CN109970849A

CN109970849A - zkscan3基因或其蛋白抑制剂在肿瘤治疗中的应用

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Publication number: CN109970849A
Application number: CN201811647898.6A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 李自宣; 游凤涛
Original assignee: PERSONGEN BIOMEDICINE (SUZHOU) CO Ltd
Current assignee: Bosheng Jianke Cell Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109970849B

Abstract

本发明提供了zkscan3基因或其蛋白调节剂在肿瘤治疗中的应用。具体地，本发明涉及一种ZKSCAN3的抑制剂的用途，用于制备促进浆细胞分化与增殖、和/或治疗肿瘤的药物组合物。本发明为临床上在血液系统肿瘤中选择敲除ZKSCAN3治疗策略提供理论参考，对临床上靶向ZKSCAN3的血液系统肿瘤治疗具有重要意义。

Description

zkscan3基因或其蛋白抑制剂在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地，涉及zkscan3基因或其蛋白调节剂在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

ZKSCAN3是一个具有KRAB与SCAN结构域的锌指蛋白，是锌指转录因子家族的成员。ZKSCAN3在人的多种类型肿瘤中发挥着重要作用，通过上调与细胞周期、细胞增殖、迁移、血管新生、蛋白水解等相关基因的表达，促进肿瘤病程的进展、肿瘤细胞的侵袭、迁移与生长等；而在肿瘤细胞中沉默其表达则能显著抑制肿瘤细胞的恶性程度，抑制肿瘤细胞的异种移植致瘤性，肿瘤细胞的生长与转移。敲除肿瘤细胞中的关键分子可抑制肿瘤生长或增强药物的抗肿瘤效果，对肿瘤的治疗意义重大。ZKSCAN3在肿瘤细胞中的广泛表达使其成为肿瘤治疗重要的潜在靶标，该基因在肿瘤细胞中的敲除将具有广泛而有力的效用。

从造血干细胞开始，B细胞的发育经历了祖B细胞(pro-B cells)、前B细胞(pre-Bells)、未成熟B细胞(immature B cells)、成熟B细胞(mature B cells)、以及浆细胞(plasma cells)。目前影响浆细胞分化的正调控转录因子主要有 Blimp-1、IRF4和Xbp1；负调控因子主要有Pax5、MITF、Bach2和Bcl6。Zkscan3 是否影响B细胞的发育，目前还未见报道。

The human protein atlass数据库报道ZKSCAN3蛋白在大部分正常组织和细胞不表达或者低表达，在免疫器官淋巴结、扁桃体的生发中心有选择性地高表达。

因此，本领域迫切需要开发一种zkscan3基因或其蛋白抑制剂来抑制肿瘤细胞的生长与转移。

发明内容

本发明目的在于提供一种zkscan3基因或其蛋白抑制剂。

本发明第一方面，提供了一种ZKSCAN3的抑制剂的用途，用于制备(i)促进浆细胞分化与增殖、和/或(ii)治疗肿瘤的药物组合物。

在另一优选例中，所述ZKSCAN3来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、浆细胞肿瘤。

在另一优选例中，所述ZKSCAN3包括ZKSCAN3的蛋白、编码核酸、活性片段或其衍生物。

在另一优选例中，所述活性片段和/或衍生物与ZKSCAN3的同源性至少为 90％，优选为95％，更优选为98％、99％。

在另一优选例中，所述活性片段和/或衍生物至少具有80％、85％、90％、95％、100％的ZKSCAN3活性。

在另一优选例中，所述ZKSCAN3蛋白如SEQ ID NO.:2。

MARELSESTALDAQSTEDQMELLVIKVEEEEAGFPSSPDLGSEGSRERFRG FRYPEAAGPREALSRLRELCRQWLQPEMHSKEQILELLVLEQFLTILPGNLQSW VREQHPESGEEVVVLLEYLERQLDEPAPQVSGVDQGQELLCCKMALLTPAPGS QSSQFQLMKALLKHESVGSQPLQDRVLQVPVLAHGGCCREDKVVASRLTPESQ GLLKVEDVALTLTPEWTQQDSSQGNLCRDEKQENHGSLVSLGDEKQTKSRDLP PAEELPEKEHGKISCHLREDIAQIPTCAEAGEQEGRLQRKQKNATGGRRHICHEC GKSFAQSSGLSKHRRIHTGEKPYECEECGKAFIGSSALVIHQRVHTGEKPYECEE CGKAFSHSSDLIKHQRTHTGEKPYECDDCGKTFSQSCSLLEHHRIHTGEKPYQCS MCGKAFRRSSHLLRHQRIHTGDKNVQEPEQGEAWKSRMESQLENVETPMSYK CNECERSFTQNTGLIEHQKIHTGEKPYQCNACGKGFTRISYLVQHQRSHVGKNI LSQ

在另一优选例中，所述ZKSCAN3蛋白的编码核酸如SEQ ID NO.:1。

在另一优选例中，所述ZKSCAN3的抑制剂包括ZKSCAN3抗体、ZKSCAN3核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、或ZKSCAN3的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述ZKSCAN3的抑制剂抑制ZKSCAN3的活性和/或表达量。

本发明第二方面，提供了一种体外非治疗性的促进浆细胞分化与增殖的方法，包括步骤：

在ZKSCAN3抑制剂的存在下，培养浆细胞，从而促进浆细胞分化与增殖。

在另一优选例中，所述浆细胞选自哺乳动物，优选地为人、小鼠或大鼠。

本发明第三方面，提供了一种筛选ZKSCAN3调节剂的候选组合物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组xist的表达量和/或活性；在对照组中，在相同培养体系中不添加所述的候选组合物，并观察所述对照组中xist的表达量和/或活性；

其中，如果测试组培养体系中xist的表达量和/或活性P1显著高于对照组P0，则说明所述候选组合物为ZKSCAN3的抑制剂；

如果测试组培养体系中xist的表达量和/或活性P1显著低于对照组P0，则说明所述候选组合物为ZKSCAN3激动剂。

本发明第四方面，提供了一种促进浆细胞分化及增殖和/或治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的ZKSCAN3抑制剂或含有ZKSCAN3抑制剂的药物组合物。

在另一优选例中，所述需要的对象包括患有肿瘤的哺乳动物，优选地为人、小鼠或大鼠。

在另一优选例中，所述的施用包括将ZKSCAN3抑制剂直接输入到有需要的对象体内，例如静脉、肌肉或胃肠途径。

本发明第五方面，提供了一种促进浆细胞分化及增殖和/或治疗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的抑制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了zkscan3敲除小鼠发育正常；a.zkscan3基因敲除小鼠模型示意图；b.WT与KO小鼠脾脏GFP表达的荧光图；c.Western blot分析GFP在WT， Het，KO小鼠中的表达；d.小鼠脾脏GFP表达的平均荧光强度图；e.小鼠肝脏cDNA的电泳图；F.WT与KO小鼠12.5d的胚胎；G.WT与het、KO小鼠的基因型比例为1:2:1；H.7-8周龄的WT与KO小鼠的体重。

图2显示了流式分析7-8周龄的zkscan3WT与KO小鼠的各阶段B细胞及浆细胞的数量(左侧)，然后进行统计分析(右侧)；a.WT与KO小鼠的骨髓中 CD19+B细胞流式图；b.WT与KO小鼠的骨髓中AA4+IgM-CD19+CD43+HSA+ 原B细胞，AA4+IgM-CD19+CD43-HSA+前B细胞，和AA4+IgM+CD19+HSA+ 幼稚B细胞；c.WT与KO小鼠的骨髓中CD138+浆细胞；d.WT与KO小鼠的脾脏中CD19+B细胞；e.WT与KO小鼠的脾脏中CD19+/IgM+/IgD-/GL7+生发中心B 细胞；f.WT与KO小鼠的脾脏中CD19+/B220+/IgM+/AA4-/CD23-/CD21/35+边缘带B细胞；g.WT与KO小鼠的脾脏中CD19+/B220+/IgM++/AA4+/CD23-T1B细胞，CD19+/B220+/IgM++/AA4+/CD23+T2B细胞， CD19+/B220+/IgM+/AA4+/CD23+T3B细胞，和 CD19+/B220+/IgM+/AA4-/CD23+滤泡B细胞(*P<0.005)。

图3显示了与野生小鼠相比，患有结肠直肠癌zkscan3^-/-小鼠的浆细胞增加； a.WT与KO小鼠骨髓中的原B细胞、前B细胞、幼稚B细胞数量统计图；b.WT 与KO小鼠骨髓中浆细胞数量统计图；c.WT与KO小鼠脾脏中的生发中心B细胞数量统计图；d.WT与KO小鼠脾脏中的边缘带B细胞数量统计图；e)WT与KO 小鼠脾脏中的T1B细胞、T2B细胞和T3B细胞数量统计图(*p<0.05n＝5)。

图4显示了B细胞体外分化，浆细胞和生发中心B细胞增加；A.WT与KO小鼠浆细胞数量流式图；B.WT与KO小鼠生殖中心B细胞数量流式图。

图5显示了Xist在zkscan3^-/-小鼠中上调；A.选取了7-8周的WT与KO小鼠各三只(两只雌鼠，一只雄鼠)，流式分选脾脏中CD19+B细胞进行RNA–序列分析；B.Q-PCR进一步验证RNA-SEQUENCE数据；C.Q-PCR检测zkscan3的mRNA 在CT26与CT26-zk3细胞中的表达(n＝3)；D.荧光素酶报告基因结果显示zkscan3 调控xist的表达(**p<0.01；****p<0.0001)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现zkscan3与B细胞发育、浆细胞发生之间的关系及其潜在的分子机制。具体地，本发明人构建了zkscan3 敲除小鼠模型。与野生小鼠相比，在敲除小鼠中发现浆细胞数量增加，同时，也发现在结直肠癌移植瘤及LPS诱导的条件下浆细胞数量显著增加。 RNA-sequence和Q-PCR数据表明，B细胞中xist上调，荧光素酶报告基因实验结果表明zkscan3调控xist的表达。这为临床上在血液系统肿瘤中选择敲除 ZKSCAN3治疗策略提供理论参考，对临床上靶向ZKSCAN3的血液系统肿瘤治疗具有重要意义。在此基础上完成了本发明。

PCBP1基因及其蛋白

PCBP1(Poly(C)-binding protein 1，hnRNP E1)，是包含3个KH结构域的RNA 结合蛋白，其第三个KH结构域被证明具有RNA结合活性，可以结合3’UTR富含 CU区域(CU richeleemnt)调控α-Globin的mRNA稳定性；结合3’UTR DICE元件抑制12-LOX mRNA翻译；结合3’UTR BAT元件抑制Dab2mRNA翻译等。

PCBP1不仅是RNA结合蛋白，还是重要的胞内铁离子载体，它可以结合细胞质中的二价铁离子，并将铁离子转运给非血红素铁结合蛋白，如铁蛋白 (Ferritin)、HIF脯氨酰羟化酶等

可用于本发明PCBP1蛋白包括其全长或其活性片段，例如含有KH3结构域的具有RNA结合活性的PCBP1蛋白活性片段。

本发明有益效果

1.敲除了zkscan3基因后，浆细胞增多，有利于体液免疫，同时达到抗肿瘤的效果。

2.本发明为临床上选择zkscan3敲除策略来治疗骨髓瘤提供了理论指导。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料和方法

zkscan3敲除小鼠的产生

在zkscan3基因起始密码子前插入eGFP表达框及终止元件，另外插入Neo基因以方便胚胎干细胞克隆筛选，Neo基因两侧的Frt位点用于在成功构建敲除小鼠后，去除Neo基因以消除该基因本身的表达造成的小鼠表型的改变。上下游的两个LoxP序列可以在需要时恢复zkscan3的表达。

如图1a所示，首先构建目的载体，在zkscan3基因起始密码子前插入eGFP 片段与polyA终止元件，polyA下游则插入两侧被Frt位点包裹的Neo基因，同时在整个插入单元的上下游分别装上同向排列的LoxP位点。载体与ES细胞(胚胎干细胞)基因组DNA进行同源重组，目的序列被插入到基因组DNA中，利用Neo基因的抗性筛选出阳性ES细胞克隆，并由代孕鼠提供发育环境，最终获得带有目的序列的嵌合体小鼠。

得到的嵌合体小鼠与Flp工具鼠进行杂交可产生去除Neo基因的F1代小鼠，即所需要的Knockout-first目的小鼠，此时可进行正常的交配繁殖与基因敲除分析。在Knockout-first小鼠细胞中，由于eGFP利用zkscan3基因的启动子代替了其阅读框的表达，因此，eGFP的表达水平即代表zkscan3的转录水平。如果需要恢复zkscan3基因的表达，只需要与特定的Cre转基因小鼠进行杂交，就可以得到相应组织或器官内恢复zkscan3基因正常表达的小鼠。

小鼠

将Zkscan3小鼠维持在C57BL/6F1背景中，并通过使用杂合杂交育种小鼠获得实验小鼠。对子代小鼠进行基因型鉴定，所用引物为正向： TCTCCACCTCTCAGTAGTC，第一反向引物为反向：CCTCTTCTTGTTCCACCTT(SEQ ID NO.:3)，第二反向引物为反向2：CCTTGATGCCGTTCTTCT(SEQ ID NO.:4)，分别用第一、第二反向引物与正向引物配对扩增得到169bp的野生型片段与629bp的敲除型片段。所有动物实验都经过苏州大学伦理委员会审议，该研究的实验设计和实施方案充分考虑了动物福利和国家对动物实验管理和伦理的要求，研究内容和结果不存在利益冲突。

抗体试剂

具有以下特异性的抗体用于流式细胞术和组织学：AA4-BV510(BD cat:740152)、lgM-BV421(BD cat：562595)CD19-PE-CY7(BD cat:552854)、 CD43-PE(BD cat:553271)、HAS-PE-C594(BD cat:562477)、CD138-APC(BD cat：558626)CD45R-PE-CF594(BD cat:562290)、CD23-PE(BD cat:553139) CD21/35-APC(BD cat:558658)、lgD-APC(BD cat:560868)、GL7-PE(BD cat:561530)CD19-APC(BD cat:550992)、GFP(4B10)鼠单抗(CST:2955)

流式细胞术

开始用含有2％FBS的PBS中的抗-Fc-g受体(CD16/32BD cat：553141)封闭细胞悬浮液，然后与所示试剂的组合进一步孵育。在7-AAD摄取的基础上排除死细胞。流式细胞术在三激光八色细胞计数器(Kaluza for Gallios 1.0) 上进行，并用Kaluza Analysis 2.0进行分析。每个样品至少收集5×10⁵个。荧光减一(FMO)对照用于指导粘连细胞鉴别后活细胞的进一步分析

B细胞的分离和定量实时PCR

分选细胞(CD19B220)并通过MicroElute Total RNA Kit(OMEGA R6831) 用RNA分离试剂盒提取总RNA。根据制造商的说明，使用RevertAid First Strand cDNA SythesisKit(分子生物学k1622)以20μl的总反应体积通过0.2μg总 RNA的逆转录产生cDNA。使用xist和ctrb1的引物和SYBR PCR Array试剂盒 (RR420A TaKaRa.)在高通量定量PCR(LightCycler480Ⅱ，罗氏应用科学) 中进行定量PCR。以下引物：xist-正义5'-CAGAGTAGCGAGGACTTGAAGAG(SEQ ID NO.:5)和反义5'-GCTGGTTCGTCTATCTTGTGGG(SEQ IDNO.:6)，ctrb1-正义 5'-ATGGCATTCCTTTGGCTTGTG(SEQ ID NO.:7)和反义 5'-GGATAGCATCCTCTCCGTTGAC(SEQ ID NO.:8)，GAPDH-正义 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQID NO.:9)和反义 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID NO.:10)。

zkscan3-正义5'-TGACAGCTACTAGGCTCACAT(SEQ ID NO.:11)和反义 5'-GCAAGTCCCTAACCTTAGTCTGC(SEQ ID NO.:12)，atp9a-正义5'-CGGGGGAAATCACGTTCTACA(SEQID NO.:13)和反义 5'-GAGCGGTCATGCACACTCA(SEQ ID NO.:14)。Q-PCR的条件遵循SYBRPCR Array 试剂盒的步骤。

MCA38结直肠癌小鼠模型的构建

选取7-8周龄的敲除与野生C57BL/6小鼠各8只，用12.5mg/ml戊巴比妥钠 (0.9％Nacl溶)麻醉小鼠，用剔毛刀剔去需要注射肿瘤细胞部位的小鼠皮肤，酒精擦拭皮肤。皮下注射20万个MCA38细胞，观察小鼠的生命状、测量肿瘤体积、称量小鼠的体重。待肿瘤长到一定大小时，麻醉小鼠，颈椎脱臼。

离体分化

使用EasySep^TM小鼠APC阳性选择试剂盒(干细胞#18452)分离B细胞以阳性分选脾CD19+B细胞用于脂多糖(LPS)分化以0.5×10⁶细胞/ml接种，并用LPS (10ug/ml)刺激。将细胞在37℃、5％二氧化碳(CO₂)的潮湿培养箱中培养36-72 小时，然后染色。

荧光素酶测定

将CT26-ZK3细胞保持在10％FBS的1640中。对于瞬时转染，根据制造商的说明(invitrogen)，将细胞接种在6孔板中并使用lipofectamine 2000转染。 xist报告载体在-1500-0bp启动子的控制下编码萤火虫荧光素酶基因。使用空载体(PGL4.17)标准化每次转染的DNA总量。使用双荧光素酶测定试剂盒 (Promega)在转染后48小时测定荧光素酶活性，并用微孔板光度计(Thermo Scientific)测量。

统计分析

通过对数秩检验(GraphPad Prism 5)分析组间的存活比较。使用学生t 检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。使用相关性测试进行相关性分析，置信区间为95％。

资金：

这项工作得到江苏省高校优先学术发展计划、国家自然科学基金(批准号：31471283)、中国国家重点研发计划(2016YFC1303403)、协同创新重大项目 (批准号XYXT2015304)、江苏省六大人才项目(No.SWYY-CXTD-010)的支持。苏州大学赛勒斯汤血液中心，江苏苏州，中国苏州大学血液学协同创新中心，江苏苏州，中国苏州大学放射医学与防护国家重点实验室，江苏苏州。

实施例1.

zkscan3敲除小鼠的构建

ZKSCAN3在人类多种肿瘤组织中高表达，但是其在正常生理条件下所扮演的作用依然大量未知。因此本发明人构建了zkscan3敲除小鼠模型。首先构建目的载体，在zkscan3基因起始密码子前插入eGFP片段与polyA终止元件，polyA 下游则插入两侧被Frt位点包裹的Neo基因，同时在整个插入单元的上下游分别装上同向排列的LoxP位点。由于eGFP利用zkscan3基因的启动子代替了其阅读框的表达，所以eGFP的表达水平即代表zkscan3的转录水平(图1a-d)。

结果：Zkscan3敲除小鼠无KRAB的cDNA条带，野生小鼠有KRAB的cDNA条带 (图1e)。说明zkscan3已被完全敲除。Zkscan3敲除小鼠胚胎期发育正常(图 1F)，对其出生后的情况进行了进一步的研究，发现出生后各基因型小鼠符合孟德尔遗传定律(图1G)。小鼠的体重与野生小鼠相比也没有差异(图1H)，其他方面也未见异常，并且可以正常分娩。因此，可以判断zkscan3基因敲除不影响小鼠胚胎正常发育。

实施例2.

本发明人在前期工作中发现zkscan3基因在人的生发中心高表达，猜想它可能参与了B细胞的发育。为了检验这一假设，本发明人系统分析小鼠模型中B 细胞的发育与浆细胞的形成。选取七到八周龄的C57BL/6小鼠各八只，zkscan3 敲除和wt小鼠含有相似数量的骨髓CD19+B细胞(图2a)，和骨髓 AA4+IgM-CD19+CD43+HSA+原B细胞、AA4+IgM-CD19+CD43-HSA+前B细胞和 AA4+IgM+CD19+HSA+幼稚B的数量(图2b)。同样，zkscan3敲除和wt小鼠含有相似数量的脾CD19+B细胞(图1d)、和CD19+/IgM+/IgD-/GL7+生发中心B细胞 (图2e)、CD19+/B220+/IgM+/AA4-/CD23-/CD21/35+边缘区B细胞(图2f)、 CD19+/B220+/IgM++/AA4+/CD23-T1B细胞、CD19+/B220+/IgM++/AA4+/CD23+T2 B细胞，和CD19+/B220+/IgM+/AA4-/CD23+滤泡B细胞(图2g)。此外，本发明人在zkscan3敲除小鼠骨髓中发现CD138+浆细胞增加(图2c)并有统计学意义 (*P<0.05)。这说明zkscan3的敲除促进了浆细胞的发生。

实施例3.

为了进一步研究zkscan3与浆细胞发生之间的关系，本发明人构建了结直肠癌(MCA38cell)小鼠模型，为小鼠营造了肿瘤微环境。

结果：在zkscan3敲除小鼠中，骨髓中浆细胞的数量急剧增加与野生小鼠有统计学差异(图3b*P<0.05)，生发中心B细胞略微增加(图3c)。BM CD19+ B细胞、原B细胞、前B细胞、幼稚B细胞、边缘带B细胞、T1B细胞、T2B细胞和 T3B细胞相比于野生小鼠没有明显的差异(图3a、d、e)。说明zkscan3敲除小鼠在接种MAC38肿瘤细胞的情况下，浆细胞增加更明显。

实施例4.

为了更好的研究zkscan3敲除对浆细胞形成的影响，本发明人用EasySep^TM MouseAPC Positive Selection Kit和抗CD19抗体磁珠分选出骨髓中的B细胞，所有操作均按照试剂盒所提供的步骤，然后培养在RPMI-1640培养基(10％FBS， 1％青霉素链霉素双抗)。经LPS刺激72h后，流式检测，zkscan3敲除小鼠的浆细胞是野生小鼠浆细胞的2.5倍(图4A),zkscan3敲除小鼠的生发中心B细胞是野生小鼠生发中心B细胞的2倍(图4B)。因此，本发明人认为zkscan3是潜在的浆细胞发育的负调控因子。

实施例5.

为了研究Zkscan3如何负向调控浆细胞的分化与增殖，本发明人流式分选了zkscan3敲除与野生小鼠骨髓中的B细胞，进行RNA-SEQUENCE分析。 RNA-SEQUENCE数据显示zkscan3敲除小鼠xist上调(图5A)，Q-PCR验证结果与RNA-SEQUENCE结果一致，xist转录水平升高(图5B)。为了进一步研究xist与 zkscan3的关系，本发明人用zkscan3过表达载体转染CT26细胞(图5C)。在小鼠中，转录因子zkscan3识别的序列目前没有报道，因此本发明人将xist启动子上游的-1500-0bp序列克隆到PGL4.17载体上，将xist-1500-0+PGL4.17质粒、空载+PGL4.17质粒、renilla质粒转染CT26细胞和CT26-zkscan3细胞，48h后，用荧光素酶报告系统检测，含有xist启动子的实验组luciferase/renilla是空载对照的66倍，并具有统计学意义(图5C；****P<0.0001)。这说明zkscan3 调控了xist的表达。

讨论

B细胞分化为浆细胞涉及基因表达程序的实质性变化，包括B细胞转录因子和其他B细胞特性的抑制以及诱导产生促进浆细胞分化的转录因子。浆细胞分化需要的转录因子有B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(Blimp-1)，干扰素调节因子4(IRF4)和X-box结合蛋白1(Xbp1)。此外，还需要抑制浆细胞分化的转录因子Pax5，MITF，Bach2和Bcl6。在此，本发明人证明了zkscan3是潜在的浆细胞分化的负调控因子。

ZKSCAN3是锌指蛋白家族的一员，在多种肿瘤细胞类型中均有较高水平的表达，包括结肠癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌与前列腺癌乳腺癌，子宫颈癌等。例如在多发性骨髓瘤中，使用小发夹RNA(shRNA)抑制ZKSCAN3的表达可抑制骨髓瘤细胞系增殖。可喜的是，在zkscan3敲除的小鼠中，本发明人发现浆细胞增加。当给予小鼠接种结直肠癌(MCA38)细胞以及LPS体外刺激B细胞分化的条件下，浆细胞数量显著增加。浆细胞数量增加有利于抗肿瘤的适应性免疫应答。这提示本发明人在临床上为血液系统肿瘤患者靶向ZKSCAN3治疗，一方面可抑制肿瘤细胞的增值，另一方面可以提高机体的适应性免疫应答，进而达到抗肿瘤的作用。

本发明人对zkscan3敲除和野生小鼠的B细胞进行RNA-SEQUENCE分析，用 Q-PCR进一步验证RNA-SEQUENCE的结果，发现xist上调。据报道，X染色体含有许多与免疫相关的基因。在雌性哺乳动物中，X染色体失活(XCI)使无活性X 染色体(Xi)沉默进而富集xist，以平衡两性之间的基因表达，增强雌性的免疫力和自身免疫的易感性。xist的上调促进了浆细胞的分化产生大量的抗体。。另一方面，Eda Yildirim等在小鼠中敲除了xist，发现雌性小鼠患有高度侵袭性骨髓增生性肿瘤和骨髓增生异常综合征(混合MPN/MDS)，具有100％的外显率，包括原发性骨髓纤维化，白血病，组织细胞肉瘤和血管炎，他们认为xist 是小鼠血液系统癌症的有效抑制剂。与此同时，本发明人的荧光素酶报告基因结果显示zkscan3调控了xist的表达。在zkscan3敲除小鼠中，zkscan3下调而 xist上调，这说明zkscan3可能负向调控xist。当然，zkscan3是否负向调控 xist，还需要本发明人在后续的实验中进一步的验证。

总而言之，在zkscan3敲除小鼠中，一方面浆细胞增加有利于抗肿瘤的体液免疫应答；另一方面xist的上调有效的抑制造血系统癌症的发生；其次,zkscan3的敲除不影响小鼠的正常生命活动。鉴于ZKSCAN3是肿瘤治疗重要的潜在靶标,这为将来在临床上通过靶向ZKSCAN3治疗恶性肿瘤患者提供了一定的理论基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> zkscan3基因或其蛋白抑制剂在肿瘤治疗中的应用

<130> P2018-2422

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctagag aattaagtga aagcacagcc ctggatgccc agtctacaga agaccagatg 60

gagcttctgg tcataaaggt ggaggaagaa gaagccggtt ttcccagtag cccagatctg 120

ggttctgagg gctcccgcga gcgcttccga ggcttccgct acccggaggc tgcaggcccc 180

cgcgaggcgc tgagtcggct ccgagagctc tgccgacagt ggctgcagcc tgagatgcac 240

agcaaggagc agatcctgga gctgctggtg ctggagcagt tcctgaccat cctgccgggg 300

aatctgcaga gctgggtgcg ggagcagcat ccagagagcg gggaggaggt ggtggtgcta 360

ttggagtatt tggagaggca gctggatgag ccggcgccgc aggtttcagg tgttgaccag 420

gggcaagaac tgctctgttg caagatggca ctattgacac cagccccagg gtcacaaagt 480

agccaatttc agctaatgaa ggctctgctc aagcatgaat ctgtgggatc ccagccttta 540

caagatagag ttctccaggt ccccgtgctt gcccatggag gatgctgcag agaagataaa 600

gtggtagctt ctaggcttac tccagagtcc caggggttgt tgaaagtgga agatgtggcc 660

ctgaccctca cccctgaatg gacacagcag gattcatctc aggggaatct ctgtagagat 720

gaaaagcagg agaaccatgg cagcctggtc tccctgggtg atgaaaaaca gactaagagc 780

agggacttgc ctccagctga ggagcttcca gaaaaggagc atgggaagat atcgtgccac 840

ctgagagaag acattgccca gattcctaca tgtgcagaag ctggtgaaca ggagggcagg 900

ctacaaagaa agcagaaaaa tgccacagga gggaggcggc acatctgcca tgaatgtgga 960

aagagttttg ctcaaagctc aggcctgagt aaacacagga gaatccacac tggtgagaaa 1020

ccctacgaat gtgaagagtg tggcaaagcc ttcattggga gctctgccct tgtcattcat 1080

cagagagtcc acactggtga gaagccatat gagtgtgaag aatgtggtaa ggccttcagt 1140

catagctcag accttatcaa gcatcagaga acccacactg gggagaagcc ctatgagtgt 1200

gatgactgtg ggaagacctt cagccagagc tgcagcctcc ttgaacatca cagaatccac 1260

actggggaga agccgtatca gtgcagtatg tgtggcaaag cctttaggcg aagttcacat 1320

ctcctgagac atcagaggat ccatactggg gataaaaatg ttcaggaacc tgagcaggga 1380

gaggcctgga aaagtaggat ggaaagccag ttggaaaatg ttgaaactcc catgtcttat 1440

aaatgtaatg agtgtgaaag aagtttcact cagaatacag gcctcattga acatcaaaaa 1500

atccacactg gtgagaaacc ctatcagtgt aatgcgtgtg gaaaaggctt cacccgaatt 1560

tcataccttg ttcaacatca gagaagccat gtagggaaaa acatcctatc acagtga 1617

<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Arg Glu Leu Ser Glu Ser Thr Ala Leu Asp Ala Gln Ser Thr

1 5 10 15

Glu Asp Gln Met Glu Leu Leu Val Ile Lys Val Glu Glu Glu Glu Ala

20 25 30

Gly Phe Pro Ser Ser Pro Asp Leu Gly Ser Glu Gly Ser Arg Glu Arg

35 40 45

Phe Arg Gly Phe Arg Tyr Pro Glu Ala Ala Gly Pro Arg Glu Ala Leu

50 55 60

Ser Arg Leu Arg Glu Leu Cys Arg Gln Trp Leu Gln Pro Glu Met His

65 70 75 80

Ser Lys Glu Gln Ile Leu Glu Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Leu Thr

85 90 95

Ile Leu Pro Gly Asn Leu Gln Ser Trp Val Arg Glu Gln His Pro Glu

100 105 110

Ser Gly Glu Glu Val Val Val Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Arg Gln Leu

115 120 125

Asp Glu Pro Ala Pro Gln Val Ser Gly Val Asp Gln Gly Gln Glu Leu

130 135 140

Leu Cys Cys Lys Met Ala Leu Leu Thr Pro Ala Pro Gly Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ser Gln Phe Gln Leu Met Lys Ala Leu Leu Lys His Glu Ser Val Gly

165 170 175

Ser Gln Pro Leu Gln Asp Arg Val Leu Gln Val Pro Val Leu Ala His

180 185 190

Gly Gly Cys Cys Arg Glu Asp Lys Val Val Ala Ser Arg Leu Thr Pro

195 200 205

Glu Ser Gln Gly Leu Leu Lys Val Glu Asp Val Ala Leu Thr Leu Thr

210 215 220

Pro Glu Trp Thr Gln Gln Asp Ser Ser Gln Gly Asn Leu Cys Arg Asp

225 230 235 240

Glu Lys Gln Glu Asn His Gly Ser Leu Val Ser Leu Gly Asp Glu Lys

245 250 255

Gln Thr Lys Ser Arg Asp Leu Pro Pro Ala Glu Glu Leu Pro Glu Lys

260 265 270

Glu His Gly Lys Ile Ser Cys His Leu Arg Glu Asp Ile Ala Gln Ile

275 280 285

Pro Thr Cys Ala Glu Ala Gly Glu Gln Glu Gly Arg Leu Gln Arg Lys

290 295 300

Gln Lys Asn Ala Thr Gly Gly Arg Arg His Ile Cys His Glu Cys Gly

305 310 315 320

Lys Ser Phe Ala Gln Ser Ser Gly Leu Ser Lys His Arg Arg Ile His

325 330 335

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile

340 345 350

Gly Ser Ser Ala Leu Val Ile His Gln Arg Val His Thr Gly Glu Lys

355 360 365

Pro Tyr Glu Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser His Ser Ser Asp

370 375 380

Leu Ile Lys His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys

385 390 395 400

Asp Asp Cys Gly Lys Thr Phe Ser Gln Ser Cys Ser Leu Leu Glu His

405 410 415

His Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Ser Met Cys Gly

420 425 430

Lys Ala Phe Arg Arg Ser Ser His Leu Leu Arg His Gln Arg Ile His

435 440 445

Thr Gly Asp Lys Asn Val Gln Glu Pro Glu Gln Gly Glu Ala Trp Lys

450 455 460

Ser Arg Met Glu Ser Gln Leu Glu Asn Val Glu Thr Pro Met Ser Tyr

465 470 475 480

Lys Cys Asn Glu Cys Glu Arg Ser Phe Thr Gln Asn Thr Gly Leu Ile

485 490 495

Glu His Gln Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asn Ala

500 505 510

Cys Gly Lys Gly Phe Thr Arg Ile Ser Tyr Leu Val Gln His Gln Arg

515 520 525

Ser His Val Gly Lys Asn Ile Leu Ser Gln

530 535

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctcttcttg ttccacctt 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttgatgcc gttcttct 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagagtagcg aggacttgaa gag 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctggttcgt ctatcttgtg gg 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcattcc tttggcttgt g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatagcatc ctctccgttg ac 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgacagctac taggctcaca t 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaagtccct aaccttagtc tgc 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgggggaaat cacgttctac a 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagcggtcat gcacactca 19

Claims

1.一种ZKSCAN3的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备(i)促进浆细胞分化与增殖、和/或(ii)治疗肿瘤的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ZKSCAN3来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、浆细胞肿瘤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ZKSCAN3包括ZKSCAN3的蛋白、编码核酸、活性片段或其衍生物。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述活性片段和/或衍生物与ZKSCAN3的同源性至少为90％，优选为95％，更优选为98％、99％。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ZKSCAN3的抑制剂抑制ZKSCAN3的活性和/或表达量。

7.一种体外非治疗性的促进浆细胞分化与增殖的方法，其特征在于，包括步骤：

8.一种筛选ZKSCAN3调节剂的候选组合物的方法，其特征在于，包括步骤：

9.一种促进浆细胞分化及增殖和/或治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的ZKSCAN3抑制剂或含有ZKSCAN3抑制剂的药物组合物。

10.一种促进浆细胞分化及增殖和/或治疗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1所述的抑制剂。