CN114507732B - 一种用于评价组织中细胞衰老特征的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种用于评价组织中细胞衰老特征的组合物及其应用。本发明还公开了一种基于17个细胞衰老核心基因建立的细胞衰老特征定量方法，并应用于评估多种肿瘤患者的生存预后、治疗效果及其相关的应用。该细胞衰老评分系统不仅能够应用于预测肿瘤患者的临床预后，其准确性和特异性优于常规的肿瘤临床分期，而且可以应用于预测肿瘤患者的化学治疗和免疫治疗的效果，进而辅助病人治疗方案的选择，避免过度治疗、降低医疗成本，实现精准个体化医疗的目的。

Description

一种用于评价组织中细胞衰老特征的组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，特别是涉及一种用于评价组织中细胞衰老特征的组合物及其用于预测胃癌和其他肿瘤患者生存预后和治疗效果。
背景技术
细胞衰老，是由于严重的细胞内部或外部的损害因子，如致癌基因的激活或DNA损伤化疗药物，触发的细胞周期停止的状态。细胞衰老被认为是机体的一种安全保护程序，通过阻止有害细胞的进一步扩增，来抑制机体肿瘤的发生。然而，另一方面,最近的研究发现衰老细胞可以分泌大量的细胞因子和生长因子,包括白细胞介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8),称为衰老相关分泌表型(SASP)。通过这种分泌表型，衰老细胞能够引起局部组织微环境的免疫抑制和高代谢特征,进而促进肿瘤的生长和化疗抵抗。相反，衰老细胞分泌的因子也可以通过自分泌或旁分泌的方式触发衰老，来发挥抗肿瘤作用。因此，细胞衰老在肿瘤的发生发展和治疗反应中发挥着重要的作用。但是目前仍然缺乏肿瘤组织中细胞衰老特征的定量评估方法。目前,虽然存在一系列特征，例如细胞的大小和形态变化、细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶和CDK抑制剂CDKN2A基因表达的增加,以及DNA损伤修复反应的增强,来区分衰老细胞和正常细胞,但衰老细胞的独有的标志物仍然缺乏,这也阻碍干预衰老细胞的进程。
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在所有癌症中排名第五位，死亡率位居恶性肿瘤死亡率的第三位。化学治疗是胃癌患者的主要治疗策略之一，特别是对晚期的胃癌患者。然而，尽管在相同的临床分期或病理类型下，胃癌患者的化疗反应和临床预后仍存在相当大的差异，这就强调需要新的预测标志物，来进一步辅助临床分期和病理组织学分类。随着高通量技术的快速发展，癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)建立了胃癌的分子亚型，包括微卫星不稳定(MSI)、基因组稳定(GS)、染色体不稳定(CIN)、EB病毒相关(EBV)和高突变单核苷酸变异(HM-SNV)五个亚型，以及亚洲癌症研究组织(ACRG)也建立了微卫星稳定(MSS)/上皮-间充质转化(EMT)、MSI、MSS/p53+和MSS/p53四种亚型。然而，这种分子分型在临床转化中面临巨大的障碍和局限性，因此需要研发一种更简单可行的评分系统。
近年来，以免疫检查点(PD-1/PD-L1)抑制剂为代表的免疫治疗在多种实体癌症患者中产生持久的抗肿瘤效果。然而，只有一小部分癌症患者对免疫治疗有效，这就也需要开发新的生物标志物来指导用药的选择。目前的研究揭示多种肿瘤特征，如以MSI或肿瘤突变负荷状态为指征的基因组不稳定性和肿瘤微环境中的肿瘤浸润免疫细胞，与临床治疗中的患者免疫治疗效果相关。也有临床研究发现老年肿瘤患者更趋向于从免疫治疗中获益，提示衰老可能与免疫治疗效果有关。但是目前仍没有一种细胞衰老的评价指标能够预测肿瘤患者的免疫治疗效果。
发明内容
本发明提供一种用于评价组织中细胞衰老特征的组合物及其应用，解决现有技术中没有简单可行的细胞衰老评分系统，也没有一种细胞衰老的评价指标能够预测肿瘤患者的免疫治疗效果的问题。
本发明提供一种用于评估组织中细胞衰老特征的组合物，包括如下A1-A17中的至少一种，其中，
A1)用于检测ADH1B基因表达量的物质；
A2)用于检测ABCA8基因表达量的物质；
A3)用于检测IGFBP6基因表达量的物质；
A4)用于检测NDN基因表达量的物质；
A5)用于检测CRYAB基因表达量的物质；
A6)用于检测C7基因表达量的物质；
A7)用于检测SPARC基因表达量的物质；
A8)用于检测COL1A2基因表达量的物质；
A9)用于检测COL3A1基因表达量的物质；
A10)用于检测TNFAIP2基因表达量的物质；
A11)用于检测SNCA基因表达量的物质；
A12)用于检测MAPK10基因表达量的物质；
A13)用于检测ADARB1基因表达量的物质；
A14)用于检测EZH2基因表达量的物质；
A15)用于检测IL1A基因表达量的物质；
A16)用于检测IL6基因表达量的物质；
A17)用于检测SERPINE1基因表达量的物质。
进一步，所述组合物包括A1、A7、A10、A14、A15和A17。
上述物质可以试剂盒也可以是试剂组合物，例如，可以为多重免疫荧光免疫组化采用珀金埃尔默公司(PerkinElmer)的Opal7色免疫组化试剂盒配合相应基因的抗体。也可以直接使用Illumina mRNA样本准备试剂盒(Part#1004898,RevA:Illumina,San Diego,CA)构建测序文库，通过Illumina GAIIX Genome Analyzer仪器测序获得转录组数据。下机的原始的转录组数据再经过基因组比对，转录组比对和基因表达定量获得组织样本的基因表达矩阵。
上述的组合物在如下任一中的应用也应在本发明的保护范围之内：
P1)制备评估组织中细胞衰老特征的产品中的应用；
P2)制备评价肿瘤患者的临床预后的产品中的应用；
P3)制备评预测胃癌患者的病理类型和肿瘤突变负荷的产品中的应用；
P4)制备预测胃癌患者的化疗治疗的效果的产品中的应用；
P5)制备评价肿瘤患者免疫治疗效果的产品中的应用。
本发明还提供一种系统所述系统包括检测组件和分析模块，所述检测组件用于检测待测样品的基因表达量数据并将基因表达量数据传输给分析模块；所述分析模块接收检测组件传递来的基因表达量数据并根据基因表达量数据计算衰老评分；所述基因表达量数据为ADH1B基因、ABCA8基因、IGFBP6基因、NDN基因、CRYAB基因、C7基因、SPARC基因、COL1A2基因、COL3A1基因、TNFAIP2基因、SNCA基因、MAPK10基因、ADARB1基因、EZH2基因、IL1A基因、IL6基因和SERPINE1基因中的至少一种的表达量数据。
其中，所述基因表达量数据为ADH1B基因、IL1A基因、TNFAIP2基因、EZH2基因、SPARC基因和SERPINE1基因的表达量数据。
所述分析模块用于利用所述检测装置得到的检测数据根据细胞衰老评分模型得到衰老评分，所述细胞衰老评分模型为
Figure GDA0003877648830000031
其中，n表示涉及的基因的个数，n为1-17中的任意自然数。
进一步，所述细胞衰老评分模型为
Figure GDA0003877648830000032
其中，n为6，六个基因分别为ADH1B、IL1A、TNFAIP2、EZH2、SPARC和SERPINE1。
上述的系统在如下任一中的应用也应在本发明的保护范围之内：
P1)制备评估组织中细胞衰老特征的产品中的应用；
P2)制备评价肿瘤患者的临床预后的产品中的应用；
P3)制备评预测胃癌患者的病理类型和肿瘤突变负荷的产品中的应用；
P4)制备预测胃癌患者的化疗治疗的效果的产品中的应用；
P5)制备评价肿瘤患者免疫治疗效果的产品中的应用。
进一步，所述分析模块还用于然后根据衰老评分对待评估者的B1-B5任一所述的情况进行评级：
B1)待评估者的组织中细胞衰老特征；
B2)待评估者的的临床预后情况；
B3)待评估者的胃癌的病理类型和肿瘤突变负荷；
B4)待评估者的的化疗治疗的效果；
B5)待评估者的免疫治疗效果；
所述系统可以为为如下C1-C5中的任一个：
C1)评估组织中细胞衰老特征的系统；
C2)评价肿瘤患者的临床预后的系统；
C3)评预测胃癌患者的病理类型和肿瘤突变负荷的系统；
C4)预测胃癌患者的化疗治疗的效果的系统；
C5)评价肿瘤患者免疫治疗效果的系统。
本发明还要求保护一种标志物在如下任一中的应用，所述标志物为ADH1B基因、ABCA8基因、IGFBP6基因、NDN基因、CRYAB基因、C7基因、SPARC基因、COL1A2基因、COL3A1基因、TNFAIP2基因、SNCA基因、MAPK10基因、ADARB1基因、EZH2基因、IL1A基因、IL6基因和SERPINE1基因中的至少一种：
P1)制备评估组织中细胞衰老特征的产品中的应用；
P2)制备评价肿瘤患者的临床预后的产品中的应用；
P3)制备评预测胃癌患者的病理类型和肿瘤突变负荷的产品中的应用；
P4)制备预测胃癌患者的化疗治疗的效果的产品中的应用；
P5)制备评价肿瘤患者免疫治疗效果的产品中的应用。
所述标志物为ADH1B基因、IL1A基因、TNFAIP2基因、EZH2基因、SPARC基因和SERPINE1基因。
本发明应用国际通用的肿瘤数据库，首先以胃癌为出发点，通过胃癌组织相对于正常组织的差异表达分析和预后分析，并结合分子特征基因集数据库中所有细胞衰老的基因集，确定了17个细胞衰老特征标志物。然后利用最小绝对值收敛和选择算子、套索算法(LASSO算法)建立评分系统，并成功应用于胃癌患者的生存预后和治疗反应的预测。进一步，该衰老评分系统成功地扩展应用于多种其他肿瘤患者临床预后和免疫治疗效果的预测。此方法可用于辅助预测肿瘤患者治疗效果，帮助判断患者是否从化疗和免疫治疗中获益，进而协助病人治疗方法的选择，避免过度用药，降低医疗成本。
与目前已有的技术相比，本发明首次开发细胞衰老的评分系统，首次将细胞衰老特征引入胃癌的分型和预后评价中。进一步，本发明的系统能够预测多种肿瘤患者的预后和治疗效果，判断患者是否从化疗和免疫治疗中获益，从而强化治疗方案的选择、避免过度治疗，降低医疗成本，最终达到个性化医疗的目的。
附图说明
图1:胃癌衰老亚型与患者的生存预后和肿瘤突变负荷有关。A图不同衰老亚型之间细胞衰老相关基因集富集程度存在显著差异；B图衰老亚型与患者的生存预后相关；C图不同的衰老亚型患者之间肿瘤突变密度存在显著的差异。
图2:Kaplan-Meier生存曲线显示不同衰老评分的胃癌患者之间总生存存在显著差异。
图3：衰老评分与胃癌患者化疗的效果有关。A图高衰老评分组化疗与未化疗病人生存无显著的差异；B图低衰老评分组化疗与未化疗病人生存存在显著的差异。
图4：衰老评分与胃癌患者的分子分型、突变负荷、病理类型和MSI状态有关。图A，不同胃癌分子亚型的衰老评分存在显著差异；图B，衰老评分和突变负荷存在显著的正相关；图C，不同胃癌的病理类型间衰老评分存在显著差异；图D，不同基因组不稳定状态的胃癌患者之间衰老评分存在显著差异。
图5：衰老评分应用于胃癌组织芯片样本生存预后的预测。图A，Kaplan-Meier生存曲线显示通过多色免疫组化技术获得的细胞衰老评分与胃癌患者的生存预后相关。图B，曲线下面积(AUC)比较衰老评分和临床分期对患者生存预后预测的准确性和特异性。
图6:Kaplan-Meier生存曲线结果显示在结直肠癌(图A)和食管癌(图B)中不同的衰老评分的患者生存预后存在显著的差异。
图7：细胞衰老评分与晚期黑色素瘤和泌尿上皮肿瘤患者的免疫治疗反应有关。图A，生存曲线结果显示高衰老评分的病人接受抗PD1/PD-L1单克隆抗体免疫治疗预后较好。图B，高衰老评分肿瘤患者接受免疫治疗效果响应率高。
具体实施方式
在下文中结合一些具体的实施方案对本发明作进一步的示例性描述，应当理解，下面的这些实施例用于说明本发明而非限定本发明的范围，任何形式上的变动和/或变通都将落入本发明的保护范围之内。
本发明提供一种用于评估组织中细胞衰老特征的基因和评分系统。本发明包括了17个细胞衰老基因及其用于衰老亚型的确定，细胞衰老评分系统用于预测临床预后和治疗效果包括化疗和免疫治疗。
作为优选方案，我们开发了一种多步骤的策略，来建立组织中细胞衰老特征的方法。首先利用癌症基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA),通过正常和胃癌组织之间的差异表达分析,确定了在胃癌组织中显著差异表达的3225个基因，其中上调的1455个，下调的1770个。
进一步，我们利用单因素比例风险回归分析(单因素cox回归分析)确定影响患者预后的基因，最后结合分子特征基因集数据库中所有细胞衰老相关的基因集确定17个胃癌衰老特征核心标志物，具体包括：ADH1B、ABCA8、IGFBP6、NDN、CRYAB、C7、SPARC、COL1A2、COL3A1、TNFAIP2、SNCA、MAPK10、ADARB1、EZH2、IL1A、IL6、SERPINE1，基因的具体信息见表1。
表1. 17个细胞衰老标志物的具体基因信息
Figure GDA0003877648830000061
Figure GDA0003877648830000071
在本发明中，为了更好地评价细胞衰老特征核心标志物的应用价值，我们利用无监督的聚类算法，根据17个细胞衰老标志物的表达水平，能够将胃癌患者分为2个完全不同的亚型。其中，亚型2为衰老亚型，表现为更显著地细胞衰老通路的激活，更高的肿瘤突变负荷以及更长的总生存期(详见实施例1，图1)。
利用上述的17个细胞衰老核心标志物，我们利用最小绝对值收敛和选择算子、套索算法，筛选获得最优的基因数量构建衰老评分系统，最终确定6个基因分别是ADH1B、IL1A、TNFAIP2、EZH2、SPARC、SERPINE1。该评分系统，英文名称为senescore，结合上述6个基因表达值以及由算法所获得的回归系数，计算公式如下：
Figure GDA0003877648830000072
注：具体数据见表一。基于17个细胞衰老标志物和算法依据不同的训练数据集，该回归系数和基因的组成可以发生细微变动。
采用上述的衰老评分系统，在癌症基因组数据库和基因表达汇编数据库(GeneExpressionOmnibus database，GEO数据库)的数据中验证评估患者的生存预后均获得令人满意的结果。在TCGA胃癌的数据中，如果衰老评分≤0.68，我们定义为低衰老评分；反之，衰老评分>0.68，我们定义为高衰老评分。图2显示高衰老评分比低衰老评分总生存时间显著延长。而且，胃癌组织衰老评分与细胞衰老通路和DNA损伤修复通路等的激活程度呈正相关性。
进一步，该衰老评分系统可以用于预测胃癌患者的治疗反应。从GEO数据库中收集获得胃癌患者化疗队列的临床信息和表达谱数据，利用上述衰老评分系统对每一位患者打分，采用评分的中位数划分高衰老评分组和低衰老评分组。其中，在低衰老评分组中，接受化疗的患者总生存时间比未接受化疗的患者显著延长；而在高衰老评分组中，化疗并不能延长患者的总生存时间(见实施例3，图3)。而且，在接受免疫治疗的患者中，高衰老评分的患者比低衰老评分的患者生存时间长。
在本发明中，我们根据不同的检测技术平台，包括但不限于实时荧光定量PCR、基因芯片、转录组测序、多重荧光免疫组织化学技术，通过采用胃癌和其他肿瘤患者组织样本，包括但不限于新鲜活检组织，术后组织和石蜡包埋的组织，设计相应的检测试剂盒以及相应的评分系统。本发明中衰老评分高低的分界值可依不同的检测技术平台而不同，需要分别确定。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明提供一种用于评估组织中细胞衰老特征的基因和评分系统。本发明包括了17个细胞衰老基因及其用于衰老亚型的确定，细胞衰老评分系统用于预测临床预后和治疗效果包括化疗和免疫治疗。
作为优选方案，本发明开发了一种多步骤的策略，来建立组织中细胞衰老特征的方法。首先利用癌症基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA),通过正常和胃癌组织之间的差异表达分析,确定了在胃癌组织中显著差异表达的3225个基因，其中上调的1455个，下调的1770个。
进一步，本发明利用单因素比例风险回归分析(单因素cox回归分析)确定影响患者预后的基因，最后结合分子特征基因集数据库(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中所有细胞衰老相关的基因集确定17个胃癌衰老特征核心标志物，具体包括：ADH1B、ABCA8、IGFBP6、NDN、CRYAB、C7、SPARC、COL1A2、COL3A1、TNFAIP2、SNCA、MAPK10、ADARB1、EZH2、IL1A、IL6、SERPINE1。
利用上述的17个细胞衰老核心标志物，结合最小绝对值收敛和选择算子、套索算法，筛选获得最优的基因数量构建衰老评分系统，最终确定6个基因分别是ADH1B、IL1A、TNFAIP2、EZH2、SPARC、SERPINE1。该评分系统，英文名称为senescore，结合上述6个基因表达值以及由算法所获得的回归系数，计算公式如下：
Figure GDA0003877648830000091
注：具体数据见表2。
上述公式也可以进一步扩展为基于17个细胞衰老标志物和算法依据不同的训练数据集，该回归系数和基因的组成可以发生细微变动。
表2、衰老评分计算公式中的基因和对应的回归系数
基因 NCBI Entrez ID 回归系数
ADH1B 125 0.0394
IL1A 3552 0.0515
TNFAIP2 7127 -0.1386
EZH2 2146 -0.0473
SPARC 6678 0.0100
SERPINE1 5054 0.1513
采用上述的衰老评分系统，在开源的癌症基因组数据库(TCGA数据库，https://portal.gdc.cancer.gov/)和基因表达汇编数据库(Gene Expression Omnibus database，GEO数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的数据中验证评估患者的生存预后均获得令人满意的结果。在TCGA胃癌的数据中，利用上述6个基因的衰老评分系统对每例胃癌患者打分，计算所有患者衰老评分的中位数为0.68，作为分组界值。如果患者的衰老评分≤0.68，定义为低衰老评分；反之，将衰老评分>0.68，定义为高衰老评分。
在本发明中，可以根据不同的检测技术平台，包括但不限于实时荧光定量PCR、基因芯片、转录组测序、多重荧光免疫组织化学技术，通过采用胃癌和其他肿瘤患者组织样本，包括但不限于新鲜活检组织，术后组织和石蜡包埋的组织，设计相应的检测试剂盒以及相应的评分系统。本发明中衰老评分高低的分界值可依不同的检测技术平台而不同，需要分别确定。
实施例117个细胞衰老标志物的应用
为了更好地评价细胞衰老特征核心标志物的应用价值，17个细胞衰老标志物应用于374例TCGA数据库胃癌患者组织样本细胞衰老特征和临床预后的分析。TCGA数据库提供了胃癌患者的转录组数据及其对应的患者的临床信息。该数据库胃癌患者转录组数据是利用illumina公司的转录组测序平台，检测了胃癌患者手术切除的胃癌组织样本的基因表达水平。
首先，将基因表达矩阵输入开源的R语言软件(版本3.6.1，https://www.r-project.org/)，提取所有患者17个细胞衰老标志物的表达值，基于欧式距离和无监督的聚类方法(Ward's linkage method)，采用pheatmap R包(版本1.0.12)对胃癌患者进行无监督聚类。聚类的数量及其稳定性被确定通过NbClust R包(版本3.0)，该R包提供了30个确定聚类数量的指标，以提出最佳的聚类方案。分析结果显示聚类数为2时取得最佳的聚类效果，说明该胃癌队列患者可以分成2个完全不同的亚型。
为了分析不同亚型患者之间的细胞衰老特征，我们使用基因集变异分析方法，通过GSVAR包(版本1.34.0)对胃癌患者的基因表达谱进行细胞衰老相关基因集富集分析，包括基因本体(GO)数据库下的细胞衰老基因集(GO:0090398)、Reactome信号通路数据库下的细胞衰老基因集(R-HSA-2559583)和衰老相关炎症表型基因集(SASP,R-HSA-2559582)。威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon Signed Rank Test)比较两个亚型之间衰老相关基因集富集的差异，结果如图1A所示亚型2与亚型1相比存在显著的细胞衰老通路的激活，提示亚型2为衰老亚型。
从TCGA数据库获取上述胃癌患者的临床信息，包括预后信息和基因组突变特征。Kaplan-Meier方法分析比较不同亚型患者之间的生存差异，结果如图1B所示亚型2的患者具有更长的总生存时间(p＝0.024)。此外，对两个亚型之间肿瘤突变负荷进行比较，结果如图1C所示亚型2的患者具有更高的突变密度。
实施例2、采用TCGA数据库胃癌患者的转录组数据系统验证衰老评分：
将表2的回归系数对应的衰老评分系统应用于374例具有临床信息的胃癌患者预后分析。胃癌患者手术后切除的肿瘤组织提取RNA，利用illumina公司的转录组测序平台进行基因表达水平的检测。从胃癌组织的转录组数据中提取计算衰老评分所需要的6个基因表达值，然后带入到衰老评分计算公式，获得每一位患者的衰老评分。根据所有患者评分的中位值作为分界值分成2组。将衰老评分≤0.68定义为低衰老评分；将衰老评分>0.68定义为高衰老评分。
首先衰老评分被用于预测患者的生存概率。将胃癌患者的高或者低衰老评分的分组结果以及临床预后信息包括总生存时间和生存状态输入开源的R语言软件(版本3.6.1，https://www.r-project.org/)，接着用survival包(版本3.2-10)里面的Surv函数创建生存数据对象(主要输入生存时间和生存状态)，再用survival包的survfit函数对生存数据对象拟合生存函数，创建Kaplan-Meier生存曲线，使用survminerR包(版本0.4.9)的ggsurvplot函数获得图2所示Kaplan-Meier生存曲线，从图2可以看出高衰老评分的患者生存时间显著长于低衰老评分的患者。
其次，结合胃癌数据集提供的患者的分子分型、突变密度、病理类型和微卫星不稳定状态的信息，通过威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon Signed Rank Test，用于比较2组变量)和克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test，用于比较2组以上的变量)比较不同分子分型、突变密度、病理类型和微卫星不稳定状态之间患者的细胞衰老评分的差异，并使用R语言软件(版本3.6.1)的ggplot2包(版本3.3.3)绘制图4展示比较结果。如图4结果所示高衰老评分的胃癌患者具有较高的概率为微卫星不稳定、染色体不稳定或EB病毒相关的亚型，病理类型为肠型胃癌，并且具有较高的肿瘤突变负荷；而低衰老评分的患者更高的概率为基因组稳定的亚型，病理类型为印戒细胞癌。说明该衰老评分可以用于预测胃癌患者的分子分型、病理类型和突变负荷。
实施例3、应用胃癌患者的组织芯片采用多重免疫荧光免疫组化技术验证衰老评分预测患者临床预后：
利用胃癌患者的组织芯片(购自上海芯超生物科技有限公司，编号HStmAde180Sur05)，采用多重免疫荧光免疫组化技术对衰老评分系统中的6个衰老标志物进行抗体染色、成像和定量。多重免疫荧光免疫组化采用珀金埃尔默公司(PerkinElmer)的Opal 7色免疫组化试剂盒，货号No.NEL811001KT。6个衰老标志物的抗体物质具体来源可如下：IL-1A抗体购自Proteintech公司，货号：No.16765-1-AP；ADH1B抗体购自Proteintech公司，货号：No.17165-1-AP；SERPINE1抗体购自ABclonal公司，货号：No.A14758；SPARC抗体购自ABclonal公司，货号：No.A14494；EZH2抗体购自ABclonal公司，货号：No.A19577；TNFAIP2抗体购自Signal Antibody公司，货号：No.40163。具体步骤如下：
一、多重免疫荧光免疫组化染色
1.脱蜡和复水：组织芯片置于烤箱65度拷片1小时，然后放入二甲苯溶液中浸泡15分钟。使用梯度浓度乙醇复水：100％乙醇浸泡5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇浸泡5分钟。1×TBST溶液(1×TBS，0.1％Tween20(体积百分含量))浸泡5分钟。
2.抗原修复：将玻片置于500ml柠檬酸钠抗原修复液(博世德公司，货号：AR0024)中，放入微波炉中高火5—6分钟至溶液微沸腾，低火15分钟。然后冷却至室温。
3.抗原封闭：5％牛血清白蛋白溶液(质量百分含量)滴加到组织芯片上，使其完全覆盖，保湿孵育30分钟。
4.染一抗：将稀释的一抗抗体滴加到组织芯片上，常温保湿孵育1小时或者4度孵育过夜。
5.HRP二抗孵育：将HRP标记的二抗(来自Opal7色免疫组化试剂盒)滴加到样本上，保湿孵育10分钟。1×TBST溶液浸泡5分钟。
6.酪酰胺信号放大(TSA)染色：将TSA染料(来自Opal7色免疫组化试剂盒)滴加到组织样本上，保湿孵育10分钟。
7.微波处理：具体操作同步骤2
8.重复步骤3—6，复染第二种抗体和对应不同的TSA染料。然后再继续重复上面步骤复染其余4种抗体。
9.以含DAPI的封片剂(中杉金桥，货号ZLI-9557)封片
二、多重免疫荧光免疫组化结果图像采集和分析
1.衰老标志物多重染色成像：使用PerkinElmer公司的Vectra Polaris仪器对组织芯片进行拍照，采集图像(20×物镜)；
2.多重荧光图像拆分：使用Nuance system(PerkinElmer公司)构建的每个单光谱的数据集并进行光谱拆分，获得每一个光谱的染色图片。
3.标志物表达定量分析：临床病理医师对每例样本的每个标志物染色的灰度和范围进行打分。染色灰度分级评分为0分(阴性)、1分(弱)、2分(中等)、3分(强)。染色阳性范围评分主要依据阳性面积的百分比：0分(阳性面积小于5％)；1分(阳性面积的比例为5％-25％)；2分(26％-50％)；3分(51％-75％)；4分(大于75％)。每一个标志物的评分为染色灰度评分和阳性面积评分的乘积。
然后，将6个标志物的表达水平评分输入衰老评分系统获得细胞衰老评分，再对所有患者的衰老评分进行标准化和均一化。根据评分的中位值0.97作为分界值，将所有患者分成高或者低衰老评分组，患者的衰老评分≤0.97，定义为低衰老评分；反之，将衰老评分>0.97，定义为高衰老评分。
上述用于染色的胃癌组织芯片共包含90例胃癌患者的肿瘤组织及相应患者的临床信息和随访信息，肿瘤组织来源于患者胃癌手术。10例样本由于染色过程中的脱片导致无法进行下游分析，最终有80例样本进行生存分析。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，根据上述衰老分组和预后信息分析结果如图5A所示：高衰老评分的患者生存时间显著长于低衰老评分的患者。此外，与单一衰老标志物的表达水平对生存预后的预测结果相比，6个衰老标志物组合的细胞衰老评分具有更显著预后预测能力。更重要的是，与肿瘤临床分期相比，衰老评分系统表现出更高的准确性和特异性(如图5B所示)。
实施例4、细胞衰老评分分别应用于预测TCGA数据库中结直肠癌和食管癌患者的临床预后：
利用TCGA数据库中617例结直肠癌和161例食管癌患者的转录组数据和临床预后信息计算患者的衰老评分。该数据库中提供的转录组测序数据是来自于肿瘤患者手术后的肿瘤组织样本。肿瘤组织通过常规方法提取RNA，再使用IlluminamRNA样本准备试剂盒(Part#1004898,Rev A:Illumina,San Diego,CA)构建测序文库，通过Illumina GAIIXGenome Analyzer仪器测序获得转录组数据。下机的原始的转录组数据再经过基因组比对，转录组比对和基因表达定量获得组织样本的基因表达矩阵。
从转录组基因表达矩阵中提取6个衰老标志物的表达值，带入衰老评分计算公式，获得每位患者的衰老评分。再分别根据结直肠癌和食管癌患者的衰老评分进行分组，Kaplan-Meier方法比较生存预后的差异，结果如图6所示高衰老评分的患者生存时间显著长于低衰老评分的患者。因此，医生可以根据细胞衰老评分高低预测结直肠癌和食管癌患者预后。
实施例5、应用GEO数据库胃癌患者基因表达谱数据结合临床信息验证衰老评分预测化疗治疗效果：
采用GEO数据库GSE26899、GSE26901和GSE13861数据集共267例胃癌患者的数据，应用衰老评分预测化疗治疗效果。这三个数据集包括患者的基因表达谱数据和临床信息。基因表达谱数据是由illumina公司的表达谱芯片检测获得。在入组队列267例胃癌患者中，有80例患者接受了术后辅助化疗(5-氟尿嘧啶单药或5-氟尿嘧啶与顺铂/奥沙利铂、阿霉素或紫杉醇的联合用药)。本发明根据每位患者的6个基因的表达值计算衰老评分，获得每一位患者的细胞衰老得分。根据每个数据集中患者的评分的中位值作为分界值分成2组。Kaplan-Meier方法分析结果如图3B所示在低衰老评分组中，接受化疗的患者总生存时间显著长于未接受化疗的患者(P＝0.0049)；而在高衰老评分组中，化疗并不能延长患者的总生存时间(P＝0.47)(如图3A所示)。
实施例6、应用细胞衰老评分预测晚期黑色素瘤和晚期尿路上皮肿瘤病人对PD-1/PD-L1抑制剂治疗的效果。
整合GEO数据库GSE91061数据集51例接受纳武单抗免疫治疗的晚期黑色素瘤患者和IMvigor210队列348例接受抗PD-L1单克隆抗体治疗的晚期尿路上皮肿瘤病人的表达谱数据和临床信息。GEO数据库GSE91061数据集的基因表达数据是检测的51例晚期黑色素瘤患者免疫治疗前活检的肿瘤组织样本。肿瘤组织样本提取RNA，通过Illumina公司的基因测序平台，获得基因的转录组数据。IMvigor210队列患者的基因表达数据和临床信息具体记载于“TGFβattenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing toexclusion of T cells.Nature,2018.554(7693):544-548.doi:10.1038/nature25501”一文中，数据的下载地址如下http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies/。IMvigor210队列的基因表达数据是来自348例晚期尿路上皮肿瘤病人肿瘤组织样本，使用Illumina公司的TruSeq RNA检测技术(TruSeq RNA Access technology)检测获得。
首先，我们从样本的基因表达数据中获取6个衰老标志基因ADH1B、IL1A、TNFAIP2、EZH2、SPARC、SERPINE1基因的表达值，根据上述细胞衰老评分模型计算每位病人的衰老评分，根据临床信息中的生存信息，通过survminer R包(版本0.4.9)的surv_cutpoint函数获得最适分界阈值，将患者进行分组，高于分界阈值患者为高衰老评分组，低于分界阈值为低衰老评分组。Kaplan-Meier方法分析生存差异如图7所示，高衰老评分患者免疫治疗总生存比低衰老评分的延长，而且在高衰老评分的患者中，治疗响应的患者所占的比例较高(如图7所示)。因此，对于衰老评分高的患者，医生可以预测该患者可对免疫治疗效果好，可以酌情先使用免疫治疗。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (2)

1.一种系统，其特征在于，所述系统包括检测组件和分析模块，所述检测组件用于检测待测样品的基因表达量数据并将基因表达量数据传输给分析模块；所述分析模块接收检测组件传递来的基因表达量数据并根据基因表达量数据计算衰老评分；所述基因表达量数据为ADH1B基因、IL1A基因、TNFAIP2基因、EZH2基因、SPARC基因和SERPINE1基因的表达量数据；
所述分析模块用于利用所述检测组件得到的基因表达量数据根据细胞衰老评分模型得到衰老评分，所述细胞衰老评分模型为
Figure FDA0003952956940000011
其中，n表示涉及的基因的个数，n为6，六个基因分别为ADH1B、IL1A、TNFAIP2、EZH2、SPARC和SERPINE1；
所述回归系数分别为：所述基因ADH1B的回归系数为0.0394，所述基因IL1A的回归系数为0.0515，所述基因TNFAIP2的回归系数为-0.1386，所述基因EZH2的回归系数为-0.0473，所述基因SPARC的回归系数为0.0100，所述基因SERPINE1的回归系数为0.1513。
2.权利要求1所述的系统在如下任一中的应用：
P1)制备评估组织中胃癌组织细胞衰老特征的产品中的应用；
P2)制备评价胃癌、结直肠癌、食管癌患者的临床预后的产品中的应用；
P3)制备预测胃癌患者的病理类型和肿瘤突变负荷的产品中的应用；
P4)制备预测胃癌患者的术后辅助化疗治疗的效果的产品中的应用；
P5)制备评价晚期黑色素瘤、晚期尿路上皮肿瘤患者免疫治疗效果的产品中的应用。
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