CN101772572A - 提高神经前体细胞的迁移的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了关于通过增加神经前体细胞中TMEM18蛋白的水平来提高神经前体细胞的迁移的方法。所述方法可用于疾病治疗，其包括神经胶质瘤或神经变性疾病的治疗。

Description

提高神经前体细胞的迁移的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2007年3月23日提交的美国临时专利申请第60/907,187号的优先权，其全部内容在此通过引用方式并入。

技术领域

本发明主要涉及向神经组织内的部位递送神经祖细胞的方法。

背景技术

神经胶质瘤是最常见类型的颅内肿瘤，并且趋向于快速侵入脑中。神经胶质瘤起源于神经胶质细胞，主要起源于星形胶质细胞，并且随着恶性程度的增加分成I～IV级。IV级神经胶质瘤，又称作多形性成胶质细胞瘤(GBM)，包括几乎一半的神经胶质瘤，并且在成年人中是最常见的原发性脑瘤。GBM目前几乎不可治愈。即使使用外科手术、放射疗法和化学疗法，患有GBM的病人通常在大约一年内死亡，仅仅少数病人存活超过3年。因此，对神经胶质瘤的治疗和疗法已成为癌症治疗的主要焦点。

神经胶质瘤是所有癌症中最致命的并且对当前治疗的效果不明显。神经胶质瘤的高致死率可归因于神经胶质瘤细胞侵入周围健康脑组织的能力。神经胶质瘤细胞利用生长因子、蛋白酶以及细胞外基质和细胞表面蛋白的错误调节而获得破坏性的侵入能力(在Tysnes等人，2001；Mueller等人，2003中评述)。

目前的神经胶质瘤的治疗方法的失败主要是由于肿瘤细胞广泛侵入周围健康脑组织从而逃避限局性治疗的这种能力。由于限局性治疗如此无效而全面治疗对脆弱的脑部损害太大，所以优选的方案是找到能够明确定位于肿瘤细胞的治疗方法。

发明内容

在一个方面中，提供了一种提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞的迁移的方法，该方法包括增加神经前体细胞中TMEM18的水平。

在另一个方面中，提供了一种TMEM18的水平增加的神经前体细胞。

在另一个方面中，提供了一种包含TMEM18的水平增加的神经前体细胞的药物组合物。

在另一个方面中，提供了TMEM18的水平增加的神经前体细胞用于治疗神经疾病的用途，包括TMEM18的水平增加的神经前体细胞在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。

在本发明不同方面的各种实施方式中，TMEM18可包含SEQ ID NO.：1～SEQ ID NO.：5中任一项所述的氨基酸序列。

所述神经前体细胞可来自胚胎干细胞或来自神经组织。神经前体细胞可被修饰包括标记分子或治疗剂。神经前体细胞可包含编码TMEM18的表达载体，并且可包含编码治疗性蛋白或肽的表达载体。因此，所述神经前体细胞可用于治疗神经疾病。

所述分泌神经前体趋化因子的细胞可为神经胶质瘤细胞或位于神经组织变性部位的细胞。

神经前体趋化因子可包括基质细胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白、细胞因子干细胞因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子或成纤维细胞生长因子。

增加TMEM18的水平可包括提高神经前体细胞中天然TMEM18的表达水平或者在神经前体细胞中由表达载体表达重组TMEM18。

当前描述的方法可进一步包括将神经前体细胞递送到包括分泌神经前体趋化因子的细胞的细胞群体中。该细胞群体可为体外或体内。递送可包括外科植入或注射。

结合附图，根据发明的具体实施方式的以下说明，对本领域普通技术人员而言，本发明的其它方面和特点是明显的。

附图说明

在图中，只通过实施例说明本发明的实施方式：

图1：鉴定作为调节神经前体细胞向神经胶质瘤细胞迁移的基因的TMEM18。(A)用来识别能够促进神经前体细胞向神经胶质瘤细胞迁移的蛋白的cDNA文库筛选的流程图。用携带cDNA文库的逆转录病毒感染人神经前体细胞系，NT2。将被感染细胞平板接种到神经胶质瘤细胞培养物上面的transwell迁移小室上。收集能够通过小室的孔迁移到小室的膜的相对位置的神经前体细胞并使其经过两次以上的相同的迁移实验。通过PCR克隆迁移细胞中的病毒引入的cDNA并测序。(B)TMpred程序预测TMEM18具有四个跨膜α-螺旋(Hofman和Stoffel，1993)。用TMpred图覆盖TMEM18蛋白质结构的示意性判读来图解程序的结果。(C)序列比对人的TMEM18蛋白[SEQ IDNO.1]、小鼠的TMEM18蛋白[SEQ ID NO.2]、大鼠的TMEM18蛋白[SEQ IDNO.3]、狗的TMEM18蛋白[SEQ ID NO.4]和鸡的TMEM18蛋白[SEQ ID NO.5]。星号(*)表示氨基酸完全保守而冒号(：)表示序列中的一个氨基酸不同。注意，狗的序列中仅显示了[SEQ ID NO.：4]的C末端部分。加下划线的粗体序列表示由PredictNLS程序(Cokol等人2000)预测的可能的核定位信号肽。

图2：稳定的超量表达TMEM18的神经前体细胞系。

通过在NT2细胞和C17.2细胞中进行常规RT-PCR(A，D)以及定量实时RT-PCR(B，E)检测慢病毒属引入的TMEM18的超量表达。结果显示不受感染的亲本细胞(对照)、空病毒感染的对照细胞(载体对照)和两种神经前体细胞的每个类型的两个群体(TMEM18A和B)。为了实时RT-PCR分析，使用β-肌动蛋白mRNA表达使TMEM18mRNA的表达标准化。(C)显示NT2细胞中TMEM18的超量表达的免疫染色。

图3：TMEM18的超量表达提高了神经前体细胞的迁移活性。(A，B)进行评价TMEM18对非特异性细胞运动的影响的划痕实验的结果。以相同密度平板接种NT2(A)和C17.2(B)细胞并且通过用移液管头刮而除去一层细胞。刮后24小时，检查空区域的恢复。(C，D)评价TMEM18对神经前体细胞的神经胶质瘤特异性迁移的影响的Transwell迁移实验。(C)NT2细胞向U87和H4神经胶质瘤细胞系与NIH3T3和293T非神经胶质瘤细胞系的迁移。(D)C17.2细胞向U87和C6神经胶质瘤细胞系的迁移。结果呈现出与用对照病毒转导的细胞相比的的成倍差别。使用t检验计算超量表达TMEM18的细胞与载体对照间的统计比较。一个星号(*)、两个星号(**)和三个星号(***)分别表示小于0.10、0.05和0.01的p值。

图4：在大鼠脑中TMEM18的超量表达提高了C17.2神经前体细胞向C6神经胶质瘤细胞的迁移活性。将超量表达绿色荧光染料标记的TMEM18的C17.2细胞与红色荧光染料标记的载体对照的C17.2细胞混合并注射到与C6神经胶质瘤接种部位(右)对侧的大鼠脑部的左侧。两周后，在荧光显微镜下对脑部切片以进行细胞迁移检查。在A和B中的右侧的正方形表示细胞向肿瘤迁移的前面，其在C和D中高倍放大显示。E为C和D的合并图像。黄点表示绿色和红色荧光染料标记的细胞运动到一起。注意，许多超量表达绿色荧光染料标记的TMEM18的C17.2细胞(箭头)单独迁移。

图5：内源TMEM18表达的基因抑制(Knockdown)抑制细胞迁移。(A，B)如实时PCR定量所示，针对TMEM18转录物的短干扰RNA降低了内源TMEM18在NT2和C17.2细胞中的表达。在NT2细胞中检测针对TMEM18的短干扰RNA的两种不同序列并得出TMEM18mRNA的四种不同的基因抑制水平。使用针对萤光素酶的siRNA作为对照。(C，D)TMEM18表达水平的下降同时降低了神经前体细胞向DMEM和U87MG的迁移活性。

图6：TMEM18蛋白显示了覆盖核与胞质结构的定位形式。(A)使用免疫前血清(前血清)以及在超量表达细胞系与不受感染的和空病毒感染的对照NT2细胞中的TMEM18抗体血清通过免疫荧光实验研究针对TMEM18肽制成的抗体的特异性。用罗丹明显示TMEM18而用DAPI显示DNA。(B)为了更加精确地在细胞中定位TMEM18蛋白，对NT2细胞的TMEM18(1)、DNA(2)和α-微管蛋白(4)进行染色。TMEM18与DNA间的覆盖(Overlay)(3)显示TMEM18抗体识别核膜(在核周围的环)，而TMEM18与α-微管蛋白间的覆盖(5)显示TMEM18也定位在核的外部，进入细胞质。全部TMEM18、DNA和α-微管蛋白的重叠示于(6)中。(C)具有TMEM18的N端的GFP融合蛋白局限于核内。用表达GFP、连接有HIV TAT的GFP或连接有TMEM18N端的GFP的质粒载体转染U87细胞。左侧和右侧分别为相同细胞的光学显微镜图像和荧光显微镜图像。

具体实施方式

神经干细胞和前体细胞能够迁移到脑肿瘤部位，这使其成为用于神经胶质瘤治疗的有吸引力的工具。

为了提高神经前体细胞追踪神经胶质瘤的能力，本发明人进行了cDNA文库表达筛选来鉴定一旦超量表达就会提高神经前体细胞对神经胶质瘤的向性的候选基因。功能未经宣布的编码跨膜蛋白18(TMEM18)的基因被鉴定为这样一种基因。发明人然后发现，TMEM18在神经前体细胞中的超量表达提高了这些细胞向神经胶质瘤细胞(体外和体内)迁移的能力。本发明利用这一发现提供了提高神经前体细胞迁移的方法。

TMEM18在人体内是一种140个氨基酸的小蛋白质，并且被推测为具有核定位信号的跨膜蛋白。TMEM18的超量表达赋予神经前体细胞具有提高的向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的能力。

TMEM18在发现新的表达的全长开放读码框的筛选中首次被鉴定(Hofmann和Stoffel，1993)。由于发明人意识到关于该蛋白没有其他公布。现在，发明人已鉴定了TMEM18为神经前体细胞运动性的重要因素。神经前体细胞中内源TMEM18基因的功能性失活导致这些细胞的迁移活性丧失。因此，出现了神经前体细胞的迁移性需要TMEM18的表达并且该基因的超量表达可有利地用于提高这些细胞对神经胶质瘤的向性。特别是，TMEM18充当指向神经胶质瘤迁移的特定增强子。

TMEM18的功能重要性突出显示于在全部哺乳动物到甚至多细胞真核生物的低等形式中强氨基酸保守。此外，根据TMEM18表达序列标签的图谱，在大多数成年人组织中和在胚胎发育期转录该蛋白(在NCBI’s ESTexpression profile viewer检索中发现)。

如上所述，神经前体细胞具有对包括神经胶质瘤的脑损伤的部位的内在向性。如Benedetti等人和Aboody等人首次显示，移入的初级和无限增殖化神经前体细胞可用于动物模型中神经胶质瘤的基因疗法中(Benedetti等人，2000；Aboody等人，2000)。这些移入的神经前体细胞已揭示出在神经胶质瘤存在时经由健康脑内现存的迁移途径以及非典型的途径散开(Aboody等人，2000；Flax等人，1998)。除初级和无限增殖化神经干细胞之外，源自胚胎干细胞的神经祖细胞对神经胶质瘤细胞追踪似乎具有相同的能力(Arnhold等人，2003)。而且，神经干细胞不仅能够定位于神经胶质瘤而且能够定位于非神经元起源的肿瘤，这说明这种追踪能力可取决于在肿瘤部位分泌的一般因子(Brown等人，2004；Allport等人，2004)。

已研究了引导神经前体细胞到神经胶质瘤的线索。吸引神经前体细胞到脑损伤和肿瘤部位的明显候选信号为炎症处释放的因子。已揭示脑内发现的免疫反应性细胞类型(小胶质细胞)释放使神经前体细胞移动的因子(Aarum等人，2003)。细胞因子是炎症处释放的小蛋白质，包括小胶质细胞的脑内所有细胞类型表达它们。已揭示细胞因子为脑发育期间的神经干细胞迁移提供线索(在Tran和Miller，2003中评述)。已揭示基质细胞衍生因子1(SDF-1)趋化因子吸引神经干细胞，并且在SDF-1的受体CX趋化因子受体4被阻断时，其阻止神经干细胞迁移到损伤部位(Allport等人，2004；Ehtesham等人，2004；Imitola等人，2004)。同样，趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)也可激活神经干细胞的迁移，肿瘤坏死因子α可诱导其表达(Widera等人，2004)。细胞因子干细胞因子也作为神经干细胞的吸引剂，其由神经胶质瘤细胞系表达并在脑损伤部位神经元内被超量表达(Erlandsson等人，2004；Sun等人，2004；Serfozo等人，2006)。由于已揭示表皮生长因子受体和血管内皮生长因子介导的信号发送可增强神经干细胞迁移，与促进神经胶质瘤细胞迁移类似，生长因子也促进神经前体细胞迁移(Boockvar等人，2003；Schmidt等人，2005)。神经胶质瘤发病主要取决于细胞修饰细胞外基质的能力，并且有趣地是，已揭示分泌细胞外基质的神经胶质瘤细胞系也能够促进神经干细胞的运动性(Ziu等人，2006)。

因此，提供一种提高神经前体细胞迁移的方法。该方法涉及增加神经前体细胞中TMEM18蛋白的水平。然后可将神经前体细胞递送到存在可包括分泌神经前体细胞趋化因子的细胞(包括神经胶质瘤细胞)的细胞群体的区域。

本文所用术语“神经前体”细胞与术语“神经祖”细胞和“神经干”细胞交替使用，其指没有完全分化成特定神经细胞类型而可具有变成神经细胞类型的能力的细胞。因此，本文所用的“神经前体细胞”指未分化或部分未分化的细胞，并且该细胞可分裂增殖产生未分化或部分未分化的细胞，或者该细胞可分化产生一种或两种分化的或特异性神经细胞。神经前体细胞包括：未分化的干细胞(包括胚胎干细胞)，该细胞可分裂产生两种未分化细胞或一种未分化细胞和一种分化细胞；或者部分分化的前体细胞，该细胞可分裂产生两种部分分化的细胞或两种分化的细胞。神经前体细胞可为多能的，这意味着该细胞能够自我更新以及在分化时转分化成几种类型的神经细胞。

前体细胞可从多种来源得到，包括但不限于，神经组织、神经元组织以及包括胚胎干细胞的胚细胞。前体细胞可来自包括哺乳动物的任何动物，且特别是啮齿动物或人。在用于治疗被试者时，本发明的方法中使用的前体细胞可为被试者产生的(自体的)或来自相同物种的供体(同种异体的)或来自不同物种的供体(异种的)。如果前体细胞是异种的，则该细胞优选为裸细胞(nudecell)，即为已被修饰为不表达或具有减小或最低限度表达在被治疗的被试者中将诱导免疫反应的表面抗原的细胞。

除非另外指定，本文所用术语“细胞”是指并包括上下文允许的单细胞、多细胞或细胞群体。细胞可为体外细胞(包括从被试者移植的细胞)，或者其可为体内细胞。同样地，除非另外指定，细胞的含义还包括上下文允许的单细胞的含义。

神经前体细胞中TMEM18水平的增加提高了神经前体细胞向神经胶质瘤细胞迁移的能力。神经胶质瘤细胞可为任何神经胶质瘤细胞，包括I～IV级神经胶质瘤，包括如多形性成胶质细胞瘤的成胶质细胞瘤。

如上所述，细胞运动性部分依赖于细胞沿着化学引诱物梯度的运动。因此，在没有限定到任何特定理论的情况下，TMEM18似乎有助于神经前体细胞沿着如吸引神经前体细胞的细胞因子的因子的化学梯度迁移的能力。该化学梯度可由神经胶质瘤细胞分泌的一种或多种因子产生。因此，TMEM18应指引沿着由分泌神经前体细胞趋化因子的任何细胞产生的梯度迁移。

因此，在本方法中，神经前体细胞中TMEM18水平的增加可以提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的任何细胞的迁移。“神经前体细胞趋化因子”指在置于某一浓度梯度时促使神经前体细胞沿着该梯度向浓度增加的分子迁移的任何分子，包括细胞因子。

已知的吸引神经前体的因子包括基质细胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白、细胞因子干细胞因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子或成纤维细胞生长因子。

分泌该因子的细胞可产生该因子，其为天然地细胞内的致癌或致瘤事件的结果，或者为遗传修饰的结果，例如用指导这种因子表达的核酸分子转化或转染该细胞。同样，分泌该因子的细胞可产生该因子，其为对肿瘤细胞的免疫原性应答的结果。此外，已揭示了神经前体细胞向脑内创伤或损伤部位迁移；当注射到脑组织中时，神经前体细胞将趋向迁移到被损坏的区域而后可分化成具体神经细胞类型，例如神经元和支持神经元的神经胶质细胞。因此，分泌该因子的细胞还可为创伤或损伤部位的细胞，所述部位包括如在包括神经变性疾病中看到的神经组织变性部位，所述神经变性疾病包括帕金森氏症、中风损伤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨延顿氏症。

在本方法中，通过增加TMEM18的水平提高了神经前体细胞的迁移。神经前体细胞可表达内源TMEM18，说明该细胞具有编码和表达TMEM18的天然基因。因此，本文所用术语“增加(动词)”、“增加(动名词)”或“增加(名词)”指将神经前体细胞内TMEM18的水平提高至高于在不增加的情况下细胞中看到的正常水平。

增加TMEM18的水平包括通过化学方法或通过遗传方法调节天然内源TMEM18的表达水平，所述方法包括通过暴露于提高TMEM18表达的化学药品或化合物或者通过引入编码致使神经前体细胞中天然TMEM18的表达增加的调节因子的核酸分子或表达盒。

增加神经前体细胞中TMEM18的水平还包括遗传修饰神经前体细胞使其包括编码TMEM18的核酸分子，所述核酸分子包括含有TMEM18编码区的表达盒。将理解的是，对于要在遗传修饰的神经前体细胞中表达的TMEM18而言，该核酸分子将包含可操作地连接到实现表达所需要的必需的调节区(包括适合的天然或异源启动子区和任选地增强子元件)的TMEM18的编码区。如上所述，神经前体细胞可以已经表达TMEM18，因此，编码TMEM18的核酸分子可被设计成在神经前体细胞中以高于天然表达水平的水平表达TMEM18。

使用本领域已知的分子生物学和克隆方法可以实现遗传修饰。例如，可以用设计成由天然或异源启动子表达TMEM18的载体转化或转染前体细胞，并且该启动子可为组成型、瞬时型或诱导型启动子，且可以以基础表达水平或提高的表达水平指导表达。适合的载体包括细菌质粒或包括病毒基因组的病毒载体。例如，可以使用杆状病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。

使用遗传修饰技术表达的TMEM18蛋白可为任何TMEM18蛋白，该蛋白在以增加的水平在神经前体细胞中表达时，即将神经前体细胞中TMEM18的总水平提高到高于在该细胞内TMEM18的天然表达水平，其将提高神经前体细胞向分泌神经前体趋化因子的细胞迁移的能力。

人TMEM18蛋白(如NCBI登录号.NP_690047.2中所述)具有氨基酸序列：

MPSAFSVSSFPVSIPAVLTQTDWTEPWLMGLATFHALCVLLTCLSSRSYRLQIGHFLCLVILVYCAEYINEAAAMNWRLFSKYQYFDSRGMFISIVFSAPLLVNAMIIVVMWVWKTLNVMTDLKNAQERRKEKKRRRKED[SEQ ID NO.：1]

小鼠TMEM18蛋白(如NCBI登录号.NP_742046.1中所述)具有氨基酸序列：

METDWTEPWLLGLLAFHLLCLLLTCFSSQRYKLQIGHFLCLVVLVYSAEYINEVAAVNWRLFSKYQYFDSRGMFISLVFSAPLLFNAMLIVIMWVRKTLTVMTDLKTLQEERKERRRRRKEE[SEQ ID NO.：2]

大鼠TMEM18蛋白(如NCBI登录号.NP_001007749.1中所述)具有氨基酸序列：

MASPYSVRVFPVSIPAVIMETDWTEPWLLGLLAFHLLCLLLTCFSAQRYKLQIGHFLCLVVLVYCAEYINEVAAMNWRLFAKYQYFDSRGMFISLVFSAPLLFNAMVIVIMWVRKTLTVMSDLKNLQERRKERKRRRKEE[SEQ ID NO.：3]

狗TMEM18蛋白(如NCBI登录号.XP_848731.1中所述)具有氨基酸序列：

MCEWCCWQRPYAYLLSARDDFRCEGYGGPTKLRAPSLCITAPVEAACARVADPLSSSNGRLPARHRERSPRNFKLTGDVSVQRGLEHRKTGGKLPSQEARVPACLLLHHRGREGAADTLPQDHEWAVFCEWRLQERLARARARTTGASVTVPIPAILGVHRPVTQTHRVSPSGLAVAQRPPRSQELCGLQHPARERSGGDALHERVVPRPGACCHLLPPGETATGPVHTGSPTPVRLGTRAGQESGPGPNTRDTSHLRGAPFRNPTCRDAVPPPWGPLLRRVLPRLRLGPRPQTDWTEPWLLGLAVFHVLCLLLTCLSSQRYKLQVGHFLCLVILVYCAEYINEIAAMNWRLFSKYQYFDSRGMFISIVFSAPLLLNAMIIVILWVRKTLNVMTDLKTLQEKRRERKRKEE[SEQ ID NO.：4]

鸡TMEM18蛋白(如NCBI登录号.NP_001012716.1中所述)具有氨基酸序列：

MVSLAIWASSREASAVRMRSVAVAMEQPLHGPPGLSTILARTDWAEPWLLGLAGFHVLCFLLTCF SFQHYRVQIGHFLCMVCLVYCAEYINELAAMNWRLFSKYQYFDSRGMFISLVFSAPLLVNTIIIVVNWVYRTLNVMTELKTLQQRIKAEKDKKK[SEQ ID NO.：5]

美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索程序搜索同源蛋白质序列(同源基因(Homologene))也定位了从果蝇(D.melanogaster)到水稻(O.sativa)的同源序列。

因此，本文所用术语“TMEM18蛋白”指任何TMEM18蛋白并且包括TMEM18的同系物，以及能够提高神经前体细胞向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的任何衍生物、变体或其片段。如果两个序列在指定区域内具有基本同一性并且序列的功能活性是保守的，则某一多核苷酸序列或多肽序列是另一序列的“同系物”或者与另一序列是“同源的”，(本文中所用术语‘同源的’不意指进化关联)。如果在最佳比对(允许有间隙)时，两个多核苷酸序列或多肽序列共有至少大约50％的序列同一性，或者如果序列共有定义的功能基序，则多核苷酸序列或多肽序列被认为具有基本同一性。在另外的实施方式中，如果最佳比对序列在指定区域共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，则最佳比对序列可被认为基本相同(即具有基本同一性)。在同源性的指定区域内，“无关的”或“非同源的”序列与本发明的多肽或多核苷酸共有低于40％的同一性，但优选为低于约25％的同一性。术语“同一性”和“相同的”指两个肽或两个多核苷酸分子间的序列相似性。可以通过比较比对序列中的每个位置确定同一性。氨基酸序列间的同一性程度是在序列共有位置处(即在指定区域)的相同氨基酸或匹配氨基酸的函数。为了比较同一性，可以使用本领域已知的各种算法进行序列的最佳比对，包括在http://clustalw.genome.ad.jp可得到的ClustalW程序，Smith和Waterman的局部同源性算法，1981，Adv.Appl.Math 2：482，Needleman和Wunsch的同源性比对算法，1970，J.Mol.Biol.48：443，Pearson和Lipman的相似性方法的搜索，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，以及对这些算法的计算机化执行(例如Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)。如Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-10中所述，序列同一性也可使用BLAST算法确定(使用公布的默认设置)。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心得到(通过互联网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

TMEM18的变体或衍生物指保留了提高神经前体细胞向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的能力的单独或在融合或嵌合蛋白中包含的片段，或一个或多个氨基酸已突变(包括点、插入或缺失突变)但仍保留有指导神经前体细胞向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的能力的TMEM 18蛋白，以及能够模仿TMEM 18生物活性的非肽和肽类似物。变体或衍生因此包括：缺失，包括平截和片段；插入和添加，包括标记多肽和融合蛋白；置换，例如，保守置换、定点突变体和等位变体；以及修饰，包括具有一个或多个共价连接到肽的非氨酰基(请参阅，糖、脂等)的类肽和翻译后修饰。本文所用术语“保守氨基酸置换”或“保守置换”指在肽中在给定位置将一个氨基酸置换成另一个氨基酸，其中该置换可在相关功能没有基本丧失的情况下进行。在进行这些改变时，可基于侧链取代基的相对相似性进行相似氨基酸残基的置换，例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等等，并且通过常规测试可以检测这种置换对肽的功能的影响。保守变化还可以包括，例如，通过氨基酸的功能侧基的反应，将非衍生残基置换成化学衍生部分。

变体和衍生物可被制备，例如，通过在TMEM18蛋白或其片段的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基并进行生物活性筛选。优选地，用保守氨基酸残基(即，具有相似物理、生物或化学性质的残基)进行置换。技术人员将理解，如何使用标准分子生物学技术和方法(例如在Sambrook等人((2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3^rd ed.，ColdSpring Harbour Laboratory Press)中所述)得到这些衍生物或变体，以及如何检测这些衍生物或变体指导神经前体细胞向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的能力，包括使用本文实例中所述的技术。

在各种实施方式中，TMEM18包含[SEQ ID NO.：1]～[SEQ ID NO.5]中任一项的氨基酸序列。特别是，TMEM18包含[SEQ ID NO.：1]的氨基酸序列。

在各种实施方式中，TMEM18主要由[SEQ ID NO.：1]～[SEQ ID NO.5]中任一项的氨基酸序列组成。特别是，TMEM18主要由[SEQ ID NO.：1]的氨基酸序列组成。本文所用“主要由…组成”或“主要由…组成的”表示序列包括位于所述序列的一端或两端的一个或多个氨基酸，但添加的氨基酸并没有在实质上影响TMEM 18蛋白指导神经前体细胞向神经胶质瘤或向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的功能。例如，主要由上述序列之一组成的TMEM 18蛋白可在所述序列的一端或两端具有一个、二个、三个、五个或十个氨基酸，条件是这种蛋白质仍具有指导神经前体细胞向神经胶质瘤细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的能力。

在各种实施方式中，TMEM18由[SEQ ID NO.：1]～[SEQ ID NO.5]中任一项的氨基酸序列组成。特别是，TMEM18由[SEQ ID NO.：1]的氨基酸序列组成。

因此，通过增加神经前体细胞中TMEM18的水平，包括通过遗传修饰神经前体细胞(用指导TMEM18表达的表达载体转染细胞)，神经前体细胞沿着增加的趋化因子梯度迁移的能力被提高了。迁移的“提高(动名词)”或“提高(名词)”是指与TMEM18的水平没有增加的速度相比，神经前体细胞迁移速度的提高。迁移的提高(动名词)或提高(名词)也指与在TMEM18的水平没有增加的情况下迁移的群体的比例相比，在神经前体细胞内将迁移的细胞群体的比例的增加。

在根据适合增加神经前体细胞中TMEM 18的水平的条件下和时间内，神经前体细胞可在体外培养从而以增加的水平表达TMEM 18。正如将要理解的，如需要，神经前体细胞可以在一定温度下在适合的培养基中体外生长一段时间，上述条件通常维持神经前体细胞并可允许神经前体细胞群体扩大。生长条件可以没有吸引神经前体细胞的趋化因子。在表达载体中使用诱导型启动子以实现TMEM 18水平的增加的情况下，该生长条件将包括诱导TMEM 18基因表达所需的任何条件，包括任何化学物质或化合物、温度、光的波长或级别。

该方法可进一步包括将TMEM 18的水平增加的神经前体细胞递送到包括如上所述的分泌神经前体趋化因子的细胞的细胞群体中。在一个实施方式中，将神经前体细胞递送到其中的细胞群体包括神经胶质瘤细胞。在另一个实施方式中，将神经前体细胞递送到其中的细胞群体包括神经变性部位的细胞，例如神经变性疾病(包括帕金森氏症、中风损伤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨延顿氏症)中的神经变性部位。

将神经前体细胞递送到其中的细胞群体可为体外细胞培养物或者可为被试者内的体内细胞群体。

因此，在将TMEM18的水平增加的神经前体细胞递送到体内细胞群体中时，当前所述的方法包括治疗神经疾病(包括神经胶质瘤或神经变性疾病)的方法。

所述神经疾病可为神经组织的任何疾病、病症、创伤、损伤或损害，其可通过施用神经前体细胞治疗或修复，并且其可包括神经胶质瘤或神经变性疾病。

所述神经胶质瘤可为任何神经胶质瘤，包括如上所述的神经胶质瘤。就是说，该神经胶质瘤可为I～IV级神经胶质瘤，包括多形性成胶质细胞瘤。

所述神经变性疾病可为以神经组织的恶化为特征的任何疾病，并且包括帕金森氏症、中风损伤、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿氏症。

“治疗”神经胶质瘤或神经变性疾病指获得有益的或所需的效果(包括临床效果)的途径。有益的或所需的临床效果可包括但不限于，一种或多种症状或病情的缓解或改善，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定，疾病发展的预防，疾病蔓延的预防，疾病进程的延迟或慢化，疾病状态的改善或减轻，以及好转(部分或全部)。“治疗”也可意味着延长了被试者的生存时间使其超过在没有治疗的情况下预期的生存时间。“治疗”还可意味着抑制疾病的进展暂时慢化疾病的进展，虽然更优选地，其包括使疾病的进展永远停止。

所述被试者可为需要治疗(包括需要神经胶质瘤或神经变性疾病治疗)的任何被试者。该被试者可为任何动物，包括哺乳动物，特别是人。

所述神经前体细胞通过递送到分泌神经前体细胞趋化因子的细胞附近范围内的部位而被施用，其包括神经胶质瘤细胞或位于神经组织变性部位的细胞或该细胞附近范围内以及使神经前体细胞前往神经胶质瘤细胞或神经组织变性部位的细胞的部位的距离以内的细胞。体内递送可使用本领域已知的方法完成，包括通过手术植入或通过注射。

向被试者施用有效量的TMEM18的水平增加的神经前体细胞。本文所用术语“有效量”指为实现预期的效果(例如，治疗神经胶质瘤或神经变性疾病)所需的剂量和时段的有效的量。

要施用的总的神经前体细胞的数量会根据几个因素改变，包括神经胶质瘤或神经组织变性部位的严重程度和大小，神经胶质瘤已侵入到周围健康组织的程度，施用的细胞类型，施用方式，以及被试者的年龄和健康状况。

将要理解的是，可以施用TMEM18的水平增加的神经前体细胞并结合其它治疗或疗法(包括药物疗法、化学疗法、放射疗法和手术)治疗神经胶质瘤或神经变性疾病。

在体内施用时，神经前体细胞还可被修饰为包括标记分子，从而一旦神经前体细胞已经向被试者脑内的神经胶质瘤细胞或神经组织变性部位迁移就会检测到或看到它。例如，神经前体细胞可被修饰为包括放射性标记，或者神经前体细胞被遗传修饰为包括一个或多个编码标记蛋白或肽的核酸分子，例如编码绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或萤光素酶的核酸分子，包括作为融合蛋白的一部分。

或者，神经前体细胞可被修饰为包括一种或多种将要在被试者内被递送到神经胶质瘤细胞部位或神经组织变性部位的附加治疗剂。例如，神经前体细胞可被遗传修饰为包括编码治疗剂的核酸分子，例如要在神经胶质瘤细胞部位或神经组织变性部位分泌的蛋白。将理解的是，所述核酸可包括治疗性蛋白或肽的编码区以及在细胞中实现该治疗性蛋白或肽的表达的必需的调节区。所述调节区包括适合的启动子区(例如天然或异源启动子)，以及任选的增强子元件。例如，载体(包括用于在神经前体细胞中表达TMEM18的载体)可被设计为表达治疗性蛋白或肽。

所述治疗性蛋白或肽为这样一种蛋白或肽：其当在前体细胞中表达时，对前体细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞具有治疗作用，或者在前体细胞或分泌神经前体细胞趋化因子的细胞内实现所需的效果。例如，神经前体细胞可被修饰为分泌指引免疫细胞到神经胶质瘤部位的细胞因子，例如白细胞介素-23，或者神经前体细胞可被修饰为表达自杀基因，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。

关于神经胶质瘤或神经变性疾病，虽然已经描述了以上治疗方法，将要理解的是，该方法可适用于治疗其中可利用神经前体细胞沿着趋化因子梯度的迁移而向需要治疗的神经组织内的部位递送神经前体细胞的任何疾病。

除了上述方法之外，如上所述，还考虑了TMEM18的水平增加的神经前体细胞。在某些实施方式中，所述神经前体细胞包括编码TMEM18的表达载体。

因此，当前提供了一种神经前体细胞，其包含编码TMEM18的重组核酸分子，并因此将该神经前体细胞遗传修饰以表达增加水平的TMEM18。所述神经前体细胞可进一步包括标记分子。该神经前体细胞可进一步包括核酸分子，包括表达载体(编码一种或多种治疗性蛋白或肽)。

为了有助于向被试者施用这种神经前体细胞，例如需要神经胶质瘤或神经变性疾病治疗的被试者，可以将TMEM18的水平增加的神经前体细胞配制成药物组合物中的成分。

因此，提供了一种药物组合物，其包含TMEM18的水平增加的神经前体细胞。所述药物组合物可进一步包括药学上可接受的稀释剂或载体。因此本发明的一个方面还包括这种药物组合物用于治疗神经胶质瘤或神经变性疾病的用途。所述组合物通常可包含药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种相容性载体。对于递送的全部形式，可以将神经前体细胞配制到生理盐溶液中。

所述药物组合物可另外包含用于治疗神经胶质瘤或神经变性疾病的其它治疗剂。此外，所述药物组合物可包含当在被试者内递送到神经胶质瘤或神经组织变性部位时促进细胞存活并诱导神经前体细胞的增殖或分化的生长因子或细胞因子。

所述药学上可接受的稀释剂或载体的比例和特征通过所选的施用途径、与活细胞的相容性以及标准药学实践来确定。通常，用不会杀死或明显损害活神经前体细胞的生物学特性的成分配制所述药物组合物。

所述药物组合物可通过用于制备适合向被试者施用的药学上可接受的组合物的已知方法而制备，以使有效量的神经前体细胞和任何附加的活性物质与药学上可接受的载体组合成混合物。例如，在雷明顿氏药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)中描述了适合的载体。在此基础上，该组合物包括，但不限于，与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂联合且包含在具有适合的pH值且与生理液体等渗的缓冲溶液中的神经前体细胞溶液。

所述神经前体细胞溶液因此可在生理和药理上适合的缓冲系统中制备。在储藏和使用的普通条件下，这些制品包含防止微生物生长且将使细胞保持生活状态的防腐剂。本领域技术人员会知道如何制备适合的制剂。例如，在雷明顿氏药物科学中和在美国药典(1999年出版的国家处方集(USP 24 NF19))中描述了选择和制备适合的制剂的常规程序和成分。

正如本领域技术人员将理解的，根据所选的施用途径，所述药物组合物可以以多种形式向被试者施用。本发明的组合物可以通过手术或通过注射施用到所需部位。

在不同的实施方式中，可通过注射(皮下注射、静脉注射、肌肉注射等)直接在所需部位施用该组合物，例如在被试者的脑内的神经胶质瘤或神经组织变性附近范围以内，包括例如颅内注射。

所使用的药物组合物的剂量取决于被治疗的特定神经胶质瘤或神经变性疾病，病情的严重程度，个别患者的参数(包括年龄、身体状况，大小和重量)，治疗的持续时间，治疗的并发性(如有)，施用的具体途径以及在保健医生的知识和技能的范围内的其它类似因素。这些因素是本领域技术人员已知的并且可以用最小的常规实验处理。

通过下列非限定性的实施例进一步说明本方法和用途。

实施例

实施例1

这项研究设计用来鉴定能够用于神经前体细胞的生物工程以实现提高追踪神经胶质瘤细胞或分泌吸引神经前体细胞的趋化因子的细胞的能力的新的蛋白质。然后，这种遗传修饰可有助于使用神经前体细胞作为能够到达分散的疾病部位(包括分散的神经胶质瘤细胞)的疾病治疗载体。

cDNA文库筛选方法用于发现新的蛋白质，该蛋白质能够在超量表达时在transwell迁移实验中特异性增强神经元干细胞向神经胶质瘤细胞迁移。先前没有确定特性的蛋白跨膜蛋白18(TMEM18)从筛选中出现成为一种增强神经前体细胞的神经胶质瘤趋向的潜在的候选者。然后，TMEM18的特性被确定为通常细胞运动性的内源调节子并且其的确可以赋予神经前体细胞对神经胶质瘤细胞定向迁移的提高的偏好。

材料和方法

细胞和病毒：NT2、U87MG、H4和NIH3T3细胞系购自ATCC(美国菌种保藏中心，美国)以及293FT细胞购自Invitrogen。所有预先的细胞系维持在补充有10％胎牛血清(Gibco)、青霉素-链霉素(Gibco)、normoxin(Invivogen)和非必需的氨基酸(Gibco)的DMEM中。C17.2细胞维持在补充有10％胎牛血清(Gibco)、5％马血清(Gibco)、青霉素-链霉素(Gibco)、normoxin(Invivogen)和非必需的氨基酸(Gibco)的DMEM中。

包含逆转录病毒上清的人的Daudi细胞cDNA文库购自Stratagene并且按照供应商的建议进行感染和维持。使用下列引物通过PCR从人的Daudi细胞cDNA文库感染的细胞中克隆TMEM18并且将该PCR产物随后克隆到pLenti6/V5-TOPO载体(Invitrogen)中：5’CACCATGCCGTCCGCCTTCTCTG[SEQ ID NO.：6]和5’AAAGTCTTCTTTCCTTCTCCTTTTC[SEQ ID NO.：7]。序列测定用于确保该克隆序列是正确的(Research Biolabs)。TMEM18A病毒包含在103位点从丙氨酸到苏氨酸的一个氨基酸突变，这在后来的试验中似乎没有任何效果。使用VIRAPOWER^TM慢病毒定向

表达试剂盒和病毒产品制造空的慢病毒和TMEM18慢病毒。按照制造商(Invitrogen)建议，进行细胞感染、选择和细胞维持。

Boyden小室实验：使用Boyden小室实验检测神经前体细胞向神经胶质瘤细胞的体外迁移。利用购自BD Falcon的具有24孔细胞培养板的迁移试剂盒。通过8μm孔的小室膜将培养板的每个孔分成两个小室。在实验前一天，将50,000个神经胶质瘤细胞接种到每个下部小室。第二天，移除下部小室中的细胞培养基并替换为500μl的未补充的DMEM。然后，将神经前体细胞(50,000个于500μl的未补充的DMEM)接种到上部小室。在37℃孵育12或24小时之后，通过胰酶消化(trypsination)分离小室膜底部上的迁移细胞和该膜上面的未迁移细胞。随后使用CYQUANT^TM细胞增殖检测试剂盒(分子探针)将这些细胞溶解并染色。使用荧光板计数器(Tecan GENios pro)测量荧光。结果表示为迁移细胞与未迁移细胞的数量的比(以任意单位(AU))。显示6到12个孔的平均值和标准差。使用t检测进行统计分析。

cDNA文库筛选：用cDNA文库逆转录病毒上清感染一百万个NT2细胞(详见细胞和病毒部分)得到20％的感染效率以确保文库中所有cDNA完全呈现。使细胞恢复4天，其后使它们通过如先前所述的transwell迁移实验。收集迁移细胞并使其恢复5天，其后使它们通过第二迁移实验，收集它们并使其恢复5天。在第三迁移实验之后，收集未迁移细胞和迁移细胞并使其静置恢复。

按照制造商的建议，使用DNEASY^TM试剂盒(Qiagen)从未迁移细胞和迁移细胞中收集染色体DNA。使用VIRAPORT^TM手册(Stratagene)中建议的病毒PCR规程和引物重获逆转录病毒引入的序列。在未迁移细胞和迁移细胞的PCR中使用相同量的染色体DNA。在使用TA-克隆试剂盒(Qiagen)将PCR产物克隆到pDrive之前，通过在琼脂糖凝胶上跑反应的等分部分证实了PCR的成功。用该克隆产物转化DHα5大肠杆菌细胞并铺平板。过夜孵育后，挑选细菌克隆并分离质粒DNA，而后使用与先前分离单独序列的相同条件将该质粒DNA用于PCR中，然后将其送去测序。总共来自未迁移细胞的46个序列和来自迁移细胞的70个序列被测序(Research Biolabs)。

RT-PCR：按照制造商的建议，用RNEASY^TM试剂盒(Qiagen)收集细胞质RNA。检验浓度和纯度，之后在使用oligo-T-priming of Superscript IIIFirst-Strand Synthesis System ^TM(Invitrogen)通过反转录生产cDNA的所有样品中使用等量的RNA。按照HotStart^TM Taq手册的建议，使用HotStart^TM Taq系统(Qiagen)进行制备cDNA的常规PCR。使用Power Sybr Green PCR mastermix和规程(Applied Biosystems)进行实时PCR，TMEM18的引物为5’-ATGCCGTCCGCCTTCTCTG[SEQ ID NO.：8]和5’-GTCTTCTTTCCTTCTCCTTTTC[SEQ ID NO.：9]，以及β-肌动蛋白的引物为5’-TCATGTTTGAGACCTTCAA[SEQ ID NO.：10]和5’-GTCTTTGCGGATGTCCACG[SEQ ID NO.：11]。使用Opticon 2实时PCR仪器(Applied Biosystems)来运行PCR反应，TMEM18PCR的程序为95℃10分钟，接着45个循环(95℃15秒，接着68℃1分钟)；以及β-肌动蛋白的程序为95℃10分钟，接着40个循环(95℃10秒，55℃20秒，和68℃20秒)。实时PCR结果显示为TMEM18mRNA的量与β-肌动蛋白的量的比。

划痕与细胞增殖实验：在划痕实验的前一天将细胞铺平板，从而在实验当天使汇合度达到大约80％。使用移液管头去除一层细胞，更换新鲜的细胞培养基，并且对该细胞进行光学显微镜拍照，并且在细胞培养平板上标记确切位置。在第二次记录刮痕区域的恢复之前，孵育细胞24小时。

对于细胞增殖实验，将5000个细胞平铺到24孔板上，并且在4天的时间段期间内每天通过胰酶消化从孔中收集细胞。将收集的细胞离心并在-20℃冷冻。然后，按照供应商的建议，使用CYQUANT ^TM细胞增殖检测试剂盒(分子探针)对每个样品中的细胞的量计数。使用荧光板计数器(GENios pro，Tecan)对细胞计数。

siRNA：按照制造商的规程的建议，将两个序列，

5’TCATCTTAGTCTACTGTGCTGAATA[SEQ ID NO.：12]和

5’TGCTCACGCAGACGGACTGGACTGA[SEQ ID NO.：13]，克隆到双启动子siRNA表达载体pFIV-H1/U6-PURO(System Biosciences)。制备在pFIV-载体克隆试剂盒(System Biosciences)中提供的针对萤光素酶的siRNA序列作为对照。将NT2细胞铺平板以在siRNA表达质粒的转染当天使汇合度达到90％，并且根据制造商的规程用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染质粒DNA。对嘌呤霉素抗性细胞进行选择4天，其后将该细胞用于迁移实验以及RT-PCR研究。

免疫荧光：针对肽122-135：DLKNAQERRKEKKR[SEQ ID NO.：14](Biogenes GmbH)在兔子中制备针对TMEM18的抗体，并在免疫荧光中以1∶200使用。针对α-微管蛋白(ab7291)的抗体购自Zymed并在免疫荧光中以1∶100使用。以2nM的浓度使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(分子探针)，DAPI。第二荧光抗体购自Jacksonimmunoresearch。

在24孔板上稀疏地平板接种细胞并在第二天移除细胞培养基并用PBS洗涤该细胞。然后将细胞在4％的多聚甲醛中固定10分钟，用PBS洗涤，在PBS中的0.2％的triton-X-100中透化处理5分钟，用PBS洗涤，以及在PBS中的1％BSA中封闭30分钟。将抗体与于PBS中的1％的BSA混合并在细胞上孵育30～60分钟，其后用PBS将该细胞洗涤3次并与在于PBS中1％BSA中的第二抗体孵育1小时。在荧光显微镜下进行染色研究之前，将细胞用PBS洗涤并用DAPI简单染色。

体内细胞迁移实验：使用连接有30号针头的10μl Hamilton注射器以0.5μl/min的速度将大鼠C6神经胶质瘤细胞(1百万个细胞于5μl中)注射到大鼠脑右纹状体中(从前囟点和硬膜AP+1.0mm，ML+2.5mm，和DV-5.0mm)。三天后，将250万个细胞(125万个绿色荧光染料标记的TMEM18超量表达的C17.2细胞和125万个红色荧光染料标记的载体对照C17.2细胞)注射到大鼠脑对侧。2周后，收集脑样本切片并检查。在动物处理和照料期间，遵循由新加坡实验动物研究的国家咨询委员会颁布的用于科研目的的动物的照料和使用指南(the Guidelines on the Care and Use of Animals for ScientificPurposes)。新加坡的机构动物护理和使用委员会(the Institutional Animal Careand Use Committee(IACUC))、新加坡国立大学(National University ofSingapore)和生物资源中心(Biological Resource Center)、新加坡科技研究局(the Agency for Science，Technology and Research(A*STAR))认可了当前研究的实验规程。

GFP融合蛋白表达质粒：在NT-GFP融合

表达试剂盒手册(Invitrogen)中指导下，构建GFP融合蛋白表达质粒。通过使寡核苷酸

5’CAGCGCAAAAAACGCCGCCAGCGCCGCTAGA[SEQ ID NO.：15]和

5’CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTGCGCTGA[SEQ ID NO.：16]退火形成TAT编码序列。使用引物5’TCAGTCTTCTTTCCTTCTCC[SEQ ID NO.：17]和5’AAGAATGCACAAGAGAGAAG[SEQ ID NO.：18]通过PCR克隆来自TMEM18N端的15个氨基酸。在通过Lipofectamine(Invitrogen)转染到U87MG细胞之前，对GFP融合质粒进行测序。

结果

在发现促进神经胶质瘤-定向的干细胞迁移的基因的筛选中鉴定TMEM18。已揭示干细胞能够定位于神经胶质瘤。建立cDNA文库筛选来找到新的基因，当在干细胞中超量表达时，这些基因将进一步促进其追踪神经胶质瘤细胞的能力。CDNA文库来自淋巴瘤细胞系，Daudi，并且由逆转录病毒载体表达。用cDNA文库感染人的神经元前体细胞系NT2，而后评价它们在transwell细胞迁移实验中定向于神经胶质瘤的迁移能力。在transwell迁移实验中，准备迁移的细胞勉强通过8微米孔到达transwell小室膜的相对位置，而未迁移细胞待在该膜的顶部。分离迁移的细胞并使其通过两轮以上的迁移实验筛选，其后通过PCR克隆病毒引入的cDNA并通过测序鉴定，该规程总结于图1中。使用未迁移细胞作为分析的对照。从迁移细胞中收集的三个百分比的病毒引入的cDNA克隆编码TMEM18基因，而从未迁移细胞中收集的克隆不含有病毒引入的TMEM18序列。因此TMEM18是验证其在神经干细胞迁移中的作用的进一步分析的大有前景的候选基因。

TMEM18是具有C末端核定位信号的有潜力的跨膜蛋白。TMEM18是迄今为止没有公布功能的未定性的蛋白质。使用几种基于网络的程序(ca.expacy.org/tools/)从TMEM18的氨基酸序列中找到功能基序的搜索没有发现有强的相关性，可是用于磷酸化和N-豆蔻酰化的弱潜在位点的确出现了。如TMEM18的名称所示，由设计用来识别跨膜蛋白的TMpred程序(Hofmann和Stoffel，1993)预测的，该蛋白具有四个跨膜跨越α-螺旋，尽管根据某些其它预测程序，第一跨膜部分的可能性小于其它三个(图1B)。根据PredictNLS程序(Cokol等人，2000)TMEM18的氨基酸序列的强亲水性C-末端具有可能的核定位信号(图1C，加下划线的序列)。

ClustalW程序(ch.EMBnet.org)用于对人(NCBI登录号.NP_690047.2)、小鼠(NP_742046.1)、大鼠(NP_001007749.1)、狗(XP_848731.1)和鸡(XP_419929.1)的TMEM18蛋白质序列进行比对并显示出物种间的强保守性(图1C)，暗示了TMEM18具有一种或多种关键功能。此外，使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的同源蛋白质序列(同源基因)搜索程序，还发现了从果蝇(D.melanogaster)到水稻(O.sativa)的同源序列。

TMEM18的超量表达提高了神经前体细胞的神经胶质瘤特异性迁移能力。在我们的cDNA文库筛选中，TMEM18的超量表达已被鉴定为神经干细胞向神经胶质瘤细胞迁移的促进因子。为了证实这一观察，研究了在人的神经前体NT2细胞和大鼠的神经前体C17.2细胞中的超量表达来确定是否超量表达会以剂量依赖方式影响迁移。慢病毒载体用于制备超量表达TMEM18的NT2和C17.2的稳定细胞系。慢病毒感染的滴度控制在每一个细胞有一病毒。选择对于表达不同水平的TMEM18的神经前体细胞的各类型的稳定细胞系的两个群体。使用RT-PCR(图2A为NT2细胞以及图2D为C17.2细胞)和免疫染色(图2C)证实了TMEM18的超量表达。实时RT-PCR定量，NT2TMEM18细胞系A和B分别表达了超过对照大约25和38倍的TMEM18mRNA(图2B)，并且在C17.2TMEM18细胞系A和B中的增加分别为10和25倍(图2E)。

划痕实验首先用来检查非特异性的细胞运动。如向划痕空区域的运动远快于亲本细胞或载体对照(图3A和3B)所示，超量表达TMEM18的NT2群体和C17.2群体都显示了全面提高的迁移能力。细胞增殖实验证实了TMEM18的超量表达没有影响不同细胞群体的增殖速率，因此排除了在划痕实验中覆盖空区域速度的不同是由于超量表达TMEM18的细胞的提高的繁殖能力造成的可能性。

其次，使用transwell迁移实验(图3C和D)，检查这些细胞系向U87神经胶质瘤细胞(在先前的cDNA筛选中使用的肿瘤细胞系)的运动。超量表达TMEM18的NT2细胞和C17.2细胞在与其亲本细胞和空载体对照比较时显示出了明显更高的迁移能力。通过显示出显著的迁移优势，这些细胞也对其它神经胶质瘤细胞系(H4和C6)做出反应。有趣的是，在将非肿瘤细胞系(小鼠成纤维细胞系NIH3T3和人肾脏细胞系293FT)用于transwell迁移实验时，这些超量表达TMEM18的细胞没有显示出提高的迁移能力。而且，在超量表达TMEM18的细胞和对照之间，迁移到纯细胞培养基的细胞数量保持相同。因此，超量表达TMEM18的细胞向神经胶质瘤细胞的偏好暗示了TMEM18对应答神经胶质瘤分泌的因子的特异性作用。

为了对上述体外结果进行补充，TMEM18的超量表达用于确定是否在脑内C17.2大鼠神经前体细胞向神经胶质瘤的迁移会提高。在大鼠C6神经胶质瘤异种移植模型中，将超量表达绿色荧光染料标记的TMEM18的C17.2细胞与红色荧光染料标记的载体对照C17.2细胞一起注射到肿瘤接种部位对侧的脑的一侧上。注射2周后，收集脑样本用于检查。如图4中所示，全部细胞都向肿瘤侧迁移并且几乎一半的细胞历时2周已经穿过了脑中线。在迁移细胞的前面，观察到了明显高的数目的绿色细胞，说明这些超量表达TMEM18的细胞在脑内向神经胶质瘤的迁移提高了。

TMEM18是神经前体细胞迁移的关键。为了验证是否TMEM18表达的内源水平涉及调节神经干细胞迁移，使用RNA干扰方法来关闭NT2细胞中的内源TMEM18的表达。构建嘌呤霉素抗性siRNA表达载体来表达针对TMEM18(两个不同序列)或针对萤光素酶的siRNA序列。两种不同转染产生了具有不同下降水平的TMEM18表达的四种NT2细胞群体，其为原始内源TMEM18mRNA水平的31％、35％、37％至65％(图5A)。在C17.2细胞中也观察到了类似水平的下降(图5B)。在24小时transwell迁移实验中，作为siRNA对照的针对萤光素酶基因的siRNA似乎对细胞迁移行为没有产生大的影响。另一方面，针对TMEM18的siRNA确实对NT2和C17.2细胞的迁移产生了巨大作用。TMEM18mRNA的量下降到正常水平的60％显著降低了迁移细胞的数量，以及将TMEM18表达的量减少至正常NT2细胞水平的31％几乎完全终止了细胞迁移能力(图5C)。有趣的是，下调TMEM18同时同等地降低了向神经胶质瘤细胞和向纯培养基的迁移(图5B和D)，说明TMEM18是调节普通细胞运动性的重要因素并且与神经干细胞的整体迁移能力有关。

TMEM18蛋白定位到核和胞质结构上。为了理解TMEM18作用的根本机制，研究了TMEM18蛋白的细胞定位。制备针对TMEM18C末端肽的抗体来揭示TMEM18蛋白的细胞定位。通过免疫荧光检查抗体的特异性，其中在对照中和超量表达TMEM18的NT2细胞中免疫前血清染色与TMEM18抗体染色之间比较细胞染色。免疫前血清几乎没有给出信号，而TMEM18抗体对对照细胞和超量表达的样品(以稍强的方式)都染色了(图6A)。对在对照NT2细胞中TMEM18抗体(图6B1，红色)识别的结构的更近观察显示核膜(显示核轮廓的环)、核内以及在细胞质的限制区域被染色(图6B)。在用核染色(蓝色)覆盖TMEM18免疫荧光染色时，其证实了这种环结构可重叠于核(图6B3)。与用α-微管蛋白抗体(图6B4，绿色)染色的细胞骨架结构相比，看到TMEM18仅部分定位在微管蛋白网络的区域上(图6B5&6)。

为了检测TMEM18核定位信号(NLS)的功能，采用GFP融合蛋白方法。U87细胞中对照GFP质粒的转染导致绿色荧光信号遍布细胞中(图6C)。显著地，用编码由来自TMEM18的最后15个N-端氨基酸(KED)和GFP组成的杂合蛋白的质粒载体的转染导致细胞核中的强荧光信号(图6C)。TMEM18KED肽在指导GFP进入核中出现了与Tat肽(一种完善的核定位信号肽)相同的效果。

讨论

cDNA文库筛选本身能够选择迁移到神经胶质瘤细胞的能力增强的细胞，这改善了非特异性细胞运动，或者提高了增殖速率。由于超量表达TMEM18的细胞与对照具有相似的细胞周期，最后一种可能被证明是无效的。在通过划痕实验研究非特异性细胞运动时，看到与对照细胞相比TMEM18细胞能够更快恢复空区域。同样，用siRNA进行的TMEM18的下调急剧降低了transwell实验中的细胞迁移能力。甚至在没有任何空间线索的情况下，全部这些结果显示TMEM18影响细胞的运动能力。

transwell迁移实验显示了超量表达TMEM18的细胞系向神经胶质瘤细胞而不向纯细胞培养基的特异性迁移的增加，其用作检测非特异性迁移率的对照。超量表达TMEM18的细胞以与对照细胞系相同的方式迁移到肾脏细胞系、小鼠成纤维细胞系和到纯培养基。由于TMEM18的超量表达与空间线索联系，没有增加迁移。即，即使明显提高了向靶细胞的迁移，TMEM18细胞和对照细胞之间也没有改变。这表明TMEM18确实具备感觉有利于迁移的源自神经胶质瘤的线索的能力。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇出版物或专利申请被具体单独指出以被引用作为参考那样。任何出版物的引用为在申请日前公开的内容并且不应将其解释为由于在前的发明而承认本发明不被赋予比这些公开更早的日期。

如在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数含义，除非文意另有明确表示。除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

虽然通过用于清楚理解的说明和实施例已经在一定程度上详细描述了前述发明，对本领域普通技术人员来说，显而易见的是，鉴于本发明的教导，在没有脱离所附权利要求的实质或范围的情况下，可以另外进行一些变化和修改。

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5.Flax，J.D.，Aurora，S.，Yang，C.，Simonin，C.，Wills，A.M.，Billinghurst，L.L.，Jendoubi，M.，Sidman，R.L.，Wolfe，J.H.，Kim，S.U.，and Snyder，E.Y.Engraftable huma neural stem cellsrespond to developmental cues，replace neurons，and express foreign genes.Nat Biotechnol.16：1033-9，1998.

6.Arnhold，S.，Hilgers，M.，Lenartz，D.，Semkova，I.，Kochanek，S.，Voges，J.，Andressen，C.，and Addicks，K.Neural precursor cells as carriers for a gene therapeutical approach intumour therapy.Cell Transplant.12：827-37，2003.

7.Brown，A.B.，Yang，W.，Schmidt，N.O.，Carroll，R.，Leishear，K.K.，Rainov，N.G.，Black，P.M.，Breakefield，X.O.，and Aboody，K.S.Hum Gene Ther.14：1777-85，2003.

8.Allport，J.R.，Shinde Patil，V.R.，and Weissleder，R.Murine neuronal progenitor cells arepreferentially recruited to tumour vasculature via alpha4-integrin andSDF-1alpha-dependent mechanisms.Cancer Biol Ther.3：838-44，2004.

9.Aarum，J.，Sandberg，K.，Haeberlein，S.L.，and Persson，M.A.Migration and differentiationof neural precursor cells can be directed by microglia.PNAS.100：15983-8.2003

10.Tran，P.B.，and Miller，R.J.Chemokine receptors：signposts to brain development anddisease.Nat Rev Neurosci.4：444-55，2003.

11.Ehtesham，M.，Yuan，X.，Kabos，P.，Chung，N.H.，Liu，G.，Akasaki，Y.，Black，K.L.，and Yu，J.S.Glioma tropic neural stem cells consist of astrocytic precursors and their migratorycapacity is mediated by CXCR4.Neoplasia.6：287-93，2004.

12.Imitola，J.，Raddassi，K.，Park，K.I.，Mueller，F.J.，Nieto，M.，Teng，Y.D.，Frenkel，D.，Li，J.，Sidman，R.L.，Walsh，C.A.，Snyder，E.Y.，and Khoury，S.J.Directed migration of neuralstem cells to sites of CNS injury by the stromal cell-derived factor 1alpha/CXC chemokinereceptor 4 pathway.PNAS，101：18117-22，2004.

13.Widera，D.，Holtkamp，W.，Entschladen，F.，Niggemann，B.，Zanker，K.，Kaltschmidt，B.，and Kaltschmidt，C.MCP-1 induces migration of adult neural stem cells.Eur J Cell Biol.83：381-7，2004

14.Erlandsson，A.，Larsson，J.，and Forsberg-Nilsson，K..Stem cell factor is a chemoattractantand a survival factor for CNS stem cells.Exp Cell Res.301：201-10，2004.

15.Sun，L.，Lee，J.，and Fine，H.A.Neuronally expressed stem cell factor induces neural stemcell migration to areas of brain injury.J Clin Invest.113：1364-74.2004.

16.Serfozo，P.，Schlarman，M.S.，Pierret，C.，Maria，B.L.，and Kirk，M.D.Selective migrationof neuralized embryonic stem cells to stem cell factor and media conditioned by glioma celllines.Cancer Cell Int.6：1，2006.

17.Boockvar，J.A.，Kapitonov，D.，Kapoor，G.，Schouten，J.，Counelis，G.J.，Bogler，O.，Snyder，E.Y.，McIntosh，T.K.，and O′Rourke，D.M.Constitutive EGFR signaling confers a motilephenotype to neural stem cells.Mol Cell Neurosci.24：1116-30，2003.

18.Schmidt，N.O.，Przylecki，W.，Yang，W.，Ziu，M.，Teng，Y.，Kim，S.U.，Black，P.M.，Aboody，K.S.，and Carroll，R.S.Brain tumour tropism of transplanted huma neural stemcells is induced by vascular endothelial growth factor.Neoplasia.7：623-9，2005.

19.Ziu，M.，Schmidt，N.O.，Cargioli，T.G.，Aboody，K.S.，Black，P.M.，and Carroll R.S.Glioma-produced extracellular matrix influences brain tumour tropism of huma neural stemcells.J Neurooncol.79(2)：125-33，2006.

20.Larsen，M.，Tremblay，M.L.，and Yamada，K.M.Phosphatases in cell-matrix adhesion andmigration.Nat Rev Mol Cell Biol.4：700-11，2003.

21.Cokol，M.，Nair，R.，and Rost，B.Finding Nuclear localization signals.EMBO Rep 1：411-415，2000.

22.Hofmann，K.，and Stoffel，W.TMbase-A database of membrane spanning proteinssegments Biol Chem Hoppe-Seyler 374：166，1993.

23.Strausberg，R.L.，Feingold，E.A.，Grouse，L.H.，Derge，J.G.，Klausner，R.D.，Collins，F.S.，Wagner，L.，Shenmen，C.M.，Schuler，G.D.，Altschul，S.F.，Zeeberg，B.，Buetow，K.H.，Schaefer，C.F.，Bhat，N.K.，Hopkins，R.F.，Jordan，H.，Moore，T.，Max，S.I.，Wang，J.，Hsieh，F.，Diatchenko，L.，Marusina，K.，Farmer，A.A.，Rubin，G.M.，Hong，L.，Stapleton，M.，Soares，M.B.，Bonaldo，M.F.，Casavant，T.L.，Scheetz，T.E.，Brownstein，M.J.，Usdin，T.B.，Toshiyuki，S.，Carninci，P.，Prange，C.，Raha，S.S.，Loquellano，N.A.，Peters，G.J.，Abramson，R.D.，Mullahy，S.J.，Bosak，S.A.，McEwan，P.J.，McKernan，K.J.，Malek，J.A.，Gunaratne，P.H.，Richards，S.，Worley，K.C.，Hale，S.，Garcia，A.M.，Gay，L.J.，Hulyk，S.W.，Villalon，D.K.，Muzny，D.M.，Sodergren，E.J.，Lu，X.，Gibbs，R.A.，Fahey，J.，Helton，E.，Ketteman，M.，Madan，A.，Rodrigues，S.，Sanchez，A.，Whiting，M.，Madan，A.，Young，A.C.，Shevchenko，Y.，Bouffard，G.G.，Blakesley，R.W.，Touchman，J.W.，Green，E.D.，Dickson，M.C.，Rodriguez，A.C.，Grimwood，J.，Schmutz，J.，Myers，R.M.，Butterfield，Y.S.，Krzywinski，M.I.，Skalska，U.，Smailus，D.E.，Schnerch，A.，Schein，J.E.，Jones，S.J.，andMarra，M.A.；Mammalian Gene Collection Program Team.Generation and initial analysisof more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences.PNAS，99：16899-903，2002.

序列表

 

<110>新加坡科技研究局(AGENCY FOR SCIENCE，TECHNOLOGY AND RESEARCH)

 

<120>提高神经前体细胞的迁移的方法

 

<130>IP09-1340-XC37

 

<150>US 60/907,187

<151>2007-03-23

 

<160>18

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>140

<212>PRT

<213>人

 

<400>1

Met Pro Ser Ala Phe Ser Val Ser Ser Phe Pro Val Ser Ile Pro Ala

1               5                   10                  15

Val Leu Thr Gln Thr Asp Trp Thr Glu Pro Trp Leu Met Gly Leu Ala

            20                  25                  30

Thr Phe His Ala Leu Cys Val Leu Leu Thr Cys Leu Ser Ser Arg Ser

        35                  40                  45

Tyr Arg Leu Gln Ile Gly His Phe Leu Cys Leu Val Ile Leu Val Tyr

    50                  55                  60

Cys Ala Glu Tyr Ile Asn Glu Ala Ala Ala Met Asn Trp Arg Leu Phe

65                  70                  75                  80

Ser Lys Tyr Gln Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Met Phe Ile Ser Ile Val

                85                  90                  95

Phe Ser Ala Pro Leu Leu Val Asn Ala Met Ile Ile Val Val Met Trp

            100                 105                 110

Val Trp Lys Thr Leu Asn Val Met Thr Asp Leu Lys Asn Ala Gln Glu

        115                 120                 125

Arg Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Arg Lys Glu Asp

    130                 135                 140

 

<210>2

<211>122

<212>PRT

<213>小鼠

 

<400>2

Met Glu Thr Asp Trp Thr Glu Pro Trp Leu Leu Gly Leu Leu Ala Phe

1               5                   10                  15

His Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Cys Phe Ser Ser Gln Arg Tyr Lys

            20                  25                  30

Leu Gln Ile Gly His Phe Leu Cys Leu Val Val Leu Val Tyr Ser Ala

        35                  40                  45

Glu Tyr Ile Asn Glu Val Ala Ala Val Asn Trp Arg Leu Phe Ser Lys

    50                  55                  60

Tyr Gln Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Met Phe Ile Ser Leu Val Phe Ser

65                  70                  75                  80

Ala Pro Leu Leu Phe Asn Ala Met Leu Ile Val Ile Met Trp Val Arg

                85                  90                  95

Lys Thr Leu Thr Val Met Thr Asp Leu Lys Thr Leu Gln Glu G1u Arg

            100                 105                 110

Lys Glu Arg Arg Arg Arg Arg Lys Glu Glu

        115                 120

 

<210>3

<211>140

<212>PRT

<213>大鼠

 

<400>3

Met Ala Ser Pro Tyr Ser Val Arg Val Phe Pro Val Ser Ile Pro Ala

1               5                   10                  15

Val Ile Met Glu Thr Asp Trp Thr Glu Pro Trp Leu Leu Gly Leu Leu

            20                  25                  30

Ala Phe His Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Cys Phe Ser Ala Gln Arg

        35                  40                  45

Tyr Lys Leu Gln Ile Gly His Phe Leu Cys Leu Val Val Leu Val Tyr

    50                  55                  60

Cys Ala Glu Tyr Ile Asn Glu Val Ala Ala Met Asn Trp Arg Leu Phe

65                  70                  75                  80

Ala Lys Tyr Gln Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Met Phe Ile Ser Leu Val

                85                  90                  95

Phe Ser Ala Pro Leu Leu Phe Asn Ala Met Val Ile Val Ile Met Trp

            100                 105                 110

Val Arg Lys Thr Leu Thr Val Met Ser Asp Leu Lys Asn Leu Gln Glu

        115                 120                 125

Arg Arg Lys Glu Arg Lys Arg Arg Arg Lys Glu Glu

    130                 135                 140

 

<210>4

<211>411

<212>PRT

<213>狗

 

<400>4

Met Cys Glu Trp Cys Cys Trp Gln Arg Pro Tyr Ala Tyr Leu Leu Ser

1               5                   10                  15

Ala Arg Asp Asp Phe Arg Cys Glu Gly Tyr Gly Gly Pro Thr Lys Leu

            20                  25                  30

Arg Ala Pro Ser Leu Cys Ile Thr Ala Pro Val Glu Ala Ala Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Val Ala Asp Pro Leu Ser Ser Ser Asn Gly Arg Leu Pro Ala Arg

    50                  55                  60

His Arg Glu Arg Ser Pro Arg Asn Phe Lys Leu Thr Gly Asp Val Ser

65                  70                  75                  80

Val Gln Arg Gly Leu Glu His Arg Lys Thr Gly Gly Lys Leu Pro Ser

                85                  90                  95

Gln Glu Ala Arg Val Pro Ala Cys Leu Leu Leu His His Arg Gly Arg

            100                 105                 110

Glu Gly Ala Ala Asp Thr Leu Pro Gln Asp His Glu Trp Ala Val Phe

        115                 120                 125

Cys Glu Trp Arg Leu Gln Glu Arg Leu Ala Arg Ala Arg Ala Arg Thr

    130                 135                 140

Thr Gly Ala Ser Val Thr Val Pro Ile Pro Ala Ile Leu Gly Val His

145                 150                 155                 160

Arg Pro Val Thr Gln Thr His Arg Val Ser Pro Ser Gly Leu Ala Val

                165                 170                 175

Ala Gln Arg Pro Pro Arg Ser Gln Glu Leu Cys Gly Leu Gln His Pro

            180                 185                 190

Ala Arg Glu Arg Ser Gly Gly Asp Ala Leu His Glu Arg Val Val Pro

        195                 200                 205

Arg Pro Gly Ala Cys Cys His Leu Leu Pro Pro Gly Glu Thr Ala Thr

    210                 215                 220

Gly Pro Val His Thr Gly Ser Pro Thr Pro Val Arg Leu Gly Thr Arg

225                 230                 235                 240

Ala Gly Gln Glu Ser Gly Pro Gly Pro Asn Thr Arg Asp Thr Ser His

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Ala Pro Phe Arg Asn Pro Thr Cys Arg Asp Ala Val Pro

            260                 265                 270

Pro Pro Trp Gly Pro Leu Leu Arg Arg Val Leu Pro Arg Leu Arg Leu

        275                 280                 285

Gly Pro Arg Pro Gln Thr Asp Trp Thr Glu Pro Trp Leu Leu Gly Leu

    290                 295                 300

Ala Val Phe His Val Leu Cys Leu Leu Leu Thr Cys Leu Ser Ser Gln

305                 310                 315                 320

Arg Tyr Lys Leu Gln Val Gly His Phe Leu Cys Leu Val Ile Leu Val

                325                 330                 335

Tyr Cys Ala Glu Tyr Ile Asn Glu Ile Ala Ala Met Asn Trp Arg Leu

            340                 345                 350

Phe Ser Lys Tyr Gln Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Met Phe Ile Ser Ile

        355                 360                 365

Val Phe Ser Ala Pro Leu Leu Leu Asn Ala Met Ile Ile Val Ile Leu

    370                 375                 380

Trp Val Arg Lys Thr Leu Asn Val Met Thr Asp Leu Lys Thr Leu Gln

385                 390                 395                 400

Glu Lys Arg Arg Glu Arg Lys Arg Lys Glu Glu

                405                 410

 

<210>5

<211>159

<212>PRT

<213>鸡

 

<400>5

Met Val Ser Leu Ala Ile Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ala Ser Ala Val

1               5                   10                  15

Arg Met Arg Ser Val Ala Val Ala Met Glu Gln Pro Leu His Gly Pro

            20                  25                  30

Pro Gly Leu Ser Thr Ile Leu Ala Arg Thr Asp Trp Ala Glu Pro Trp

        35                  40                  45

Leu Leu Gly Leu Ala Gly Phe His Val Leu Cys Phe Leu Leu Thr Cys

    50                  55                  60

Phe Ser Phe Gln His Tyr Arg Val Gln Ile Gly His Phe Leu Cys Met

65                  70                  75                  80

Val Cys Leu Val Tyr Cys Ala Glu Tyr Ile Asn Glu Leu Ala Ala Met

                85                  90                  95

Asn Trp Arg Leu Phe Ser Lys Tyr Gln Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Met

            100                 105                 110

Phe Ile Ser Leu Val Phe Ser Ala Pro Leu Leu Val Asn Thr Ile Ile

        115                 120                 125

Ile Val Val Asn Trp Val Tyr Arg Thr Leu Asn Val Met Thr Glu Leu

    130                 135                 140

Lys Thr Leu Gln Gln Arg Ile Lys Ala Glu Lys Asp Lys Lys Lys

145                 150                 155

 

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>6

caccatgccg tccgccttct ctg                                      23

 

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>7

aaagtcttct ttccttctcc ttttc                                    25

 

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>8

atgccgtccg ccttctctg                                           19

 

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>9

gtcttctttc cttctccttt tc                                        22

 

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>10

tcatgtttga gaccttcaa                                            19

 

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>11

gtctttgcgg atgtccacg                              19

 

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>12

tcatcttagt ctactgtgct gaata                       25

 

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>13

tgctcacgca gacggactgg actga                       25

 

<210>14

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>TMEM18序列产生的合成肽

 

<400>14

Asp Leu Lys Asn Ala Gln Glu Arg Arg Lys Glu Lys Lys Arg

1               5                   10

 

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>15

cagcgcaaaa aacgccgcca gcgccgctag a                31

 

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>16

ctagcggcgc tggcggcgtt ttttgcgctg a                31

 

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>17

tcagtcttct ttccttctcc                     20

 

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物

 

<400>18

aagaatgcac aagagagaag                     20

Claims (23)

1.一种提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的方法，该方法包括增加神经前体细胞中TMEM18的水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分泌神经前体趋化因子的细胞为神经胶质瘤细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分泌神经前体趋化因子的细胞为神经组织变性部位的细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述TMEM18包含SEQ ID NO.：1～SEQ ID NO.：5中任一项所述的氨基酸序列。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述增加包括提高神经前体细胞中天然TMEM18的表达水平。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述增加包括在神经前体细胞中通过表达载体表达重组TMEM18。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述神经前体趋化因子包括基质细胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白、细胞因子干细胞因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子或成纤维细胞生长因子。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞源自胚胎干细胞。

9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞源自神经组织。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，该方法进一步包括向包含所述分泌神经前体趋化因子的细胞的细胞群体中递送神经前体细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞群体为体外细胞群体。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞群体为体内细胞群体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，该方法包括通过外科植入或注射递送神经前体细胞。

14.根据权利要求10～13中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞已被修饰为包括标记分子。

15.根据权利要求10～13中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞已被修饰为包括治疗剂。

16.一种TMEM18的水平增加的神经前体细胞。

17.根据权利要求16所述的神经前体细胞，其中，所述神经前体细胞包含编码TMEM18的表达载体。

18.根据权利要求17所述的神经前体细胞，其中，所述TMEM18包含SEQ ID NO.：1～SEQ ID NO.：5中任一项所述的氨基酸序列。

19.根据权利要求16～18中任一项所述的神经前体细胞，其进一步包含编码治疗性蛋白或肽的表达载体。

20.根据权利要求16所述的神经前体细胞用于治疗神经疾病。

21.一种包含权利要求16～19中任一项所述的神经前体细胞的药物组合物。

22.TMEM18的水平增加的神经前体细胞用于治疗神经疾病的用途。

23.TMEM18的水平增加的神经前体细胞在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。

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