CN111701023B - 抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用 - Google Patents

抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用，揭示了zkscan3与GATA1相互作用并抑制GATA1的转录活性，进而影响红细胞生成。同时，还揭示了zkscan3基因能通过促进KLF1的表达导致红细胞脱核障碍。基于此，本发明的抑制剂能够通过调节GATA1、KLF1的转录进而影响红细胞的生成和成熟。

Description

抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用
技术领域
本发明涉及一种抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
ZKSCAN3是一种具有KRAB和SCAN结构域的锌指蛋白，属于Krüppel相关的盒结构域锌指蛋白(KRAB-ZFP)家族，该家族参与多种细胞的生命活动，例如细胞增殖，凋亡和赘生性转化等。KRAB-ZFP有四个亚家族，两个带有KRAB和C2H2锌指基序，另外两个在N端带有一个额外的SCAN(SCAN-ZFP)。KRAB结构域具有抑制基因转录的功能，而C2H2锌指结构域则与特定的DNA序列结合，SCAN结构域的功能仍知之甚少。据报道，ZKSCAN3通过上调与细胞周期、细胞增殖、迁移、血管生成和蛋白水解相关的基因的表达来促进癌细胞的增殖，迁移和侵袭。
目前zkscna3依然成为癌症的候选基因，也发现Zkscan3基因在许多重要的细胞生物学和肿瘤发病机理中起重要作用。目前国际上对zkscan3基因的研究越来越活跃。然而，正常生理条件下，人们对zkscan3基因的功能知之甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制剂、抑制剂组合物、药物及其应用，该抑制剂能够通过调节GATA1、KLF1的转录进而影响红细胞的生成和成熟。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抑制剂，所述抑制剂抑制Zkscan3基因的表达，以降低Zkscan3基因的表达产物的水平；或者，所述抑制剂与Zkscan3基因的表达产物结合，以降低Zkscan3基因的产物的促进红细胞生成和/或成熟的活性。
进一步地，所述抑制剂选自抗体、抗体功能性片段、肽类或拟肽类中的一种或多种。
进一步地，所述抑制剂选自基因干扰、基因编辑、基因沉默或基因敲除材料中的任一种。
进一步地，所述抑制剂选自DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体中的一种或多种。
本发明还提供一种根据所述的抑制剂在用于制备抑制红细胞生成和/或成熟的药物中的应用。
本发明还提供一种抑制剂组合物，其含有所述的抑制剂作为活性成分。
进一步地，还含有药学上可接受的辅料，所述辅料使所述抑制剂稳定和/或增强所述抑制剂效果。
本发明还提供一种药物，其含有所述的抑制剂，或者，含有所述的抑制剂组合物。
进一步地，所述药物的剂型选自水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂中的任一种或多种。
本发明还提供一种根据所述的药物在抑制红细胞生成和/或成熟中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明揭示了zkscan3与GATA1相互作用并抑制GATA1的转录活性，进而影响红细胞生成。同时，还揭示了zkscan3基因能通过促进KLF1的表达导致红细胞脱核障碍。基于此，本发明的抑制剂能够通过调节GATA1、KLF1的转录进而影响红细胞的生成和成熟。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明一实施例中研究zkscan3基因对红细胞的生产和/或成熟的影响的实验步骤图；
图2A为本发明一实施例中KO小鼠模型示意图；
图2B至图2E为本发明一实施例中小鼠脾脏和骨髓中红细胞的流式分析图；
图2F为本发明一实施例中小鼠外周血中的RBC，网织细胞，MCHC含量检测图；
图3A为本发明一实施例中苯肼诱导小鼠实验的示意图；
图3B为本发明一实施例中苯肼诱导小鼠3天后WT和KO小鼠的脾脏示意图；
图3C为本发明一实施例中小鼠脾脏和小鼠体重的百分比含量示意图；
图3D和图3E为本发明一实施例中小鼠脾脏和骨髓红细胞亚群的细胞数量示意图；
图3F至图3H为本发明一实施例中小鼠外周血中的RBC，MCHC,网织细胞含量检测图；
图4A为本发明一实施例中小鼠细胞的差异基因聚类图；
图4B为本发明一实施例中小鼠细胞的差异基因火山图；
图4C为本发明一实施例中样本差异基因表达的上调和下调示意图；
图4D为本发明一实施例中小鼠脾脏红细胞的Q-PCR验证示意图；
图5A和图5B为本发明一实施例中GATA1，KLF1，Tiam1启动子的荧光检测示意图；
图5C和图5D为本发明一实施例中zkscan3和GATA1之间的western blot分析示意图；
图5E和图5F为本发明一实施例中GATA1和zkscan3之间的染色体免疫共沉淀结果示意图；
图5G和图5H为本发明一实施例中小鼠骨髓和脾脏中红细胞的凋亡示意图；
图5I和图5J为本发明一实施例中zkscan3和Tiam1之间的CHIP分析示意图；
图5K为本发明一实施例中zkscan3和KLF1之间的的CHIP分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明对zkscan3基因进行了详细地研究，发现zkscan3基因对红细胞的生产和/或成熟起到重要调控作用，基于此，本发明提供了一种抑制剂，其中，该抑制剂能够抑制zkscan3基因的表达，以降低zkscan3基因的表达产物的水平；或者，该抑制剂能够与zkscan3基因的表达产物结合，以降低zkscan3基因的产物的促进红细胞生成和/或成熟的活性。
本发明中，对能够抑制zkscan3基因的表达或者能够与zkscan3基因的表达产物结合的抑制剂的种类没有特别的限制，只要能够实现沉默zkscan3基因的表达或抑制zkscan3基因的促进红细胞生成和/或成熟的功能即可。例如，该抑制剂选自抗体、抗体功能性片段、肽类或拟肽类中的一种或多种；或者，该抑制剂选自基因干扰、基因编辑、基因沉默或基因敲除材料中的任一种；或者，该抑制剂选自DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体中的一种或多种。
本发明还提供了一种抑制剂组合物，其含有上述的抑制剂作为活性成分，并且，还含有药学上可接受的辅料，该辅料使所述抑制剂稳定和/或增强所述抑制剂效果。具体的，所述药用辅料选自生物可容性的高分子多聚物、高分子多聚物的混合物或共聚物中的任一种或多种，例如聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、对羧苯基丙烷与葵二酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物中的任一种或多种。
本发明还提供一种药物，其含有上述的抑制剂，或者，含有上述的抑制剂组合物。所述药物按照药物制备的常用方法制成口服剂、针剂、片剂或缓释剂，具体的，如，但不限于，浑悬液、软膏、胶囊、丸剂、片剂或注射剂等；呈各种形状，如，但不限于，颗粒样、片状、球形、块状、针状、棒状及膜状。上述剂型和形状适用于含或不含添加剂的组合物，且所述药物制剂采用本领域常规的制备方法进行制备。所述药物的剂型选自水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂中的任一种或多种。
所述药物制剂的给药剂量可根据根据给药对象、给药途径(如，口服、静脉注射、局部注射)或药物的制剂形式不同进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。
实施例
请参见图1，本实施例采用以下步骤进行：
1)用流式检测zkscan3基因敲除小鼠和野生小鼠骨髓和脾脏中的红细胞亚群的百分比。请参见图2A-图2F，(2B-2E)流式分析小鼠脾脏和骨髓中红细胞的百分比并统计分析(n＝10)。(2F)五分类血细胞分析仪检测小鼠外周血中的RBC，网织细胞，MCHC。其结果显示zkscan3基因敲除小鼠脾脏中早期和晚期成红细胞的百分比增加。骨髓中早期成红细胞百分比降低。红细胞的其他亚群，外周血并无明显差异。
2)流式检测脾脏和骨髓中的红细胞，五分类血液分析仪检测小鼠外周血。具体的，选取6-8周的WT和KO小鼠各6只，腹腔注射PHZ(100mg/kg)(n＝6)，3天后，流式检测小鼠骨髓，脾脏和外周血中的红细胞。请参见图3A-图3H，(3A)苯肼诱导小鼠实验的示意图。(3B)3天后WT和KO小鼠的脾脏。(3C)小鼠脾脏和小鼠体重的百分比。(3D-3E)脾脏和骨髓红细胞亚群的细胞数量。(3F-3H)外周血中的RBC，MCHC,网织细胞。与野生型小鼠相比，zkscan3基因敲除小鼠的脾脏更大，脾脏中早期和晚期成红细胞的百分比显著增加，骨髓中早期成红细胞的百分比下降，外周血中的网织红细胞(％)明显增加，MCHC(％)显着减少，RBC数量减少；
3)请参见图4A-图4D，分选脾脏中的红细胞，进行RNA-seq分析，zkscan3基因敲除小鼠红细胞中有283个基因下调和472个基因上调。然后qPCR验证关键基因的差异表达。madcam1，zfp697，cela2a，calm13，GNAI，KLF1和α-珠蛋白表达量降低。Epha2，GL16372，GATA1，Tiam1和BCAR的表达量增加，其中：(4A)差异基因聚类图，Log10(RPKM+1)值用于聚类，蓝色表示高表达的基因，红色表示低表达的基因。颜色从红色变为蓝色，表明基因表达更高。(4B)差异基因火山图，显著差异的基因红点表示上调，蓝点表示下调；横坐标代表不同样品中基因表达的倍数变化。纵坐标代表基因表达差异的统计显著性。(4C)样本差异基因表达的上调和下调。(4D)Q-PCR验证脾脏红细胞中的基因表达；
4)鉴于GATA1和KLF1在红细胞发育过程中是不可缺少的。因此，研究了zkscan3和GATA1,KLF1的关系。首先用荧光素酶检测zkscan3和GATA1，KLF1的启动子的关系。GATA1的荧光素酶信号增强，KLF1的荧光素酶信号减弱。CHIP和CO-IP进一步验证了zkscan3和GATA1,KLF1的关系。Zkscan3和GATA1，KLF相互作用，促进GATA1的转录活性，抑制KLF1的活性。请参见图5，(5A-5B)荧光素酶报告基因实验分析(**P＜0.01)研究了zkscan3对GATA1，KLF1，Tiam1启动子的靶向作用。(5C-5D)我们提取了CT26-ZK3细胞和MEL-ZK3细胞的蛋白，进行免疫共沉淀，然后western blot分析zkscan3和GATA1之间的关系。(5E-5F)染色体免疫共沉淀(ChIP)证实了GATA1和zkscan3之间的关系。(5G-5H)小鼠骨髓和脾脏中红细胞的凋亡。(5I-5J)在CT26-zk3和MEL-zk3细胞中，CHIP分析了zkscan3和Tiam1的相互作用。(5K)在MEL-ZK3细胞中，CHIP检测zkscan3和KLF1之间的关系。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种抑制剂在制备抑制红细胞生成和/或成熟的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为基因敲除材料，所述抑制剂抑制Zkscan3基因的表达，以降低Zkscan3基因的表达产物的水平。
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