を作用させて誘導された時点ではコネキシン抑制因子とＴＧＦβシグナリング抑制因子の一方又は両方が細胞内に存在すると考えられる。特に、これらの抑制因子が細胞内での遺伝子発現を抑制する分子である場合には、ｉＰＳになった瞬間には細胞内に存在するものと考えられる。特に、コネキシン抑制因子は、従来ｉＰＳの作製及び培養時に用いられていなかったものであり、コネキシン抑制因子を細胞内に含むｉＰＳ細胞は新規な細胞である。
コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子は、いずれもｉＰＳ細胞に誘導するために使用することができ、これらはｉＰＳ細胞誘導剤として有用である。
コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の抑制因子を含む培地は、ｉＰＳ細胞を誘導することができるため、ｉＰＳ細胞誘導用培地として有用である。
さらに、コネキシン抑制因子及びＴＧＦβシグナリング抑制因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の抑制因子は、ｉＰＳ細胞を誘導することができるので、これらはｉＰＳ細胞誘導用キットとして有用である。
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明する。
実施例1：新生仔マウスの心室に由来する心筋細胞の初期化
対象と方法
１）心筋細胞の単離
生後二日後マウス新生仔（C57/BL6及びC57BL/6-Tg (CAG-EGFP)）から従来法により心室部分を残した心臓を約2mm×2mmの大きさに解剖用ハサミで細切した。それらを0.2% コラゲナーゼ(Collagenase Type ＩＩ, Worthington, アメリカ, PBSに溶解)にて、心筋細胞を解離した。解離した心筋細胞を遠心分離し、10% FBS を添加したDMEM培養液で、37℃、5% CO2の条件で45分間インキュベートした後、上清を再度、同条件でインキュベートし、これを4回行い、線維芽細胞を除去し、心筋細胞を分離した。
２）心筋細胞の初期化
6 cm dishに2×105心筋細胞を撒き、上述したDMEM培地で一週間培養した後、10 μM TGF-βレセプター阻害剤であるSB-431542 (Tocris, アメリカ) か100nM siRNA Cx43またはその両方を含んだ15% FBS、マウスES培地でそれぞれ心筋細胞の初期化選択を行った。
使用したマウスCx43 siRNA配列は、次の通りである。
sense: 5’-CAA UUC CUC CUG CCG CAA TT-3’
antisense: 5’-UUG CGG CAG GAG GAA UUG TT-3’
３）多能性の評価
(i)．ES細胞初期マーカーの細胞免疫染色
10 μM SB-431542 と100nM siRNA Cx43両方添加したES培地条件で選択培養した心筋細胞から約２週間で2個のiPS細胞コロニーが得られた。フィーダー細胞上でマウスES細胞培養条件と同様の条件で培養して増殖したiPS様細胞を免疫染色など及びTeratoma形成確認に用いた。
Alkaline phosphatase (ALP) の測定はAlkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore,アメリカ)により行った。
細胞免疫染色で使用した抗体は、次の通りである。
ウサギ抗Nanog抗体 (200倍希釈、Cosmo Bio. REC-RAB004PF)、ウサギ抗Oct4抗体(500倍希釈、sc-9081)、ヤギ抗Sox2抗体 (200倍希釈、sc-17320)、マウス抗SSEA1抗体(200倍希釈、sc-21702)。
(ii)．Teratoma作製
2×105のiPS様細胞をSCIDマウスの皮下に移植し、5週間後、腫瘍を摘出し、HE染色により、奇形腫を形成するかを組織学的に確認した。
(iii)．キメラマウスの作成
iPS様細胞をICRマウス由来の8細胞期の受精卵に移植した後、ICRマウスに戻し、キメラマウスができるかを確認した。
結果
１．ES初期マーカー遺伝子の発現
本発明で作製したマウス心筋細胞由来の２個のiPS細胞、siPSCs (silencing-induced pluripotent stem cells) が形態的にマウスES細胞コロニーに類似し（図 1a）、ALP活性が確認でき（図 1b）、多能性マーカー因子、Nanog, Oct4, Sox2, SSEA1の発現がタンパク質レベルで確認できた（図 1c）。また、各種多能性マーカー遺伝子の発現が遺伝子レベルでも確認できた（図 1d）。更にEGFPマウス心筋細胞からのiPS様細胞の誘導も確認できた（図 ２）。
２．siPSCsの分化能検証
iPSCsをSCIDマウスの皮下に移植すると５週間後、外胚葉である上皮と神経、中胚葉である筋肉と軟骨、内胚葉である腺管などの三胚葉系の様々な組織からなるTeratomaを形成した（図 1e）。なお、データは示さないが、siPSCsが胚葉体を形成し、分化誘導条件により神経細胞、心筋細胞、内皮細胞へとそれぞれ分化可能なことが確認できた。心筋細胞では拍動と伝導も認められた。また、免疫抗体法、RT-PCRにより、分化誘導を行った細胞では三胚葉マーカー遺伝子に発現がタンパク質レベルと遺伝子レベルで共に確認できた。
３．キメラマウスの作製
本発明で作製したマウス心筋細胞由来の２個のiPS細胞を胚盤胞への注入により、iPS細胞由来の細胞が混在した成体キメラマウスを得ることができたことから、ES細胞と同様の分化万能性を持つと言える（図３）。
本明細書に記載された特許文献および論文は、その全体が本明細書に参考として援用される。
本発明は、ｉＰＳ細胞を安全かつ迅速に調製する方法であるため、今後、ｉＰＳ細胞を臨床上利用する上で、極めて有効な手段を提供するものである。

Claims (11)

  1. コネキシン４３、コネキシン４０、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子と少なくとも１種のＴＧＦβシグナリング抑制因子を心筋細胞に作用させる；又は
    コネキシン４３、コネキシン２６、コネキシン３２、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子と少なくとも１種のＴＧＦβシグナリング抑制因子を新生仔又は新生児から得た細胞に作用させる；
    ことを特徴とするｉＰＳ細胞を作製する方法。
  2. コネキシン抑制因子がコネキシン４３抑制因子である請求項１に記載の方法。
  3. 前記コネキシン抑制因子が、コネキシンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド、抗体もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＴＧＦβシグナリング抑制因子がTGF-βレセプターＩ阻害剤である請求項１に記載の方法。
  5. 前記TGF-βレセプター阻害剤がSB-431542、A-83-01またはALK5 Inhibitorである請求項１に記載の方法。
  6. コネキシン４３、コネキシン２６、コネキシン３２、コネキシン４０、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子を含むｉＰＳ細胞。
  7. コネキシン抑制因子がコネキシン４３抑制因子である請求項６に記載のｉＰＳ細胞。
  8. 前記コネキシン抑制因子が、コネキシンに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド、抗体もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターであることを特徴とする、請求項６に記載のｉＰＳ細胞。
  9. コネキシン４３、コネキシン２６、コネキシン３２、コネキシン４０、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子並びにＴＧＦβシグナリング抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導剤。
  10. コネキシン４３、コネキシン２６、コネキシン３２、コネキシン４０、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子並びにＴＧＦβシグナリング抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導用培地。
  11. コネキシン４３、コネキシン２６、コネキシン３２、コネキシン４０、及びコネキシン４５からなる群より選択されるコネキシンの少なくとも１種に対するコネキシン抑制因子並びにＴＧＦβシグナリング抑制因子を含むｉＰＳ細胞誘導用キット。
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