CN110195057A - Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法，根据所述方法制备的非人动物或其子代体内不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能，且能够表现出无毛的表型。

Description

Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种Hr基因功能缺失动物模型的构建方法及其在生物医药研究中的应用。
背景技术
小鼠生理过程与人类相似，基因组98％与人类同源，很多小鼠的疾病模型可以基本上真实的模拟人类疾病的发病过程和对药物的反应，因此各种人源化免疫缺陷型小鼠已经成为在医学领域尤其是肿瘤研究过程中常规的、重要的研究工具。
目前公认的免疫缺陷程度最高的小鼠模型为NOD SCID Il2rg-/-小鼠，包括美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的NSG，日本中央实验动物研究所(CentralInstitute for Experimental Animals)的NOG、深圳市体内生物医药科技有限公司的NSI以及北京百奥赛图生物技术有限公司的B-NDG，其中NSG和NOG经过遗传杂交和多代回交获得，背景不纯，实验结果可重复性差。此外，有关文献和资料也指出，NSG和NOG小鼠均存在一定程度的功能性T、B、NK细胞残留。NSI是使用NOD SCID背景小鼠，利用TALEN技术上对Il2rg基因敲除6个碱基，并插入2个碱基，造成移码突变，并没有完全敲除Il2rg基因的编码区，IL-2Rγ链可能仍具有一定的功能。B-NDG将NOD/SCID鼠体内编码的IL-2Rγ链(白细胞介素2受体)的基因编码区完全敲除，对IL-2Rγ链的功能抑制更彻底。该小鼠遗传背景清晰，几乎没有成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失，免疫缺陷程度更高，非常适合人造血干细胞、外周血单核细胞、人肿瘤细胞和组织等的移植和生长。而且对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型研发与药效检测应用等方面。
在人源化免疫缺陷小鼠的实际应用中，具有完全被毛的小鼠，接种细胞前必须先对小鼠进行除毛处理，而除毛不完全、除毛导致皮肤损伤以及除毛后小鼠的残留毛囊，都会干扰后续生物发光和荧光成像的研究，亦不利于对肿瘤细胞生长发育情况的观察。另一方面，无毛小鼠皮肤更接近人类的皮肤，有利于对化妆品、烧伤创面愈合药品等的研究。因此无毛高免疫缺陷型动物模型的建立将极大的缩减实验周期，节约实验成本。
Hairless(无毛)基因简称Hr(Gene ID:55806)，人HR基因定位于8号染色体，鼠Hr基因定位于12号染色体。HR蛋白包含一个C端的十字形结构域和高度保守的C6-锌指结构域，三个阻遏结构域(RD1、RD2和RD30两个TR互作结构域，两个ROR互作结构域，在皮肤和大脑中大量的表达。HR蛋白与多个核受体相互作用，并影响它们的表达，这些核受体包括甲状腺激素受体(TR)，视黄酸相关孤儿受体α(RORα)，维生素D受体(VDR)。HR蛋白通过与去乙酰化酶相互作用阻遏TR的表达，通过一个新型的共激活结合元件(LXXLL)来抑制RORα的转录，通过配体结合受体抑制VDR转录。HR蛋白与核受体的相互作用会影响上皮细胞的发育和功能。在人类中，甲状腺激素(TH)缺乏通常会引起表皮增厚和脱发。在人类和小鼠中，一些Hr突变引起VDR缺乏，导致先天性脱发。
Hr基因功能部分或完全丧失，在很多哺乳动物中都表现为脱毛现象。Gerard M.J.等研究证明，HR蛋白作为转录因子通过参与Wnt/β-catenin信号通路，与其它转录因子相互作用控制毛囊的发育和循环(GerardMJ,2005,PNAS,102(41):14653)。在HR蛋白缺失的突变体中，Wnt信号传导抑制剂过度表达，阻遏Wnt信号通路，并导致毛囊不能再生。Y.Liu等研究发现，小鼠中Hr基因的12号外显子发生无义突变(Hrrh-R)导致Hr基因的mRNA显著减少，在小鼠14d幼龄时，毛囊漏斗状扩张，并迅速充满角质导致脱毛，而此突变引起的脱毛反应不致死或者影响繁殖力(Y.Liuet al,NIH Public Access,2010,47(1):167–176)。朱奎成等使用TALLEN技术获得C57BL/6J背景的Hr基因敲除小鼠，结果发现小鼠自14d开始脱毛，30d左右毛发脱落干净，并保持终身无毛(朱奎成等，2016，中国比较医学杂志，26(8):75-78)。
美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)使用CRISPR技术突变NSG(NOD SCIDIL2γg-/-)小鼠的Rhbdf2基因，获得NSG-BSLD小鼠，该小鼠具有无毛表型(PCT/US2016/059711)，但是该NSG背景小鼠，可能仍然具有背景不纯，T、B、NK细胞残留，体液免疫泄露的问题。深圳体内生物医药科技有限公司在NSI(NOD SCID IL2γg-/-)背景下使用CRISPR技术敲除Foxn1基因获得NSIN(NOD SCID IL2γg-/-Foxn1-/-)小鼠，该小鼠几乎无毛但不是完全无毛；且NSIN小鼠乳腺发育不完全，不能对小鼠哺乳，后代繁育需要通过纯合的NSIN小鼠和杂合的NSIN小鼠交配(CN10661593A)。文献报道，在C57BL/6背景下，使用CRISPR/Cas9敲除Foxn1基因，获得△44/△44和△44/△66突变体，其中△44/△44没有脱毛的表型，而△44/△66突变体经历过前期(4周)脱毛后，后期(5周)又重新被毛，并且Foxn1基因缺失对小鼠具有一定的致死性(Teppei Goto et al,2016,Transgenic Res,25(4):1-12；Liangetal.,1997,Lab Anim Sci,47:549–553；McDermott-Lancaster et al,1987,Int J LeprOther Mycobact Dis,55:885–888)。因此本领域仍需要脱毛更完全、免疫缺陷程度更高、繁殖力更强的动物模型。
为了克服上述缺陷，本领域仍需要提供一种小鼠，该小鼠背景清晰、脱毛完全、繁殖力较高，在实际应用中不仅简化了实验过程，生物成像更清晰，更便于观察肿瘤发生过程，还极大的缩减了实验成本和实验周期，不仅可以应用于肿瘤细胞发育的研究，对药物筛选、皮肤病、化妆品的研究也有重要的应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使用EGE技术敲除和/或敲入免疫缺陷小鼠的Hr的特定片段或全部片段，获得无毛的免疫缺陷动物模型Hr KO小鼠。本发明成果得到的基因改造小鼠背景清晰，脱毛完全，繁殖力较高，生物成像更清晰，更便于观察肿瘤发生过程，还极大的缩减了实验成本和实验周期。成功制备Hr基因改造动物模型，该模型体内不表达HR蛋白，可用于肿瘤细胞发育的研究，在药物筛选、皮肤病、化妆品的研究上也有重要的应用价值。
利用本发明所述的方法进行基因改造动物模型的制备可以加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。
同时还可以利用本模型与其它动物模型交配得到双基因改造动物模型或多基因改造动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
本发明的第一方面，涉及一种Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代，所述动物的细胞、组织或器官中不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能。
优选的，所述不表达HR蛋白的动物中，删除所述动物Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生了移码突变。进一步优选的，删除所述动物的Hr基因的第2内含子至第7内含子的全部或部分序列，或者，向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
优选的，所述非人动物或其子代是免疫缺陷的。
优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
进一步优选的，所述非人动物或其子代遗传背景为免疫缺陷小鼠；
在本发明的一个具体实施方式中，所述免疫缺陷小鼠遗传背景为B-NDG小鼠。
优选的，所述的非人动物或其子代，进一步包含在非人动物或其子代体内进行人免疫系统重建。进一步优选的，所述人免疫系统重建使用人外周血细胞移入，或使用人造血干细胞移入。其中，所述人造血干细胞为CD34+细胞。
本发明的第二方面，涉及一种Hr基因经遗传修饰的细胞株，所述细胞株中不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能。
优选的，删除所述细胞株中Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
进一步优选的，删除所述细胞株中Hr基因的第2内含子至第7内含子的全部或部分序列，或者，向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
优选的，所述细胞株来源于非人动物或其子代。进一步优选的，所述动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
优选的，所述细胞株遗传背景为免疫缺陷小鼠的细胞株；
在本发明的一个具体实施方式中，所述免疫缺陷小鼠遗传背景为B-NDG小鼠。
本发明的第三方面，涉及一种靶向动物Hr基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列在待改变的Hr基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
优选的，所述sgRNA在小鼠Hr基因的靶位点位于小鼠Hr基因的第2内含子和/或第7内含子上。
优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：4所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：10所示。
优选的，编码sgRNA的DNA分子双链序列为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17，或SEQID NO：19和SEQ ID NO：21。
本发明的第四方面，涉及一种包含上述的sgRNA序列的构建体。
本发明的第五方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Hr基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Hr基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
优选的，所述的方法包括如下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：22所示，其中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
本发明的第六方面，涉及一种细胞，所述细胞包含一种或多种上述的sgRNA序列和/或一种或多种上述的构建体和/或上述方法获得sgRNA载体。
本发明的第七方面，涉及上述的sgRNA序列、上述的构建体或上述的细胞在构建Hr基因敲除/敲入动物或HR基因人源化动物中的应用。
本发明的第八方面，涉及一种Hr基因经遗传修饰非人动物或其子代的制备方法，所述动物体内的细胞、组织或器官中不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能。
优选的，删除所述动物Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括删除所述动物Hr基因的第2内含子至第7内含子的全部或部分序列，或者，向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
优选的，所述非人动物或其子代是免疫缺陷的。
优选的，使用基因编辑技术进行Hr基因改造动物的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行Hr基因改造动物的建立。
优选的，使用靶向Hr基因的sgRNA序列删除动物Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生移码突变，使得非人动物或其子代体内HR蛋白不表达或表达的HR蛋白不具有功能。
其中，所述sgRNA序列在待改变的Hr基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；
优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
优选的，所述的制备方法，包括如下步骤：
1)提供一种上述的细胞，所述细胞包含一种或多种上述的sgRNA序列和/或一种或多种上述的构建体和/或上述方法获得sgRNA载体；
2)将步骤1)所述细胞在培养液中进行培养；
3)将步骤2)培养后的细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
4)鉴定步骤(3)的怀孕雌性的子代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
进一步优选的，所述非人动物或其子代遗传背景为免疫缺陷的；
在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物或其子代遗传背景为B-NDG小鼠。
优选的，所述的制备方法，包括如下步骤：
1)按照上述制备sgRNA载体的步骤(1)-(4)，获得sgRNA载体；
2)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
3)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Hr基因改造成功，获得Hr基因改造阳性非人动物；
4)将步骤3)筛选出的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Hr基因改造动物。
进一步优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：24和SEQID NO：25所示。
优选的，所述的制备方法包含在经遗传修饰的非人动物或其子代体内进行人免疫系统重建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述人免疫系统重建使用人外周血细胞，或使用人造血干细胞。
优选的，所述动物用作动物模型。更优选的，所述动物动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
本发明的第九方面，涉及根据上述的制备方法产生的基因改造非人动物或其子代。优选的，所述的非人动物为啮齿类动物。更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠
本发明的第十方面，涉及一种制备多基因改造非人动物或其子代的方法，包括如下步骤：
a)利用上述的非人动物或其子代；
b)将步骤a)获得的动物与其他基因改造动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因改造非人动物或其子代。
优选的，所述多基因改造动物可以是双基因改造动物、三基因改造动物、四基因改造动物、五基因改造动物、六基因改造动物、七基因改造动物、八基因改造动物或九基因改造动物。
本发明的第十一方面，涉及根据上述的方法产生的多基因改造非人动物或其子代。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第十二方面，涉及一种荷瘤动物模型，来源于上述的非人动物或其子代或上述的多基因改造非人动物或其子代。
优选的，所述的动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第十三方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或其子代或上述的多基因改造非人动物或其子代。
本发明的第十四方面，涉及一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述的非人动物或其子代或上述的多基因改造非人动物或其子代。
优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第十五方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
本发明的第十六方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在Hr基因或蛋白相关的领域中的应用。
本发明的第十七方面，涉及来源于上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
来源于上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
来源于上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在筛选、验证、评价或研究免疫缺陷药物、药效研究，免疫缺陷相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
优选的，所述应用包括使用人PBMC在体内进行人免疫系统重建和/或移植人肿瘤细胞后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内抑瘤效果评估或筛选。
本发明的第十八方面，涉及所述的非人动物或子代在肿瘤细胞发育的研究的应用或药物筛选、皮肤病领域及化妆品试验研究的应用。
本发明的第十九方面，涉及一种Hr基因敲除小鼠使用人PBMC进行免疫系统重建的方法，包括将人肿瘤细胞移入所述的小鼠体内，向移入人肿瘤细胞的小鼠给予所述肿瘤相应药物，对给予药物的小鼠进行检测。
优选的，所述Hr基因敲除小鼠为免疫缺陷的。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的小鼠遗传背景为B-NDG。
优选的，所述的小鼠为上述Hr基因经遗传修饰非人动物或其子代的制备方法获得的小鼠。
优选的，所述肿瘤细胞选自B细胞淋巴瘤细胞株、人外周血细胞或脐带血细胞中的一种或两种以上的组合；优选的，所述人外周血细胞选自CD34+细胞或多发性骨髓瘤细胞。
优选的，所述移入的方法为鼠尾注射和/或股骨内注射和/或胫骨内注射。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的存活力和/或增值速率；所述检测的方法为流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
本发明的第二十方面，涉及一种人用药剂筛选或评价的方法，包括将人肿瘤细胞移入已通过移植人PMBC重建人免疫系统的上述的Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代体内，向移入人肿瘤细胞的非人动物或其子代给予候选药剂，对给予药剂的非人动物或其子代进行药效检测和比较。
优选的，所述的Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代为上述Hr基因经遗传修饰非人动物或其子代的制备方法获得的Hr基因经遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
优选的，所述候选药剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增值速率；所述检测的方法为游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
本发明的第二十一方面，涉及一种CAR-T体内验证的方法，包括向上述非人动物或其子代体内植入人肿瘤细胞，向植入人肿瘤细胞的非人动物或其子代注射人CAR-T，对注射人CAR-T后的非人动物或其子代进行肿瘤抑制效果检测和评价。
优选的，所述非人动物或其子代为上述制备方法制备的小鼠或已通过移植人PMBC重建人免疫系统的上述方法制备的小鼠。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：sgRNA活性检测结果，其中，Con.为阴性对照，PC为阳性对照，A为识别5’端靶位点的序列sgRNA1-sgRNA7的相对活性图，B为识别3’端靶位点的序列sgRNA8-sgRNA14的相对活性图；
图2：pT7-sgRNA G2质粒图谱示意图；
图3：F0代小鼠PCR检测，其中，WT为B-NDG野生型对照，H2O为水对照，F0-1、F0-4、F0-18、F0-21、F0-28、F0-35、F0-37、F0-38、F0-41、F0-45为F0代阳性小鼠编号；
图4：F0-18与野生型杂交后代的PCR检测；其中，F1-2、F1-3、F1-7代表F0-18杂交后代，WT为B-NDG小鼠，M为Marker，+为阳性对照。H2O为水对照；
图5：F0-28与野生型杂交后代的PCR检测；其中，F1-10、F1-11、F1-12代表F0-28杂交后代，WT为B-NDG小鼠，M为Marker，+为阳性对照。H2O为水对照；
图6：Hr基因突变重度免疫缺陷小鼠图片；
图7：B-NDG小鼠图片；
图8：本发明方法获得的重度免疫缺陷小鼠体内移植人肿瘤细胞后的荷瘤小鼠图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-CM-001；
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
EcoRI，BamHI，BbsI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3136M，R0539L；
卡那霉素购自Amresco，货号为0408；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；
pHSG299质粒购自Takara，货号3299。
实施例1 Hr基因sgRNA的设计
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
针对小鼠Hr基因(NCBI Gene ID:15460)设计多个sgRNA，其中，各个sgRNA靶向的靶位点序列如下：
sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-acccgacaggctcgagtcactgg-3’
sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-cctggcactgccgtcgggcttgg-3’
sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-ccccagagagacgcaagcgaggg-3’
sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-cgctgctaactgaagcccggagg-3’
sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-ttccctcgcttgcgtctctctgg-3’
sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-ggtgccctggcactgccgtcggg-3’
sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-cccagtgactcgagcctgtcggg-3’
sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-ggtgctagggaccggaacgtagg-3’
sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-aaacaggaggacctacgttccgg-3’
sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-gcaatgtttaagtcgagccaggg-3’
sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-gcatgtatgacggtcagatttgg-3’
sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-tgcacgtgcacgcatgccctcgg-3’
sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-tctacattaacatcgtgaaatgg-3’
sgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-attcagtccgatccttctcaagg-3’
所述sgRNA1-sgRNA7识别靶基因上的5’端靶位点，sgRNA8-sgRNA14识别靶基因上的3’端靶位点。5’端靶位点位于Hr基因的第2内含子上，3’端靶位点位于第7内含子上(基于NCBI登录号为NM_021877.3→NP_068677.2的转录本)。
实施例2 sgRNA的筛选
利用UCA试剂盒检测上述sgRNA的活性，结果显示sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1和表1。根据活性检测结果，从中优选sgRNA4和sgRNA10并在其上游序列的5’端加上TAGG分别得到sgRNA4和sgRNA10正向寡核苷酸，在其互补链(下游序列)的5’端加上AAAC分别得到sgRNA4和sgRNA10得到反向寡核苷酸，合成正向、反向寡核苷酸后进行后续实验。
sgRNA4序列上游：5’-cgctgctaactgaagcccgg-3’(SEQ ID NO：15)
sgRNA4正向寡核苷酸：5’-taggcgctgctaactgaagcccgg-3’(SEQ ID NO：16)
sgRNA4序列下游：5’-ccgggcttcagttagcagcg-3’(SEQ ID NO：17)
sgRNA4反向寡核苷酸：5’-aaacccgggcttcagttagcagcg-3’(SEQ ID NO：18)
sgRNA10序列上游：5’-gcaatgtttaagtcgagcca-3’(SEQ ID NO：19)
sgRNA10正向寡核苷酸：5’-tagggcaatgtttaagtcgagcca-3’(SEQ ID NO：20)
sgRNA10序列下游：5’-tggctcgacttaaacattgc-3’(SEQ ID NO：21)
sgRNA10反向寡核苷酸：5’-aaactggctcgacttaaacattgc-3’(SEQ ID NO：22)
表1 UCA检测结果
实施例3 pT7-sgRNA G2质粒构建
由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体pHSG299上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒：pT7-sgRNAG2质粒图谱见图2。
含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：23)：
5’-gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc-3’
实施例4 pT7-Hr-4和pT7-Hr-10质粒的构建
将实施例2中获得的正向、反向寡核苷酸退火后分别将退火产物连接至pT7-sgRNAG2质粒(质粒先用BbsI线性化)。
连接反应体系见表2：
表2连接反应体系
sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA G2载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H<sub>2</sub>O 补至10μL
反应条件：
室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-Hr-4和pT7-Hr-10进行后续实验。
实施例5显微注射、胚胎移植及繁育
取B-NDG小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将pT7-Hr-4和pT7-Hr-10质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)与Cas9mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的Hr基因突变小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的Hr基因突变重度免疫缺陷小鼠品系。
实施例6 Hr基因突变小鼠的基因型鉴定
1、F0代基因型鉴定
为了验证是否获得了F0代Hr基因突变杂合子小鼠，将实施例5中获得的F0代小鼠剪尾提取基因组DNA，然后以提取的DNA为模板，以引物MSD-F(SEQ ID NO：24)和MSD-R(SEQID NO：25)扩增片段，MSD-F位于sgRNA4靶位点左侧，MSD-R位于sgRNA10靶位点右侧，WT应扩增片段长度为7859bp，在PCR检测中延伸10s不能扩增此片段；突变体检测片段长度为610bp左右。具体引物序列如下：
MSD-F(SEQ ID NO：24)：5’-gctcacgtacatccatccctcttgg-3’
MSD-R(SEQ ID NO：25)：5’-tagaattcttgtttttggaacgcaga-3’
反应体系和扩增条件见表3、4；多只阳性F0代小鼠的扩增结果见图3。
表3 PCR反应体系(20μL)
2×PCR buffer 10μL
dNTP(2μM) 4μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 100ng
KOD-FX(1U/μL) 0.4μL
H<sub>2</sub>O 补至20μL
表4 PCR扩增反应条件
将阳性小鼠的PCR产物送测序公司进行测序。F0代小鼠测序结果表明(表5)，利用本方法得到了多只Hr基因敲除小鼠，且存在多种突变类型。
表5 F0代基因检测结果
编号 性别 测序结果
F0-1 ♂ △7258
F0-4 ♂ △7252
F0-18 ♂ △7253
F0-21 ♂ in15△7248
F0-28 ♂ △7257
F0-35 ♀ △7265
F0-37 ♀ in1△7254
F0-38 ♀ in4△7263
F0-41 ♀ △7252
说明：△为敲除，如△7258为敲除7258bp，△7252为敲除7252bp；in为敲入，in15为敲入15bp，in1为敲入1bp。
2、F1代基因型鉴定
将鉴定为阳性的F0小鼠与B-NDG小鼠交配，可得到F1代小鼠。例如，可将F0-18与野生型B-NDG小鼠交配，或将F0-28与野生型B-NDG小鼠交配，对得到的多只后代小鼠进行鼠尾检测，检测方法同F0代基因鉴定，结果显示共有6只小鼠为F1代阳性小鼠，PCR检测结果见图4、5，其中编号为F1-2、F1-3、F1-7的小鼠为F0-18后代，编号为F1-10、F1-11、F1-12为F0-28的后代。进一步对这6只小鼠进行测序验证，测序结果见表6。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代的Hr基因敲除小鼠。
表6 F1代基因检测结果
将F1代检测为阳性的小鼠进行相互交配，可以从后代中筛选获得具有无毛表型的阳性F2代纯合子小鼠，结果见图6所示。作为对比，图7显示的是未敲除Hr基因的B-NDG小鼠。
实施例7 Hr基因突变小鼠的人免疫系统重建
使用本发明方法获得的Hr基因突变重度免疫缺陷小鼠，在移植人外周血细胞(hPBMC)或人造血干细胞后，可以在小鼠体内构建人免疫系统重建的人源化小鼠模型。
以hPBMC重建为例，选取3只使用本方法制备的免疫缺陷小鼠，通过尾静脉注射5×106人外周血细胞(hPBMC)，24天后取血进行流式细胞检测。流式数据显示，通过注射人外周血细胞(hPBMC)，可以在3只免疫缺陷小鼠体内检测到表达人白细胞表面分子标记(CD45+)的细胞。本测试例结果表明通过移植人外周血细胞，可以初步在小鼠体内重建人免疫系统。
进一步的，在本发明方法获得的重度免疫缺陷小鼠或完成人免疫系统重建的小鼠体内移植人肿瘤细胞(图8所示)，得到的荷瘤鼠模型可用于筛选抗肿瘤的抗体药物及进行药效测试。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司
北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用
<130> 1
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acccgacagg ctcgagtcac tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctggcactg ccgtcgggct tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccagagag acgcaagcga ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctgctaac tgaagcccgg agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttccctcgct tgcgtctctc tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgccctgg cactgccgtc ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccagtgact cgagcctgtc ggg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgctaggg accggaacgt agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacaggagg acctacgttc cgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaatgttta agtcgagcca ggg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatgtatga cggtcagatt tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcacgtgca cgcatgccct cgg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctacattaa catcgtgaaa tgg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attcagtccg atccttctca agg 23
<210> 15
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgctgctaac tgaagcccgg 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taggcgctgc taactgaagc ccgg 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccgggcttca gttagcagcg 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaacccgggc ttcagttagc agcg 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaatgttta agtcgagcca 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagggcaatg tttaagtcga gcca 24
<210> 21
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tggctcgact taaacattgc 20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaactggctc gacttaaaca ttgc 24
<210> 23
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
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<210> 24
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<210> 25
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tagaattctt gtttttggaa cgcaga 26

Claims (30)

1.一种Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法，其特征在于，所述动物体内的细胞、组织或器官中不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，删除所述动物Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，删除所述动物Hr基因的第2内含子至第7内含子的全部或部分序列，或者，向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述非人动物或其子代遗传背景是免疫缺陷的；优选的，所述的非人动物或其子代为免疫缺陷的啮齿类动物；更优选的，所述的非人动物或其子代为免疫缺陷的小鼠。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行Hr基因改造动物的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，使用靶向Hr基因的sgRNA序列删除动物Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生移码突变，使得非人动物或其子代体内HR蛋白不表达或表达的HR蛋白不具有功能；
其中，所述sgRNA序列在待改变的Hr基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；
优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备获得sgRNA载体；
2)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
3)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Hr基因改造成功，获得Hr基因改造阳性非人动物；
4)将步骤3)筛选出的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Hr基因改造动物；
优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示。
8.根据权利1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含在经遗传修饰的非人动物或其子代体内进行人免疫系统重建。
9.根据权利要求1-8任一所述的制备方法，其特征在于，所述动物用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
10.一种根据权利要求1-9任一所述的制备方法产生的Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代。
11.一种Hr基因经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株不表达HR蛋白或表达的HR蛋白不具有功能。
12.根据权利要求11所述的细胞株，其特征在于，删除所述细胞株中Hr基因的全部或部分序列或向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
13.根据权利要求11或12所述的细胞株，其特征在于，删除所述细胞株Hr基因的第2内含子至第7内含子的全部或部分序列，或者，向Hr基因座插入序列产生了移码突变。
14.根据权利要求11-13任一所述的细胞株，其特征在于，所述的细胞株遗传背景为免疫缺陷的非人动物或其子代的细胞株；优选的，所述细胞株遗传背景为免疫缺陷的啮齿类动物的细胞株；更优选的，所述的细胞株遗传背景为免疫缺陷的小鼠的细胞株。
15.一种制备多基因改造非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)利用权利要求1-9任一所述的制备方法获得的非人动物或其子代，或者，权利要求10所述的非人动物或其子代；
b)将步骤a)获得的动物与其他基因改造动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因改造非人动物或其子代。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述多基因改造动物可以是双基因改造动物、三基因改造动物、四基因改造动物、五基因改造动物、六基因改造动物、七基因改造动物、八基因改造动物或九基因改造动物。
17.一种根据权利要求15或16所述的方法产生的多基因改造非人动物或其子代。
18.一种靶向动物Hr基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在待改变的Hr基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
19.根据权利要求18所述的sgRNA序列，其特征在于，所述动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠；所述sgRNA在小鼠Hr基因的靶位点位于小鼠Hr基因的第2内含子和/或第7内含子上。
20.根据权利要求18或19所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：4所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：10所示。
21.一种包含权利要求18-20任一所述的sgRNA序列的构建体。
22.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含一种或多种权利要求18-20任一所述的sgRNA序列和/或一种或多种权利要求21所述的构建体。
23.根据权利要求18-20任一所述的sgRNA序列、权利要求21所述的构建体或权利要求22所述的细胞在构建Hr基因敲除/敲入动物或HR基因人源化动物中的应用。
24.一种荷瘤动物模型，其特征在于，来源于权利要求10所述的非人动物或其子代，或者，权利要求17所述的多基因改造非人动物或其子代。
25.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求10所述的非人动物或其子代或权利要求17所述的多基因改造非人动物或其子代。
26.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求10所述的非人动物或其子代或权利要求17所述的多基因改造非人动物或其子代。
27.一种权利要求10所述的非人动物或其子代、权利要求11-14任一所述的细胞株、权利要求17所述的多基因改造非人动物或其子代或权利要求25所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物在制备动物模型中的用途。
28.来源于权利要求10所述的非人动物或其子代、权利要求11-14任一所述的细胞株、权利要求17所述的多基因改造非人动物或其子代、权利要求24所述的荷瘤动物模型、权利要求25所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或权利要求26所述的组织或器官在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究免疫缺陷药物、药效研究，免疫缺陷相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用；
优选的，所述应用包括使用人PBMC在体内进行人免疫系统重建和/或移植人肿瘤细胞后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内抑瘤效果评估或筛选。
29.一种人用药剂筛选或评价的方法，其特征在于，包括将人肿瘤细胞移入已通过移植人PMBC重建人免疫系统的权利要求10或17所述的非人动物或其子代体内，向移入人肿瘤细胞的非人动物或其子代给予候选药剂，对给予药剂的非人动物或其子代进行药效检测和比较。
30.一种CAR-T体内验证的方法，其特征在于，包括向权利要求10或17所述的非人动物或其子代体内植入人肿瘤细胞，向植入人肿瘤细胞的非人动物或其子代注射人CAR-T，对注射人CAR-T后的非人动物或其子代进行肿瘤抑制效果检测和评价。
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