CN112522394A

CN112522394A - 新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用

Info

Publication number: CN112522394A
Application number: CN201910873723.5A
Authority: CN
Inventors: 孙宇; 韩柳
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN112522394B; WO2021052286A1

Abstract

本发明提供了一种新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用。本发明揭示了衰老细胞产生的外泌体以及参与调控所述外泌体的一些生物分子，它们与肿瘤化疗治疗后的耐药性以及肿瘤预后密切相关。因此，本发明提供了新的抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性的靶点，已提新的肿瘤诊断和预后评估的标志物。

Description

新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用。

背景技术

衰老相关疾病主要包括恶性肿瘤及多种器官退行性疾病如心力衰竭、骨质疏松、关节炎、阿尔茨海默病、帕金森综合症等，是导致人类死亡的直接因素。其中恶性肿瘤近年来已经超越其它各种疾病，成为危害人类健康的头号杀手。与人类疾病密切关联的细胞衰老，最初由美国科学家Hayflick于19世纪60年代发现并提出，是以正常细胞增殖受阻、细胞周期停滞为主要特征的一个生命现象。之后，大量研究致力于探究细胞衰老的触发因素、信号通路、表型特征及对于多种疾病的影响机制。在多细胞生物中，细胞衰老与机体衰老有着不同的含义，但二者之间密切关联。机体衰老是生物体在退化时期自稳态失衡和修复能力下降的一种综合表现，细胞衰老则是细胞在内外环境多种因素的影响下发生结构损伤和功能紊乱而进入的一种被动状态。同新陈代谢一样，细胞衰老是客观存在的，属于细胞生命活动的基本规律。在正常生理条件下，细胞衰老可以由端粒缩短造成。然而，一系列理化刺激或者生物信号也能引发细胞衰老，例如电离辐射、化学药物、氧化应激和特定癌基因的表达等，但这些因素对细胞的影响普遍涉及DNA损伤等胁迫事件的发生。

尤其重要的，慢性衰老细胞的蛋白质合成与代谢也发生了显著变化，即细胞进入一种强烈而持久的分泌状态，学界称之为衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretory phenotype，SASP)，有别于以往报道过的急性胁迫应激现象(acute stress-associated phenotype，ASAP)。SASP的发生发展受到DNA损伤分泌程序(DNA damagesecretory program，DDSP)的驱动，后者在几个方面有着显著性和独特性。尽管SASP分泌型细胞释放的效应因子可以激发体内局部组织的免疫反应，促进衰老细胞的清除，但更能显著改变周边微环境的结构和功能，加速肿瘤等衰老相关疾病的进展。

以生命现象为目标、临床样本为核心开展的研究，可以揭示细胞衰老对于组织微环境的病理生理学意义。本发明人近年发现，抗癌过程中因药物副作用等理化因素造成病灶中肿瘤相关基质细胞DNA损伤并出现衰老特征的同时，伴随有WNT16B，SFRP2和SPINK1等可溶蛋白的高度合成与大量释放(典型SASP特征)，可以引起病灶内部癌细胞Twist，Snail和Smad等转录因子的表达上调，最终加速癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。越来越多的数据验证了临床条件下肿瘤的这一发展规律，即以DNA为靶向目标的化疗、放疗或干扰DDR相关通路的靶向治疗等当代临床常规手段在治疗过程中所起的脱靶作用可以激活肿瘤微环境、造成基质细胞衰老并形成SASP分泌表型，后者对于癌细胞在各阶段所表现出来的增殖率、迁移率、侵袭性和异质性等恶性特征的发生发展具有不可忽视的病理作用，客观上赋予了癌细胞以获得性耐药和高度转移潜力。

研究实践中，细胞衰老以及肿瘤发生发生的机理极为复杂，本领域迫切需要从中找到规律，发现新的调控机制，在此基础上获得有用的临床药物。

发明内容

本发明的目的在于提供新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用。

在本发明的第一方面，提供SIRT1的应用，用于：作为调控外泌体的合成、释放或活性的靶点；作为筛选调控外泌体的合成、释放或活性的物质的靶点；制备调控外泌体的合成、释放或活性的调节剂；作为肿瘤诊断或预后的标志物(细胞(如基质细胞)、组织中或体液(如血液)中)；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂；其中，所述外泌体为衰老细胞分泌的外泌体。

在一个优选例中，所述衰老细胞为衰老的基质细胞；所述衰老细胞分泌的外泌体携带的小RNA分子组分不同于增殖态细胞；或所述调控外泌体的合成、释放或活性为下调(包括抑制或阻滞)外泌体的合成、释放或活性。

在本发明的另一方面，提供SIRT1上调剂(包括激动剂)的应用，用于：制备下调外泌体的合成、释放或活性的组合物，所述外泌体为衰老细胞分泌的外泌体；制备降低肿瘤耐药性(对化疗药物的耐药性)的组合物；或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒；较佳地，所述药物组合物或药盒中还包括肿瘤化疗药物。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：SIRT1上调剂和肿瘤化疗药物。较佳地，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的SIRT1上调剂包括增强SIRT1活性的物质或增强SIRT1的表达、稳定性或延长其有效作用时间的物质；较佳地，所述SIRT1上调剂包括(但不限于)：重组表达SIRT1的构建物，SIRT1的化学激动剂，促进SIRT1基因启动子驱动能力的上调剂、SIRT1基因特异性的过表达多肽、靶向抑制SIRT1基因的microRNA的下调剂；更佳地，所述的化学激动剂包括：SRT2104、SRT1720、SRT2183、SRT3025、CAY10602、Bay 11-7082、QNZ(EVP4593)、Curcumin或Diethylmaleate。

在另一优选例中，所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物；较佳地是基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨或5-氟尿嘧啶，紫杉醇，长春新碱。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。

在另一优选例中，所述SIRT1上调剂和肿瘤化疗药物按照摩尔比(或质量比)为：1:0.0001～1:1；较佳地为1:0.0005～1:0.5；更佳地为1:0.001～1:0.1，如1:0.002(用于给药时)。

在另一优选例中，所述的肿瘤化疗药物的终浓度为：0.01～200μM；较佳地0.05～150μM；更佳地0.08～100μM(如0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、80μM)(体外细胞处理时)。

在另一优选例中，所述SIRT1上调剂的终浓度为：0.5～80uM；较佳地1～50uM；更佳地5～20uM。

在另一优选例中，所述的肿瘤化疗药物优选的终浓度为(体外细胞处理时)：米托蒽醌1uM,沙铂，顺铂，卡铂100uM,博来霉素50ug/ml，其它药物均为10uM；可上下浮动80％、70％、50％、40％、30％、20％或10％。

在另一优选例中，所述SIRT1上调剂的终浓度优选为(体外细胞处理时)：10uM；可上下浮动80％、70％、50％、40％、30％、20％或10％。

在本发明的另一方面，提供一种筛选下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达SIRT1；和(2)检测所述体系中SIRT1的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高SIRT1的表达或活性，则表明该候选物质是下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(2)包括：检测所述体系中SIRT1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)SIRT1的表达或活性，则表明该候选物质是下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1’)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达SIRT1；和(2’)检测所述体系中SIRT1对于外泌体的调控作用；若所述候选物质在统计学上促进SIRT1对于外泌体的合成、释放或活性的下调作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1’)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(2’)包括：检测所述体系中SIRT1对于外泌体的调控作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上促进(如促进20％以上，较佳的促进50％以上；更佳的促进80％以上)SIRT1对于外泌体的合成、释放或活性的下调作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对SIRT1或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，小分子化合物等。

在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增SIRT1的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的SIRT1为基质细胞的SIRT1。

在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：特异性结合SIRT蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增SIRT1基因的引物；特异性识别SIRT1基因的探针；或特异性识别SIRT1基因的芯片。

在另一优选例中，利用所述特异性识别或扩增SIRT1的试剂(较佳地针对基质细胞)，若判断SIRT1发生上调，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断SIRT1发生下调，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

在本发明的另一方面，提供衰老细胞分泌的外泌体的应用，用于：作为调控(抑制)肿瘤耐药性的靶点；作为筛选调控(抑制)肿瘤耐药性的物质的靶点；作为肿瘤诊断或预后的标志物(组织中或体液(如血液)中)；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂；较佳地，所述的衰老细胞为衰老的基质细胞。

在本发明的另一方面，提供抑制衰老细胞分泌的外泌体合成、释放或活性的试剂的应用，用于：制备降低肿瘤耐药性(对化疗药物的耐药性)的组合物；或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒；较佳地，所述药物组合物或药盒中还包括化疗药物。

在一个优选例中，所述抑制衰老细胞分泌的外泌体合成、释放或活性的试剂包括：SIRT1上调剂(包括激动剂)、ABCB4下调剂。

在本发明的另一方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(a)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体；和(b)检测所述体系中外泌体的合成、释放或活性；若所述候选物质在统计学上抑制外泌体的合成、释放或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(b)包括：检测所述体系中外泌体的合成、释放或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)外泌体的合成、释放或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对SIRT1或ABCB4或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物等。

在本发明的另一方面，提供特异性识别衰老细胞分泌的外泌体、外泌体相关标记蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述衰老细胞为衰老的基质细胞。

在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：特异性结合外泌体或其相关标记蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增外泌体相关标记基因的引物；特异性识别外泌体相关标记基因的探针；或特异性识别外泌体相关标记基因的芯片。

在另一优选例中，利用所述特异性识别衰老细胞分泌的外泌体、外泌体相关标记蛋白或其编码基因的试剂(较佳地针对血液或血清)，若判断外泌体的合成、释放或活性受抑制，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断外泌体的合成、释放或活性受促进，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

在本发明的另一方面，提供ABCB4的应用，用于：作为调控(抑制)肿瘤耐药性的靶点；作为筛选调控(抑制)肿瘤耐药性的物质的靶点；作为肿瘤诊断或预后的标志物(肿瘤组织中)；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂。

在本发明的另一方面，提供ABCB4下调剂的应用，用于：制备抑制衰老细胞分泌的外泌体与肿瘤细胞相互作用(包括抑制外泌体通过诱导癌细胞中ABCB4上调表达而赋予其耐药性)的组合物；制备降低肿瘤耐药性(对化疗药物的耐药性)的组合物；或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒；较佳地，所述药物组合物或药盒中还包括肿瘤化疗药物。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：ABCB4下调剂和肿瘤化疗药物。

在一个优选例中，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的ABCB4下调剂包括：敲除或沉默ABCB4的试剂，抑制ABCB4活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰ABCB4的编码基因表达的干扰分子，针对ABCB4的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将ABCB4进行功能丧失性突变，针对ABCB4化学小分子拮抗剂或抑制剂。

在本发明的另一方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(i)用候选物质处理一表达体系，该体系表达ABCB4；和(ii)检测所述体系中ABCB4的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低ABCB4的表达或活性，则表明该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(i)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(ii)包括：检测所述体系中ABCB4的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上降低(如降低20％以上，较佳的降低50％以上；更佳的降低80％以上)ABCB4的表达或活性，则表明该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(i’)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达ABCB4；和(ii’)检测所述体系中外泌体对于ABCB4的调控作用；若所述候选物质在统计学上减弱外泌体对于ABCB4的调控作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(i’)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(ii’)包括：检测所述体系中ABCB4对于外泌体的调控作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上减弱(如减弱20％以上，较佳的减弱50％以上；更佳的减弱80％以上)外泌体对于ABCB4的调控作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对ABCB4或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物等。

在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增ABCB4的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的ABCB4为肿瘤细胞的ABCB4。

在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：特异性结合ABCB4蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增ABCB4基因的引物；特异性识别ABCB4基因的探针；或特异性识别ABCB4基因的芯片。

在另一优选例中，利用所述特异性识别或扩增ABCB4的试剂(较佳地针对肿瘤组织)，若判断ABCB4发生下调，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断ABCB4发生上调，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人源前列腺原代基质细胞系PSC27经过化疗药物BLEO(添加于培养基，终浓度50ug/ml)处理之后第7天，以SA-β-Gal染色进行细胞衰老检测。左，增殖态细胞(PRE)和衰老细胞(SEN)染色阳性率对比；右，SA-β-Gal染色代表性图像。

图2、利用DNA合成速率进行PSC27细胞的增殖状态分析。左，BrdU渗入率在增殖态和衰老细胞之间进行对比；右，代表性BrdU染色图像。

图3、基于RNA-Seq数据生成的PSC27基因表达图谱。PSC27经过BLEO损伤之后第7天收集细胞总RNA，并经建库、测序获得全转录组原始数据；图中显示上调列表中前50个基因在增殖态和衰老细胞之间的表达情况。

图4、PSC27细胞释放胞外囊泡的数量对比。收集增殖态和衰老细胞各自释放至胞外空间的外泌体，并针对细胞数量进行规范化之后，计算出的外泌体释放数/细胞。

图5、基于纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)对基质细胞释放的外泌体进行数量和粒径的精确检测。左，增殖态细胞；右，衰老细胞。

图6、根据NTA数据对基质细胞在衰老前后释放的外泌体的粒径进行统计之后，进行的相互比较。

图7、透射电镜对增殖态和衰老细胞释放的外泌体进行拍摄之后的代表性图像。

图8、通过SDS-PAGE凝胶电泳对PSC27产生的外泌体蛋白裂解物进行分析。左，上样蛋白在根据蛋白总量进行规范化之后，两组样本之间的比较；右，上样蛋白根据母细胞数量予以规范化之后，两组样本间的比较。

图9、在母细胞数量相同的情况下，增殖态和衰老细胞释放的外泌体蛋白通过immunoblot进行平行比较。Syntenin-1，TSG101和ALIX，外泌体标记蛋白；GAPDH，母细胞总蛋白内参。

图10、Immunoblot分析增殖态和衰老细胞中特定蛋白的表达水平。Syntenin-1，TSG101和ALIX，外泌体标记蛋白；GAPDH，总蛋白内参。

图11、免疫荧光染色技术确定细胞中多泡体(multivesicular bodies，MVBs)的定位与分子标记表达。CD63，MVB标记，绿色；TSG101，外泌体标记，红色；DAPI，细胞核，蓝色。

图12、qRT-PCR分析增殖态和衰老细胞中几组蛋白分子的表达水平。Syntenin-1，TSG101，ALIX，CD9，CD63，CD81，ADAM10和EHD4为外泌体标价分子；SMPD2/3为MV和外泌体通用标记分子；IL6，IL8，IL1a，WNT16B，MMP3和GM-CSF为SASP典型标记分子。

图13、通过小RNA测序(small RNA sequencing，sRNA-Seq)对增殖态和衰老细胞进行全转录组范围测序之后，small RNA各类别分子的表达情况。左，增殖态细胞；右，衰老细胞。

图14、sRNA-Seq数据导出之后呈现的所有miRNA分子在增殖态和衰老细胞之间的关系。无论已知(known)或未知(novel)的miRNA在两种状态下，共有834个分子位于重叠区域。

图15、增殖态和衰老细胞中已知(Known)miRNA在所有可测的总体sRNA中所占比例。

图16、已知(Known)miRNA在增殖态和衰老细胞中之间的关系分析。

图17、散点图显示衰老细胞相较于增殖态细胞，出现上调和下调表达的miRNA分子。红色，上调；绿色，下调；灰色，不变。

图18、Heatmap显示在衰老细胞外泌体中，有53个miRNA为显著上调，117个属于显著下调。

图19、Heatmap展现前50个显著上调的衰老细胞外泌体中的miRNA分子。

图20、对列表中前18个显著上调的已知miRNAs，根据其生物过程、分子功能等特性，进行等级聚类分析并以heatmap显示。

图21、Heatmap显示人类SIRT家族7个成员在基质细胞衰老前后的表达水平。

图22、qRT-PCR检测SIRT1-7这组分子的转录本表达变化。每组样本的数据为衰老细胞向增殖态细胞进行规范化之后的结果。

图23、Immunoblot检测增殖态和衰老细胞中SIRT1和IL8的表达水平。GAPDH，蛋白样本内参对照。

图24、经过shRNA在基质细胞PSC27中特异性敲除SIRT1之后，对一组外泌体相关蛋白的表达情况进行转录本水平的分析。

图25、基质细胞经过BLEO处理之后第7天收集总RNA并分析其HSP70，TSG101和IL8进行转录水平的表达分析。

图26、Immunoblot检测图25中几个分子在两种状态下的表达水平。

图27、在PSC27基质细胞中过表达HSP70之后，分析TSG101，ALIX和IL8的表达水平。GAPDH，内参对照。

图28、使用Bay 11-7082和BLEO分别或同时处理基质细胞之后第7天，裂解细胞、收集其总蛋白并以immunoblot进行分析，确定外泌体相关分子表达变化。Bay，Bay 11-7082。

图29、使用SAHA(终浓度10nM)或NAM(终浓度200nM)处理基质细胞之后收集总蛋白并以immunoblot分析其SIRT1，HSP70，ALIX，CD63和IL8的表达情况。GAPDH，内参对照。

图30、通过NAM(终浓度200nM)或SRT2104(终浓度10uM)处理原始态或BLEO(终浓度50ug/ml)损伤下的基质细胞，并分析其ubiquitination水平，和TSG101/ALIX/CD63/IL8的表达变化。GAPDH，内参对照。

图31、收集基质细胞胞外液(CM)并从中分离、纯化外泌体，随后用于前列腺癌细胞的培养和表型鉴定的技术流程。

图32、PSC27细胞经过CD63-GFP表达载体转染之后，收集其外泌体并用于处理PC3和DU145细胞系，荧光显微镜显示外泌体被后者吸收3天之后的亚细胞定位情况。

图33、一组前列腺癌细胞系(PC3，DU145，LNCaP和M12)经过PSC27基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理3天之后，细胞增殖情况分析。

图34、显微图像展示PC3和DU145经过吸收PSC27基质细胞外泌体(用量1.8×10¹²/10⁶癌细胞)3天之后在二维平面上的生长情况。

图35、前列腺癌细胞系(PC3，DU145，LNCaP和M12)经过接触PSC27基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)3天之后在transwell中的迁移活性检测结果。

图36、前列腺癌细胞系(PC3，DU145，LNCaP和M12)经过接触PSC27基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)3天之后在transwell中的侵袭活性检测结果。HeLa，阳性对照细胞系。

图37、前列腺癌细胞系(PC3，DU145，LNCaP和M12)经过接触PSC27基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)3天之后在IC50浓度米托蒽醌(mitoxantrone，MIT)作用下的存活率检测结果。

图38、PC3细胞在一定剂量范围内的MIT作用下(0.01-10μM)的存活曲线。在衰老细胞外泌体比增殖态细胞外泌体造成癌细胞更高的耐药性(显著性差异)尤其在0.1-1μM范围内。

图39、Immunoblot对几种不同条件下PC3细胞中caspase 3的活化(自我切割)情况分析。GAPDH，内参对照。

图40、增殖态或衰老细胞释放的外泌体，跟MIT(终浓度1um)以及QVD(终浓度100nM)、ZVAD(终浓度10uM)这两种pan-caspase抑制剂，以及PAC1(终浓度0.2uM)、gambogicacid(GA)(终浓度1.2uM)这两种caspase激活剂，结合用于处理PC3细胞之后，获得的细胞凋亡数据分析。

图41、PC3细胞在一定剂量范围内的紫杉醇(docetaxel，DOC)作用下的存活曲线(0.01-10μM)。衰老细胞外泌体比增殖态细胞外泌体造成癌细胞更高的耐药性(显著性差异)，尤其在0.1-1μM范围内。

图42、增殖态或衰老细胞释放的外泌体，跟DOC(终浓度100nM)以及QVD(终浓度100nM)、ZVAD(终浓度10uM)这两种pan-caspase抑制剂，以及PAC1(终浓度0.2uM)、GA(终浓度1.2uM)这两种caspase激活剂，结合用于处理PC3细胞之后，获得的细胞凋亡数据分析。外泌体与癌细胞的比例1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞。

图43、RNA-Seq测序结果显示衰老细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)导致受体PC3前列腺癌细胞中ABCB家族11个成员的表达变化情况。其中，ABCB4的表达在两组样本之间呈显著上调。

图44、NA-Seq测序结果显示衰老细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)导致受体DU145前列腺癌细胞中ABCB家族11个成员的表达变化情况。其中，ABCB4的表达在两组样本之间呈显著上调。

图45、qRT-PCR和Immunoblot分析PC3和DU145细胞系经过PSC27基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理之后，ABCB4的表达变化。

图46、在一组前列腺癌细胞系中敲除ABCB4之后，再用基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理，3天之后检测得到的癌细胞增殖率数据。

图47、前列腺癌细胞系(同图46)中敲除ABCB4之后，再用基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理，3天之后检测其迁移率变化情况。

图48、前列腺癌细胞系(同图46)中敲除ABCB4之后，再用基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理，3天之后检测其侵袭率变化情况。

图49、前列腺癌细胞系(同图46)中敲除ABCB4之后，再用基质细胞外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)处理，3天之后检测其对化疗药物MIT(终浓度1uM)的抵抗性变化情况。

图50、前列腺癌细胞系PC3经过基质细胞外泌体处理(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)之后，在MIT药物(终浓度1uM)作用下的细胞生长和形态学图像。

图51、PC3细胞各亚系在一定剂量阿霉素MIT作用下的存活曲线(0.01-10μM)。ABCB4的缺失可以造成衰老细胞外泌体赋予癌细胞耐药性的显著性下降，尤其在0.1-1μM浓度范围内。外泌体与癌细胞的比例1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞。

图52、乳腺癌细胞系MDA-MB-231在一定剂量阿霉素(doxorubicin，DOX)作用下的存活曲线(0.01-100μM)。ABCB4的缺失可以造成衰老乳腺基质细胞系HBF1203外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)赋予乳腺癌细胞耐药性的显著性下降，尤其在0.1-1μM浓度范围内。

图53、在衰老前后，使用SIRT1激活剂SRT2104(终浓度10uM)处理PSC27基质细胞，收集并分离其产生的外泌体并以NTA对其计数。

图54、在衰老前后，使用SIRT1激活剂SRT2104(终浓度10uM)处理PSC27基质细胞，收集并分离其产生的外泌体(1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞)并用于处理PC3细胞。通过细胞存活曲线比较不同条件下癌细胞对MIT的耐药性。

图55、在衰老前后，使用SIR1激活剂SRT1720(终浓度10uM)或者SRT2104(终浓度10uM)处理HBF1203基质细胞，收集并分离其产生的外泌体并以NTA对其计数。

图56、乳腺癌细胞系MDA-MB-231在一定剂量DOX(0.01-100μM)作用下的存活曲线。ABCB4的缺失可以造成衰老乳腺基质细胞系HBF1203外泌体赋予乳腺癌细胞耐药性的显著性下降，尤其在0.1-1μM浓度范围内。外泌体与癌细胞的比例1.8×10¹²外泌体/10⁶癌细胞。

图57、预临床试验中免疫缺陷型小鼠(SCID)经过基质细胞/癌细胞移植体皮下移植，随后即接受小周期、多循环式化疗/SIRT1靶向治疗并在疗程结束之后进行病理分析的技术流程图。

图58、在8周的疗程结束之后，小鼠在MIT(0.6mg/kg)和/或SRT2104(300mg/kg)治疗组最终呈现的终端肿瘤体积统计性分析。左，统计比较各组差异；右，代表性肿瘤图片。

图59、对各种治疗方案下的小鼠肿瘤组织进行SA-β-Gal染色之后的结果对比分析。

图60、使用激光俘获显微切割(LCM)技术对小鼠组织中的基质细胞和癌细胞进行特异性分离之后，检测两个细胞亚型中SASP典型因子的表达变化，包括IL6/IL8/IL1a/MMP3。

图61、组织化学染色(IHC)结果显示小鼠肿瘤组织中SIRT1的表达情况。HE，苏木精伊红染色。

图62、使用LCM技术对小鼠组织中的基质细胞和癌细胞进行特异性分离之后，检测两个细胞亚型中外泌体标记物蛋白的表达变化，包括Syntenin-1/TSG101/CD9/CD63/CD81。

图63、通过构建PC3-luc(过表达luciferase的PC3亚系)，利用生物荧光信号成像(bioluminescence imaging)技术显示小鼠体内癌细胞在组织和器官中的大致定位。

图64、在几种不同治疗条件(MIT(0.2mg/kg每次，自第三周期起每隔一周一次，共3次腹腔注射)和/或SRT2104(100mg/kg每次，自第三周期起每隔一周一次，共3次口服给药))下小鼠组织中细胞DNA损伤和凋亡百分比统计分析。

图65、IHC染色比较在几种不同治疗条件(MIT(0.2mg/kg每次，自第三周期起每隔一周一次，共3次腹腔注射)和/或SRT2104(100mg/kg每次，自第三周期起每隔一周一次，共3次口服给药)下小鼠组织中细胞凋亡情况。Caspase 3(cleaved)，细胞凋亡相关指标。

图66、针对前列腺癌临床患者肿瘤组织进行IHC分析并比较化疗(米托蒽醌)前后两组样本中p16^INK4a，SIRT1和ABCB4的表达水平。每组患者数目为10，仅显示代表性图片。

图67、针对SIRT1在患者组织中基质细胞内的表达水平进行化疗(米托蒽醌)前后的对比分析。数据为经过双盲病理读片和临床分级后的结果。每组样本为20个。

图68、针对ABCB4在患者组织中癌细胞内的表达水平进行化疗(米托蒽醌)前后的对比分析。数据为经过双盲病理读片和临床分级后的结果。每组样本为20个。

图69、基于化疗(米托蒽醌)前后阶段前列腺癌患者外周血中循环态外泌体，进行TSG101特异性的ELISA分析。每组样本为10个。

图70、Immunoblot对比分析化疗前后患者外周血中循环态外泌体标记蛋白TSG101表达情况。Albumin，血清蛋白对照。

图71、基于临床样本的研究：化疗后阶段前列腺癌患者肿瘤组织中基质细胞SIRT1表达水平同其无病生存期的关联。SIRT1高水平患者，绿色曲线。SIRT1低水平患者，红色曲线。每组患者数量，20名。

图72、基于临床样本的研究：化疗后阶段前列腺癌患者肿瘤组织中癌细胞ABCB4表达水平同其无病生存期的关联。ABCB4低水平患者，蓝色曲线。ABCB4高水平患者，橙色曲线。每组患者，20名。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了衰老细胞产生的外泌体以及参与调控所述外泌体的一些生物分子，它们与肿瘤化疗治疗后的耐药性以及肿瘤预后密切相关。因此，本发明提供了新的抑制肿瘤、逆转肿瘤耐药性的靶点，已提新的肿瘤诊断和预后评估的标志物。

如本文所用，所述的“降低/抑制肿瘤耐药性”与“提高/增加肿瘤敏感性”可互换使用，均是指使原先对肿瘤化疗药物不敏感或发生耐药的肿瘤细胞更易于被肿瘤化疗药物所影响或受抑制。

如本文所用，所述的“肿瘤”或“癌”是原位肿瘤(癌)或转移肿瘤(癌)，包括对化疗药物存在耐药性的肿瘤。例如，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肾癌等。

耐药相关靶点

本发明人观察到，衰老细胞可以大量释放外泌体并出现粒径分布异常等特征，衰老细胞外泌体携带组分迥异于增殖态细胞的小RNA分子。这些衰老细胞外泌体可以促进癌细胞的恶性特征尤其耐药性发展。更特别地，所述衰老细胞为衰老的基质细胞。

基于上述新发现，本发明提供了衰老细胞分泌的外泌体作为药学靶点的应用，包括用于：作为调控(抑制或逆转)肿瘤耐药性的靶点；作为筛选调控(抑制或逆转)肿瘤耐药性的物质的靶点；作为肿瘤诊断或预后的标志物；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂；较佳地，所述的衰老细胞为衰老的基质细胞。进一步地，本发明也提供了针对所述衰老细胞分泌的外泌体，抑制其合成、释放或活性的试剂的应用，用于制备降低肿瘤耐药性的组合物，或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒。

在上述基础上，本发明人还发现，沉默调节蛋白1(Silent mating typeinformation regulation 2homolog-1，SIRT1)(GenBank登录号：NM-012238)下调导致衰老细胞中外泌体生物合成更加活跃并大量释放至胞外空间，SIRT1是基质细胞中外泌体生物合成与胞外释放的一个十分关键的负性调控因子，并同DNA损伤背景下的蛋白质泛素化程度密切相关。因此，靶向性激活SIRT1可以限制外泌体合成与释放并提高抗癌治疗的效率。

因此，本发明还提供了SIRT1作为药学靶点的应用，用于：作为调控外泌体的合成、释放或活性的靶点；作为筛选调控外泌体的合成、释放或活性的物质的靶点；制备调控外泌体的合成、释放或活性的调节剂；作为肿瘤诊断或预后的标志物；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂。进一步地，本发明也提供了SIRT1上调剂(包括激动剂)的应用，用于：制备下调外泌体的合成、释放或活性的组合物，所述外泌体为衰老细胞分泌的外泌体；制备降低肿瘤耐药性(对化疗药物的耐药性)的组合物；或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒。

本发明人还发现，衰老基质细胞外泌体通过诱导癌细胞中ABCB4(ATP bindingcassette subfamily B member 4)(GenBank登录号：NM_018849)上调表达而赋予其显著耐药性，ABCB4在介导癌细胞通过接触基质细胞外泌体而获得对化疗药物的抵抗性上，起到了十分关键的作用，且ABCB4所介导的基质外泌体赋予的癌细胞耐药性在多个实体瘤中较为普遍的现象，具有广谱性。因此，靶向性下调ABCB4可以显著降低基质外泌体对于癌细胞的影响，降低癌细胞的耐药性。

因此，本发明还提供了ABCB4的应用，用于：作为调控(抑制或逆转)肿瘤耐药性的靶点；作为筛选调控(抑制或逆转)肿瘤耐药性的物质的靶点；作为肿瘤诊断或预后的标志物；或制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂。进一步地，本发明也提供了ABCB4下调剂的应用，用于：制备抑制衰老细胞分泌的外泌体与肿瘤细胞相互作用(包括抑制外泌体通过诱导癌细胞中ABCB4上调表达而赋予其耐药性)的组合物；制备降低肿瘤耐药性的组合物；或制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒。

药物组合物

根据本发明，衰老细胞外泌体可以促进癌细胞的恶性特征尤其耐药性发展，那么，对于外泌体的合成、释放或活性具有下调作用的物质，或者特异性阻断外泌体与肿瘤细胞的相互作用的物质，参与外泌体的合成、释放或活性的一个或多个环节的物质，可被应用于制备降低肿瘤耐药性的药物组合物。并且，这些物质也可与肿瘤化疗药物进行混合，制备成药物组合物；或者与肿瘤化疗药物作为联用试剂，制备成药盒或试剂盒。

在本发明的优选方式中，本发明提供了一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：SIRT1上调剂和肿瘤化疗药物。通常，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在本发明的优选方式中，本发明提供了一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：ABCB4下调剂和肿瘤化疗药物。通常，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物，例如但不限于米托蒽醌(MIT)，紫杉醇，长春新碱，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶,紫杉醇，长春新碱等。应理解，在阅读了本发明之后，本领域人员可能在本发明所列举的上述药物基础上，拓展一些其它类型的化疗药物，这也应包含在本发明总体方案中。

如本文所用，所述的SIRT1上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂等。可提高SIRT1蛋白的活性、维持SIRT1蛋白的稳定性、促进SIRT1蛋白的表达、促进SIRT1蛋白的分泌、延长SIRT1蛋白有效作用时间、或促进SIRT1基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调控外泌体进而调控肿瘤耐药性的有效物质；更具体的例如但不限于：重组表达SIRT1的构建物，SIRT1的化学激动剂，促进SIRT1基因启动子驱动能力的上调剂、SIRT1基因特异性的过表达多肽、靶向抑制SIRT1基因的microRNA的下调剂。作为本发明的优选方式，所述的SIRT1上调剂为SIRT1选择性激活剂SRT2104和SRT1720。可选择地，所述SIRT1上调剂也可以是在转入细胞后可表达(优选过表达)SIRT1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码SIRT1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。SIRT1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生SIRT1蛋白。

本发明所述的ABCB4下调剂包括了抑制剂、拮抗剂剂、阻滞剂、阻断剂等。所述的ABCB4下调剂可以是指可降低ABCB4蛋白的活性、降低ABCB4基因或蛋白的稳定性、下调ABCB4蛋白的表达、减少ABCB4蛋白有效作用时间、或抑制ABCB4基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于调控肿瘤耐药性的有效物质。例如，所述的下调剂是：特异性干扰ABCB4基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与ABCB4基因编码的蛋白结合的抗体或配体，等等。作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂是一种ABCB4特异性的干扰RNA分子(shRNA)，本发明人观察到，采用本发明的干扰RNA分子，可显著地下调ABCB4，对于逆转肿瘤的耐药性作用非常显著。作为其它的可选择方式，也可采用CRISPR/Cas9系统进行靶向ABCB4的基因编辑。

本发明的组合物中，所述的SIRT1上调剂、ABCB4下调剂或化疗药物均为有效量的。在用作药物时，通常它们还与药学上可接受的载体相混合。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W^2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m²计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明提供了一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒，所述的药盒中包括SIRT1上调剂或ABCB4下调剂，以及化疗药物。更优选地，所述药盒中还包括：使用说明书，以指导临床医师以正确合理的方式用药。

为了方便给药，所述的SIRT1上调剂、ABCB4下调剂与化疗药物的组合物或彼此独立存在的SIRT1上调剂、ABCB4下调剂与化疗药物可以被制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将药物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

筛药方法

根据本发明，在得知了衰老细胞分泌的外泌体及其与SIRT1或ABCB4的作用方式后，可以基于这些特征来筛选对于调控外泌体有用的物质，或筛选对于逆转肿瘤的耐药性有用的物质。可从所述的物质中找到对于抑制肿瘤或逆转肿瘤耐药性真正有用的药物。

作为本发明的优选方式，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，包括：用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体；和检测所述体系中外泌体的合成、释放或活性；若所述候选物质在统计学上抑制外泌体的合成、释放或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

作为本发明的优选方式，提供一种筛选下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，包括：用候选物质处理一表达体系，该体系表达SIRT1；和，检测所述体系中SIRT1的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高SIRT1的表达或活性，则表明该候选物质是下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

作为本发明的优选方式，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，包括：用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达SIRT1；和，检测所述体系中SIRT1对于外泌体的调控作用；若所述候选物质在统计学上促进SIRT1对于外泌体的合成、释放或活性的下调作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

作为本发明的优选方式，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，包括：用候选物质处理一表达体系，该体系表达ABCB4；和，检测所述体系中ABCB4的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低ABCB4的表达或活性，则表明该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

作为本发明的优选方式，提供一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，包括：用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达ABCB4；和检测所述体系中外泌体对于ABCB4的调控作用；若所述候选物质在统计学上减弱外泌体对于ABCB4的调控作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

本发明中，所述的候选物质包括但不限于：针对SIRT1或ABCB4或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到外泌体的合成、释放或活性情况、SIRT的活性或表达情况、SIRT1对于外泌体的调控作用、ABCB4的表达或活性、外泌体对于ABCB4的调控作用等，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达体系。

在本发明的优选方式中，所述的体系可以是细胞(培养物)体系、亚细胞(培养物)体系、组织(器官)体系、溶液体系等等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤或逆转肿瘤耐药性真正有用的物质。

诊断及预后

基于本发明人的上述新发现，可以将衰老蛋白产生的外泌体、调控该外泌体的SIRT1以及接收该外泌体信号的ABCB4作为肿瘤的诊断和预后评估的标志物：(i)进行肿瘤分型、鉴别诊断、和/或无病生存率分析；(ii)评估相关人群的肿瘤治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出肿瘤微环境中、特别是外泌体、SIRT1或ABCB4呈现特殊状态的人群，从而可进行更有针对性地治疗。优选地，所述的诊断和预后评估为肿瘤化疗后阶段的诊断和预后评估。

可采用各种本领域已知的技术来定性或定量地检测外泌体、SIRT1或ABCB4的存在情况、表达情况或活性情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增靶基因的引物；或特异性识别靶基因的探针来确定靶基因的存在情况；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合靶蛋白的抗体或配体来确定靶蛋白的表达情况。

作为本发明的优选方式，特异性识别衰老细胞分泌的外泌体、外泌体相关标记蛋白或其编码基因的试剂包括：特异性结合外泌体或其相关标记蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增外泌体相关标记基因的引物；特异性识别外泌体相关标记基因的探针；或特异性识别外泌体相关标记基因的芯片。利用所述特异性识别衰老细胞分泌的外泌体、外泌体相关标记蛋白或其编码基因的试剂(较佳地针对血液或血清)，若判断外泌体的合成、释放或活性受抑制，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断外泌体的合成、释放或活性受促进，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

作为本发明的优选方式，特异性识别或扩增SIRT1的试剂包括：特异性结合SIRT蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增SIRT1基因的引物；特异性识别SIRT1基因的探针；或特异性识别SIRT1基因的芯片。利用所述特异性识别或扩增SIRT1的试剂(较佳地针对基质细胞)，若判断SIRT1发生上调，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断SIRT1发生下调，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

作为本发明的优选方式，特异性识别或扩增ABCB4的试剂包括：特异性结合ABCB4蛋白的结合分子(如抗体)；特异性扩增ABCB4基因的引物；特异性识别ABCB4基因的探针；或特异性识别ABCB4基因的芯片。所述的试剂可以根据已知的技术制备，或也可通过商购途径获得。利用所述特异性识别或扩增ABCB4的试剂(较佳地针对肿瘤组织)，若判断ABCB4发生下调，则表明受试者肿瘤的预后相对较好；若判断ABCB4发生上调，则表明受试者肿瘤的预后相对较差。

所述的试剂可被置于试剂盒中。所述试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、衰老细胞可以大量释放外泌体并出现粒径分布异常等特征

以往有关外泌体在癌症研究中的报道大多集中在癌细胞自身或增殖态细胞的研究上。相比之下，患者基质组织中衰老细胞的变化情况却鲜见报道。目前，本发明人注意到人源前列腺基质细胞系PSC27(主要是由成纤维细胞组成)在被细胞毒尤其是基因毒化疗药物博来霉素(BLEO)处理之后，会迅速进入衰老状态(图1～图2)。与此同时，细胞呈现出典型的衰老相关分泌表型(SASP)，集中体现在高度上调表达大量的外泌因子(图3)。

有趣的是，伴随细胞衰老和SASP发生发展的，则是胞外囊泡(extracellularvesicles，EVs)释放数量的大幅上升，实际增长到了非衰老细胞的7倍之多(图4)。为了确认这一现象，本发明人使用了纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)技术，并发现EV的粒径也发生了深刻变化。

相比于增殖态细胞在72，102，121和170nm等几处颗粒峰值的主要分布，衰老细胞则大致呈现为33，47，64，122，156，182，266和314nm的颗粒直径分布(图5)。统计数据表明，这些EV的平均直接从116nm增长到了161nm(图6)。扫描电镜分析结果显示，衰老细胞产生的EV大小更加不均匀(图7)。随后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，本发明人发现在蛋白总量相当的情况下，衰老细胞EV蛋白在多个条带位置均出现与增殖态细胞的明显区别(图8左)；当蛋白样本根据母细胞数量进行规范化之后，本发明人注意到衰老细胞释放的EV蛋白丰度相比于增殖态细胞呈现显著上升(图8右)。在母细胞数量相当的情况下，释放的EV中作为外泌体标记的蛋白其含量在衰老细胞中更高(图9)；在母细胞的总蛋白裂解液中，这些标记蛋白的总量，在衰老细胞中也出现明显上升的趋势(图10)。通过免疫荧光染色，本发明人发现衰老细胞中多泡体(multivesicular bodies，MVBs)显得更大，并且其内部空间外泌体的生物合成更加活跃(图11)。

荧光定量RT-PCR结果表明，外泌体相关标记蛋白如Syntenin-1，TSG101，ALIX，CD9，CD63，CD81，ADAM10和EHD4的转录本表达水平显著升高，但SMPD2/3的表达不变，表明仅仅外泌体、而非所有类型EV的生物合成明显增强(图12)。同时，多个SASP典型外泌因子如IL6，IL8等的表达也出现大幅上升。

实施例2、衰老细胞外泌体携带组分迥异于增殖态细胞的小RNA分子

在体内环境下，胞外囊泡可以运输多种生物活性物质，包括多种类型的小RNA分子特别是microRNAs(miRNAs)，后者可以反映母细胞的病理生理学特征并参与到胞间通讯等生命活动过程中。为此，本发明人首先通过小RNA测序(small RNA sequencing，sRNA-Seq)对基质细胞衍生外泌体中的microRNAs分子进行深度测序分析。高通量数据表明小RNA的总量在增殖态细胞与衰老细胞之间未出现较大差异，但特定的小RNA的亚型存在一定程度的变化，例如rRNA，tRNA和人类基因内含子区段编码的一些位点产生的transcripts(图13)。

随后本发明人将注意力集中于miRNAs这一类分子，因其通过外泌体等胞外囊泡的递送可以影响受体细胞的活性、功能、命运和表达等基本特征。在增殖态与衰老细胞之间，共有834个为二者共同表达的miRNAs(图14)。在Illumina测序结果展示的1031个miRNAs中，至今已有功能注解的miRNAs(known miRNAs)在所有miRNAs中所占比例大致恒定(图15)。在增殖态与衰老细胞之间，有250个已知miRNAs位于重叠区域(图16)。有170个miRNAs在衰老细胞中出现显著性变化，其中有53个发生上调而117个存在下调(图17，图18)。

在这53个显著上调的miRNAs中，无论是已知(known)还是未知(novel)的transcripts对于细胞衰老的相关性均没有文献报道(图19)。然而，其中18个miRNAtranscripts，根据其生物过程、分子功能等特性，在等级聚类分析之后存在一定关联(图20)。

实施例3、SIRT1下调导致衰老细胞中外泌体生物合成更加活跃并大量释放至胞外空间

本发明人随后思考一个关键问题是：造成这种分子组分发生显著性变化的生物基础究竟是什么？近年有文献报道，溶酶体或自噬活性的异常可以导致外泌体生物合成过程发生紊乱，这一过程主要由多泡体(multivesicular bodies，MVBs)的改变而引起，后者为细胞质中外泌体的主要来源。特别的，在一些癌细胞中SIRT1表达下调则能够使得溶酶体酸度维持受到严重影响，并最终促进外泌体的过量或异常释放。

鉴于此，本发明人接下来分析了SIRT1，一个NAD⁺依赖性去乙酰化酶，在增殖态和衰老细胞中的表达情况。全转录组测序(RNA-Seq)结果显示，该家族中的所有7个成员均存在不同程度的下调(图21)；而根据荧光定量PCR数据，显著性差异出现在SIRT1和SIRT2这两个分子之间(图22)。此外，immunoblot结果证实了蛋白水平也存在类似趋势(图23)。

通过short hairpin RNA(shRNA)技术，本发明人构建了一组SIRT1缺陷型基质细胞系(shRNA靶向序列#1：CATGAAGTGCCTCAGATATTA(SEQ ID NO:1)；#2：GCGGGAATCCAAAGGATAATT(SEQ ID NO:2)。后者出现了外泌体一系列特异性标记如TSG101，Syntenin-1，ALIX和tetraspanins(CD9/63/81)的显著上调表达，而HSP70却表现为下降，后者则同哺乳动物细胞中泛素化蛋白的上升密切相关(图24)。随后本发明人注意到，DNA损伤可以造成HSP70下调，并伴随有TSG101和IL8表达水平的上升(图25)，同时蛋白水平发生平行变化(图26)。此外，本发明人在基质细胞中使用慢病毒转染表达了外源HSP70，反而发现TSG101和ALIX表达下降，暗示着HSP70同外泌体生成之间存在某种负相关性(图27)。

然而，SIRT1在衰老细胞中下调同NF-κB，这一跟细胞衰老和SASP表型密切相关的转录因子，是否存在某种相关性呢？为回答这一问题，本发明人使用了Bay11-7082(BAY)处理PSC27细胞，发现SIRT1表达水平反而出现上升，同外泌体标记蛋白和IL8等因子的表达规律完全相反(图28)。

为进一步阐明SIRT1下调与外泌体生成之间的关系，本发明人使用了suberoylanilide hydroxamine acid(SAHA)和nicotinamide(NAM)，这两种药物分别为pan-histone deacetylase(HDAC)抑制剂和SIRT1-特异性抑制剂。Immunoblot结果显示，SIRT1水平基本不受影响，但HSP70和外泌体标记蛋白包括ALIX和CD63表达则出现显著改变(图29)。这些数据暗示SIRT1的活性对于外泌体相关分子的生物合成具有关键作用。

为了确认这一发现，本发明人继而选择性使用了SRT2104，一种SIRT1特异性激活剂，同化疗药物博来霉素(bleomycin，BLEO)分别或者同时处理PSC27基质细胞。结果表明，SRT2104活化SIRT1之后，可以大幅弱化外泌体生成并降低细胞整体蛋白的泛素化程度，而这些变化均可被NAM单独使用逆转，不论是否存在药物引发的DNA损伤，尽管TSG101，CD63，ALIX和IL8表达在DNA损伤条件下发生明显上调(图30)。因而，SIRT1是基质细胞中外泌体生物合成与胞外释放的一个十分关键的负性调控因子，并同DNA损伤背景下的蛋白质泛素化程度密切相关。

实施例4、衰老基质细胞衍生的外泌体可以促进癌细胞的恶性特征尤其耐药性发展

虽然在数量上呈上升趋势，那么衰老基质细胞产生的外泌体是否对受体癌细胞造成某些方面的显著影响呢？本发明人首先在体外建立了PSC27一个亚系PSC27-CD63，使用的是慢病毒转染的表达载体pCT-CD63-eGFP。这一表达体系借鉴于eGFP融合型CD63，可以实时而准确地对外泌体在受体细胞中进行跟踪、定位和显像。从基质细胞中收集其外泌液CM之后，通过序列离心技术流程对外泌体进行了分离与纯化，并随即用于前列腺癌细胞的培养(图31)。不出所料，本发明人观测到在前列腺癌细胞的核周区附近存在大量的eGFP-markedCD63，表明这些癌细胞已经吸收了基质细胞来源的外泌体并进入到胞内特定空间(图32)。

随后的一组体外实验数据证明异源性质的外泌体显著提高了多个前列腺癌细胞系的增殖率(图33，图34)。同时，癌细胞的迁移率和侵袭性也出现显著增强(图35，图36)。更值得注意的则是，基质细胞外泌体造成癌细胞对于米托蒽醌(mitoxantrone，MIT，一种临床上常用的II型拓扑异构酶抑制剂用于前列腺癌患者)的显著耐药性(图37)。尽管增殖态细胞外泌体没有对这些癌细胞的耐药性产生显著影响，衰老细胞衍生外泌体却造成不可忽略的变化。随后的一组基于MIT在临床患者体内实际浓度(0.01～>1.0μM)的体外模拟药物动力学数据，显示衰老细胞通过其外泌体就发挥十分明显的影响，尤其在0.1-1μM浓度范围内，造成癌细胞在MIT作用下生存率的显著提升(图38)。

接下来的耐药机制研究数据表明，衰老细胞而非增殖态细胞的外泌体能够对受体癌细胞内caspase 3的活化(主要表现为自我切割)产生大幅影响(图39)。尽管其它影响癌细胞存活的机制不能被排除，但caspase对抗性的分子机制在此过程中明显起到关键作用。接着，本发明人使用QVD-OPH和ZVAD-FMK，两种高效的pan-caspase抑制剂，以及PAC1和gambogic acid(GA)，两种典型的caspase激活剂，处理这组癌细胞(图40)。结果表明，QVD-OPH或ZVAD-FMK可以显著降低细胞凋亡活性，但PAC1或GA却起到相反作用，即明显上调其凋亡活性(P<0.001；P<0.01)。为了证实这一发现，本发明人又使用了docetaxel(DOC)，另外一种化疗药物，其功能主要是干扰细胞的微管系统顺利聚合与解聚。结果显示，衰老细胞外泌体对癌细胞耐药性的影响，基本可以再次重复，衰老细胞外泌体比增殖态细胞外泌体造成癌细胞更高的耐药性(图41，图42)。

因此，衰老基质细胞衍生的外泌体可以通过抑制Caspase依赖的凋亡造成癌细胞在药物作用下获得耐药性，并且使其表现为多药耐药(multidrug resistance，MDR)的特征。

实施例5、衰老基质细胞外泌体通过诱导癌细胞中ABCB4上调表达而赋予其显著耐药性

RNA-Seq数据表明，一旦接触衰老基质细胞产生的外泌体，PC3和DU145细胞中均出现ABCB4的显著上调，而其它ABC家族成员的表达却大致不变(图43，图44)。体外进一步实验中，这一趋势在转录本水平和蛋白水平得以确认(图45)。

有趣的是，当ABCB4在癌细胞中被预先敲除(shRNA靶向序列#1：GCTGGAAATCTCGCCTATTTA(SEQ ID NO:3)；#2：GTTCTTGTTGCTGCCTATATA(SEQ ID NO:4)；无关序列对照shRNA^C：ATCGATGCTAGCTACGATATG(SEQ ID NO:1))之后，原先衰老基质细胞外泌体造成的癌细胞(PC3、DU145、LNCaP、M12细胞)增殖优势却出现大幅逆转(图46)。同时，癌细胞(PC3、DU145、LNCaP、M12细胞)在基质外泌体的作用下呈现出的更高的迁移性和侵袭力，也被显著削弱(图47，图48)。在细胞耐药性测试中，本发明人更发现ABCB4的缺失造成各个癌细胞系(PC3、DU145、LNCaP、M12、Hela细胞)对于MIT(各自均为IC50浓度)的抵抗力显著下降(图49)，这在细胞(PC3为例)于几种条件下的总体数量上也能反映出来(图50)。

本发明人随即在模拟临床条件下的一定MIT浓度范围内，测试了PC3的生存率。发现，ABCB4的缺失可以显著降低基质外泌体对于癌细胞的影响(图51)，尤其在MIT为0.1-1μM浓度范围内。这些结果表明，ABCB4在介导癌细胞通过接触基质细胞外泌体而获得对化疗药物的抵抗性上，起到了十分关键的作用。

为了扩展这一发现，本发明人接下来使用了HBF1203，一个来源于人乳腺组织的基质细胞系。通过类似的方法和程序，本发明人将ABCB4从乳腺癌细胞系MDA-MB-231中敲除，并发现随后的一套基质-癌细胞相关数据，基本可以重复之前在前列腺基质-癌细胞实验中获得的结果，即乳腺癌细胞对阿霉素(doxorubicin，DOX)的耐药性受到显著影响(图52)，尤其在阿霉素0.1-1μM浓度范围内。

因此，ABCB4所介导的基质外泌体赋予的癌细胞耐药性，实际上是在多个实体瘤中较为普遍的现象，具有肿瘤广谱性。

实施例6、靶向性激活SIRT1可以限制外泌体合成与释放并提高抗癌治疗的效率

既然衰老基质细胞中SIRT1表达显著下调，本发明人探测通过药物靶向SIRT1从而控制外泌体生成的技术可行性。为此目的，本发明人针对性使用了SRT2104和SRT1720，两种高效的SIRT1选择性激活剂。对基质细胞PSC27同时使用BLEO和任意一种SIRT1激动剂，可以显著降低外泌体的释放数量(图53)。更重要的则是，SRT2104或SRT1720的使用可以大幅减弱体外条件下PC3对于MIT的耐药性(图54)。同时进行的基于乳腺基质细胞和癌细胞的实验，结果表明SIRT1激动剂能够明显减少衰老细胞中外泌体的合成与释放，最终降低受体癌细胞对于乳腺临床化疗药物(DOX)的抵抗(图55，图56)。

为了更加准确地模拟结构和功能均相对完整的微环境中基质细胞同癌细胞之间的互作与通讯，本发明人对PSC27基质细胞和PC3癌细胞按照预实验确定的比例(1:4)进行混合，体外形成了重构组织，并移植到免疫缺陷型小鼠(SCID)的皮下位置(图57)。移植之后第3周开始，化疗药物MIT和SRT2104分别(单药)或者联合(双药)注射到小鼠腹腔，并按照两周一次的节拍式给药方案向小鼠定期给药，直至8周疗程全部结束(图57)。第8周末获得的预临床数据表明，MIT单独给药可以大幅降低小鼠肿瘤的终端体积(41.3％，图58)；SRT2104单独给药并没有造成显著影响，但与MIT同时给药时却可以显著缩小肿瘤体积(63.9％，图58)，这大大超出仅给药MIT时的技术效果。无论是否存在MIT的情况下，本发明人均发现在小鼠肿瘤组织中出现广泛的细胞衰老，并被SA-β-Gal染色数据所支持(图59)。

其他化疗药物与SIRT1激动剂的联用也是有效果的，化疗药物包括米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶，紫杉醇，长春新碱；SIRT1激动剂包括：SRT2183、SRT3025和CAY10602。

化疗过程中出现细胞衰老的同时，SASP也得以发展，并集中体现在肿瘤组织中的基质细胞，如IL6，IL8，IL1α，MMP3等因子的显著上调；相比之下，基质细胞临近的癌细胞并未形成典型的SASP(图60)。值得注意的是，基质细胞在化疗后阶段呈现表达下降的SIRT1，跟体外数据相互吻合(图61)。伴随基质细胞中SIRT1下调的，则是外泌体相关标记分子TSG101，Syntenin-1，CD9，CD63和CD81(图62)。有趣的是，周边癌细胞没有出现类似的变化趋势，暗示着在基质细胞和癌细胞之间存在着某种差异性调控机制。

因胞外囊泡往往可以促进微环境中前转移灶的形成并引发癌细胞在体内转移，本发明人构建了PC3-luciferase亚系并同PSC27一起用于组织重构。生物荧光信号数据证明，癌细胞在8周疗程中并未从原发位点向远处器官发生转移，且BLI信号强度与先前获得的一套小鼠肿瘤体积数据大致吻合并彼此印证(图63)。以上数据证明，传统化疗结合SIRT1激动剂，在现实中可以比单纯化疗更加有效地引起肿瘤退行，可作为一种控制肿瘤微环境中的基质细胞所造成的病理恶化后果的新型、有效、安全的治疗方式进行发展和实践。

本发明人进一步的组织病理分析表明，化疗本身可以引发组织内的DNA损伤与细胞凋亡，主要反映于DDR foci数量上升和caspase 3自我切割程度的增强。尽管SRT2104单药使用并不会引起以上反应，但MIT/SRT2104组合式给药却造成组织中以上两项指数的显著上扬。相比于MIT单药，MIT/SRT2104的同时使用形成更加显著的毒理效果，DDR foci和细胞凋亡比例分别上升了40.3％和112.5％(图64，图65)。

实施例7、化疗后阶段基质细胞中SIRT1下调和癌细胞中ABCB4上调预示着临床患者较差的疾病无进展生存

通过对临床队列的病理分析，本发明人发现在化疗后获取的前列腺癌组织中的基质细胞出现较高水平的衰老标记p16^INK4a的表达，但与其邻近的癌细胞却没有这一变化(图66)。与化疗前样本相比，组织中的这些基质细胞呈现SIRT1表达下调，而周围的癌细胞中ABCB4表达则出现截然相反的趋势，即明显上调(图66)。

随后本发明人通过激光捕捉显微切割(LCM)技术，将组织中的基质细胞和癌细胞予以特异性分离并提取其中的总RNA，进行转录本水平的表达检测。结果证实了组化染色中获得的一套数据，即基质细胞和癌细胞分别发生SIRT1下降和ABCB4上升(图67，图68)。

本发明人进而开展了一项基于患者样本的临床分析，即分别获取化疗前和化疗后前列腺癌一定数量(各10例)患者的血液样本。TSG101特异性的ELISA检测分析结果表明，化疗后患者血液中存在显著增多的循环态外泌体(图69)；更令人兴奋的则是，Immunoblot结果证明在化疗后部分患者血清中出现了Syntenin-1的可见信号(5例中的3例)，同化疗前患者血清样本(5例均呈阴性)，形成鲜明对比(图70)。因此，化疗后阶段临床患者循环血中的外泌体成分，例如其典型生物标记物，可以作为凭借常规生物技术监测患者特定病理状态的一个有利指标。

最后，本发明人试图建立组织中同基质细胞中外泌体生成和癌细胞外泌体吸收后果相关的分子，跟癌症患者无病生存期(Disease Free Interval，DFI)之间的关联。经过一系列的组化染色和严格的病理分级，本发明人发现基质细胞SIRT1表达水平同癌症患者临床后阶段的无病生存期之间存在显著正相关(图71)，SIRT1高水平患者，无病生存期显著更长；SIRT1低水平患者则生存期短。与此相反的是，患者病灶组织中癌细胞ABCB4表达水平同其无病生存期则呈现显著的负相关(图72)，ABCB4低水平患者，无病生存期显著更长；ABCB4高水平患者则生存期短。

结合本发明所发现的基质细胞SIRT1丧失造成的外泌体合成与释放的显著活跃，以及至今报道的有关SIRT1下降引发的人类多种衰老相关疾病这一情况，本发明人认为，SIRT1特异性药物靶向可以作为今后临床医学予以重点发展的一种干预手段。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用

<130> 196316

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> shRNA靶向序列(shRNA target)

<400> 1

catgaagtgc ctcagatatt a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> shRNA靶向序列(shRNA target)

<400> 2

gcgggaatcc aaaggataat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> shRNA靶向序列(shRNA target)

<400> 3

gctggaaatc tcgcctattt a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> shRNA靶向序列(shRNA target)

<400> 4

gttcttgttg ctgcctatat a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> shRNA靶向序列(shRNA target)

<400> 5

atcgatgcta gctacgatat g 21

Claims

1.SIRT1的应用，用于：

作为调控外泌体的合成、释放或活性的靶点；

作为筛选调控外泌体的合成、释放或活性的物质的靶点；

制备调控外泌体的合成、释放或活性的调节剂；

作为肿瘤诊断或预后的标志物；或

制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂；

其中，所述外泌体为衰老细胞分泌的外泌体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述衰老细胞为衰老的基质细胞；

所述衰老细胞分泌的外泌体携带的小RNA分子组分不同于增殖态细胞；或

所述调控外泌体的合成、释放或活性为下调外泌体的合成、释放或活性。

3.SIRT1上调剂的应用，用于：

制备下调外泌体的合成、释放或活性的组合物，所述外泌体为衰老细胞分泌的外泌体；

制备降低肿瘤耐药性的组合物；或

制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒；较佳地，所述药物组合物或药盒中还包括肿瘤化疗药物。

4.一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，其特征在于，包括：SIRT1上调剂和肿瘤化疗药物。

5.如权利要求3或4，其特征在于，所述的SIRT1上调剂包括增强SIRT1活性的物质或增强SIRT1的表达、稳定性或延长其有效作用时间的物质；较佳地，所述SIRT1上调剂包括：重组表达SIRT1的构建物，SIRT1的化学激动剂，促进SIRT1基因启动子驱动能力的上调剂、SIRT1基因特异性的过表达多肽、靶向抑制SIRT1基因的microRNA的下调剂；更佳地，所述的化学激动剂包括：SRT2104、SRT1720、SRT2183、SRT3025、CAY10602、Bay 11-7082、QNZ、Curcumin或Diethylmaleate；或

所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物；较佳地是基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨或5-氟尿嘧啶，紫杉醇，长春新碱；或

所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。

6.如权利要求3或4，其特征在于，所述SIRT1上调剂和肿瘤化疗药物按照摩尔比为：1:0.0001～1:1；较佳地为1:0.0005～1:0.5；更佳地为1:0.001～1:0.1，如1:0.002；或

所述的肿瘤化疗药物的终浓度为：0.01～200μM；较佳地0.05～150μM；更佳地0.08～100μM；或

所述SIRT1上调剂的终浓度为：0.5～80uM；较佳地1～50uM；更佳地5～20uM。

7.一种筛选下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达SIRT1；和

(2)检测所述体系中SIRT1的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高SIRT1的表达或活性，则表明该候选物质是下调外泌体的合成、释放或活性或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

8.一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1’)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达SIRT1；和

(2’)检测所述体系中SIRT1对于外泌体的调控作用；若所述候选物质在统计学上促进SIRT1对于外泌体的合成、释放或活性的下调作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

9.特异性识别或扩增SIRT1的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的SIRT1为基质细胞的SIRT1。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括：特异性结合SIRT蛋白的结合分子；特异性扩增SIRT1基因的引物；特异性识别SIRT1基因的探针；或特异性识别SIRT1基因的芯片。

11.衰老细胞分泌的外泌体的应用，用于：

作为调控肿瘤耐药性的靶点；

作为筛选调控肿瘤耐药性的物质的靶点；

作为肿瘤诊断或预后的标志物；或

制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂；

较佳地，所述的衰老细胞为衰老的基质细胞。

12.抑制衰老细胞分泌的外泌体合成、释放或活性的试剂的应用，用于：

制备降低肿瘤耐药性的组合物；或

制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒；较佳地，所述药物组合物或药盒中还包括化疗药物。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述抑制衰老细胞分泌的外泌体合成、释放或活性的试剂包括：SIRT1上调剂、ABCB4下调剂。

14.一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体；和

(b)检测所述体系中外泌体的合成、释放或活性；若所述候选物质在统计学上抑制外泌体的合成、释放或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

15.特异性识别衰老细胞分泌的外泌体、外泌体相关标记蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述衰老细胞为衰老的基质细胞。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括：特异性结合外泌体或其相关标记蛋白的结合分子；特异性扩增外泌体相关标记基因的引物；特异性识别外泌体相关标记基因的探针；或特异性识别外泌体相关标记基因的芯片。

17.ABCB4的应用，用于：

作为调控肿瘤耐药性的靶点；

作为筛选调控肿瘤耐药性的物质的靶点；

作为肿瘤诊断或预后的标志物；或

制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂。

18.ABCB4下调剂的应用，用于：

制备抑制衰老细胞分泌的外泌体与肿瘤细胞相互作用的组合物；

制备降低肿瘤耐药性的组合物；或

19.一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，其特征在于，包括：ABCB4下调剂和肿瘤化疗药物。

20.如权利要求18或19，其特征在于，所述的ABCB4下调剂包括：敲除或沉默ABCB4的试剂，抑制ABCB4活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰ABCB4的编码基因表达的干扰分子，针对ABCB4的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将ABCB4进行功能丧失性突变，针对ABCB4化学小分子拮抗剂或抑制剂；或

21.如权利要求18或19，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物的终浓度为：0.01～200μM；较佳地0.05～150μM；更佳地0.08～100μM。

22.一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(i)用候选物质处理一表达体系，该体系表达ABCB4；和

(ii)检测所述体系中ABCB4的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低ABCB4的表达或活性，则表明该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

23.一种筛选降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(i’)用候选物质处理一表达体系，该体系存在衰老细胞且分泌外泌体，同时该体系还表达ABCB4；和

(ii’)检测所述体系中外泌体对于ABCB4的调控作用；若所述候选物质在统计学上减弱外泌体对于ABCB4的调控作用，则该候选物质是降低肿瘤耐药性的潜在物质。

24.特异性识别或扩增ABCB4的试剂的用途，用于制备肿瘤诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的ABCB4为肿瘤细胞的ABCB4。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括：特异性结合ABCB4蛋白的结合分子；特异性扩增ABCB4基因的引物；特异性识别ABCB4基因的探针；或特异性识别ABCB4基因的芯片。