CN117471107A - 检测先天性无毛症的hr突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

检测先天性无毛症的hr突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用。所述HR突变基因相比于野生型HR基因第12号外显子的第2754位碱基由G突变为T。根据本发明提供的一种检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用，不仅能丰富基因诊断先天性无毛症的突变位点，也为治疗先天性无毛症提供了基础，缩短了检测所用时间，方便医生或者患者及时了解病情，并针对性的进行后续治疗。

Description

检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
先天性无毛症是一组罕见的遗传性皮肤病，具有较强的临床和遗传异质性，其临床表现为头皮或身体其他部位的毛发缺失或完全脱光，伴或不伴有身体其他系统的损害，根据表型可分为综合征型和非综合征型。先天性少毛症的遗传模式常呈常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及性连锁遗传。或伴丘疹性损害先天性无毛症（atrichia withpapular lesions，APL；MIM 209500）。本病系常染色体隐性遗传，其致病基因是HR基因(MIM602302）。APL患者出生时毛发正常，出生后不久头皮毛发完全脱失且不可逆，大概2岁时，患者开始出现多发的毛囊丘疹，出现在面部、头皮、肢端等，某些患者还可见色素减退斑。
其中HR基因(MIM 602302）基因突变会导致常染色体隐性遗传疾病先天性无毛症（MIM 209500）；HR基因定位于染色体8p21.3，包括19个外显子和18个内含子，基因长16.6kb，开放读码框3567bp，编码1189个氨基酸序列的HR蛋白（无毛基因蛋白）。HR只表达在皮肤和大脑，其表达产物是无毛蛋白，分子量为130kDa，该蛋白功能的缺陷会导致毛发生长周期的不稳定，其可能在第一个毛发生长周期起作用，由于此蛋白的缺失，毛囊的分化不会被诱导，休止期毛囊不会重新进入生长期，新的毛发也就无法再生长，进而导致毛发的脱落。无毛蛋白功能缺失还可导致毛囊结构的不成熟，从而引起多发性的扩散性毛囊丘疹。目前已经发现了数十种种不同的HR基因突变，包括不同的突变类型，如错义突变、无义突变、缺失突变和剪切位点突变等。其中，国外报道近亲结婚的家系，APL的HR基因的突变多为纯合突变。
基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊先天性无毛症的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。现有技术中对基因突变位点的基因型进行检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的，所以需要针对特异突变位点的特异性扩增引物、测序引物，并将通过上述引物进一步对突变基因测序，并应用于治疗先天性无毛症。
综上所述，急需一种检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用以解决相关技术中存在的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用，以解决现有技术中不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种HR突变基因，所述HR突变基因的序列如SEQID NO.48所示，其中第12号外显子的第2754位碱基为T。
通过提供的一种HR突变基因，不仅能丰富基因诊断先天性无毛症的突变位点，还能将该突变基因作为靶点为药物筛选、药效评价及靶向治疗提供基础。
本发明还提供一种HR突变基因蛋白，所述HR突变基因蛋白的序列如SEQ ID NO.49所示，其中第918位氨基酸为半胱氨酸。
本发明还提供一种如上述HR突变基因作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
通过将HR突变基因作为检测靶点用于制备试剂或制备试剂盒，从而丰富了对于先天性无毛症的检测手段的种类的同时，能通过试剂或试剂盒直接检测由于HR突变基因导致的先天性无毛症，缩短了检测所用时间，方便医生或者患者及时了解病情，并针对性的进行后续治疗。
优选的，所述试剂和/或试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物HR-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物HR-1R。
通过本发明提供的扩增引物能够特异性扩增HR突变基因和野生型HR基因，为后续检测HR突变基因以及诊断先天性无毛症提供基础。
优选的，所述试剂和/或试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物HR-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物HR-Seq1R。
通过本发明提供的测序引物能够特异性检测HR突变基因，用于区分HR突变基因和野生型HR基因，进而诊断先天性无毛症。
本发明还提供了一种如上述HR突变基因蛋白作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测先天性无毛症的试剂，所述试剂的检测靶点包括上述HR突变基因或如上述HR突变基因蛋白。
本发明还提供了一种用于检测先天性无毛症的试剂盒，所述试剂的检测靶点包括上述HR突变基因或如上述HR突变基因蛋白。
优选的，所述试剂盒包括预防先天性无毛症试剂盒、诊断先天性无毛症试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗先天性无毛症试剂盒中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂包括dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Taq聚合酶。
本发明在制备试剂的基础上，进一步将该试剂用于制备试剂盒，并得到了不同种类的试剂盒，具体包括预防先天性无毛症试剂盒、诊断先天性无毛症试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗先天性无毛症试剂盒中的一种或多种，从而能够在不同阶段（例如孕前、产前以及后期的诊断和治疗）用于检测和治疗先天性无毛症。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中先天性无毛症1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，表示女性携带者，□表示正常男性个体，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
图2为本发明一实施例中利用Sanger测序检测HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型的结果图，其中1号家系先证者为“c.2754G>T”纯合突变，先证者父亲、先证者母亲、胎儿为“c.2754G>T”杂合突变携带者（测序图中箭头所指为突变发生位置）。
图3为本发明一实施例中先天性无毛症2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者。
图4为本发明一实施例中利用试剂盒检测2号家系HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型的结果图，其中2号家系先证者为“c.2754G>T”纯合突变，先证者父亲、母亲、弟弟为“c.2754G>T”杂合突变（测序图中箭头所指为突变发生位置）。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施方式中所有方向性指示（诸如上、下……）仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明首先利用外显子测序筛选与先天性无毛症高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，最终获得导致先天性无毛症的HR突变基因（HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C。所述HR突变基因包括如SEQ ID NO.5（ATTCTGGAGGGC，方框内字母为突变后碱基）所示的核苷酸序列，所述HR突变基因相比于野生型HR基因第12号外显子的第2754位碱基由G突变为T，所述野生型HR基因的转录本ID号为NM_005144.5，其序列如SEQ ID NO.46所示，所述HR突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
通过提供的HR突变基因，不仅能丰富基因诊断先天性无毛症的突变位点，还能将该突变基因作为靶点为药物筛选、药效评价及靶向治疗提供基础，本发明的HR突变基因还可以作为诊断先天性无毛症的生物标志物，用于区分先天性无毛症患者和正常人群区。
本发明还提供一种HR突变基因蛋白，所述HR突变基因蛋白相较于野生型HR基因编码的蛋白，第918位氨基酸由色氨酸突变为半胱氨酸。即所述HR突变基因蛋白含有p.W918C的突变，所述突变是由于c.2754G>T的错义突变引起的；所述HR突变基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6（STTFEGFS）所示（方框内字母为突变后的氨基酸），所述野生型HR基因编码的蛋白的ID号为NP_005135.2，其序列如SEQ ID NO.47所示，所述HR突变基因蛋白如SEQ IDNO.49所示。
本发明还提供一种如上述HR突变基因作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
通过将HR突变基因作为检测靶点用于制备试剂或制备试剂盒，从而丰富了对于先天性无毛症的检测手段的种类的同时，更是能通过试剂或试剂盒直接检测由于HR突变基因导致的先天性无毛症，缩短了检测所述时间，方便医生或者患者及时了解病情，并针对性的进行后续治疗。
在一些实施例中，所述试剂和/或试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物HR-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物HR-1R。
通过本发明提供的扩增引物能够特异性扩增HR突变基因和野生型HR基因，为后续检测HR突变基因进行诊断先天性无毛症提供基础。
在一些实施例中，所述试剂和/或试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物HR-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物HR-Seq1R。
通过本发明提供的测序引物能够特异性检测HR突变基因，用于区分HR突变基因和野生型HR基因，进而诊断先天性无毛症。
本发明还提供一种用于检测先天性无毛症的引物组合，包括上述扩增引物和/或上述测序引物。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。
通过引物组合检测是否存在HR突变基因，具体是通过扩增引物得到扩增产物，然后通过测序引物进行测序，从而判断是否存在HR突变基因。
通过本发明提供的引物组合用于检测先天性无毛症的HR突变基因的方法如下：
提取待测样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，用所述扩增引物试剂扩增HR基因序列；
采用测序引物试剂对扩增的HR基因序列进行DNA测序；
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中HR基因未发生突变为野生型；若比对结果出现两个等位HR基因（NM_005144.5）的第12号外显子中2754位碱基G突变为T，则判断该基因型为“c.2754G>T纯合突变”，则判断患有先天性无毛症或携带有HR突变基因。
在本发明中，扩增HR基因序列的扩增引物试剂优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/L dNTPs 0.4μL、100ng/μL HR-1F 0.5μL、100ng/μL HR-1R 0.5μL、100ng/μL 抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL以及ddH2O 15.4μL。当扩增引物为上游引物HR-1F和下游引物HR-1R时，所述扩增HR基因序列的反应步骤包括：第一步：95℃预变性5min；第二步：30个循环（95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s）；第三步：保持温度72℃，7分钟；第四步：4℃保温。
本发明还提供了一种如上述HR突变基因蛋白作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测先天性无毛症的试剂，所述试剂的检测靶点包括上述HR突变基因或如上述HR突变基因蛋白。
本发明还提供了一种用于检测先天性无毛症的试剂盒，所述试剂的检测靶点包括上述HR突变基因或如上述HR突变基因蛋白。
在一些实施例中，所述试剂盒包括预防先天性无毛症试剂盒、诊断先天性无毛症试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗先天性无毛症试剂盒中的一种或多种。
在本发明中，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂包括dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Taq聚合酶。10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：优选浓度为500mmol/LKCl、优选pH 8.3的100mmol/L Tris-Cl和优选浓度为15mmol/L MgCl2。
利用所述试剂盒辅助诊断先天性无毛症的方法，包括：
用所述试剂盒检测样本中HR基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有先天性无毛症：
若检测基因型是“c.2754G>T纯合突变”，则诊断受试个体为先天性无毛症；
若检测基因型存在单个杂合突变“c.2754G>T杂合突变”，则诊断受试个体为携带者；
若检测基因型是“野生型”，则诊断受试个体为正常人。
所述样本包括血液以及羊水中的一种或多种。
本发明在制备试剂的基础上，进一步将该试剂用于制备试剂盒，并得到了不同种类的试剂盒，具体包括预防先天性无毛症试剂盒、诊断先天性无毛症试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗先天性无毛症试剂盒中的一种或多种，从而能够在不同阶段（例如孕前、产前以及后期的诊断和治疗）用于检测和治疗先天性无毛症。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，术语“常染色体隐性遗传”是指父母双方常染色体上都有致病基因时，一个致病基因不会导致疾病，但若父母将致病基因都传给孩子，孩子就可能生病，与性别无关。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生同样突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
在本发明中，术语“错义突变”是指是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增HR基因是指，在PCR反应中引物只扩增HR基因，而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种检测先天性无毛症的HR突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本获取
以1个先天性无毛症家系（简称1号家系）为受试对象，该家系部分成员的临床信息见表1。图1为1号家系遗传图谱，其中，表示男性携带者，表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：
伴丘疹性损害的先天性无毛症诊断标准：1.家族史：符合常染色体隐性遗传方式；部分患者出生时即无毛发生长，或者出生时具有正常毛发，而于数月后脱落且不再生长；1周岁内即可开始出现丘疹，多见于眼中线下，面部和四肢。2.体检：完全没有或几乎没有头发；眉毛及睫毛稀少；无腋毛、阴毛和体毛；丘疹或多或少的分布于全身所有部位或其中数处，包括头皮、面颊、手臂、肘部、股和膝部；甲和牙齿正常，汗液分泌正常，生长发育正常；头皮色素减退性条纹。实验室检查：组织病理上无成熟的毛囊结构，囊内充满角化性物质；HR基因突变。该病对于各种常规的治疗方法均反应不佳。
表1 先天性无毛症1号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ（第一代）、Ⅱ（第二代）。
采集1号家系人员Ⅰ:1（先证者父亲）、Ⅰ:2（先证者母亲）、Ⅱ:1（先证者）外周血 DNA和Ⅱ:2（胎儿）羊水DNA用于测序分析。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒（Agilent）、DNA 1000试剂盒（Agilent）、96孔板（Axygen）、不同型号枪头（Axygen）、200μL离心管（Eppendorf）、1.5mL离心管（Eppendorf）、毛细管电泳缓冲液（Thermo）、测序标准物（Thermo）、无水乙醇（Thermo）、BigDyeTerminator v3.1（Thermo）、外周血gDNA提取试剂盒（TIANGEN）、琼脂糖（TIANGEN）、EB染液（Amresco）。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释表3中的5×TBE电泳液贮存液10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ:1（先证者父亲）、Ⅰ:2（先证者母亲）、Ⅱ:1（先证者）等成员的外周血3~5mL和Ⅱ:2（胎儿）羊水10-20mL。
4.1样本DNA提取
1)将样本3~5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿（1:1 v/v）混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
参考人类全外显子测序试剂盒（Agilent）说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。
1) 取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150~250bp片段；
2) DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3) 连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4) Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5) NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到1个具有致病意义的基因纯合突变HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C；c.2754G>T突变为第12号外显子的第2754位碱基由G突变为T，造成了错义突变。在1号家系患者（先证者）HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点的基因型是“c.2754G>T”纯合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.2754G>T”杂合突变。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系中Ⅰ:1（先证者父亲）、Ⅰ:2（先证者母亲）、Ⅱ:1（先证者）、Ⅱ:2（胎儿）等4名人员和100名家系外正常人进行HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）。
2.2针对c.2754G>T位点分别设计20对候选引物（见表6），并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6 各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15~30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40%~60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3 候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管（表7中序号1至8）。
表7 引物检测PCR反应体系
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环（95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒）；（根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值）。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4 候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上（加石棉网）加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1）如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2）如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3）如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4）如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6 根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对（表6中位点1号对候选引物）作为突变家系检测用引物：
针对HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点的PCR扩增引物序列如下：
HR-1F :5’-CTGCCCTTACAACACGC-3’（SEQ ID NO.1）；
HR-1R :5’-AGGTTCTCCACCCTGTCA-3’（SEQ ID NO.2）。
其他候选引物因为存在引发发夹结构、或引物二聚体、或非特异性结合扩增，导致PCR效果较差，故舍弃。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8 突变位点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环（95℃，30秒→52℃，30秒→72℃，60秒）；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I（Exo I），1μL碱性磷酸酶（AIP），37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环（96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟）；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA（pH8.0），加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc（pH5.2）；
2)加入70μL 70%酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物（第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的）作为测序引物：
针对HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点的测序引物序列如下：
HR-Seq1F:5’-CTCTTGGGGCACTTGGA -3’（SEQ ID NO.3）；
HR-Seq1R:5’-TGCTGGTGTCCTCATCCC-3’（SEQ ID NO.4）。
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示，1号家系1名人员HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型是“c.2754G>T”纯合突变。图2测序图中箭头所指位置显示C层HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型是“c.2754G>T” 纯合突变；图2测序图中箭头所指位置显示A、B和D层HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型是“c.2754G>T” 杂合突变。
实施例4
先天性无毛症诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物（每条引物1.2μg）：如实施例3所示；
2)缓冲液（500μL的10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2）；
3)Taq酶（20U）；
4)dNTPs（四种dNTP各4mM）；
5)HR: c.2754G>T阳性突变参考品DNA，阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如SEQ ID NO.7所示：
5’-CTGCCCTTACAACACGCCCTTGCCTGGCCATGGCGGGCACCCTGGCCATTCTCCTCATGGCCTCCTTCCTTTCCCACCACAGCCTGTGTTGGTGTCAGGGATCCAAAGGACATTGCAGGGCAACCTGTGGGGGACAGAAG C TCTTGGGGCACTTGGA GGCCAGGTGCAGGCGCTGAGCCCCCTCGGACCTCCCCAGCCCAGCAGCCTGGGCAGCACAACATTCTGGAGGGCTTCTCCTGGCCTGAGCGTAAGTGTCCCCAACACAGGGGAGAGGGAGCTGGGAGCCCAAGCCCTAGGGATCGGGTGGCAGAGGAGTCCCAGGGTGACCCCGAGGGGCTGGAAGCAGGTGTTGCTGCCGCCGGGGCAGGGGCTTCAGGGCTGAGGAGGCCAATGGCCGTTCTGTCTCCTCCTGTAGTTCGCCCAAAGTCAGACGAGGGCTCTGTCCTCCTGCTGCACCGAGCTTTGG GGGATGAGGACACCAGCA GGTGTGTATGTCACCAAGGGCCAGCCCTACCTCCCCGCCACCGCAGGCCCCGCCTGGTTCAGCCCTCCCCTCCTCCTCTGCCCCCAACCCCCACCCCGTGGTCCCTGGTACTCTCATGTTTGCCCTCTGGGAGTTACCCCGGTGGTGGTGGGGCTTTGATGGGGTCTCTGGTGCCCAGGTTGGGCCTGCTGGGCATGACCCCCTACCCTGACAGGGTGGAGAACCT-3’。
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，单下划线、斜体、加粗碱基为测序引物上下游引物位置，方框内碱基为突变位点。
6)测序引物：如实施例3所示。
2、使用方法：
共筛查和检测12个毛发发育异常家系中48位个体，并再次发现7个家系7位患者，现将本试剂盒应用于2号家系患者检测为例。
表10先天性无毛症筛查情况一览表
：其中1个等位基因上的变异为新发突变。
表11 先天性无毛症2号家系成员的临床信息
如图3所示，编号采用Ⅰ（第一代）、Ⅱ（第二代）。
采集2号家系人员Ⅰ:1（父亲）、Ⅰ:2（母亲）、Ⅱ:1（先证者）、Ⅱ:2（弟弟）外周血DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图4的试剂盒检测结果显示，2号家系先证者HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型是“c.2754G>T”纯合突变。图4测序图中箭头所指位置显示D层HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C位点基因型是“c.2754G>T”纯合突变（其中1个突变遗传自其父亲，1个突变遗传其母亲）；图4测序图中箭头所指位置显示A、B和C层个体基因型为“c.2754G>T”杂合突变。检测结果确认先证者为先天性无毛症患者，其父亲、母亲、弟弟为突变基因携带者；先证者父母再生育同样患者的概率为1/4，生育携带者的概率为1/2，生育正常个体的概率为1/4。
实施例5
基因突变评级与解读（突变的致病性）
突变解读基于目前对先天性无毛症与致病基因HR的了解认识(https://www.omim.org/entry/209500)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南（http://www.hgvs.org/），并根据 GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南：Richards,S，et al., Standards and guidelines for the interpretation ofsequence variants:a joint consensus recommendation of the American College ofMedical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med, advance online publication 5 March 2015. doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等. 遗传变异分类标准与指南. 中国科学：生命科学，2017，47：668–688。
《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的（pathogenic，P）”、“可能致病的（likely pathogenic，LP）”、“意义不明确的（variant of uncertainsignificance，VUS）”、“可能良性的（likely benign，LB）”和“良性的（benign，B）”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分（表12）。
表12 变异致病性判定准则
五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1~4)、中等(moderate，PM1~6)、或辅助证据(supporting，PP1~5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1~4)、或辅助证据(BP1~6) (见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1~4/PM1~6/PP1~5/BA1/BS1~4/BP1~6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病（P）”中 (i)+(b)的准则 ]。
表13 变异判读标准及变异致病性判定准则
突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具（见表15）和众多可用的数据（库）（见表16），包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据（库）对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。
表14 程度判断评价标准
表15 生物信息分析工具
表16 人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库
根据上述标准或准则，本发明中HR基因c.2754G>T突变评定为“致病”，判断标准及具体证据如下表17：
表17 HR基因c.2754G>T突变致病性解读
AR：指常染色体隐性遗传。
HR:NM_005144.5:exon12:c.2754G>T:p.W918C变异评级证据如下：
1、PS2 ：经先证者父母等家系人员检测，该变异在1个家系分析验证为新发变异（见表10）；
2、PS4：结合文献和本病例，在多名患者（8名）中检测到该变异（见表10）；
3、PM1：该突变位于热点突变区域, 位于HR蛋白的关键功能域（JmjC Domain区域附近）；
4、PM2：HR基因c.2754G>T变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；
5、PM3：对于隐性遗传病，该突变已在7例患者该变异的反式位置（另一条同源染色体上）检测到致病变异（即纯合突变-两条染色体上均检测到该变异）；
6、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；
7、PP4：本发明中，多个病例中的先证者先天性无毛等症状非常典型，患者表型及家族史具有高度基因特异性。
因此，该突变/变异的综合性证据（PS2+PS4+PM1+PM2+PM3+PP3+PP4）符合表12中“致病（P）”评判标准(ii)，在此综合判定HR基因c.2754G>T变异为“致病”。
实施例6
随访及诊断试剂盒检测性能分析
对所有家系人员进行了随访，并对所有个体的HR基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证（见表18）。
表18 c.2754G>T位点检测的性能分析结果
注：本表包含家系1的随访数据；患者和携带者中检测到的变异均例为阳性。
根据表1和表10可以看出，在对8个家系进行检测时发现阳性患者（8例）和携带者（17例）。上述阳性位点检测结果均通过HR基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现25例真阳性病例、12例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。c.2754G>T变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI（即95%置信区间）为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的HR基因突变体，且确认了新突变体与先天性无毛症的发病密切相关，所述致病突变体可用于先天性无毛症的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种HR突变基因，其特征在于，所述HR突变基因的序列如SEQ ID NO.48所示，其中第12号外显子的第2754位碱基为T。
2.一种HR突变基因蛋白，其特征在于，所述HR突变基因蛋白的序列如SEQ ID NO.49所示，其中第918位氨基酸为半胱氨酸。
3.如权利要求1所述的HR突变基因作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物HR-1F和核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的下游引物HR-1R。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物HR-Seq1F和核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的下游引物HR-Seq1R。
6.如权利要求2所述的HR突变基因蛋白作为检测靶点在制备用于检测先天性无毛症的试剂和/或用于检测先天性无毛症的试剂盒中的应用。
7.一种用于检测先天性无毛症的试剂，其特征在于，所述试剂的检测靶点包括如权利要求1所述的HR突变基因或如权利要求2所述的HR突变基因蛋白。
8.一种用于检测先天性无毛症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测靶点包括如权利要求1所述的HR突变基因或如权利要求2所述的HR突变基因蛋白。
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