CN109136275A

CN109136275A - 人源化gitr基因改造动物模型的制备方法及应用

Info

Publication number: CN109136275A
Application number: CN201810623611.XA
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 郭雅南; 白阳; 姚佳维; 黄蕤; 赵磊; 张美玲
Original assignee: Beijing Biocytogen Co Ltd
Current assignee: Beijing Biocytogen Co Ltd
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: US10945419B2; CN109136275B; US20190364861A1

Abstract

本发明公开了一种GITR基因人源化动物模型的制备方法及应用。本发明还保护一种能够特异的靶向Gitr基因的sgRNA序列、一种多基因人源化动物模型的制备方法以及相关应用。本发明提供了一种适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，一种新的人源化动物模型制备方法，有利于相关疾病的研究，为生物医学实验的开展提供了有效的技术手段。本发明还涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化GITR基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化GITR基因改造动物模型的制备方法及应用

技术领域

本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化GITR基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的平均应答率较低，临床实践已经证明，单一的免疫治疗策略治疗效果有限，在临床中一般需要结合两种或多种免疫治疗手段进行。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor，GITR)分子是一种I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，包括胞外区、跨膜区域和胞浆区，在Treg细胞的高水平表达，也在CD4+和CD8+T细胞上低水平表达，经刺激活化后表达显著增加。GITR的配体GITRL，为肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，主要表达在抗原呈递细胞(APC)。GITR与GITRL结合后，传导T细胞表面的共刺激信号，和CD28、CD3一起辅助T细胞受体(TCR)的作用，刺激T细胞活化、增殖和分泌细胞因子(但其辅助刺激作用没有CD28强烈)；抑制Foxp3+Tregs免疫抑制活性；诱导激活巨噬细胞。

已有研究证明GITR在多种免疫过程中起重要作用，在感染、肿瘤和自身免疫/炎性疾病治疗领域具有巨大应用价值。激动性GITR抗体可在小鼠体内诱发包括自身免疫性胃炎、卵巢炎、自身免疫性脑脊髓炎在内的多种自身免疫性疾病(Takahashi T et al.J ExpMed.2000Jul 17；192(2):303-10；Shimizu J et al.Nat Immunol.2002Feb；3(2):135-42；J Immunol April 15,2004,172(8)4686-4690)，激动性GITR抗体也可在体外或体内抑制多种肿瘤的生长，且与其他免疫检查点抗体或肿瘤抗原联合使用可表现出比单一疗法更好的抗肿瘤效果(Ko K.et al,J Exp Med.2005 Oct 3；202(7):885-91；Clin Cancer Res.2010May 15；16(10):2781-91；Cohen AD.et al,PLoS One.2010；5(5):e10436；Miska J et al,Cancer Immunol Immunother.2016 Dec；65(12):1555-1567；Villarreal DO et al,Oncotarget.2017 Mar 27.doi:10.18632/oncotarget.16605)；阻止GITR与GITRL结合能抑制淋巴细胞增殖，有利于改善某些自身免疫性疾病的进展，并能通过维持Treg的功能，降低移植排斥，从而提高移植成功率(Ma J et al.Am J Pathol.2016Jun；186(6):1559-67；Sonawane SB et al.Transplantation,2009,88(10):1169-1177)。此外，GITR还参与并增强抗病毒反应(Agostini M et al.Infect Immun.2005Nov；73(11):7502-8)。

鉴于GITR具备双靶向作用，既可直接激活T细胞，又可抑制Tregs细胞，因此被认为是较为理想的靶点。但目前对于GITR及其配体GITRL参与调控免疫系统的机制仍不太清楚，尚未有针对GITR靶点的药物上市，但已有多种用于治疗肿瘤的GITR激动型抗体(如TRX518、MEDI1873和MK-4166)处于Ⅰ期临床研究，初步结果都没有观察到严重毒副反应。可以预计，随着研究的不断深入，未来会有更多的机构和生物医药企业参与到针对GITR靶点的药物研发中来。(Tone M et al,Proc Natl Acad Sci U S A.2003Dec 9；100(25):15059–15064；Kim YH et al,J Immunol November 15,2015,195(10)4721-4729；Schaer DA et al,CurrOpin Immunol.2012Apr；24(2):217–224)。

已知实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源基因已经实现，通过这种方式开发的基因人源化动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的重要发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升异种细胞或组织移植生长的效率，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达部分或全部人源蛋白，可作为识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N et al,Drug Discov Today.2013Dec；18(23-24):1200-11)。

目前已有的与GITR基因相关的动物模型主要是Gitr基因敲除小鼠，主要应用于Gitr基因的生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制的研究。最早是Ronchetti S.等人(2002年)为了研究Gitr在T细胞发育中的作用，采用传统的染色体同源重组的方法将小鼠体内的Gitr基因用抗性基因片段替换，得到了Gitr-/-小鼠，发现该小鼠T细胞可正常发育，除Treg细胞百分比较低外，T细胞亚群与野生型相似无明显差异。使用抗体激活时，比野生型T细胞增殖更快、表达较高水平的白介素-2受体，并且对活化诱导的细胞死亡更敏感(Blood 2002 100:350-352)。进一步的研究确认了GITR在T细胞中的共刺激作用(Eur JImmunol.2004Mar；34(3):613-22；J Immunol.2004Oct15；173(8):5008-20)。Agostini M等人(2005)还利用该小鼠研究了GITR在念珠菌感染传播中的作用，发现相比野生型小鼠，Gitr-/-小鼠脾脏中存在较高比例的Th1极化T细胞，能更有效的清除念球菌，存活时间也更长。

由于啮齿类如小鼠的Gitr蛋白与人GITR蛋白在氨基酸序列上同源性为60％左右，所以，一般情况下识别人GITR蛋白的抗体，无法识别小鼠Gitr，即在GITR靶点相关药物研发过程中，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人源GITR药物的药效。目前研究靶向药物药效广泛使用的是人源肿瘤异体移植小鼠模型，但该类模型在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，因此这类模型研究药效的结果准确性不高。

鉴于GITR基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究GITR相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性和研发成功率，本发明在世界范围内提供一种建立GITR基因人源化改造动物模型的新方法，并得到GITR基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达GITR蛋白，且表达的GITR蛋白能被识别并结合抗人GITR的抗体。该方法在药物筛选、有效性验证等方面有着广阔的应用前景。此外，本方法得到的非人动物还可与其它免疫检查点人源化非人动物，如PD-1基因人源化小鼠交配得到GITR和PD-1双基因或多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对多个信号通路的人用药及联合用药的药效研究。

发明内容

本发明第一方面，涉及一种人源化动物模型构建的方法，所述人源化动物模型基因组中包括人GITR基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码人源化GITR蛋白，所述人源化GITR蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合GITR基因编码的胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合GITR基因编码的胞外区域包含人GITR蛋白胞外域的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人GITR基因部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Gitr启动子后；优选的，所述嵌合GITR基因的跨膜区为动物来源。

在本发明的一个实施例中，所述动物来源部分包括Gitr基因的第4号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人GITR基因部分为第1号外显子、2号外显子、3号外显子、和/或第4号外显子的部分或全部序列。

优选的，使用基因编辑技术进行GITR人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行GITR人源化动物的构建。

进一步优选的，将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列替换为人GITR基因的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列。更进一步优选的，将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和4号外显子的全部或部分序列替换为人GITR基因的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和4号外显子的全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11。

在本发明的一个实施例中，所述动物来源的Gitr基因为啮齿类动物来源的Gitr基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠；优选的，所述小鼠Gitr的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：20中的全部或部分片段所示；所述小鼠Gitr的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：21中的全部或部分片段所示。

在本发明的另一个实施例中，所述人GITR基因的全部或部分片段的人GITR mRNA序列如SEQ ID NO：22中的全部或部分片段所示，所述人GITR全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：23中的全部或部分片段所示。

在本发明的一个实施例中，所述人源化GITR蛋白为嵌合GITR蛋白，所述的嵌合GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人GITR蛋白的全部或部分片段，所述跨膜区为动物来源。

优选的，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR蛋白序列为SEQ ID NO：27所述氨基酸序列的部分或全部；

b)嵌合GITR蛋白序列与SEQ ID NO：27所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)编码嵌合GITR蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：27所示蛋白的核苷酸序列杂交；

d)嵌合GITR蛋白序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

e)嵌合GITR蛋白序列具有SEQ ID NO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码上述的嵌合GITR蛋白，或所述的嵌合GITR基因选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR基因为SEQ ID NO：24所示的序列的部分或全部；

b)嵌合GITR基因的CDS序列为SEQ ID NO：25所示的序列的部分或全部；

c)嵌合GITR基因的mRNA序列为SEQ ID NO：26所示的序列的部分或全部；

d)嵌合GITR基因序列与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

e)嵌合GITR基因的序列在严格条件下，与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ IDNO：26所示的核苷酸序列杂交；

f)嵌合GITR基因的序列与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

g)嵌合GITR基因序列具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

h)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；

i)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

j)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列杂交；

k)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

l)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为具有SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明第二方面，涉及采用上述人源化动物模型构建的方法所构建的人源化动物模型或其后代，所述的人源化动物模型或其后代表达嵌合GITR蛋白。

本发明第三方面，涉及一种Gitr敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子全部或部分敲除，使得内源Gitr蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：11。

本发明的第四方面，涉及一种能够特异的靶向GITR基因的sgRNA，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQID NO：8-14任一项所示；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：11所示。

本发明的第五方面，涉及一种编码上述所述sgRNA的DNA分子；优选的，DNA双链序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示。

本发明的第六方面，涉及一种构建动物模型的载体，所述载体能够产生上述的sgRNA序列，用于敲除或替换GITR基因的第1位外显子至第4位外显子的部分或全部。

本发明的第七方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：

(1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：18所示，其中SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16为A组，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18为B组；

(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：19所示，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体；

(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNAG2载体的双链；

(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNAG2载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

本发明的第八方面，涉及一种Gitr基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：

第一步：按照上述制备sgRNA载体的方法1-4，获得sgRNA载体；

第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；

第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Gitr基因被敲除，获得Gitr基因敲除阳性小鼠；

第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Gitr-/-小鼠；

优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示。

本发明的第九方面，涉及一种人源化动物模型的制备方法，包括以下步骤：

第一步：按照上述制备sgRNA载体的方法步骤1-4，获得sgRNA载体；

第二步：将sgRNA载体的体外转录产物、上述的靶向载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体动物的输卵管中发育，得到F0代动物；

第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的GITR基因改造嵌合动物；

优选的，所述第三步中使用的PCR检测的5'端引物对如SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：40或SEQ ID NO：43所示；3'端引物对如SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44所示。

本发明的第十方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Gitr基因座上游的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Gitr基因座下游的100-10000个长度的核苷酸。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000070.6的第156024998-156026386位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如所示的NCBI登录号为NC_000070.6的第156028249-156029078位核苷酸。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述的待改变的转换区位于Gitr基因的第1外显子至第4外显子。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述5’臂序列如SEQ ID NO：28所示。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述3’臂序列如SEQ ID NO：29所示。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。

优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中替换的供体DNA序列片段来自人。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中替换的供体DNA序列为人GITR基因的核苷酸序列部分或全部。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述核苷酸序列包括人GITR基因DNA序列的第一外显子至第四外显子的全部或部分。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述人GITR的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000001.11的第1204209-1206571位核苷酸。

在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述人源GITR的核苷酸序列如SEQ IDNO：30所示。

本发明的第十一方面，涉及一种上述的靶向载体、上述的sgRNA序列或上述的载体在敲除或替换GITR基因的第1号外显子至第4号外显子的部分或全部中的应用。

在本发明的一个实施例中，涉及非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物是啮齿类动物。

在本发明的一个实施例中，涉及非人类哺乳动物，所述啮齿类动物是小鼠。

在本发明的一个实施例中，涉及非人类哺乳动物，所述小鼠为C57BL/6小鼠。

在本发明的一个实施例中，涉及非人类哺乳动物，所述小鼠为C57BL/6小鼠的后代。

本发明的第十二方面，涉及一种Gitr基因缺失细胞株，使用上述能够特异的靶向Gitr基因的sgRNA、上述的DNA分子敲除第1位外显子至第4位外显子的部分或全部制备获得。

本发明的第十三方面，涉及一种GITR基因人源化细胞株，所述人源化细胞株的基因组中包括人GITR基因，该人源化细胞株可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

优选的，使用上述能够特异的靶向GITR基因的sgRNA、上述的DNA分子、上述的载体通过对第1位外显子至第4位外显子的部分或全部进行替换制备获得。

本发明的第十四方面，涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法，

(a)利用本发明所述的方法获得动物模型；

(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型；

在本发明的一个实施例中，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。

本发明的第十五方面，涉及上述制备多基因人源化动物模型的方法制备获得的多基因人源化动物模型或其后代；优选的，所述的多基因人源化动物模型Gitr基因座处与Gitr启动子可操作连接的编码人GITR的核酸，和所述多基因人源化动物模型基因组中还包括其他人源化基因，所述其他人源化基因选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3或CD40中的一种或两种以上的组合。优选的，所述其他人源化基因至少一种选自下组的别的核酸：与Pd-1启动子可操作连接的编码人PD-1的核酸(201710505554.0，PCT/CN2017/090320)；与Pd-l1启动子可操作连接的编码人PD-L1的核酸(201710757022.6，PCT/CN2017/099574)；与Ctla-4启动子可操作连接的编码人CTLA-4的核酸(201710757917.X，PCT/CN2017/099577)；与Lag-3启动子可操作连接的编码人LAG-3的核酸(201711103245.7，PCT/CN2017/110435)；与Btla启动子可操作连接的编码人BTLA的核酸(201710948551.4，PCT/CN2017/106024)；与Cd27启动子可操作连接的编码人CD27的核酸(201711402264.X，PCT/CN2017/117984)；与Cd28启动子可操作连接的编码人CD28的核酸(201710465217.3)；与Cd47启动子可操作连接的编码人CD47的核酸(201810295709.7，PCT/CN2018/081628)；与Cd137启动子可操作连接的编码人CD137的核酸(201711473251.1，PCT/CN2017/120388)；与Cd154启动子可操作连接的编码人CD154的核酸(201710464564.4，201710872886.2)；与Ox40启动子可操作连接的编码人OX40的核酸(201710757005.2，PCT/CN2017/099575)；与Sirpα启动子可操作连接的编码人SIRPα的核酸(201810296193.8，PCT/CN2018/081629)；与Tigit启动子可操作连接的编码人TIGIT的核酸(201710757916.5，PCT/CN2017/099576)；与Tim-3启动子可操作连接的编码人TIM-3的核酸(201711103773.2，PCT/CN2017/110494)；与Cd40启动子可操作连接的编码人CD40的核酸(201710464564.4，201710872886.2)。

优选的，所述动物模型为非人类哺乳动物；进一步优选的，所述动物模型为啮齿动物；再进一步优选的，所述动物模型为小鼠。

本发明的第十六方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述荷瘤动物模型是通过本发明所述的方法制备获得的；优选的，所述荷瘤嵌合动物是啮齿动物；更优选的，所述荷瘤嵌合动物是小鼠。

本发明的第十七方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型。

本发明的第十八方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述的组织或器官或其培养物来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型。。

本发明的第十九方面，涉及荷瘤后的瘤组织，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型。。

本发明的第二十方面，涉及一种嵌合GITR蛋白，所述的嵌合GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人GITR蛋白的全部或部分片段；优选的，所述跨膜区为动物来源。

优选的，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：22所示的序列的部分或全部所示；

b)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：22所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列杂交；

d)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：22所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

e)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：22所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

f)嵌合GITR蛋白序列中人GITR的蛋白序列如SEQ ID NO：23部分或全部序列所示；

g)嵌合GITR蛋白序列中人GITR的蛋白序列与SEQ ID NO：23所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

h)嵌合GITR蛋白序列中编码人GITR的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：23所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；

i)嵌合GITR蛋白序列中人GITR的蛋白序列与SEQ ID NO：23所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

g)嵌合GITR蛋白序列中人GITR的蛋白序列具有SEQ ID NO：23所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；

或

k)嵌合GITR蛋白中编码人GITR蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；

l)嵌合GITR蛋白中编码人GITR蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

m)嵌合GITR蛋白中编码人GITR蛋白的核苷酸序列在严格条件下，与编码SEQ IDNO：30所示的核苷酸序列杂交；

n)嵌合GITR蛋白中编码人GITR蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

p)嵌合GITR蛋白中编码人GITR蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

q)嵌合GITR的嵌合mRNA序列为SEQ ID NO：26所示的序列的部分或全部；

r)嵌合GITR的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

s)嵌合GITR的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列杂交；

t)嵌合GITR的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

u)嵌合GITR的嵌合mRNA序列具有与SEQ ID NO：26所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

v)嵌合GITR蛋白中编码嵌合GITR蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：24所示的序列的部分或全部；

w)嵌合GITR蛋白中编码嵌合GITR蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

x)嵌合GITR蛋白中编码嵌合GITR蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列杂交；

y)嵌合GITR蛋白中编码嵌合GITR蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:24所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

z)嵌合GITR蛋白中编码嵌合GITR蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO:24所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明的第二十一方面，涉及一种表达上述人源化小鼠嵌合GITR蛋白的DNA。

本发明的第二十二方面，涉及一种编码上述嵌合GITR蛋白的嵌合GITR基因，其中所述的嵌合GITR基因序列选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR基因为SEQ ID NO：24所示的序列的部分或全部；

或

优选的，其中嵌合小鼠GITR DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ IDNO：24；进一步优选的，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的cDNA序列，与上述任意一项所述的DNA或基因序列一致或互补。

本发明的第二十三方面，涉及一种表达上述人源化小鼠嵌合GITR蛋白的构建体。

本发明的第二十四方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十五方面，涉及一种包含上述细胞的组织。

本发明的第二十六方面，涉及来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。

本发明的第二十七方面，涉及来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。

本发明的第二十八方面，涉及来源于上述的人源化动物模型或其后代、上述的多基因人源化动物模型或其后代或上述的荷瘤动物模型在筛选、验证、评价或研究GITR基因功能、GITR抗体、针对GITR靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

本发明的嵌合GITR基因，包括具有第二外显子人GITR基因的全部或部分序列，或其与人GITR基因中的第二外显子具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。

本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；theseries，Methods In ENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Millerand M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(MayerandWalker，eds.，AcademicPress，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：(A)5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sg1-sg7)；(B)3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sg8-sg14)，其中Con.为阴性对照，PC为阳性对照；

图2：pT7-sgRNA G2质粒图谱示意图；

图3：打靶策略示意图；

图4：人源化GITR小鼠基因示意图；

图5：pClon-2G-GITR质粒酶切结果图，其中，M为Marker，ck为未经酶切的对照；

图6：鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，编号为F0-20、F0-48的小鼠为F0代B-hGITR阳性小鼠

图7：鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，+为阳性对照，M为Marker，F1-1、F1-2、F1-3、F1-4为F1代小鼠编号；

图8：流式分析结果，其中，图A、C为mCD3抗体刺激的野生型小鼠(WT)，图B、D为mCD3抗体的B-hGITR阳性杂合子小鼠；分别用抗鼠Gitr抗体(mGITR PE，图A、B)和抗人GITR抗体(hGITR-01-IgG PE，图C、D)进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析；

图9：鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，M为Marker，F1-KO-1至F1-KO-10为小鼠编号；

图10：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hGITR杂合小鼠体内，并利用3种抗人GITR抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G4各组实验动物平均体重；

图11：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hGITR杂合小鼠体内，并利用3种抗人GITR抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G4各组实验动物体重变化；

图12：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hGITR杂合小鼠体内，并利用3种抗人GITR抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G4各组实验动物肿瘤平均体积；

图13：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为GITR基因杂合子对照，-为野生型对照(图A、B)，WT为野生型，-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为PD-1基因人源化小鼠杂合子(图C、D)；

图14：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

EcoRI、BamHI、BbsI、HindII、XhoI、SacI、NotI酶购自NEB，货号分别为；R3101M、R3136M、R0539L、R3104M、R0146S、R3122M、R3189M；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；

大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104－02；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

AIO试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-004；

pHSG299质粒购自Takara，货号3299；

Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e(mCD3)购自BD公司，货号：553057；

PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；

PE anti-mouse CD357(GITR)(mGitr PE)购自Biolegend，货号为：120208。

实施例1 Gitr基因sgRNA的设计

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。

设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA14)的sgRNA序列。5’端靶位点位于Gitr基因第1外显子上，3’端靶位点位于Gitr基因第4外显子上，各sgRNA在Gitr上的靶位点序列如下：

sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-aggtcagccgagtgtagttgagg-3’

sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-caactacactcggctgacctagg-3’

sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-ccaggctcctcaactacactcgg-3’

sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-ccgagtgtagttgaggagcctgg-3’

sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-ggggcatgggccatgctgtatgg-3’

sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-actcaggagaagcactatggggg-3’

sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-tgctgcagcctgtatgctccagg-3’

sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-cgggcctaggctactcatccagg-3’

sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-tccttctagtgtggtccctttgg-3’

sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-ttcttctcccaaatggcttaggg-3’

sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-ggagaagaatgggggttctctgg-3’

sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-tgctgtcccctaagccatttggg-3’

sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-aatccaaactgagaacagctggg-3’

sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-ctgtcaggattggttaccaaagg-3’

实施例2 Gitr基因sgRNA的筛选

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1和表1。根据活性检测结果，从中优选sgRNA1和sgRNA11进行后续实验。分别合成sgRNA的上、下游单链，上、下游单链序列如下：

sgRNA1序列：

上游：5’-TCAGCCGAGTGTAGTTG-3’(SEQ ID NO：15)

下游：5’-CAACTACACTCGGCTGA-3’(SEQ ID NO：16)

sgRNA11序列：

上游：5’-AGAAGAATGGGGGTTCTC-3’(SEQ ID NO：17)

下游：5’-GAGAACCCCCATTCTTCT-3’(SEQ ID NO：18)

表1 UCA试剂盒检测sgRNA活性值

实施例3 pT7-sgRNA G2质粒构建

由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体pHSG299上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒：pT7-sgRNAG2质粒，pT7-sgRNAG2质粒图谱见图2。

含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：19)：

gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc

实施例4 pT7-Gitr-1和pT7-Gitr-11重组表达载体的构建

将实施例2中获得的上游单链(SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17)的5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，下游单链(SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18)的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸(具体序列如下所示)，退火后分别将退火产物连接至pT7-sgRNA G2质粒(质粒先用BbsI线性化)。连接反应体系见表2。

sgRNA1：

正向寡核苷酸：5’-TAGGTCAGCCGAGTGTAGTTG-3’(SEQ ID NO：49)

反向寡核苷酸：5’-AAACCAACTACACTCGGCTGA-3’(SEQ ID NO：50)

sgRNA11：

正向寡核苷酸：5’-TAGGAGAAGAATGGGGGTTCTC-3’(SEQ ID NO：55)

反向寡核苷酸：5’-AAACGAGAACCCCCATTCTTCT-3’(SEQ ID NO：56)

表2连接反应体系

sgRNA退火产物	1μL(0.5μM)
		pT7-sgRNA G2载体	1μL(10ng)
T4DNA Ligase	1μL(5U)
		10×T4DNA Ligase buffer	1μL
50％PEG4000	1μL
		H<sub>2</sub>O	补至10μL

反应条件：

室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。

随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-Gitr-1和pT7-Gitr-11进行后续实验。

实施例5序列设计

将小鼠Gitr基因上(Gene ID：21936)第1号外显子至4号外显子的部分序列，(基于NCBI登录号为NM_009400.2→NP_033426.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：20所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：21所示)用对应的人GITR基因(Gene ID：8784)片段替换(基于NCBI登录号为NM_004195.2→NP_004186.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：22所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：23所示)，所述人GITR基因片段如SEQ ID NO：30所示，最终获得改造后的人源化小鼠GITR基因的DNA序列(嵌合GITR基因DNA)如SEQ ID NO：24所示：

ctgaaatcagccgacagaagactcaggagaagcactatggcacagcacggggcgatgggcgcgtttcgggccctgtg cggcctggcgctgctgtgcgcgctcagcctgggtcagcgccccaccgggggtcccgggtgcggccctgggcgcctcc tgcttgggacgggaacggacgcgcgctgctgccgggttcacacgacgcgctgctgccgcgattacccgggtaagtaa accgcgtttacttaacgcggaccggccaaggcgtcccgcggaagccgggatgggtgggcgccccccttcccgtgctc agaccggcgttgctgaggtctaaggagggtgggcacagagccgccagcagcgggagccttccggagggaggcaggat cccagagggaggcggaggtgtgccagctccagccagtggccccggccgggagcaggggtgagccaggtgggagcgcc ctcaagaggggtctggggtctggaggtggaggacggctgttccaggtcctgctgggcgggtcgtgagcccttggcca tcgcccagccccctcctgcccagttgagggcccccctgcaccaccgtctggcctgctgcctgcctctgacctgcacc tggggatgagggttcagctgacacggctggtctggagaggaagctggcagggaagtcaccccagagcttcttcctcc agggcctgtgggttgggaagggaggctctgtccggaggcccagtgtggctggtggtggggacagcagcgcccagaca ccaggcaggcggcctctgaggtgtcgacgggcctccaggggactgtgcactgttgggggccacccctgggtcctgca ggggcagctcctggttgcatatggagttagcacctgggcaggggcagctgtggggcgcaaagggggagtagccaggc cacatggccccaggagaaagagacagctggataaacccagggtccagactcccagccaggagccctctgctccctgg agccaactgtgggtggagaacggacaacctcactcccctggagggccgaggggaggcctggggaggagggggcctca gcccagctgctggggggctggcctgtctcctgcccaggcgaggagtgctgttccgagtgggactgcatgtgtgtcca gcctgaattccactgcggagacccttgctgcacgacctgccggcaccacccttgtcccccaggccagggggtacagt cccagggtaagtcctggaggtgcctctgggagtccacacaggccaggggttccactagggcccgaggcagagctcgt gggcacaggtgtccggcgaggacatgtggtgtgtggggtccggagtcctgtgaggccgggcaggccaggccatgctc aggcaccacaggccatgaagctctgggggtgtcctgtccctgctttctcagcctgggcttctccatccagcacgagg gctgtgagaaccctgcggggaggtgggggcgggttccaggagctgtctggctctcaggcccgggacacccatcctgt ctgtcctcaccacatactgaaagagcctgccctgtgccccccggagtcctgtctggggcctggggctgcaccctgtt ctggaaggagcagctcaagtcctcttagcggcttgtttacctgacaggagaggtcaggctgggcacatgagagctgg gagaaggtacaactggggaggttgtgtcaggttggacggggcagggtctggggtcaactgggacccagcctcactct ctctgggaccctcactgttctccaccctctgttctactgggtcctgcctggcttctgcccaccctcagcccccaatg ggcaggcctttcccctccctggcaggcccactgcactctgcgcacctcccccaggtgccctcactgggccccacccc agacgccccacctgggacgggcagacatgggccccagtcctgggccatgaagaactctgttgaatggatgatggggg gggcattctactcagcacccagaccccagatggacccctgcactggcctgacgccctcctcatccatcccagcaact ccaccagcctccctccctccctccccccacaccccacaccagggaaattcagttttggcttccagtgtatcgactgt gcctcggggaccttctccgggggccacgaaggccactgcaaaccttggacagagtgagtcctgggtgggccctgccg gtggccgggtggtccaggcccactctgaggaagggtcctctcctgtcccttgccccagacagcacggagggcagcag ccgggggctgatcggaggccgtgtccgggggctgataggaggccgcgtccatgtattccagctgcacccagttcggg tttctcactgtgttccctgggaacaagacccacaatgctgtgtgcatcccggagcc

SEQ ID NO：24仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人源片段。

得到的改造后的人源化小鼠GITR的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示。

实施例6载体构建

根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、人GITR基因片段、3’同源臂的载体，人源化GITR基因示意图见图4。其中5’同源臂(SEQ ID NO：28)与NCBI登录号为NC_000070.6的第156024998-156026386位核苷酸序列相同，3’同源臂(SEQ ID NO：29)与NCBI登录号为NC_000070.6的第156028249-156029078位核苷酸序列相同，人GITR基因片段(SEQ ID NO：30)与NCBI登录号为NC_000001.11的第1204209-1206571位核苷酸序列相同。

载体的构建过程如下：设计扩增2段同源重组片段(LR，RR)及2段外源片段(A1，A2)的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应LR片段，人GITR基因片段对应A1+A2片段，3’同源臂对应RR片段，引物序列见表3。

表3引物序列

以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得LR、RR片段；以人基因组DNA为模板PCR扩增获得A1、A2片段。将片段LR与A1；A2与RR通过PCR连接(反应体系和反条件见表4、5)，测序验证正确后，通过酶切连接的方式将LR+A1片段(XhoI+SacI)和A2+RR(SacI+NotI)片段连接至AIO试剂盒配备的pClon-2G质粒上，最终获得载体pClon-2G-GITR。

表4 PCR反应体系(20μL)

10×缓冲液	2μL
		dNTP(2mM)	2μL
MgSO4(25mM)	0.8μL
		引物F(10μM)	0.6μL
引物R(10μM)	0.6μL
		片段DNA	200ng
KOD-Plus-(1U/μL)	0.6μL
		H<sub>2</sub>O	补至20μL

表5 PCR扩增反应条件

其中，连接片段LR与A1时，表4所述引物F为SEQ ID NO：31，引物R为SEQ ID NO：34，片段DNA为扩增LR片段和A1片段的回收产物；连接片段A2与RR时，引物F为SEQ ID NO：35，引物R为SEQ ID NO：38，片段DNA为扩增A2片段和RR片段的回收产物。

实施例7载体pClon-2G-GITR的验证

随机挑选4个pClon-2G-GITR克隆，使用3组限制性内切酶进行酶切验证，其中，SacI+NotI应出现1923bp+5375bp，HindIII+XhoI应出现673bp+2698bp+3927bp，EcoRI+BamHI应出现778bp+1746bp+4774bp。酶切结果参见图5，质粒1的酶切结果均符合预期，表明该质粒经酶切验证结果正确。质粒1经测序公司测序验证正确。

实施例8显微注射、胚胎移植及繁育

取C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-Gitr-1和pT7-Gitr-11质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-2G-GITR质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将该免疫节点人源化小鼠命名为B-hGITR。

实施例9基因改造人源化小鼠的鉴定

1、F0代基因型鉴定

分别使用四对引物对得到的F0代B-hGITR小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置L-GT-F位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，R-GT-F和L-GT-R位于1号内含子上，Mut-R位于1号外显子，Mut-F位于3号外显子上，具体引物序列如下：

第1对引物：

上游：L-GT-F(SEQ ID NO：39)：5’-CCTGTGTCCTTTCTTTCCCACTATG-3’；

下游：Mut-R(SEQ ID NO：40)：5’-GTTCCCGTCCCAAGCAGGAGG-3’

第2对引物：

上游：Mut-F(SEQ ID NO：41)：5’-CTTCCAGTGTATCGACTGTGCCTCG-3’；

下游：R-GT-R(SEQ ID NO：42)：5’-TCCGAAAGCCTCCTTAGCTTGATGG-3’

第3对引物：

上游：L-GT-F(SEQ ID NO：39)：5’-CCTGTGTCCTTTCTTTCCCACTATG-3’；

下游：L-GT-R(SEQ ID NO：43)：5’-GCTAACTCCATATGCAACCAGG-3’

第4对引物：

上游：R-GT-F(SEQ ID NO：44)：5’-CTTCCAGTGTATCGACTGTGCCTCG-3’；

下游：R-GT-R(SEQ ID NO：42)：5’-TCCGAAAGCCTCCTTAGCTTGATGG-3’

PCR反应体系和反应条件见表6、7。如果重组载体插入位置正确，则应只有1条PCR条带，第1对引物产物长度应为1876bp，第2对引物产物长度应为1343bp，第3对引物产物长度应为2584bp，第4对引物产物长度应为3018bp，4组引物PCR结果都正确的鉴定为B-hGITR阳性小鼠。多只F0代小鼠的PCR鉴定结果见图6，其中编号为F0-20、F0-48的小鼠为阳性小鼠。

表6 PCR反应体系(20μL)

2×PCR buffer	10μL
		dNTP(2mM)	4μL
上游引物(10μM)	0.6μL
		下游引物(10μM)	0.6μL
鼠尾基因组DNA	100ng
		KOD-FX(1U/μL)	0.4μL
H<sub>2</sub>O	补至20μL

表7 PCR扩增反应条件

2、F1代基因型鉴定

将F0鉴定为阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。选择第3对和第4对引物，对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析，PCR条件同F0代基因型鉴定。F1代小鼠PCR实验结果见图7，其中编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4的小鼠为阳性小鼠。

这表明使用本方法能构建出可稳定传代的GITR人源化基因工程小鼠。

3、人源化小鼠的表达情况分析

选取1只B-hGITR阳性杂合子小鼠，另选1只相同背景的野生型小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠CD3抗体(mCD3)，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，然后用鼠源Gitr抗体PE anti-mouse CD357(GITR)(mGitr PE)和PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)及人源GITR抗体hGITR-01-IgG PE(hGITR PE，自制)和PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)对GITR胞外蛋白进行识别染色，PBS清洗细胞1次，利用流式检测GITR蛋白表达。流式分析结果(见图8)显示，与野生型小鼠(图8A、C)相比，抗人GITR抗体可以检测到人源化小鼠(图8B、D)脾脏内表达人源化GITR蛋白的细胞；而在野生型对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化GITR蛋白的细胞。

实施例10基因敲除小鼠的鉴定

由于Cas9的切割会造成DNA双链断裂，同源重组的修复方式产生插入/缺失突变可能得到Gitr蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：

F:5’-gcatcaagcttggtaccgatgctctgctctacacttcacagaagg-3’(SEQ ID NO：45)

R:5’-acttaatcgtggaggatgatgtagtaaaactgcgtgcggtaagtg-3’(SEQ ID NO：46)

PCR条件同F0代基因型鉴定条件。野生型小鼠应只有1条PCR条带，产物长度应为2324bp，基因敲除小鼠杂合子应还有1条PCR条带，产物长度应为约600bp。F1代小鼠的PCR结果参见图9，其中编号为F1-KO-1、F1-KO-2、F1-KO-3、F1-KO-4、F1-KO-7、F1-KO-8、F1-KO-9、F1-KO-10的小鼠为阳性Gitr基因敲除小鼠。

实施例11 B-hGITR基因人源化动物模型体内药效验证

取B-hGITR杂合小鼠(9周龄)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×10⁵/100μLPBS)，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝6/组)。治疗组随机选择3种抗人GITR抗体(GITR Ab1、GITR Ab2、GITR Ab3，均为使用常规方法免疫小鼠得到，参见Janeway's Immunobiology(9th Edition))进行注射治疗，剂量为10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。给药频率为每3天给药1次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm³时应执行安乐死结束试验。

整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时(分组后第21天)，所有治疗组和对照组小鼠体重均出现增长，且在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图10、11)；但从肿瘤体积测量结果上看(图12)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明这3种GITR抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。

表8中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后14天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第21天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGI_TV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。

表8各组小鼠的肿瘤体积、肿瘤体重

从表8可见，结合图10-12可知在实验终点时(分组后第21天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对3种GITR抗体耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(G1)平均肿瘤体积为1904±294mm³，治疗组平均肿瘤体积分别为833±135mm³(G2)、1112±105mm³(G3)、828±214mm³(G4)，所有治疗组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组(G1)，TGI_TV分别为59.0％、43.6％、59.2％，表明抗人GITR抗体GITR Ab1、GITR Ab2、GITR Ab3具有不同的抑制肿瘤生长效果，在相同的给药剂量和频次下，抗人GITR抗体GITRAb1(G2)、GITR Ab3(G4)抑瘤效果优于GITR Ab2抗体(G3)。由此证明不同的抗人GITR抗体在B-hGITR小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，表现出不同的疗效，且均未对动物产生明显毒副作用，安全性较好。

上述研究结果证明人源化GITR动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于人GITR信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人GITR抗体的有效性，以及评估靶向GITR的治疗效果等。

实施例12双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定

包含人源GITR基因的小鼠(如利用本方法或制得的B-hGITR动物模型)还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例8中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对B-hGITR小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到GITR人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的B-hGITR动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到GITR人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。

以双重人源化GITR/PD-1小鼠的生成为例，由于小鼠Gitr与Pd-1基因不在同一条染色体上，可通过将B-hGITR小鼠与包含人源PD-1基因的小鼠(如B-hPD-1小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化GITR/PD-1小鼠。

分别使用4对引物对双重人源化GITR/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表9，反应体系和条件见表10、11。多只双重人源化GITR/PD-1小鼠的鉴定结果见图13，其中图13A、B中编号为6870、6872的小鼠为GITR杂合子小鼠(其余均为野生型)，图13C、D中编号为6865～6872的小鼠均为PD-1杂合子小鼠，综合两组结果表明，编号为6870、6872的小鼠为双重人源化GITR ^H/+/PD-1^H/+杂合子小鼠。

表9引物序列

表10 PCR反应体系

2×Master Mix	10μL
		上游引物(10μM)	0.5μL
下游引物(10μM)	0.5μL
		鼠尾基因组DNA(100-200ng/20ml)	2μL
ddH<sub>2</sub>O	补至20μL

表11 PCR反应条件

实施例13基于胚胎干细胞的制备方法

采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得GITR基因人源化小鼠。

根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠GITR基因示意图(图4)，发明人设计了图14所示的打靶策略，图14中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠GITR基因的1号至4号外显子全部或部分用人GITR基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(4285bp)、3’同源臂(4581bp)和人源化基因片段(2363bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例9一致。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120> 人源化GITR基因改造动物模型的制备方法及应用

<130> 1

<160> 56

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtcagccg agtgtagttg agg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caactacact cggctgacct agg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaggctcct caactacact cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgagtgtag ttgaggagcc tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggcatggg ccatgctgta tgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcaggaga agcactatgg ggg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctgcagcc tgtatgctcc agg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggcctagg ctactcatcc agg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccttctagt gtggtccctt tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcttctccc aaatggctta ggg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagaagaat gggggttctc tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgctgtcccc taagccattt ggg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatccaaact gagaacagct ggg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgtcaggat tggttaccaa agg 23

<210> 15

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcagccgagt gtagttg 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caactacact cggctga 17

<210> 17

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agaagaatgg gggttctc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagaaccccc attcttct 18

<210> 19

<211> 132

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 20

<211> 1007

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 20

cgggaactcc tgaaatcagc cgacagaaga ctcaggagaa gcactatggg ggcatgggcc 60

atgctgtatg gagtctcgat gctctgtgtg ctggacctag gtcagccgag tgtagttgag 120

gagcctggct gtggccctgg caaggttcag aacggaagtg gcaacaacac tcgctgctgc 180

agcctgtatg ctccaggcaa ggaggactgt ccaaaagaaa ggtgcatatg tgtcacacct 240

gagtaccact gtggagaccc tcagtgcaag atctgcaagc actacccctg ccaaccaggc 300

cagagggtgg agtctcaagg ggatattgtg tttggcttcc ggtgtgttgc ctgtgccatg 360

ggcaccttct ccgcaggtcg tgacggtcac tgcagacttt ggaccaactg ttctcagttt 420

ggatttctca ccatgttccc tgggaacaag acccacaatg ctgtgtgcat cccggagcca 480

ctgcccactg agcaatacgg ccatttgact gtcatcttcc tggtcatggc tgcatgcatt 540

ttcttcctaa ccacagtcca gctcggcctg cacatatggc agctgaggag gcaacacatg 600

tgtcctcgag agacccagcc attcgcggag gtgcagttgt cagctgagga tgcttgcagc 660

ttccagttcc ctgaggagga acgcggggag cagacagaag aaaagtgtca tctggggggt 720

cggtggccat gaggcctggt cttcctctgt gccccaagcc agacgctaca agacttgccc 780

agctataccc ttggtgagag caggggccat gttctgcacc cttccctggg cctggccctg 840

ctcccctcaa cagtggcgga agtgggtgta tgagagcggt gagttacgat tgggccctat 900

ggctgccttt ctcatttgac agctctgttg gagtagggtc tttgggccca ccaagagcac 960

cacgtttagc acaagatctt gtacaagaat aaatacttgt ctagtaa 1007

<210> 21

<211> 228

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 21

Met Gly Ala Trp Ala Met Leu Tyr Gly Val Ser Met Leu Cys Val Leu

1 5 10 15

Asp Leu Gly Gln Pro Ser Val Val Glu Glu Pro Gly Cys Gly Pro Gly

20 25 30

Lys Val Gln Asn Gly Ser Gly Asn Asn Thr Arg Cys Cys Ser Leu Tyr

35 40 45

Ala Pro Gly Lys Glu Asp Cys Pro Lys Glu Arg Cys Ile Cys Val Thr

50 55 60

Pro Glu Tyr His Cys Gly Asp Pro Gln Cys Lys Ile Cys Lys His Tyr

65 70 75 80

Pro Cys Gln Pro Gly Gln Arg Val Glu Ser Gln Gly Asp Ile Val Phe

85 90 95

Gly Phe Arg Cys Val Ala Cys Ala Met Gly Thr Phe Ser Ala Gly Arg

100 105 110

Asp Gly His Cys Arg Leu Trp Thr Asn Cys Ser Gln Phe Gly Phe Leu

115 120 125

Thr Met Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Ile Pro Glu

130 135 140

Pro Leu Pro Thr Glu Gln Tyr Gly His Leu Thr Val Ile Phe Leu Val

145 150 155 160

Met Ala Ala Cys Ile Phe Phe Leu Thr Thr Val Gln Leu Gly Leu His

165 170 175

Ile Trp Gln Leu Arg Arg Gln His Met Cys Pro Arg Glu Thr Gln Pro

180 185 190

Phe Ala Glu Val Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Cys Ser Phe Gln Phe

195 200 205

Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Gln Thr Glu Glu Lys Cys His Leu Gly

210 215 220

Gly Arg Trp Pro

225

<210> 22

<211> 1214

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 22

gtctacaccc cctcctcaca cgcacttcac ctgggtcggg attctcaggt catgaacggt 60

cccagccacc tccgggcagg gcgggtgagg acggggacgg ggcgtgtcca actggctgtg 120

ggctcttgaa acccgagcat ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc 180

ggcctggcgc tgctgtgcgc gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc 240

ggccctgggc gcctcctgct tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg 300

acgcgctgct gccgcgatta cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt 360

gtccagcctg aattccactg cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt 420

cccccaggcc agggggtaca gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac 480

tgtgcctcgg ggaccttctc cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc 540

acccagttcg ggtttctcac tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc 600

ccagggtccc cgccggcaga gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc 660

gcctgcgtcc tcctcctgac ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt 720

cagtgcatgt ggccccgaga gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac 780

gccagaagct gccagttccc cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg 840

cggctgggag acctgtgggt gtgagcctgg ccgtcctccg gggccaccga ccgcagccag 900

cccctcccca ggagctcccc aggccgcagg ggctctgcgt tctgctctgg gccgggccct 960

gctcccctgg cagcagaagt gggtgcagga aggtggcagt gaccagcgcc ctggaccatg 1020

cagttcggcg gccgcggctg ggccctgcag gagggagaga gagacacagt catggccccc 1080

ttcctccctt gctggccctg atggggtggg gtcttaggac gggaggctgt gtccgtgggt 1140

gtgcagtgcc cagcacggga cccggctgca ggggaccttc aataaacact tgtccagtga 1200

aaaaaaaaaa aaaa 1214

<210> 23

<211> 241

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 23

Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro

20 25 30

Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg

35 40 45

Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu

50 55 60

Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His

65 70 75 80

Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro

85 90 95

Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys

100 105 110

Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys

115 120 125

Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro

130 135 140

Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala

145 150 155 160

Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys

165 170 175

Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu

180 185 190

Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val

195 200 205

Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu

210 215 220

Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp

225 230 235 240

Val

<210> 24

<211> 2443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctgaaatcag ccgacagaag actcaggaga agcactatgg cacagcacgg ggcgatgggc 60

gcgtttcggg ccctgtgcgg cctggcgctg ctgtgcgcgc tcagcctggg tcagcgcccc 120

accgggggtc ccgggtgcgg ccctgggcgc ctcctgcttg ggacgggaac ggacgcgcgc 180

tgctgccggg ttcacacgac gcgctgctgc cgcgattacc cgggtaagta aaccgcgttt 240

acttaacgcg gaccggccaa ggcgtcccgc ggaagccggg atgggtgggc gccccccttc 300

ccgtgctcag accggcgttg ctgaggtcta aggagggtgg gcacagagcc gccagcagcg 360

ggagccttcc ggagggaggc aggatcccag agggaggcgg aggtgtgcca gctccagcca 420

gtggccccgg ccgggagcag gggtgagcca ggtgggagcg ccctcaagag gggtctgggg 480

tctggaggtg gaggacggct gttccaggtc ctgctgggcg ggtcgtgagc ccttggccat 540

cgcccagccc cctcctgccc agttgagggc ccccctgcac caccgtctgg cctgctgcct 600

gcctctgacc tgcacctggg gatgagggtt cagctgacac ggctggtctg gagaggaagc 660

tggcagggaa gtcaccccag agcttcttcc tccagggcct gtgggttggg aagggaggct 720

ctgtccggag gcccagtgtg gctggtggtg gggacagcag cgcccagaca ccaggcaggc 780

ggcctctgag gtgtcgacgg gcctccaggg gactgtgcac tgttgggggc cacccctggg 840

tcctgcaggg gcagctcctg gttgcatatg gagttagcac ctgggcaggg gcagctgtgg 900

ggcgcaaagg gggagtagcc aggccacatg gccccaggag aaagagacag ctggataaac 960

ccagggtcca gactcccagc caggagccct ctgctccctg gagccaactg tgggtggaga 1020

acggacaacc tcactcccct ggagggccga ggggaggcct ggggaggagg gggcctcagc 1080

ccagctgctg gggggctggc ctgtctcctg cccaggcgag gagtgctgtt ccgagtggga 1140

ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg cggagaccct tgctgcacga cctgccggca 1200

ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca gtcccagggt aagtcctgga ggtgcctctg 1260

ggagtccaca caggccaggg gttccactag ggcccgaggc agagctcgtg ggcacaggtg 1320

tccggcgagg acatgtggtg tgtggggtcc ggagtcctgt gaggccgggc aggccaggcc 1380

atgctcaggc accacaggcc atgaagctct gggggtgtcc tgtccctgct ttctcagcct 1440

gggcttctcc atccagcacg agggctgtga gaaccctgcg gggaggtggg ggcgggttcc 1500

aggagctgtc tggctctcag gcccgggaca cccatcctgt ctgtcctcac cacatactga 1560

aagagcctgc cctgtgcccc ccggagtcct gtctggggcc tggggctgca ccctgttctg 1620

gaaggagcag ctcaagtcct cttagcggct tgtttacctg acaggagagg tcaggctggg 1680

cacatgagag ctgggagaag gtacaactgg ggaggttgtg tcaggttgga cggggcaggg 1740

tctggggtca actgggaccc agcctcactc tctctgggac cctcactgtt ctccaccctc 1800

tgttctactg ggtcctgcct ggcttctgcc caccctcagc ccccaatggg caggcctttc 1860

ccctccctgg caggcccact gcactctgcg cacctccccc aggtgccctc actgggcccc 1920

accccagacg ccccacctgg gacgggcaga catgggcccc agtcctgggc catgaagaac 1980

tctgttgaat ggatgatggg gggggcattc tactcagcac ccagacccca gatggacccc 2040

tgcactggcc tgacgccctc ctcatccatc ccagcaactc caccagcctc cctccctccc 2100

tccccccaca ccccacacca gggaaattca gttttggctt ccagtgtatc gactgtgcct 2160

cggggacctt ctccgggggc cacgaaggcc actgcaaacc ttggacagag tgagtcctgg 2220

gtgggccctg ccggtggccg ggtggtccag gcccactctg aggaagggtc ctctcctgtc 2280

ccttgcccca gacagcacgg agggcagcag ccgggggctg atcggaggcc gtgtccgggg 2340

gctgatagga ggccgcgtcc atgtattcca gctgcaccca gttcgggttt ctcactgtgt 2400

tccctgggaa caagacccac aatgctgtgt gcatcccgga gcc 2443

<210> 25

<211> 723

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atggcacagc acggggcgat gggcgcgttt cgggccctgt gcggcctggc gctgctgtgc 60

gcgctcagcc tgggtcagcg ccccaccggg ggtcccgggt gcggccctgg gcgcctcctg 120

cttgggacgg gaacggacgc gcgctgctgc cgggttcaca cgacgcgctg ctgccgcgat 180

tacccgggcg aggagtgctg ttccgagtgg gactgcatgt gtgtccagcc tgaattccac 240

tgcggagacc cttgctgcac gacctgccgg caccaccctt gtcccccagg ccagggggta 300

cagtcccagg ggaaattcag ttttggcttc cagtgtatcg actgtgcctc ggggaccttc 360

tccgggggcc acgaaggcca ctgcaaacct tggacagact gcacccagtt cgggtttctc 420

actgtgttcc ctgggaacaa gacccacaat gctgtgtgca tcccggagcc actgcccact 480

gagcaatacg gccatttgac tgtcatcttc ctggtcatgg ctgcatgcat tttcttccta 540

accacagtcc agctcggcct gcacatatgg cagctgagga ggcaacacat gtgtcctcga 600

gagacccagc cattcgcgga ggtgcagttg tcagctgagg atgcttgcag cttccagttc 660

cctgaggagg aacgcgggga gcagacagaa gaaaagtgtc atctgggggg tcggtggcca 720

tga 723

<210> 26

<211> 1043

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgggaactcc tgaaatcagc cgacagaaga ctcaggagaa gcactatggc acagcacggg 60

gcgatgggcg cgtttcgggc cctgtgcggc ctggcgctgc tgtgcgcgct cagcctgggt 120

cagcgcccca ccgggggtcc cgggtgcggc cctgggcgcc tcctgcttgg gacgggaacg 180

gacgcgcgct gctgccgggt tcacacgacg cgctgctgcc gcgattaccc gggcgaggag 240

tgctgttccg agtgggactg catgtgtgtc cagcctgaat tccactgcgg agacccttgc 300

tgcacgacct gccggcacca cccttgtccc ccaggccagg gggtacagtc ccaggggaaa 360

ttcagttttg gcttccagtg tatcgactgt gcctcgggga ccttctccgg gggccacgaa 420

ggccactgca aaccttggac agactgcacc cagttcgggt ttctcactgt gttccctggg 480

aacaagaccc acaatgctgt gtgcatcccg gagccactgc ccactgagca atacggccat 540

ttgactgtca tcttcctggt catggctgca tgcattttct tcctaaccac agtccagctc 600

ggcctgcaca tatggcagct gaggaggcaa cacatgtgtc ctcgagagac ccagccattc 660

gcggaggtgc agttgtcagc tgaggatgct tgcagcttcc agttccctga ggaggaacgc 720

ggggagcaga cagaagaaaa gtgtcatctg gggggtcggt ggccatgagg cctggtcttc 780

ctctgtgccc caagccagac gctacaagac ttgcccagct atacccttgg tgagagcagg 840

ggccatgttc tgcacccttc cctgggcctg gccctgctcc cctcaacagt ggcggaagtg 900

ggtgtatgag agcggtgagt tacgattggg ccctatggct gcctttctca tttgacagct 960

ctgttggagt agggtctttg ggcccaccaa gagcaccacg tttagcacaa gatcttgtac 1020

aagaataaat acttgtctag taa 1043

<210> 27

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro

20 25 30

Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg

35 40 45

Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu

50 55 60

Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His

65 70 75 80

Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro

85 90 95

Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys

100 105 110

Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys

115 120 125

Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro

130 135 140

Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Ile Pro Glu Pro Leu Pro Thr

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Gly His Leu Thr Val Ile Phe Leu Val Met Ala Ala Cys

165 170 175

Ile Phe Phe Leu Thr Thr Val Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu

180 185 190

Arg Arg Gln His Met Cys Pro Arg Glu Thr Gln Pro Phe Ala Glu Val

195 200 205

Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Cys Ser Phe Gln Phe Pro Glu Glu Glu

210 215 220

Arg Gly Glu Gln Thr Glu Glu Lys Cys His Leu Gly Gly Arg Trp Pro

225 230 235 240

<210> 28

<211> 1389

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 28

ctgagatgtt caaattcacc ctcggtcctc ccaacagtcc tcactatgtt tccctgtgct 60

tattcagctg gaagatgtgg gaagtaaggc tgagtacagc agaggactcc tgacagaggc 120

agggttccag aaccgtcagt ggccacacga agaagctgtt aggagactcc cagcacagca 180

ttggctctct ttcagacccc agattaggca caaactacac acaaacacct gttctcacag 240

agagattctt tactaagcag ggaagaaaag ttaaagtggt tgttttctga ctcaggcaca 300

aaaacagcag caaatgacct ttcacatgta atttttgttt gtttgtttgt ttgtttgttt 360

tttgagaaag ggtttctctg tgtagccctg gctgtcctgg aactcactct gtagaccagg 420

ctggcctcga actcagaaat ctgcctgcct ctgcctcccg agtgctggga ttaaaggcga 480

gcgccaccac acccggcttc acatgcaatt tttaagaaga gaaaaagggg aggcctgtgt 540

tagaatggat taggatgcag tggtatattt taattgggca tgttaattag ttgaaccaaa 600

ggggtttttt gattgctgga cttcaatact ttgatagcgg aaccttggca gtcagcctcc 660

ggaggaggaa atggccaaat aagagaaaag accttggtgg gcaggtaacc ctgagtttag 720

gggtgtaatc tagccagtca gagagaatgg aagagaaggg caaggcctgt cagagccatg 780

ctggccatgt tcaagaaaat gaggctcacc tgtatctggg actcctttct tgttgtctaa 840

aattgtgtga ggaagtgaac aaaagtggct ccagggagag ccaagctgga actgccaagg 900

ctagacctgg gcaggccaca ccgcccatgg cttcatgtac ttgctaggaa tacctacttt 960

atgatgatct tcttaacgag gcatggtgtg tgctctggac tcctctcgct ggctctccta 1020

gtttcccagg cttagaggaa cttcctgggg cagaaggggg aagggggtag ttttatacaa 1080

taaggggtgc ccacaggtgg cagcagtggc acatgtgaat gggcatcctt ttcctctgta 1140

gcctagccag ggcgagtttg ctggagttgg gagaggcatg taggggttag gagatgtcca 1200

gaaaggggat agctctgctc tacacttcac agaaggcctt tacaaacacc tcagatgtct 1260

gccggaaact ggaggtggag ctggcctgaa gcccagtctg aggggtgggg acagaggcag 1320

aggcagagac aaggcaagtt ggagcgggaa ctcctgaaat cagccgacag aagactcagg 1380

agaagcact 1389

<210> 29

<211> 830

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 29

ttccctggga acaagaccca caatgctgtg tgcatcccgg agccactgcc cactgagcaa 60

tacggccatt tgactgtcat cttcctggtc atggctgcat gcattttctt cctaaccaca 120

gtccagctcg gcctgcacat atggcagctg aggaggcaac acatgtgtcc tcgaggtcag 180

ttgtgtccca gggaagggga aaatgtgtct caggcccctc acttaccgca cgcagtttta 240

ctacagagac ccagccattc gcggaggtgc agttgtcagc tgaggatgct tgcagcttcc 300

agttccctga ggaggaacgc ggggagcaga cagaagaaaa gtgtcatctg gggggtcggt 360

ggccatgagg cctggtcttc ctctgtgccc caagccagac gctacaagac ttgcccagct 420

atacccttgg tgagagcagg ggccatgttc tgcacccttc cctgggcctg gccctgctcc 480

cctcaacagt ggcggaagtg ggtgtatgag agcggtgagt tacgattggg ccctatggct 540

gcctttctca tttgacagct ctgttggagt agggtctttg ggcccaccaa gagcaccacg 600

tttagcacaa gatcttgtac aagaataaat acttgtctag taacctgagt ggctgtgtcc 660

taaggacgga ggaaaggaag gagcccagag ttgcattgag ggacaccctt tgtcatccta 720

tgcccacagt catttccaga gtgaaatatc ttggcagaca aagaaagcct cctgcctcta 780

agcctgatga attgagttgg atttctggga accacagtag gagattctgc 830

<210> 30

<211> 2363

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 30

atggcacagc acggggcgat gggcgcgttt cgggccctgt gcggcctggc gctgctgtgc 60

gcgctcagcc tgggtcagcg ccccaccggg ggtcccgggt gcggccctgg gcgcctcctg 120

cttgggacgg gaacggacgc gcgctgctgc cgggttcaca cgacgcgctg ctgccgcgat 180

tacccgggta agtaaaccgc gtttacttaa cgcggaccgg ccaaggcgtc ccgcggaagc 240

cgggatgggt gggcgccccc cttcccgtgc tcagaccggc gttgctgagg tctaaggagg 300

gtgggcacag agccgccagc agcgggagcc ttccggaggg aggcaggatc ccagagggag 360

gcggaggtgt gccagctcca gccagtggcc ccggccggga gcaggggtga gccaggtggg 420

agcgccctca agaggggtct ggggtctgga ggtggaggac ggctgttcca ggtcctgctg 480

ggcgggtcgt gagcccttgg ccatcgccca gccccctcct gcccagttga gggcccccct 540

gcaccaccgt ctggcctgct gcctgcctct gacctgcacc tggggatgag ggttcagctg 600

acacggctgg tctggagagg aagctggcag ggaagtcacc ccagagcttc ttcctccagg 660

gcctgtgggt tgggaaggga ggctctgtcc ggaggcccag tgtggctggt ggtggggaca 720

gcagcgccca gacaccaggc aggcggcctc tgaggtgtcg acgggcctcc aggggactgt 780

gcactgttgg gggccacccc tgggtcctgc aggggcagct cctggttgca tatggagtta 840

gcacctgggc aggggcagct gtggggcgca aagggggagt agccaggcca catggcccca 900

ggagaaagag acagctggat aaacccaggg tccagactcc cagccaggag ccctctgctc 960

cctggagcca actgtgggtg gagaacggac aacctcactc ccctggaggg ccgaggggag 1020

gcctggggag gagggggcct cagcccagct gctggggggc tggcctgtct cctgcccagg 1080

cgaggagtgc tgttccgagt gggactgcat gtgtgtccag cctgaattcc actgcggaga 1140

cccttgctgc acgacctgcc ggcaccaccc ttgtccccca ggccaggggg tacagtccca 1200

gggtaagtcc tggaggtgcc tctgggagtc cacacaggcc aggggttcca ctagggcccg 1260

aggcagagct cgtgggcaca ggtgtccggc gaggacatgt ggtgtgtggg gtccggagtc 1320

ctgtgaggcc gggcaggcca ggccatgctc aggcaccaca ggccatgaag ctctgggggt 1380

gtcctgtccc tgctttctca gcctgggctt ctccatccag cacgagggct gtgagaaccc 1440

tgcggggagg tgggggcggg ttccaggagc tgtctggctc tcaggcccgg gacacccatc 1500

ctgtctgtcc tcaccacata ctgaaagagc ctgccctgtg ccccccggag tcctgtctgg 1560

ggcctggggc tgcaccctgt tctggaagga gcagctcaag tcctcttagc ggcttgttta 1620

cctgacagga gaggtcaggc tgggcacatg agagctggga gaaggtacaa ctggggaggt 1680

tgtgtcaggt tggacggggc agggtctggg gtcaactggg acccagcctc actctctctg 1740

ggaccctcac tgttctccac cctctgttct actgggtcct gcctggcttc tgcccaccct 1800

cagcccccaa tgggcaggcc tttcccctcc ctggcaggcc cactgcactc tgcgcacctc 1860

ccccaggtgc cctcactggg ccccacccca gacgccccac ctgggacggg cagacatggg 1920

ccccagtcct gggccatgaa gaactctgtt gaatggatga tggggggggc attctactca 1980

gcacccagac cccagatgga cccctgcact ggcctgacgc cctcctcatc catcccagca 2040

actccaccag cctccctccc tccctccccc cacaccccac accagggaaa ttcagttttg 2100

gcttccagtg tatcgactgt gcctcgggga ccttctccgg gggccacgaa ggccactgca 2160

aaccttggac agagtgagtc ctgggtgggc cctgccggtg gccgggtggt ccaggcccac 2220

tctgaggaag ggtcctctcc tgtcccttgc cccagacagc acggagggca gcagccgggg 2280

gctgatcgga ggccgtgtcc gggggctgat aggaggccgc gtccatgtat tccagctgca 2340

cccagttcgg gtttctcact gtg 2363

<210> 31

<211> 38

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgatctcgag ctgagatgtt caaattcacc ctcggtcc 38

<210> 32

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

catcgccccg tgctgtgcca tagtgcttct cctgagtctt ctgtcggc 48

<210> 33

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gccgacagaa gactcaggag aagcactatg gcacagcacg gggcgatg 48

<210> 34

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ctgtgcccac gagctctgcc tcg 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cgaggcagag ctcgtgggca cag 23

<210> 36

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

attgtgggtc ttgttcccag ggaacacagt gagaaacccg aactgggtg 49

<210> 37

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cacccagttc gggtttctca ctgtgttccc tgggaacaag acccacaat 49

<210> 38

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cgatgcggcc gcagaatctc ctactgtggt tcccag 36

<210> 39

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cctgtgtcct ttctttccca ctatg 25

<210> 40

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gttcccgtcc caagcaggag g 21

<210> 41

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cttccagtgt atcgactgtg cctcg 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tccgaaagcc tccttagctt gatgg 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gctaactcca tatgcaacca gg 22

<210> 44

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cttccagtgt atcgactgtg cctcg 25

<210> 45

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gcatcaagct tggtaccgat gctctgctct acacttcaca gaagg 45

<210> 46

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

acttaatcgt ggaggatgat gtagtaaaac tgcgtgcggt aagtg 45

<210> 47

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

agttgggaga ggcatgtagg ggtta 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gagaagttcc cagcctcttt tgcct 25

<210> 49

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

taggtcagcc gagtgtagtt g 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

aaaccaacta cactcggctg a 21

<210> 51

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

cttccacatg agcgtggtca gggcc 25

<210> 52

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ccaagggact attttagatg ggcag 25

<210> 53

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gaagctacaa gctcctaggt aggggg 26

<210> 54

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

acgggttggc tcaaaccatt aca 23

<210> 55

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

taggagaaga atgggggttc tc 22

<210> 56

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

aaacgagaac ccccattctt ct 22

Claims

1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人GITR基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码人源化GITR蛋白，所述人源化GITR蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合GITR基因编码胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合GITR基因编码的胞外区域包含人GITR蛋白胞外域的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人GITR基因部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Gitr启动子后；优选的，所述嵌合GITR基因的跨膜区为动物来源。

3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源部分包括Gitr基因的4号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人GITR基因部分为第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或第4号外显子的部分或全部序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行GITR人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行GITR人源化动物的构建。

5.根据权利要求4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源的Gitr基因为啮齿类动物来源的Gitr基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

6.根据权利要求5所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列替换为人GITR基因的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11。

7.根据权利要求1或2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化GITR蛋白为嵌合GITR蛋白，所述的嵌合GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人GITR蛋白的全部或部分片段，所述跨膜区为动物来源；

优选的，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：

8.根据权利要求7所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码权利要求7所述的嵌合GITR蛋白，或所述的嵌合GITR基因选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR基因为SEQ ID NO：24所示的序列的部分或全部；

e)嵌合GITR基因的序列在严格条件下，与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列杂交；

或

9.一种权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代，其特征在于，所述的人源化动物模型或其后代表达嵌合GITR蛋白。

10.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸。

11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Gitr基因的第1外显子至第4外显子。

12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQ ID NO：28所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：29所示。

13.根据权利要求10-12任一项所述的靶向载体，其特征在于，其中替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，替换的供体DNA序列为人GITR基因的核苷酸序列部分或全部；进一步优选的，所述人GITR基因的核苷酸序列包括人GITR基因DNA序列的第1外显子至第4外显子的全部或部分。

14.根据权利要求13所述的靶向载体，其特征在于，所述人GITR基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000001.11的第1204209-1206571位核苷酸；优选的，所述人GITR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。

15.一种能够特异的靶向Gitr基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在小鼠Gitr基因的靶位点位于小鼠Gitr基因的第1外显子和/或第4外显子上；所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：11所示。

16.一种构建人源化动物模型的载体，其特征在于，所述载体能够产生如权利要求15所述的sgRNA序列，用于敲除或替换Gitr基因的第1号外显子至第4号外显子的部分或全部。

17.一种权利要求10-14任一所述的靶向载体、权利要求15所述的sgRNA或权利要求16所述的载体在敲除或替换GITR基因的第1号外显子至第4号外显子的部分或全部中的应用。

18.一种GITR基因人源化细胞株，其特征在于，所述人源化细胞株的基因组中包括人GITR基因，该人源化细胞株可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

19.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，

(a)利用权利要求1-8任一所述方法获得人源化动物模型；

(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。

21.一种根据权利要求19或20所述的方法制备获得的多基因人源化动物模型或其后代，其特征在于，所述的多基因人源化动物模型Gitr基因座处与Gitr启动子可操作连接的编码人GITR的核酸，和所述多基因人源化动物模型基因组中还包括其他人源化基因，所述其他人源化基因选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3或CD40中的一种或两种以上的组合。

22.一种荷瘤动物模型，其特征在于，所述荷瘤动物模型是通过权利要求1-8或权利要求19-20任一所述的方法制备获得的。

23.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求9所述的人源化动物模型或其后代、权利要求21所述的多基因人源化动物模型或其后代或权利要求22所述的荷瘤动物模型。

24.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求9所述的人源化动物模型或其后代、权利要求21所述的多基因人源化动物模型或其后代或权利要求22所述的荷瘤动物模型。

25.一种嵌合GITR蛋白，其特征在于，所述的嵌合GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人GITR蛋白的全部或部分片段；优选的，所述跨膜区为动物来源。

26.根据权利要求25所述的嵌合GITR蛋白，其特征在于，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：

27.一种编码权利要求25或26所述的嵌合GITR蛋白的嵌合GITR基因，其特征在于，所述的嵌合GITR基因选自下列组中的一种：

a)嵌合GITR基因为SEQ ID NO：24所示的序列的部分或全部；

或

28.根据权利要求27所述的嵌合GITR基因，其特征在于，其中嵌合小鼠GITR DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：24。

29.人源化小鼠GITR的基因组cDNA，其特征在于，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与权利要求27-28任一所述的嵌合GITR基因序列一致或互补。

30.一种表达权利要求25或26所述的嵌合GITR蛋白的构建体。

31.一种包含权利要求30所述构建体的细胞。

32.一种包含权利要求31所述细胞的组织。

33.来源于权利要求9所述的人源化动物模型或其后代、权利要求21所述的多基因人源化动物模型或其后代或权利要求22所述的荷瘤动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或在筛选、验证、评价或研究GITR基因功能、GITR抗体、针对GITR靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。