CN116019916A - 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途 - Google Patents

非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了非小细胞肺癌靶点ARID1A及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途。具体地，本发明提供了糖酵解抑制剂的用途，它被用于制备一组合物或制剂，所述的组合物或制剂用于：(a)预防和/或治疗肺癌，所述的肺癌是ARID1A阴性的肺癌；和/或(b)抑制肺癌细胞，所述的肺癌细胞是ARID1A阴性的肺癌细胞。本发明为肺癌治疗提供了新的有效治疗手段。

Description

非小细胞肺癌靶点ARID1A及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地涉及非小细胞肺癌靶点ARID1A及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途。
背景技术
肺癌的发病率和死亡率在我国及全球范围内均居恶性肿瘤之首位，对人们的生命和健康造成极大的威胁，但肺癌的发病机制至今尚未完全阐明，严重阻碍了肺癌防治的进展。
通过对肺癌发生、发展中的分子事件的深入研究，寻找新的诊断标志物及其干预靶点，对于提高肺癌的总体生存率显得尤为重要。
癌基因激活/抑癌基因失活是癌症发生的根本原因，其一方面受基因组变异的调控，另一方面受表观遗传修饰的影响。染色质重塑是表观遗传修饰的重要方式。ARID1A是染色质重塑复合物SWI/SNF的一种重要亚基，参与调控多种癌症相关基因的表达，进而在多种恶性肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，但其在非小细胞肺癌发病机制中的作用至今尚未见到报道。
鉴于肺癌的发病机理多种多样，因此为了更有效地防治肺癌，本领域迫切需要开发新的肺癌治疗靶点，以及相应的针对新靶点的治疗方法。
发明内容
本发明的目的就是提供新的肺癌治疗靶点，以及相应的针对新靶点的治疗方法。
在本发明的第一方面，提供了一种糖酵解抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述的组合物或制剂用于：(a)预防和/或治疗肺癌，所述的肺癌是ARID1A阴性的肺癌；和/或(b)抑制肺癌细胞，所述的肺癌细胞是ARID1A阴性的肺癌细胞。
在另一优选例中，所述的肺癌为哺乳动物(包括人和非人哺乳动物)的肺癌。
在另一优选例中，所述的ARID1A阴性指，与正常对照细胞，ARID1A表达和/或活性显著下降。
在另一优选例中，所述的显著下降指，在肺癌细胞或组织中ARID1A表达量A1与正常肺细胞或组织中的ARID1A表达量E0之比(即E1/E0)≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/5；和/或肺癌细胞或组织中ARID1A的活性A1与正常肺细胞或组织中的ARID1A活性A0之比(即A1/A0)≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/5。
在另一优选例中，所述的肺癌或肺癌细胞中，BAF250或其亚基的表达是下调的,或其活性显著降低
在另一优选例中，所述的肺癌或肺癌细胞中，SWI/SNF复合物的水平是下调的或其活性显著降低。
在另一优选例中，所述的肺癌为ARID1A缺失型肺癌。
在另一优选例中，所述的肺癌选自下组：腺癌、鳞癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肺癌选自下组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌。
在另一优选例中，所述的糖酵解抑制剂选自下组：
(Z1)Hif-1α抑制剂；
(Z2)Pgk1抑制剂；
(Z3)Pgam1抑制剂；
(Z4)Pkm2抑制剂；
(Z5)上述Z1～Z4的任意组合。
在另一优选例中，所述的糖酵解抑制剂抑制Pgk1、Pgam1和/或Pkm2。
在另一优选例中，所述的糖酵解抑制剂选自下组：小分子化合物、抗体、反义核酸、基因编辑药物、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制剂选自小分子化合物抗体、siRNA、shRNA、或CRISPR/Cas编辑工具介导的抑制复合物。
在另一优选例中，所述的抑制剂包括抑制Pgk1的反义核酸、抑制Pgam1的反义核酸、和/或抑制Pkm2的反义核酸。
在另一优选例中，所述抑制Pgam1的抑制剂如SEQ ID NO:4所示的序列：GGATTGCTCTCTTCTGCACAG；在另一优选例中，所述抑制Pgam1的抑制剂如SEQ ID NO:5所示的序列：TTGACCAGATGTGGTTGCCAG。
在另一优选例中，所述抑制Pkm2的抑制剂如SEQ ID NO:6所示的序列：GGGGCAGAGTCAATGTCCAGG；在另一优选例中，所述抑制Pgam1的抑制剂如SEQ ID NO:7所示的序列：CCGAAGCCACACAGTGAAGCA。
在另一优选例中，所述的糖酵解抑制剂选自下组：BETi小分子化合物、2-DG小分子(2-脱氧-D-葡萄糖，图1a)、或其组合。
在另一优选例中，所述的BETi小分子化合物选自下组：JQ1(图1b)、BET762(Molibresib,图1c)、OXT015(Birabresib，图1d)、BET726(图1e)、BET151(图1f)，或其组合。
在另一优选例中，所述的基因编辑药物用于抑制或消除Pgk1、Pgam1和/或Pkm2基因的表达。
在另一优选例中，所述的治疗包括：抑制肺癌细胞的增殖速率、改变肺癌细胞周期分布、促进肺癌细胞凋亡，抑制肺癌组织生长、或其组合。
在本发明的第二方面，本发明还提供了一种ARID1A基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于选自下组一种或多种用途：
(i)用于评估肺癌患者是否适合用糖酵解抑制剂进行治疗；和/或
(ii)用于评估肺癌患者用糖酵解抑制剂进行治疗的预后。
在另一优选例中，所述的试剂盒还用于
(iii)检测患肺癌或患肺癌风险；
(iv)对肺癌患者的预后评估。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于对肺癌患者基于ARID1A表达和/或活性进行分型。
在另一优选例中，所述检测试剂包括：
(a)ARID1A的特异性抗体、ARID1A的特异性结合分子；和/或
(b)特异性扩增ARID1A mRNA或ARID1A cDNA的引物或引物对、探针或芯片。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种产品组合，所述产品包括：
(a)检测试剂或含所述检测试剂的试剂盒，所述检测试剂为检测ARID1A基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合的检测试剂；和
(b)药物组合物，所述的药组合物含有糖酵解抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测ARID1A基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于评估肺癌患者是否适合用糖酵解抑制剂进行治疗。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有ARID1A基因、mRNA、cDNA、和/或蛋白作为对照品或质控品。
在本发明的第四方面，本发明还提供了一种如本发明第三方面所述的产品组合的用途，用于制备治疗ARID1A阴性的肺癌的医疗产品。
在本发明的第五方面，本发明还提供了一种治疗肺癌的方法，包括步骤：
(a)对肺癌患者基于ARID1A表达和/或活性进行分型，从而将所述患者划分为ARID1A阳性的肺癌患者和ARID1A阴性的肺癌患者；和
(b)对所述的ARID1A阴性的肺癌患者施用糖酵解抑制剂。
在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括：在治疗过程中，检测ARID1A表达和/或活性。
在另一优选例中，所述的糖酵解抑制剂被施用于人。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示干预糖代谢水平及糖酵解关键基因的小分子化合物结构图。
图2显示ARID1A基因在肺癌患者队列中存在-10％的突变频率，突变以错义突变以及截短突变为主。
图3显示ARID1A基因失活能够显著促进了KrasG12D过表达及Tp53缺失背景下小鼠肺组织成瘤能力。
图4显示ARID1A基因变异导致肿瘤细胞糖酵解信号通路明细激活。糖酵解关键基因Pgam1、Pkm以及Pgk1的表达显著上调。
图5显示ARID1A基因变异导致染色质状态重塑并使得糖酵解关联基因Pgam1、Pkm以及Pgk1的启动子区域开放。其中，乏氧通路关键基因Hif-1α能够在ARID1A缺失情况下更加紧密结合到糖酵解关键基因启动子开放区域，促进其表达水平。
图6提示通过直接抑制肿瘤细胞糖酵解水平或下调糖酵解关键基因的表达水平，能够抑制ARID1A缺失型肺癌的进展。
图7提示通过BETi小分子抑制SWI/SNF复合物能够降低ARID1A缺失型肺癌的进展，其中JQ1的抑制作用比较突出。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究发现，ARID1A可作为抑癌基因调控肿瘤，其突变能够促进肿瘤细胞的糖酵解水平，为ARID1A缺失型肺癌治疗提供新的靶点。一种或多种抑制剂可抑制肺癌细胞的增殖速率、改变肺癌细胞周期分布、促进肺癌细胞凋亡，抑制肺癌组织生长，从而治疗肺癌，为肺癌治疗开辟新的方向。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、瘤内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“p53”与“Tp53”可互换使用，是一种肿瘤抑制基因，由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。
ARID1A基因
具体地，本发明所述人源ARID1A其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所述，鼠源ARID1A其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所述。失活指编码ARID1A蛋白的核酸发生变异，导致其编码的氨基酸序列发生序列及结构改变，引起其生物学功能的缺失。
在另一优选例中，所述的核酸变异指碱基序列发生替换；
在另一优选例中，所述的核酸变异指碱基缺失；
在另一优选例中，所述的核酸变异指碱基序列插入。
在另一优选例中，所述的核酸变异指碱基之间发生融合；
在另一优选例中，所述核酸变异指碱基的异常扩增。所述核酸变异最终导致错义突变或无义突变形成。
特别地，ARID1A在肺癌中的变异未发现高频热点突变，其变异位点覆盖整个编码区域。
在另一优选例中，突变位点存在于其DNA结合结构域；
在另一优选例中，其突变位点位于SWI/SNF复合物BAF250亚基即BAF250a。或其它未定义结构区域。
特别地，经过本发明详细的生物数据分析，ARID1A在非小细胞肺癌中的突变频率大概-11％，属于显著高频突变基因，存在重大的研究价值。
具体地，ARID1A序列的缺失突变，能够促进肺腺癌病程的进展。
首先，本发明的研究对象是KrasLSL-G12D；P53Flox/Flox小鼠动物模型(KP小鼠)，能较好地模拟人体肺癌生理特征。通过一种AAV病毒载体导入含有Cre重组酶的基因片段(SEQ ID NO:3)，能够诱导小鼠肺细胞过表达KrasG12D突变体以及同时敲除P53抑癌基因。此方法为本领域内熟知的一种肺腺癌模型的建立方法。
其次，在KP小鼠模型的基础上，构建ARID1A条件性敲除小鼠体系(KrasLSL-G12D；P53Flox/Flox；ARID1A Flox/Flox，KPA)。在Cre重组酶表达情况下，能够诱导小鼠肺细胞过表达KrasG12D突变体以及同时敲除P53/ARID1A抑癌基因，此实施方案能够很好研究ARID1A基因在肺腺癌中的功能。
最后，本发明提示，ARID1A基因功能的缺失，能够显著促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭能力，并显著降低小鼠的生存期。
ARID1A基因缺失促进疾病进展机理
ARID1A基因缺失促进肺腺癌疾病进展的机制，其具体描述如下：
1)ARID1A失活突变，引起肿瘤细胞染色质重塑，改变染色质开放状态；
2)染色质开放包含糖酵解通路相关基因启动子区域开放性增强，相关基因包括但不限于Pgk1、Pgam1以及Pkm2。
3)ARID1A失活突变促使乏氧信号通路关键基因HIF-1α更显著结合与Pgk1、Pgam1以及Pkm2等基因的启动子区域，所述结合能够显著促进所述基因的表达水平。
特别地，糖酵解水平提高能够促进肿瘤细胞进展，与本领域熟知的理论知识接近。在本发明验证过程中，广泛采用了转录组测序、CHIP-SEQ测序、RT-PCR验证以及生物信息学分析等手段进行证实。本发明所采集的数据，基于大量临床样本及相关模式动物研究而来。
在另一优选例中，降低糖酵解水平能够抑制ARID1A突变型肺腺癌的进展。
在另一优选例中，降低糖酵解水平可以通过小分子抑制剂实施，如本领域内熟知的2-DG药物。
在另一优选例中，降低糖酵解水平可以通过传统的技术手段，如siRNA、shRNA、抗体等抑制Pgk1、Pgam1以及Pkm2基因的表达。
在另一优选例中，降低糖酵解水平可以通过基因编辑的方式，如CRISPR/Cas相关技术抑制Pgk1、Pgam1以及Pkm2基因的表达。
特别地，如上所述降低糖酵解水平的方法可以用于制备肺癌治疗药物。
所述药物可以是单一干扰方法或上述方法的任意组合，亦可以是任一方法与熟知的临床药物的一种组合用药。
所述肺癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述肺癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
在另一优选例中，所述药物能够抑制ARID1A缺失型非腺癌的细胞增殖速率、改变细胞周期分布等。
基因BETi
本发明所述一种或多种Bromodomain and extra terminal protein(BET)inhibitor(BETi)小分子化合物，能够有效抑制ARID1A突变型肺癌细胞增殖，提高生存周期，提供了一种新型抑制ARID1A突变型肺癌进展的方法。
BETi小分子化合物包含但不限于JQ1、BET762、OXT015、BET726以及BET151等。其中，ARID1A缺失型肺腺癌细胞对JQ1以及BET762更敏感。报道研究显示，JQ1等分子对ARID1A突变型卵巢癌同样具有抑制性，本发明内容支持并拓展了BETi对ARID1A缺失型癌组织的干预作用。特别地，本发明相关研究是基于KP及KPA小鼠模式动物完成，亦包含基于小鼠细胞构建的类器官，移植瘤模型等。
在另一优选例中，本发明提示BETi对ARID1A缺失的肺癌细胞活性、增殖能力、体内形成的肿瘤负荷均有很强的抑制性。
可以同步地或顺序地给予有效量的BETi抑制剂和至少一种有效量的其他肺癌治疗药物。
基因BETi为本发明首次发现的ARID1A缺失型肺癌的治疗靶点，在与该抑制剂以外的其他肺癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肺癌的治疗作用。
其他的肺癌治疗药物包括但不限于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
在另一优选例中，所述BETi小分子能够抑制ARID1A缺失型非腺癌的细胞增殖速率、改变细胞周期分布等。
肺癌
肺癌(Lung cancer)发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管肺癌，一般指肺实质部的癌症，是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌可向支气管腔内或/和临近的肺组织生长，并可通过淋巴血行或经支气管转移扩散。
肺腺癌(Lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。
非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma)约占所有肺癌的80％，包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。
染色质重塑
染色质重塑(Chromatin remodeling)是通过调整核小体的相位，中和组蛋白尾巴碱性氨基酸残基(赖氨酸K、精氨酸R、组氨酸H等)带正电荷，减弱核小体中碱性氨基酸与DNA的结合，降低相邻核小体间的聚集使核小体滑动暴露本来被遮蔽的元件，或使核小体表面的元件瞬间暴露的动态变化过程。
染色质重塑是基因表达表观遗传水平上控制的主要调控方式，包括：依赖ATP的染色质物理修饰和染色质的共价化学修饰。其中依赖ATP的染色质物理修饰即ATP水解供能使核小体沿DNA滑动，或使核小体解离并重新装配。由于延伸中RNA聚合酶II的周围总是伴有核小体，这些核小体又是会处于部分解离部分装配的动态平衡状态，此染色质物理重塑复合体对于转录延伸也具有重要意义。
依赖ATP染色质物理修饰是通过依赖ATP的染色质重塑复合体作用实现。这些重塑复合体多数是以ATP水解酶为催化中心的多蛋白亚基复合体。根据其中的ATP水解酶的序列和结构不同，重塑子至少可分为五类：SWI/SNF家族复合体、ISWI家族复合体、CHD家族复合体、INO80家族复合体、SWR1。
不同重塑子的染色体物理修饰方式其中SWI/SNF重塑子主要扰乱核小体的秩序。INO80和SWI/SNF家族复合体参与DNA双链断裂(DSB)修复和核苷酸切除修复(NER)。因而在p53介导的对DNA损伤的反应中发挥中心作用。
依赖ATP的染色质重塑复合体中的的多种结构域在核小体识别中发挥作用：Bromodomain是其中常见的基序，约110aa，由4个α-螺旋有可变长度环区连接形成一个疏水口袋，可以识别乙酰化的赖氨酸残基；Chomodomain(CHD)常以两个串联的方式出现在N端，能结合甲基化的赖氨酸残基。
糖酵解通路
糖酵解途径又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。糖酵解途径在无氧及有氧条件下都能进行，是葡萄糖进行有氧或者无氧分解的共同代谢途径。肿瘤细胞处于失控的分裂增殖中，对能量的需求尤为旺盛。但肿瘤细胞产生能量的过程并不主要依赖于经典的线粒体氧化磷酸化。相反，癌症细胞以及其它的一些处于不断增殖的细胞，即使是在氧气充足的情况下也往往选择糖酵解的途径来获得它们所需要的能量，这就是著名的“WarburgEffect”。
磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1，PGK1)是糖酵解过程中的一个关键酶，催化1，3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，并同时生成ATP，因而在细胞能量代谢中发挥着重要功能。肝癌病人的严重程度与其中PGK1蛋白的表达量正相关。敲减Pgk1基因后，肝癌细胞株的糖酵解能力下降，产能减少，细胞的增殖受到抑制，成瘤能力减弱。
磷酸甘油酸变位酶1(Phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)是糖酵解通路的重要功能酶之一，催化3-磷酸甘油酸(3-PG)转化生成2-磷酸甘油酸(2-PG)，促进葡萄糖代谢和能量生成。它通过调节3-PG与2-PG的转化平衡来影响其他代谢通路，参与细胞内生物大分子合成和维持氧化还原稳态，对肿瘤细胞的增殖及转移具有促进作用。PGAM1在多种恶性肿瘤包括非小细胞肺癌中普遍高表达，且与不良预后呈正相关。
M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2 isozyme，PKM2)是肿瘤细胞有氧糖酵解过程中最后一步的关键酶，是它将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)分解为丙酮酸，从而使各种癌细胞获取能量。研究表明，PKM2不仅在肿瘤细胞代谢中发挥重要作用，而且在肿瘤细胞的增殖、转化以及预后中也是重要的信号分子。
p53/Tp53
p53/Tp53是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个蛋白决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡中死去。有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。p53基因突变后，由于其空间构象发生改变，若因此失去了对细胞生长、凋亡和DNA修复的调控作用，则p53基因由抑癌基因转变为癌基因。
伴随诊断
伴随诊断是体外诊断中的一类，它提供的信息对于安全有效地使用相应的治疗产品(药品或生物制品)至关重要。为了安全有效地使用相应的治疗产品，伴随诊断检测是必不可少的，其目的包括：(1)识别很可能从治疗产品中获益的患者；(2)识别使用该治疗产品进行治疗可能增加严重不良反应风险的患者；(3)监测治疗产品对治疗的反应，以调整治疗(如治疗计划、剂量、停药)，更好的实现安全性和有效性等。伴随诊断包括用于特定检测的试剂、质控样本和配套仪器等，是一个整体成套的检测系统。
本发明的主要优点
(a)本发明阐述了ARID1A基因缺失或功能失活在促进肺癌进展中的作用，并提出了依赖乏氧、糖酵解信号通路的调控路径。
(b)本发明基于乏氧、糖酵解信号通路关键基因，提出了针对ARID1A失活型肺癌的靶向治疗方法。这些方法包含但不限于选自小分子化合物抗体、siRNA、shRNA、或CRISPR/Cas编辑工具介导的抑制复合物等。本发明为肺癌治疗提供了新的有效治疗手段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
氨基酸序列与核苷酸序列
SEQ ID NO:1
MAAQVAPAAASSLGNPPPPPPSELKKAEQQQREEAGGEAAAAAAAERGEMKAAAGQESEGPAVGPPQPLGKELQDGAESNGGGGGGGAGSGGGPGAEPDLKNSNGNAGPRPALNNNLTEPPGGGGGGSSDGVGAPPHSAAAALPPPAYGFGQPYGRSPSAVAAAAAAVFHQQHGGQQSPGLAALQSGGGGGLEPYAGPQQNSHDHGFPNHQYNSYYPNRSAYPPPAPAYALSSPRGGTPGSGAAAAAGSKPPPSSSASASSSSSSFAQQRFGAMGGGGPSAAGGGTPQPTATPTLNQLLTSPSSARGYQGYPGGDYSGGPQDGGAGKGPADMASQCWGAAAAAAAAAAASGGAQQRSHHAPMSPGSSGGGGQPLARTPQPSSPMDQMGKMRPQPYGGTNPYSQQQGPPSGPQQGHGYPGQPYGSQTPQRYPMTMQGRAQSAMGGLSYTQQIPPYGQQGPSGYGQQGQTPYYNQQSPHPQQQQPPYSQQPPSQTPHAQPSYQQQPQSQPPQLQSSQPPYSQQPSQPPHQQSPAPYPSQQSTTQQHPQSQPPYSQPQAQSPYQQQQPQQPAPSTLSQQAAYPQPQSQQSQQTAYSQQRFPPPQELSQDSFGSQASSAPSMTSSKGGQEDMNLSLQSRPSSLPDLSGSIDDLPMGTEGALSPGVSTSGISSSQGEQSNPAQSPFSPHTSPHLPGIRGPSPSPVGSPASVAQSRSGPLSPAAVPGNQMPPRPPSGQSDSIMHPSMNQSSIAQDRGYMQRNPQMPQYSSPQPGSALSPRQPSGGQIHTGMGSYQQNSMGSYGPQGGQYGPQGGYPRQPNYNALPNANYPSAGMAGGINPMGAGGQMHGQPGIPPYGTLPPGRMSHASMGNRPYGPNMANMPPQVGSGMCPPPGGMNRKTQETAVAMHVAANSIQNRPPGYPNMNQGGMMGTGPPYGQGINSMAGMINPQGPPYSMGGTMANNSAGMAASPEMMGLGDVKLTPATKMNNKADGTPKTESKSKKSSSSTTTNEKITKLYELGGEPERKMWVDRYLAFTEEKAMGMTNLPAVGRKPLDLYRLYVSVKEIGGLTQVNKNKKWRELATNLNVGTSSSAASSLKKQYIQCLYAFECKIERGEDPPPDIFAAADSKKSQPKIQPPSPAGSGSMQGPQTPQSTSSSMAEGGDLKPPTPASTPHSQIPPLPGMSRSNSVGIQDAFNDGSDSTFQKRNSMTPNPGYQPSMNTSDMMGRMSYEPNKDPYGSMRKAPGSDPFMSSGQGPNGGMGDPYSRAAGPGLGNVAMGPRQHYPYGGPYDRVRTEPGIGPEGNMSTGAPQPNLMPSNPDSGMYSPSRYPPQQQQQQQQRHDSYGNQFSTQGTPSGSPFPSQQTTMYQQQQQNYKRPMDGTYGPPAKRHEGEMYSVPYSTGQGQPQQQQLPPAQPQPASQQQAAQPSPQQDVYNQYGNAYPATATAATERRPAGGPQNQFPFQFGRDRVSAPPGTNAQQNMPPQMMGGPIQASAEVAQQGTMWQGRNDMTYNYANRQSTGSAPQGPAYHGVNRTDEMLHTDQRANHEGSWPSHGTRQPPYGPSAPVPPMTRPPPSNYQPPPSMQNHIPQVSSPAPLPRPMENRTSPSKSPFLHSGMKMQKAGPPVPASHIAPAPVQPPMIRRDITFPPGSVEATQPVLKQRRRLTMKDIGTPEAWRVMMSLKSGLLAESTWALDTINILLYDDNSIMTFNLSQLPGLLELLVEYFRRCLIEIFGILKEYEVGDPGQRTLLDPGRFSKVSSPAPMEGGEEEEELLGPKLEEEEEEEVVENDEEIAFSGKDKPASENSEEKLISKFDKLPVKIVQKNDPFVVDCSDKLGRVQEFDSGLLHWRIGGGDTTEHIQTHFESKTELLPSRPHAPCPPAPRKHVTTAEGTPGTTDQEGPPPDGPPEKRITATMDDMLSTRSSTLTEDGAKSSEAIKESSKFPFGISPAQSHRNIKILEDEPHSKDETPLCTLLDWQDSLAKRCVCVSNTIRSLSFVPGNDFEMSKHPGLLLILGKLILLHHKHPERKQAPLTYEKEEEQDQGVSCNKVEWWWDCLEMLRENTLVTLANISGQLDLSPYPESICLPVLDGLLHWAVCPSAEAQDPFSTLGPNAVLSPQRLVLETLSKLSIQDNNVDLILATPPFSRLEKLYSTMVRFLSDRKNPVCREMAVVLLANLAQGDSLAARAIAVQKGSIGNLLGFLEDSLAATQFQQSQASLLHMQNPPFEPTSVDMMRRAARALLALAKVDENHSEFTLYESRLLDISVSPLMNSLVSQVICDVLFLIGQS
SEQ ID NO:2
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SEQ ID NO:3
TCCAATCTCCTGACTGTTCACCAGAACCTCCCTGCGCTGCCAGTAGATGCCACTAGCGATGAGGTCAGGAAAAATCTCATGGATATGTTTAGGGATAGACAGGCGTTTTCTGAACACACCTGGAAAATGCTGCTTAGCGTGTGCCGATCCTGGGCAGCCTGGTGTAAGCTGAACAATCGCAAATGGTTCCCCGCCGAGCCGGAGGACGTGCGCGATTACCTGCTGTATCTCCAGGCAAGAGGGCTGGCTGTCAAGACTATCCAGCAGCACTTGGGCCAACTGAATATGCTGCATCGACGCAGCGGGCTCCCCCGGCCTAGCGATTCAAACGCAGTCTCCCTTGTTATGAGGAGAATTAGAAAGGAAAACGTAGATGCGGGTGAGAGGGCTAAGCAGGCTCTCGCTTTTGAGCGGACTGATTTCGACCAGGTCAGATCCCTGATGGAGAACAGCGATCGGTGCCAGGACATCAGGAACCTCGCATTTCTGGGAATTGCATATAACACACTTCTGCGCATAGCTGAGATCGCCCGGATCAGAGTGAAAGACATCAGTCGAACGGACGGCGGCCGGATGCTTATTCATATTGGACGCACAAAGACATTGGTCAGCACCGCTGGCGTTGAAAAGGCCTTGTCCCTGGGCGTAACGAAGCTGGTGGAAAGATGGATCTCAGTGTCCGGCGTGGCTGACGACCCTAATAATTACTTGTTCTGTCGAGTGAGAAAAAACGGAGTCGCCGCGCCCTCTGCCACCAGCCAATTGAGTACACGGGCCCTTGAAGGGATCTTTGAGGCAACCCACCGACTCATATACGGAGCCAAGGATGACAGTGGCCAGAGGTATCTCGCCTGGTCAGGTCATTCTGCTAGGGTGGGGGCCGCACGAGACATGGCGCGGGCAGGAGTCTCCATACCAGAGATTATGCAAGCTGGAGGTTGGACAAATGTGAACATCGTTATGAACTATATCCGCAATCTTGACTCTGAAACCGGGGCCATGGTGAGACTGCTCGAAGATGGTGAC
SEQ ID NO:4
GGATTGCTCTCTTCTGCACAG
SEQ ID NO:5
TTGACCAGATGTGGTTGCCAG
SEQ ID NO:6
GGGGCAGAGTCAATGTCCAGG
SEQ ID NO:7
CCGAAGCCACACAGTGAAGCA
实施例1 ARID1A基因在肺癌患者中的突变情况
通过cBioPortal工具分析了来自5个临床队列(包括2，014名肺癌患者)的突变数据；总体而言，2014名患者中有140名(7％)的ARID1A基因发生了突变，突变频率从-3.5％到-10％不等，结果如图2A所示。在分析数据集后，我们在140名患者中发现了160个突变，其中包括67个错义突变和83个其他潜在的失活突变，如图2B所示代表ARID1A基因在临床队列中的突变情况，绿点表示错义突变；黑点表示截短突变；这表明ARID1A的突变在人类肺癌中属于高频变异，提示该突变具有重要的临床研究价值。
实施例2 ARID1A基因缺失促进了体内KrasG12D驱动的肺腺癌的发生
从上海南方模式生物科技股份有限公司获得KrasLSL-G12(C57BL/6-Krasem4(LSL-G12D)Smoc，NM-KI-190003)及Tp53fl/fl(C57BL/6-Tp53tm2Smoc，NM-CKO-18005，denote as Tp53flox/flox mice)小鼠品系。从Jackson Laboratory获得ARID1A(027717-STOCK Arid1atm1.1Zhwa/J，denote as ARID1Aflox/flox mice)小鼠品系。通过互相杂交获得KrasLSL-G12D、Tp53fl/fl(KP)；KrasLSL-G12D、Tp53fl/fl、ARID1Afl/+(KPAfl/+)以及KrasLSL-G12D、Tp53fl/fl(KP)；KrasLSL-G12D、Tp53fl/fl、ARID1Afl/fl(KPAfl/fl)小鼠模型。将出生后4周的小鼠通过气管内插管递送病毒，使肺部感染能表达Cre重组酶的9型腺相关病毒(AAV9-CMV-Cre)。在10-12周时进行解剖与分析(实验方案如图3A所示)。解剖观察KP小鼠与KPAfl/fl小鼠肺部，提示ARID1A失活显著促进了KrasG12D过表达及Tp53缺失背景下肺组织成瘤能力(如图3B所示)。
在病毒灌肺后14周时，利用microCT监测野生型(WT)、KP、KPAfl/+KPAfl/fl小鼠肺部肿瘤的负荷，并解剖小鼠肺部行HE染色分析。结合MicroCT和HE染色分析结果，可得ARID1A杂合突变并不能诱导肺部肿瘤的发生。然而，ARID1A的完全缺失可以极大地促进了KP小鼠的肿瘤进展(如图3C所示)。
然后将KP和KPAfl/fl小鼠的肺部进行肺肿瘤标志物TTF-1，P63，ARID1A和KI67的免疫组化分析，免疫组化染色证实KPAfl/fl肿瘤中ARID1A蛋白水平降低；同时，细胞核内TTF-1(又称Nkx2.1)阳性，p63阴性，提示KPAfl/fl肿瘤具有明显的肺腺癌特征(如图3D，3G所示)。
将14周时KP，KPAfl/+和KPA fl/fl组小鼠肺部表面肿瘤面积和可见肿瘤结节数量进行比较：KPAfl/fl小鼠的肿瘤数量和肿瘤面积比KP或KPAfl/+组显著增加，而KP和KPAfl/+小鼠比较发现，肿瘤数目和肿瘤面积相似。以上表明ARID1A的完全缺失可以极大地促进KrasG12D过表达及Tp53缺失背景下小鼠肺部的成瘤，而ARID1A杂合突变并不影响Kras驱动肿瘤模型的成瘤(如图3E-F所示)。根据KP，KPAfl/+和KPAfl/fl组负荷肺肿瘤小鼠的存活时间绘制生存曲线，KPAfl/fl小鼠的总体存活率较低(如图3H)，与肺部肿瘤负荷较大的表型一致。
以上实验结果表明，ARID1A的缺失促进了肺肿瘤的发生发展。ARID1A变异的小鼠具有更高恶性肿瘤表型与肿瘤载荷，并且整体存活率受损。
实施例3 ARID1A缺失促进体内肺腺癌发生发展的致病机制-影响糖酵解水平
利用RNA测序鉴定出ARID1A缺失后2931个基因存在显著差异表达，这些基因涉及肿瘤进展相关的几个通路，如糖酵解、缺氧、EMT、mTORC信号和Myc靶点等。结果还表明，缺氧及糖酵解信号在KPAfl/fl肺癌中显著上调(如图4A-D所示)。对KP和KPAfl/fl肺癌组织糖酵解和乏氧途径中的关键基因进行热图分析，可知编码糖酵解促进酶的Pgam1、Pkm和Pgk1以及乏氧通路关键因子Hif-1α在KPAfl/fl肿瘤中表达上调(如图4E)。同时，糖酵解代谢产物乳酸在KPAfl/fl组肿瘤中的浓度也升高(如图4F)。利用q-PCR分析KP(n＝9)和KPAfl/fl(n＝11)肿瘤中的糖酵解基因表达水平，结果显示KPAfl/fl肿瘤中糖酵解基因的表达显著上调。进一步利用免疫荧光及Western blot显色方法证实，在ARID1A缺失的情况下，肿瘤组织PGAM1、PKM2和PGK1蛋白的表达上调(图4G-J)。乏氧因子Hif-1α的表达水平对ARID1A的缺失不敏感(图4J)。
以上实验结果表明，ARID1缺失促进体内肺腺癌的发生发展，其机制是通过上调Pgam1、Pkm和Pgk1而增强糖酵解。
实施例4 ARID1A缺失促进体内肺腺癌发生发展的致病机制-重塑染色质状态
本发明内容亦基于KP及KPAfl/fl诱导肺癌模型进行。首先，基于CHIP-seq方法分析了ARID1A在KP肿瘤背景下与基因组DNA结合情况，结果发现ARID1A能够与大量基因启动子区域(转录起始位点±3.0kb范围)结合，Pgam1、Pkm以及Pgk1三基因启动子区域也属于ARID1A结合位点(图5A，左)。
其次，采用ATAC-seq方法分析染色体状态，研究结果显示ARID1A缺失(KPAfl/fl组)能够整体上增强染色质开放(图5A，B)，而且染色质开放区域大多集中于转录起始位点(图5C，Up指上调的峰，Down指下调的峰)；差异结合分析(Diffbind)显示ARID1A缺失(KPAfl/fl组)使Pgam1、Pkm以及Pgk1等基因的转录起始区显著开放(图5D)，其开放区与CHIP-seq实验中ARID1A结合位点高度重叠，提示ARID1A缺失促进了肺癌细胞中Pgam1、Pkm以及Pgk1等基因启动子区域染色质的可触及性。
最后，本研究进一步关联了ARID1A-乏氧-糖酵解在肺癌中的互作。乏氧属于肿瘤典型微环境特征之一，前期转录组测序结果提示ARID1A的缺失能够促进肿瘤乏氧信号通路的激活(图4D，E)。通过分析公共数据库(GSM2257670)分析发现，Hif-1α能够结合到Pgam1、Pkm以及Pgk1三基因启动子区域。
值得注意的是，本发明证实ARID1A缺失(KPAfl/fl组)能够显著促进Hif-1α与Pgam1(图5H)、Pkm(图5I)以及Pgk1(图5J)等基因启动子区域结合。
以上结果提示，ARID1A失活能够促进肺癌细胞染色质开放，使得Hif-1α更易结合到Pgam1、Pkm以及Pgk1三基因启动子区域，提高其表达，在肿瘤细胞内形成更高的糖酵解水平，导致肿瘤细胞进展加剧。
本发明提供了ARID1A缺失促进体内肺腺癌发生发展的致病机制，为ARID1A缺失型肺癌的治疗提供了一系列新的靶点。
实施例5糖酵解抑制剂能够干扰ARID1A缺失型肺癌的进展
本发明实施例4中描述了ARID1A缺失通过提高糖酵解水平促进肺癌进展的生物机制。本实施例中，采用了一种或多种策略干预糖酵解水平，观察此方式能否抑制ARID1A缺失型肺癌的进展。在一种实施方式中，本发明采用了临床药物2-DG抑制肿瘤细胞糖代谢水平，包括糖酵解水平；在另一种实施方式中，本发明采用了慢病毒介导的CRISPR/Cas9干扰Pgam1基因的表达(pSECC-sgPgam1组)，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4与SEQ IDNO:5所示；在另一种实施方式中，本发明采用了慢病毒介导的CRISPR/Cas9干扰Pkm基因的表达(pSECC-sgPkm组)，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7所示。
首先，建立4周龄KP以及KPAfl/fl小鼠体系；其次，对小鼠进行AAV9-CMV-Cre病毒诱导。同时，分别给予慢病毒介导的Cas9及sgRNA进行干扰，靶向糖酵解关键基因Pgam1或Pkm，2-DG药物处理作为另一实验组。设置sgTom为阴性对照组，该组非靶向任何内源基因。实验处理方案如图6A所示。最后，采用多重检测方法对各治疗组干预效果进行评估。
研究发现，2-DG，sgPgam1以及sgPkm干预在一定程度上能够抑制ARID1A缺失引起的肿瘤进展。其中，Pkm基因的敲除能有效减少在体成瘤负荷(图6A-E)。因此，干预Pgam1、Pkm、Pgk1以及其它可控方式干预糖酵解，可以作为药靶治疗ARID1A缺失型肺癌。
实施例6
卵巢癌细胞在BRD2抑制以及ARID1A突变同时存在时致死。BRD2抑制后能够降低SWI/SWF复合物的表达水平，BETi小分子能够抑制BRD2家族蛋白BET。因此，BETi小分子具有特异性抑制ARID1A缺失型卵巢癌作用。本发明在此理论基础上，基于类器官模型与在体动物模型，对BETi小分子抑制ARID1A缺失型的肺癌进行研究。
首先，取KP和KPAfl/fl小鼠肺部肿瘤细胞进行体外类器官的培养与扩增，在肿瘤衍生类器官上进行五种广泛使用的BET抑制剂的药敏实验(如图7A)。为了测试药物对肿瘤衍生类器官形成的影响，我们将肿瘤衍生类器官播种到含有不同浓度的JQ1，Bet762，OTX015，Bet726和Bet151的培养基中，在第7天，类器官的数量随着药物浓度的升高而减少，各种药物对类有机物的形成表现出不同的抑制作用；结果提示JQ1和BET762在浓度为10μm和50μm时选择性地损害KPAfl/fl肿瘤衍生类器官的形成；JQ1对ARID1A缺失型肿瘤类器官的生存能力的损害程度大于ARID1A野生型类器官(图7B、7C)。
其次，在小鼠体内进行肿瘤异种移植，将KP和KPAfl/fl肿瘤类器官异种移植至C57小鼠皮下，测试2-DG，JQ1和Bet762对体内肺癌生长的影响(图7D)。在实验期间每3天测肿瘤体积，通过比较肿瘤体积与重量，证实具有ARID1A敲除的肿瘤对JQ1的治疗更敏感(图7E、7F)。
最后，在转基因模型鼠上(KP与KPAfl/fl组)测试BETi小分子对ARID1A缺失型细胞的敏感性(图7D)。研究结果显示，通过比较肿瘤的瘤体数量以及肿瘤面积，证实ARID1A缺失型肺癌细胞对JQ1敏感(图7G、7H)。
本发明的上述实施例的结果表明，本发明提供了BETi小分子抑制剂对ARID1A缺失型肺癌的疗效数据。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 蚌埠医学院第一附属医院
<120> 非小细胞肺癌新型靶点ARID1A及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途
<130> P2021-2624
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2285
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Ala Gln Val Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Leu Gly Asn Pro
1               5                   10                  15
Pro Pro Pro Pro Pro Ser Glu Leu Lys Lys Ala Glu Gln Gln Gln Arg
            20                  25                  30
Glu Glu Ala Gly Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Gly
        35                  40                  45
Glu Met Lys Ala Ala Ala Gly Gln Glu Ser Glu Gly Pro Ala Val Gly
    50                  55                  60
Pro Pro Gln Pro Leu Gly Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ala Glu Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ala
                85                  90                  95
Glu Pro Asp Leu Lys Asn Ser Asn Gly Asn Ala Gly Pro Arg Pro Ala
            100                 105                 110
Leu Asn Asn Asn Leu Thr Glu Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Ser Asp Gly Val Gly Ala Pro Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Leu Pro
    130                 135                 140
Pro Pro Ala Tyr Gly Phe Gly Gln Pro Tyr Gly Arg Ser Pro Ser Ala
145                 150                 155                 160
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Phe His Gln Gln His Gly Gly Gln
                165                 170                 175
Gln Ser Pro Gly Leu Ala Ala Leu Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly Leu
            180                 185                 190
Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Gln Asn Ser His Asp His Gly Phe Pro
        195                 200                 205
Asn His Gln Tyr Asn Ser Tyr Tyr Pro Asn Arg Ser Ala Tyr Pro Pro
    210                 215                 220
Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Leu Ser Ser Pro Arg Gly Gly Thr Pro Gly
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Lys Pro Pro Pro Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Gln Gln Arg Phe Gly
            260                 265                 270
Ala Met Gly Gly Gly Gly Pro Ser Ala Ala Gly Gly Gly Thr Pro Gln
        275                 280                 285
Pro Thr Ala Thr Pro Thr Leu Asn Gln Leu Leu Thr Ser Pro Ser Ser
    290                 295                 300
Ala Arg Gly Tyr Gln Gly Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Ser Gly Gly Pro
305                 310                 315                 320
Gln Asp Gly Gly Ala Gly Lys Gly Pro Ala Asp Met Ala Ser Gln Cys
                325                 330                 335
Trp Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly
            340                 345                 350
Ala Gln Gln Arg Ser His His Ala Pro Met Ser Pro Gly Ser Ser Gly
        355                 360                 365
Gly Gly Gly Gln Pro Leu Ala Arg Thr Pro Gln Pro Ser Ser Pro Met
    370                 375                 380
Asp Gln Met Gly Lys Met Arg Pro Gln Pro Tyr Gly Gly Thr Asn Pro
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Gln Gln Gln Gly Pro Pro Ser Gly Pro Gln Gln Gly His Gly
                405                 410                 415
Tyr Pro Gly Gln Pro Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Gln Arg Tyr Pro Met
            420                 425                 430
Thr Met Gln Gly Arg Ala Gln Ser Ala Met Gly Gly Leu Ser Tyr Thr
        435                 440                 445
Gln Gln Ile Pro Pro Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Tyr Gly Gln
    450                 455                 460
Gln Gly Gln Thr Pro Tyr Tyr Asn Gln Gln Ser Pro His Pro Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gln Pro Pro Tyr Ser Gln Gln Pro Pro Ser Gln Thr Pro His Ala
                485                 490                 495
Gln Pro Ser Tyr Gln Gln Gln Pro Gln Ser Gln Pro Pro Gln Leu Gln
            500                 505                 510
Ser Ser Gln Pro Pro Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Gln Pro Pro His Gln
        515                 520                 525
Gln Ser Pro Ala Pro Tyr Pro Ser Gln Gln Ser Thr Thr Gln Gln His
    530                 535                 540
Pro Gln Ser Gln Pro Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Ala Gln Ser Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Ala Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gln
                565                 570                 575
Ala Ala Tyr Pro Gln Pro Gln Ser Gln Gln Ser Gln Gln Thr Ala Tyr
            580                 585                 590
Ser Gln Gln Arg Phe Pro Pro Pro Gln Glu Leu Ser Gln Asp Ser Phe
        595                 600                 605
Gly Ser Gln Ala Ser Ser Ala Pro Ser Met Thr Ser Ser Lys Gly Gly
    610                 615                 620
Gln Glu Asp Met Asn Leu Ser Leu Gln Ser Arg Pro Ser Ser Leu Pro
625                 630                 635                 640
Asp Leu Ser Gly Ser Ile Asp Asp Leu Pro Met Gly Thr Glu Gly Ala
                645                 650                 655
Leu Ser Pro Gly Val Ser Thr Ser Gly Ile Ser Ser Ser Gln Gly Glu
            660                 665                 670
Gln Ser Asn Pro Ala Gln Ser Pro Phe Ser Pro His Thr Ser Pro His
        675                 680                 685
Leu Pro Gly Ile Arg Gly Pro Ser Pro Ser Pro Val Gly Ser Pro Ala
    690                 695                 700
Ser Val Ala Gln Ser Arg Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ala Ala Val Pro
705                 710                 715                 720
Gly Asn Gln Met Pro Pro Arg Pro Pro Ser Gly Gln Ser Asp Ser Ile
                725                 730                 735
Met His Pro Ser Met Asn Gln Ser Ser Ile Ala Gln Asp Arg Gly Tyr
            740                 745                 750
Met Gln Arg Asn Pro Gln Met Pro Gln Tyr Ser Ser Pro Gln Pro Gly
        755                 760                 765
Ser Ala Leu Ser Pro Arg Gln Pro Ser Gly Gly Gln Ile His Thr Gly
    770                 775                 780
Met Gly Ser Tyr Gln Gln Asn Ser Met Gly Ser Tyr Gly Pro Gln Gly
785                 790                 795                 800
Gly Gln Tyr Gly Pro Gln Gly Gly Tyr Pro Arg Gln Pro Asn Tyr Asn
                805                 810                 815
Ala Leu Pro Asn Ala Asn Tyr Pro Ser Ala Gly Met Ala Gly Gly Ile
            820                 825                 830
Asn Pro Met Gly Ala Gly Gly Gln Met His Gly Gln Pro Gly Ile Pro
        835                 840                 845
Pro Tyr Gly Thr Leu Pro Pro Gly Arg Met Ser His Ala Ser Met Gly
    850                 855                 860
Asn Arg Pro Tyr Gly Pro Asn Met Ala Asn Met Pro Pro Gln Val Gly
865                 870                 875                 880
Ser Gly Met Cys Pro Pro Pro Gly Gly Met Asn Arg Lys Thr Gln Glu
                885                 890                 895
Thr Ala Val Ala Met His Val Ala Ala Asn Ser Ile Gln Asn Arg Pro
            900                 905                 910
Pro Gly Tyr Pro Asn Met Asn Gln Gly Gly Met Met Gly Thr Gly Pro
        915                 920                 925
Pro Tyr Gly Gln Gly Ile Asn Ser Met Ala Gly Met Ile Asn Pro Gln
    930                 935                 940
Gly Pro Pro Tyr Ser Met Gly Gly Thr Met Ala Asn Asn Ser Ala Gly
945                 950                 955                 960
Met Ala Ala Ser Pro Glu Met Met Gly Leu Gly Asp Val Lys Leu Thr
                965                 970                 975
Pro Ala Thr Lys Met Asn Asn Lys Ala Asp Gly Thr Pro Lys Thr Glu
            980                 985                 990
Ser Lys Ser Lys Lys Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Glu Lys Ile
        995                 1000                1005
Thr Lys Leu Tyr Glu Leu Gly Gly Glu Pro Glu Arg Lys Met Trp
    1010                1015                1020
Val Asp Arg Tyr Leu Ala Phe Thr Glu Glu Lys Ala Met Gly Met
    1025                1030                1035
Thr Asn Leu Pro Ala Val Gly Arg Lys Pro Leu Asp Leu Tyr Arg
    1040                1045                1050
Leu Tyr Val Ser Val Lys Glu Ile Gly Gly Leu Thr Gln Val Asn
    1055                1060                1065
Lys Asn Lys Lys Trp Arg Glu Leu Ala Thr Asn Leu Asn Val Gly
    1070                1075                1080
Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Leu Lys Lys Gln Tyr Ile Gln
    1085                1090                1095
Cys Leu Tyr Ala Phe Glu Cys Lys Ile Glu Arg Gly Glu Asp Pro
    1100                1105                1110
Pro Pro Asp Ile Phe Ala Ala Ala Asp Ser Lys Lys Ser Gln Pro
    1115                1120                1125
Lys Ile Gln Pro Pro Ser Pro Ala Gly Ser Gly Ser Met Gln Gly
    1130                1135                1140
Pro Gln Thr Pro Gln Ser Thr Ser Ser Ser Met Ala Glu Gly Gly
    1145                1150                1155
Asp Leu Lys Pro Pro Thr Pro Ala Ser Thr Pro His Ser Gln Ile
    1160                1165                1170
Pro Pro Leu Pro Gly Met Ser Arg Ser Asn Ser Val Gly Ile Gln
    1175                1180                1185
Asp Ala Phe Asn Asp Gly Ser Asp Ser Thr Phe Gln Lys Arg Asn
    1190                1195                1200
Ser Met Thr Pro Asn Pro Gly Tyr Gln Pro Ser Met Asn Thr Ser
    1205                1210                1215
Asp Met Met Gly Arg Met Ser Tyr Glu Pro Asn Lys Asp Pro Tyr
    1220                1225                1230
Gly Ser Met Arg Lys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Phe Met Ser Ser
    1235                1240                1245
Gly Gln Gly Pro Asn Gly Gly Met Gly Asp Pro Tyr Ser Arg Ala
    1250                1255                1260
Ala Gly Pro Gly Leu Gly Asn Val Ala Met Gly Pro Arg Gln His
    1265                1270                1275
Tyr Pro Tyr Gly Gly Pro Tyr Asp Arg Val Arg Thr Glu Pro Gly
    1280                1285                1290
Ile Gly Pro Glu Gly Asn Met Ser Thr Gly Ala Pro Gln Pro Asn
    1295                1300                1305
Leu Met Pro Ser Asn Pro Asp Ser Gly Met Tyr Ser Pro Ser Arg
    1310                1315                1320
Tyr Pro Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg His Asp Ser
    1325                1330                1335
Tyr Gly Asn Gln Phe Ser Thr Gln Gly Thr Pro Ser Gly Ser Pro
    1340                1345                1350
Phe Pro Ser Gln Gln Thr Thr Met Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Asn
    1355                1360                1365
Tyr Lys Arg Pro Met Asp Gly Thr Tyr Gly Pro Pro Ala Lys Arg
    1370                1375                1380
His Glu Gly Glu Met Tyr Ser Val Pro Tyr Ser Thr Gly Gln Gly
    1385                1390                1395
Gln Pro Gln Gln Gln Gln Leu Pro Pro Ala Gln Pro Gln Pro Ala
    1400                1405                1410
Ser Gln Gln Gln Ala Ala Gln Pro Ser Pro Gln Gln Asp Val Tyr
    1415                1420                1425
Asn Gln Tyr Gly Asn Ala Tyr Pro Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr
    1430                1435                1440
Glu Arg Arg Pro Ala Gly Gly Pro Gln Asn Gln Phe Pro Phe Gln
    1445                1450                1455
Phe Gly Arg Asp Arg Val Ser Ala Pro Pro Gly Thr Asn Ala Gln
    1460                1465                1470
Gln Asn Met Pro Pro Gln Met Met Gly Gly Pro Ile Gln Ala Ser
    1475                1480                1485
Ala Glu Val Ala Gln Gln Gly Thr Met Trp Gln Gly Arg Asn Asp
    1490                1495                1500
Met Thr Tyr Asn Tyr Ala Asn Arg Gln Ser Thr Gly Ser Ala Pro
    1505                1510                1515
Gln Gly Pro Ala Tyr His Gly Val Asn Arg Thr Asp Glu Met Leu
    1520                1525                1530
His Thr Asp Gln Arg Ala Asn His Glu Gly Ser Trp Pro Ser His
    1535                1540                1545
Gly Thr Arg Gln Pro Pro Tyr Gly Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro
    1550                1555                1560
Met Thr Arg Pro Pro Pro Ser Asn Tyr Gln Pro Pro Pro Ser Met
    1565                1570                1575
Gln Asn His Ile Pro Gln Val Ser Ser Pro Ala Pro Leu Pro Arg
    1580                1585                1590
Pro Met Glu Asn Arg Thr Ser Pro Ser Lys Ser Pro Phe Leu His
    1595                1600                1605
Ser Gly Met Lys Met Gln Lys Ala Gly Pro Pro Val Pro Ala Ser
    1610                1615                1620
His Ile Ala Pro Ala Pro Val Gln Pro Pro Met Ile Arg Arg Asp
    1625                1630                1635
Ile Thr Phe Pro Pro Gly Ser Val Glu Ala Thr Gln Pro Val Leu
    1640                1645                1650
Lys Gln Arg Arg Arg Leu Thr Met Lys Asp Ile Gly Thr Pro Glu
    1655                1660                1665
Ala Trp Arg Val Met Met Ser Leu Lys Ser Gly Leu Leu Ala Glu
    1670                1675                1680
Ser Thr Trp Ala Leu Asp Thr Ile Asn Ile Leu Leu Tyr Asp Asp
    1685                1690                1695
Asn Ser Ile Met Thr Phe Asn Leu Ser Gln Leu Pro Gly Leu Leu
    1700                1705                1710
Glu Leu Leu Val Glu Tyr Phe Arg Arg Cys Leu Ile Glu Ile Phe
    1715                1720                1725
Gly Ile Leu Lys Glu Tyr Glu Val Gly Asp Pro Gly Gln Arg Thr
    1730                1735                1740
Leu Leu Asp Pro Gly Arg Phe Ser Lys Val Ser Ser Pro Ala Pro
    1745                1750                1755
Met Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Leu Leu Gly Pro Lys Leu
    1760                1765                1770
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Val Glu Asn Asp Glu Glu Ile
    1775                1780                1785
Ala Phe Ser Gly Lys Asp Lys Pro Ala Ser Glu Asn Ser Glu Glu
    1790                1795                1800
Lys Leu Ile Ser Lys Phe Asp Lys Leu Pro Val Lys Ile Val Gln
    1805                1810                1815
Lys Asn Asp Pro Phe Val Val Asp Cys Ser Asp Lys Leu Gly Arg
    1820                1825                1830
Val Gln Glu Phe Asp Ser Gly Leu Leu His Trp Arg Ile Gly Gly
    1835                1840                1845
Gly Asp Thr Thr Glu His Ile Gln Thr His Phe Glu Ser Lys Thr
    1850                1855                1860
Glu Leu Leu Pro Ser Arg Pro His Ala Pro Cys Pro Pro Ala Pro
    1865                1870                1875
Arg Lys His Val Thr Thr Ala Glu Gly Thr Pro Gly Thr Thr Asp
    1880                1885                1890
Gln Glu Gly Pro Pro Pro Asp Gly Pro Pro Glu Lys Arg Ile Thr
    1895                1900                1905
Ala Thr Met Asp Asp Met Leu Ser Thr Arg Ser Ser Thr Leu Thr
    1910                1915                1920
Glu Asp Gly Ala Lys Ser Ser Glu Ala Ile Lys Glu Ser Ser Lys
    1925                1930                1935
Phe Pro Phe Gly Ile Ser Pro Ala Gln Ser His Arg Asn Ile Lys
    1940                1945                1950
Ile Leu Glu Asp Glu Pro His Ser Lys Asp Glu Thr Pro Leu Cys
    1955                1960                1965
Thr Leu Leu Asp Trp Gln Asp Ser Leu Ala Lys Arg Cys Val Cys
    1970                1975                1980
Val Ser Asn Thr Ile Arg Ser Leu Ser Phe Val Pro Gly Asn Asp
    1985                1990                1995
Phe Glu Met Ser Lys His Pro Gly Leu Leu Leu Ile Leu Gly Lys
    2000                2005                2010
Leu Ile Leu Leu His His Lys His Pro Glu Arg Lys Gln Ala Pro
    2015                2020                2025
Leu Thr Tyr Glu Lys Glu Glu Glu Gln Asp Gln Gly Val Ser Cys
    2030                2035                2040
Asn Lys Val Glu Trp Trp Trp Asp Cys Leu Glu Met Leu Arg Glu
    2045                2050                2055
Asn Thr Leu Val Thr Leu Ala Asn Ile Ser Gly Gln Leu Asp Leu
    2060                2065                2070
Ser Pro Tyr Pro Glu Ser Ile Cys Leu Pro Val Leu Asp Gly Leu
    2075                2080                2085
Leu His Trp Ala Val Cys Pro Ser Ala Glu Ala Gln Asp Pro Phe
    2090                2095                2100
Ser Thr Leu Gly Pro Asn Ala Val Leu Ser Pro Gln Arg Leu Val
    2105                2110                2115
Leu Glu Thr Leu Ser Lys Leu Ser Ile Gln Asp Asn Asn Val Asp
    2120                2125                2130
Leu Ile Leu Ala Thr Pro Pro Phe Ser Arg Leu Glu Lys Leu Tyr
    2135                2140                2145
Ser Thr Met Val Arg Phe Leu Ser Asp Arg Lys Asn Pro Val Cys
    2150                2155                2160
Arg Glu Met Ala Val Val Leu Leu Ala Asn Leu Ala Gln Gly Asp
    2165                2170                2175
Ser Leu Ala Ala Arg Ala Ile Ala Val Gln Lys Gly Ser Ile Gly
    2180                2185                2190
Asn Leu Leu Gly Phe Leu Glu Asp Ser Leu Ala Ala Thr Gln Phe
    2195                2200                2205
Gln Gln Ser Gln Ala Ser Leu Leu His Met Gln Asn Pro Pro Phe
    2210                2215                2220
Glu Pro Thr Ser Val Asp Met Met Arg Arg Ala Ala Arg Ala Leu
    2225                2230                2235
Leu Ala Leu Ala Lys Val Asp Glu Asn His Ser Glu Phe Thr Leu
    2240                2245                2250
Tyr Glu Ser Arg Leu Leu Asp Ile Ser Val Ser Pro Leu Met Asn
    2255                2260                2265
Ser Leu Val Ser Gln Val Ile Cys Asp Val Leu Phe Leu Ile Gly
    2270                2275                2280
Gln Ser
    2285
<210> 2
<211> 2283
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Ala Ala Gln Val Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Leu Gly Asn Pro
1               5                   10                  15
Pro Pro Pro Pro Ser Glu Leu Lys Lys Ala Glu Gln Gln Gln Arg Glu
            20                  25                  30
Glu Ala Gly Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Gly Glu Met
        35                  40                  45
Lys Ala Ala Ala Gly Gln Glu Ser Glu Gly Pro Ala Val Gly Pro Pro
    50                  55                  60
Gln Pro Leu Gly Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ala Glu Ser Asn Gly Gly
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ala Glu Pro
                85                  90                  95
Asp Leu Lys Asn Ser Asn Gly Asn Ala Gly Pro Arg Pro Ala Leu Asn
            100                 105                 110
Asn Asn Leu Pro Glu Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser
        115                 120                 125
Ser Ser Asp Gly Val Gly Ala Pro Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Pro Pro Pro Ala Tyr Gly Phe Gly Gln Ala Tyr Gly Arg Ser Pro Ser
145                 150                 155                 160
Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Phe His Gln Gln His Gly Gly
                165                 170                 175
Gln Gln Ser Pro Gly Leu Ala Ala Leu Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly
            180                 185                 190
Leu Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Gln Asn Ser His Asp His Gly Phe
        195                 200                 205
Pro Asn His Gln Tyr Asn Ser Tyr Tyr Pro Asn Arg Ser Ala Tyr Pro
    210                 215                 220
Pro Pro Pro Gln Ala Tyr Ala Leu Ser Ser Pro Arg Gly Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Lys Pro Pro Pro Ser Ser
                245                 250                 255
Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Gln Gln Arg Phe
            260                 265                 270
Gly Ala Met Gly Gly Gly Gly Pro Ser Ala Ala Gly Gly Gly Thr Pro
        275                 280                 285
Gln Pro Thr Ala Thr Pro Thr Leu Asn Gln Leu Leu Thr Ser Pro Ser
    290                 295                 300
Ser Ala Arg Gly Tyr Gln Gly Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Gly Gly Gly
305                 310                 315                 320
Pro Gln Asp Gly Gly Ala Gly Lys Gly Pro Ala Asp Met Ala Ser Gln
                325                 330                 335
Cys Trp Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser
            340                 345                 350
Gly Gly Ala Gln Gln Arg Ser His His Ala Pro Met Ser Pro Gly Ser
        355                 360                 365
Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Leu Ala Arg Thr Pro Gln Ser Ser Ser
    370                 375                 380
Pro Met Asp Gln Met Gly Lys Met Arg Pro Gln Pro Tyr Gly Gly Thr
385                 390                 395                 400
Asn Pro Tyr Ser Gln Gln Gln Gly Pro Pro Ser Gly Pro Gln Gln Gly
                405                 410                 415
His Gly Tyr Pro Gly Gln Pro Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Gln Arg Tyr
            420                 425                 430
Pro Met Thr Met Gln Gly Arg Ala Gln Ser Ala Met Gly Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Tyr Ala Gln Gln Ile Pro Pro Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Tyr
    450                 455                 460
Gly Gln Gln Gly Gln Thr Pro Tyr Tyr Asn Gln Gln Ser Pro His Pro
465                 470                 475                 480
Gln Gln Gln Pro Pro Tyr Ala Gln Gln Pro Pro Ser Gln Thr Pro His
                485                 490                 495
Ala Gln Pro Ser Tyr Gln Gln Gln Pro Gln Thr Gln Gln Pro Gln Leu
            500                 505                 510
Gln Ser Ser Gln Pro Pro Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Gln Pro Pro His
        515                 520                 525
Gln Gln Ser Pro Thr Pro Tyr Pro Ser Gln Gln Ser Thr Thr Gln Gln
    530                 535                 540
His Pro Gln Ser Gln Pro Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Ala Gln Ser Pro
545                 550                 555                 560
Tyr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Ala Ser Ser Ser Leu Ser Gln
                565                 570                 575
Gln Ala Ala Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Gln Gln Ser Gln Gln Thr Ala
            580                 585                 590
Tyr Ser Gln Gln Arg Phe Pro Pro Pro Gln Glu Leu Ser Gln Asp Ser
        595                 600                 605
Phe Gly Ser Gln Ala Ser Ser Ala Pro Ser Met Thr Ser Ser Lys Gly
    610                 615                 620
Gly Gln Glu Asp Met Asn Leu Ser Leu Gln Ser Arg Pro Ser Ser Leu
625                 630                 635                 640
Pro Asp Leu Ser Gly Ser Ile Asp Asp Leu Pro Met Gly Thr Glu Gly
                645                 650                 655
Ala Leu Ser Pro Gly Val Ser Thr Ser Gly Ile Ser Ser Ser Gln Gly
            660                 665                 670
Glu Gln Ser Asn Pro Ala Gln Ser Pro Phe Ser Pro His Thr Ser Pro
        675                 680                 685
His Leu Pro Gly Ile Arg Gly Pro Ser Pro Ser Pro Val Gly Ser Pro
    690                 695                 700
Ala Ser Val Ala Gln Ser Arg Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ala Ala Val
705                 710                 715                 720
Pro Gly Asn Gln Met Pro Pro Arg Pro Pro Ser Gly Gln Ser Asp Ser
                725                 730                 735
Ile Met His Pro Ser Met Asn Gln Ser Ser Ile Ala Gln Asp Arg Gly
            740                 745                 750
Tyr Met Gln Arg Asn Pro Gln Met Pro Gln Tyr Thr Ser Pro Gln Pro
        755                 760                 765
Gly Ser Ala Leu Ser Pro Arg Gln Pro Ser Gly Gly Gln Met His Ser
    770                 775                 780
Gly Val Gly Ser Tyr Gln Gln Asn Ser Met Gly Ser Tyr Gly Pro Gln
785                 790                 795                 800
Gly Ser Gln Tyr Gly Pro Gln Gly Gly Tyr Pro Arg Gln Pro Asn Tyr
                805                 810                 815
Asn Ala Leu Pro Asn Ala Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Met Ala Gly Ser
            820                 825                 830
Met Asn Pro Met Gly Ala Gly Gly Gln Met His Gly Gln Pro Gly Ile
        835                 840                 845
Pro Pro Tyr Gly Thr Leu Pro Pro Gly Arg Met Ala His Ala Ser Met
    850                 855                 860
Gly Asn Arg Pro Tyr Gly Pro Asn Met Ala Asn Met Pro Pro Gln Val
865                 870                 875                 880
Gly Ser Gly Met Cys Pro Pro Pro Gly Gly Met Asn Arg Lys Thr Gln
                885                 890                 895
Glu Ser Ala Val Ala Met His Val Ala Ala Asn Ser Ile Gln Asn Arg
            900                 905                 910
Pro Pro Gly Tyr Pro Asn Met Asn Gln Gly Gly Met Met Gly Thr Gly
        915                 920                 925
Pro Pro Tyr Gly Gln Gly Ile Asn Ser Met Ala Gly Met Ile Asn Pro
    930                 935                 940
Gln Gly Pro Pro Tyr Pro Met Gly Gly Thr Met Ala Asn Asn Ser Ala
945                 950                 955                 960
Gly Met Ala Ala Ser Pro Glu Met Met Gly Leu Gly Asp Val Lys Leu
                965                 970                 975
Thr Pro Ala Thr Lys Met Asn Asn Lys Ala Asp Gly Thr Pro Lys Thr
            980                 985                 990
Glu Ser Lys Ser Lys Lys Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Glu Lys
        995                 1000                1005
Ile Thr Lys Leu Tyr Glu Leu Gly Gly Glu Pro Glu Arg Lys Met
    1010                1015                1020
Trp Val Asp Arg Tyr Leu Ala Phe Thr Glu Glu Lys Ala Met Gly
    1025                1030                1035
Met Thr Asn Leu Pro Ala Val Gly Arg Lys Pro Leu Asp Leu Tyr
    1040                1045                1050
Arg Leu Tyr Val Ser Val Lys Glu Ile Gly Gly Leu Thr Gln Val
    1055                1060                1065
Asn Lys Asn Lys Lys Trp Arg Glu Leu Ala Thr Asn Leu Asn Val
    1070                1075                1080
Gly Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Leu Lys Lys Gln Tyr Ile
    1085                1090                1095
Gln Cys Leu Tyr Ala Phe Glu Cys Lys Ile Glu Arg Gly Glu Asp
    1100                1105                1110
Pro Pro Pro Asp Ile Phe Ala Ala Ala Asp Ser Lys Lys Ser Gln
    1115                1120                1125
Pro Lys Ile Gln Pro Pro Ser Pro Ala Gly Ser Gly Ser Met Gln
    1130                1135                1140
Gly Pro Gln Thr Pro Gln Ser Thr Ser Ser Ser Met Ala Glu Gly
    1145                1150                1155
Gly Asp Leu Lys Pro Pro Thr Pro Ala Ser Thr Pro His Ser Gln
    1160                1165                1170
Ile Pro Pro Leu Pro Gly Met Ser Arg Ser Asn Ser Val Gly Ile
    1175                1180                1185
Gln Asp Ala Phe Pro Asp Gly Ser Asp Pro Thr Phe Gln Lys Arg
    1190                1195                1200
Asn Ser Met Thr Pro Asn Pro Gly Tyr Gln Pro Ser Met Asn Thr
    1205                1210                1215
Ser Asp Met Met Gly Arg Met Ser Tyr Glu Pro Asn Lys Asp Pro
    1220                1225                1230
Tyr Gly Ser Met Arg Lys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Phe Met Ser
    1235                1240                1245
Ser Gly Gln Gly Pro Asn Gly Gly Met Gly Asp Pro Tyr Ser Arg
    1250                1255                1260
Ala Ala Gly Pro Gly Leu Gly Ser Val Ala Met Gly Pro Arg Gln
    1265                1270                1275
His Tyr Pro Tyr Gly Gly Pro Tyr Asp Arg Val Arg Thr Glu Pro
    1280                1285                1290
Gly Ile Gly Pro Glu Gly Asn Met Gly Thr Gly Ala Pro Gln Pro
    1295                1300                1305
Asn Leu Met Pro Ser Thr Pro Asp Ser Gly Met Tyr Ser Pro Ser
    1310                1315                1320
Arg Tyr Pro Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Asp
    1325                1330                1335
Ser Tyr Gly Asn Gln Phe Ser Thr Gln Gly Thr Pro Ser Ser Ser
    1340                1345                1350
Pro Phe Pro Ser Gln Gln Thr Thr Met Tyr Gln Gln Gln Gln Gln
    1355                1360                1365
Asn Tyr Lys Arg Pro Met Asp Gly Thr Tyr Gly Pro Pro Ala Lys
    1370                1375                1380
Arg His Glu Gly Glu Met Tyr Ser Val Pro Tyr Ser Ala Gly Gln
    1385                1390                1395
Gly Gln Pro Gln Gln Gln Gln Leu Pro Ala Ala Gln Ser Gln Pro
    1400                1405                1410
Ala Ser Gln Pro Gln Ala Ala Gln Pro Ser Pro Gln Gln Asp Val
    1415                1420                1425
Tyr Asn Gln Tyr Ser Asn Ala Tyr Pro Ala Ser Ala Thr Ala Ala
    1430                1435                1440
Thr Asp Arg Arg Pro Ala Gly Gly Pro Gln Asn Gln Phe Pro Phe
    1445                1450                1455
Gln Phe Gly Arg Asp Arg Val Ser Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ala
    1460                1465                1470
Gln Gln Asn Met Pro Pro Gln Met Met Gly Gly Pro Ile Gln Ala
    1475                1480                1485
Ser Ala Glu Val Ala Gln Gln Gly Thr Met Trp Gln Gly Arg Asn
    1490                1495                1500
Asp Met Thr Tyr Asn Tyr Ala Asn Arg Gln Asn Thr Gly Ser Ala
    1505                1510                1515
Thr Gln Gly Pro Ala Tyr His Gly Val Asn Arg Thr Asp Glu Met
    1520                1525                1530
Leu His Thr Asp Gln Arg Ala Asn His Glu Gly Pro Trp Pro Ser
    1535                1540                1545
His Gly Thr Arg Gln Pro Pro Tyr Gly Pro Ser Ala Pro Val Pro
    1550                1555                1560
Pro Met Thr Arg Pro Pro Pro Ser Asn Tyr Gln Pro Pro Pro Ser
    1565                1570                1575
Met Pro Asn His Ile Pro Gln Val Ser Ser Pro Ala Pro Leu Pro
    1580                1585                1590
Arg Pro Met Glu Asn Arg Thr Ser Pro Ser Lys Ser Pro Phe Leu
    1595                1600                1605
His Ser Gly Met Lys Met Gln Lys Ala Gly Pro Pro Val Pro Ala
    1610                1615                1620
Ser His Ile Ala Pro Thr Pro Val Gln Pro Pro Met Ile Arg Arg
    1625                1630                1635
Asp Ile Thr Phe Pro Pro Gly Ser Val Glu Ala Thr Gln Pro Val
    1640                1645                1650
Leu Lys Gln Arg Arg Arg Leu Thr Met Lys Asp Ile Gly Thr Pro
    1655                1660                1665
Glu Ala Trp Arg Val Met Met Ser Leu Lys Ser Gly Leu Leu Ala
    1670                1675                1680
Glu Ser Thr Trp Ala Leu Asp Thr Ile Asn Ile Leu Leu Tyr Asp
    1685                1690                1695
Asp Asn Ser Ile Met Thr Phe Asn Leu Ser Gln Leu Pro Gly Leu
    1700                1705                1710
Leu Glu Leu Leu Val Glu Tyr Phe Arg Arg Cys Leu Ile Glu Ile
    1715                1720                1725
Phe Gly Ile Leu Lys Glu Tyr Glu Val Gly Asp Pro Gly Gln Arg
    1730                1735                1740
Thr Leu Leu Asp Pro Gly Arg Phe Thr Lys Val Tyr Ser Pro Ala
    1745                1750                1755
His Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu His Leu Asp Pro Lys Leu Glu
    1760                1765                1770
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Val Gly Asn Asp Glu Glu Met Ala Phe
    1775                1780                1785
Leu Gly Lys Asp Lys Pro Ser Ser Glu Asn Asn Glu Glu Lys Leu
    1790                1795                1800
Val Ser Lys Phe Asp Lys Leu Pro Val Lys Ile Val Gln Arg Asn
    1805                1810                1815
Asp Pro Phe Val Val Asp Cys Ser Asp Lys Leu Gly Arg Val Gln
    1820                1825                1830
Glu Phe Asp Ser Gly Leu Leu His Trp Arg Ile Gly Gly Gly Asp
    1835                1840                1845
Thr Thr Glu His Ile Gln Thr His Phe Glu Ser Lys Ile Glu Leu
    1850                1855                1860
Leu Pro Ser Arg Pro Tyr Val Pro Cys Pro Thr Pro Pro Arg Lys
    1865                1870                1875
His Leu Thr Thr Val Glu Gly Thr Pro Gly Thr Thr Glu Gln Glu
    1880                1885                1890
Gly Pro Pro Pro Asp Gly Leu Pro Glu Lys Arg Ile Thr Ala Thr
    1895                1900                1905
Met Asp Asp Met Leu Ser Thr Arg Ser Ser Thr Leu Thr Asp Glu
    1910                1915                1920
Gly Ala Lys Ser Ala Glu Ala Thr Lys Glu Ser Ser Lys Phe Pro
    1925                1930                1935
Phe Gly Ile Ser Pro Ala Gln Ser His Arg Asn Ile Lys Ile Leu
    1940                1945                1950
Glu Asp Glu Pro His Ser Lys Asp Glu Thr Pro Leu Cys Thr Leu
    1955                1960                1965
Leu Asp Trp Gln Asp Ser Leu Ala Lys Arg Cys Val Cys Val Ser
    1970                1975                1980
Asn Thr Ile Arg Ser Leu Ser Phe Val Pro Gly Asn Asp Phe Glu
    1985                1990                1995
Met Ser Lys His Pro Gly Leu Leu Leu Ile Leu Gly Lys Leu Ile
    2000                2005                2010
Leu Leu His His Lys His Pro Glu Arg Lys Gln Ala Pro Leu Thr
    2015                2020                2025
Tyr Glu Lys Glu Glu Glu Gln Asp Gln Gly Val Ser Cys Asp Lys
    2030                2035                2040
Val Glu Trp Trp Trp Asp Cys Leu Glu Met Leu Arg Glu Asn Thr
    2045                2050                2055
Leu Val Thr Leu Ala Asn Ile Ser Gly Gln Leu Asp Leu Ser Pro
    2060                2065                2070
Tyr Pro Glu Ser Ile Cys Leu Pro Val Leu Asp Gly Leu Leu His
    2075                2080                2085
Trp Ala Val Cys Pro Ser Ala Glu Ala Gln Asp Pro Phe Ser Thr
    2090                2095                2100
Leu Gly Pro Asn Ala Val Leu Ser Pro Gln Arg Leu Val Leu Glu
    2105                2110                2115
Thr Leu Ser Lys Leu Ser Ile Gln Asp Asn Asn Val Asp Leu Ile
    2120                2125                2130
Leu Ala Thr Pro Pro Phe Ser Arg Leu Glu Lys Leu Tyr Ser Thr
    2135                2140                2145
Met Val Arg Phe Leu Ser Asp Arg Lys Asn Pro Val Cys Arg Glu
    2150                2155                2160
Met Ala Val Val Leu Leu Ala Asn Leu Ala Gln Gly Asp Ser Leu
    2165                2170                2175
Ala Ala Arg Ala Ile Ala Val Gln Lys Gly Ser Ile Gly Asn Leu
    2180                2185                2190
Leu Gly Phe Leu Glu Asp Ser Leu Ala Ala Thr Gln Phe Gln Gln
    2195                2200                2205
Ser Gln Ala Ser Leu Leu His Met Gln Asn Pro Pro Phe Glu Pro
    2210                2215                2220
Thr Ser Val Asp Met Met Arg Arg Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ala
    2225                2230                2235
Leu Ala Lys Val Asp Glu Asn His Ser Glu Phe Thr Leu Tyr Glu
    2240                2245                2250
Ser Arg Leu Leu Asp Ile Ser Val Ser Pro Leu Met Asn Ser Leu
    2255                2260                2265
Val Ser Gln Val Ile Cys Asp Val Leu Phe Leu Ile Gly Gln Ser
    2270                2275                2280
<210> 3
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 含有Cre重组酶的基因片段
<400> 3
tccaatctcc tgactgttca ccagaacctc cctgcgctgc cagtagatgc cactagcgat 60
gaggtcagga aaaatctcat ggatatgttt agggatagac aggcgttttc tgaacacacc 120
tggaaaatgc tgcttagcgt gtgccgatcc tgggcagcct ggtgtaagct gaacaatcgc 180
aaatggttcc ccgccgagcc ggaggacgtg cgcgattacc tgctgtatct ccaggcaaga 240
gggctggctg tcaagactat ccagcagcac ttgggccaac tgaatatgct gcatcgacgc 300
agcgggctcc cccggcctag cgattcaaac gcagtctccc ttgttatgag gagaattaga 360
aaggaaaacg tagatgcggg tgagagggct aagcaggctc tcgcttttga gcggactgat 420
ttcgaccagg tcagatccct gatggagaac agcgatcggt gccaggacat caggaacctc 480
gcatttctgg gaattgcata taacacactt ctgcgcatag ctgagatcgc ccggatcaga 540
gtgaaagaca tcagtcgaac ggacggcggc cggatgctta ttcatattgg acgcacaaag 600
acattggtca gcaccgctgg cgttgaaaag gccttgtccc tgggcgtaac gaagctggtg 660
gaaagatgga tctcagtgtc cggcgtggct gacgacccta ataattactt gttctgtcga 720
gtgagaaaaa acggagtcgc cgcgccctct gccaccagcc aattgagtac acgggccctt 780
gaagggatct ttgaggcaac ccaccgactc atatacggag ccaaggatga cagtggccag 840
aggtatctcg cctggtcagg tcattctgct agggtggggg ccgcacgaga catggcgcgg 900
gcaggagtct ccataccaga gattatgcaa gctggaggtt ggacaaatgt gaacatcgtt 960
atgaactata tccgcaatct tgactctgaa accggggcca tggtgagact gctcgaagat 1020
ggtgac 1026
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pgam1抑制剂sgRNA的核苷酸序列
<400> 4
ggattgctct cttctgcaca g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pgam1抑制剂sgRNA的核苷酸序列
<400> 5
ttgaccagat gtggttgcca g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pkm2抑制剂shRNA的核苷酸序列
<400> 6
ggggcagagt caatgtccag g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pkm2抑制剂shRNA的核苷酸序列
<400> 7
ccgaagccac acagtgaagc a 21

Claims (10)

1.一种糖酵解抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一组合物或制剂，所述的组合物或制剂用于：(a)预防和/或治疗肺癌，所述的肺癌是ARID1A阴性的肺癌；和/或(b)抑制肺癌细胞，所述的肺癌细胞是ARID1A阴性的肺癌细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ARID1A阴性指，与正常对照细胞，ARID1A表达和/或活性显著下降。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肺癌为ARID1A缺失型肺癌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肺癌选自下组：腺癌、鳞癌、或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖酵解抑制剂选自下组：
(Z1)Hif-1α抑制剂；
(Z2)Pgk1抑制剂；
(Z3)Pgam1抑制剂；
(Z4)Pkm2抑制剂；
(Z5)上述Z1～Z4的任意组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖酵解抑制剂选自下组：小分子化合物、抗体、反义核酸、基因编辑药物、或其组合。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖酵解抑制剂选自下组：BETi小分子化合物、2-DG小分子、或其组合。
8.一种ARID1A基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于选自下组一种或多种用途：
(i)用于评估肺癌患者是否适合用糖酵解抑制剂进行治疗；和/或
(ii)用于评估肺癌患者用糖酵解抑制剂进行治疗的预后。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括：
(a)ARID1A的特异性抗体、ARID1A的特异性结合分子；和/或
(b)特异性扩增ARID1A mRNA或ARID1A cDNA的引物或引物对、探针或芯片。
10.一种产品组合，其特征在于，所述产品包括：
(a)检测试剂或含所述检测试剂的试剂盒，所述检测试剂为检测ARID1A基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合的检测试剂；和
(b)药物组合物，所述的药组合物含有糖酵解抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。
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