ES2313734T3 - Tak1 humana y adn que la codifica. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA QUINASA ACTIVADA POR TGF- BE , QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA AMINOACIDA COMPRENDIDA ENTRE LA MET EN POSICION 1 Y LA SER EN POSICION 579, COMO SE MUESTRA EN SEQ ID NO: 5, ASI COMO UN ADN QUE CODIFICA PARA LA MISMA.
Description
TAK1 humana y ADN que la codifica.
Se describe una quinasa (quinasa 1 activada por
el factor-\beta de crecimiento transformante
(TGF-\beta); TAK1) portadora del sistema de
transducción de señal de la familia del TGF-\beta,
cuya quinasa está activada por TGF-\beta, un
método para producir la quinasa, y un gen humano que codifica la
quinasa. TAK1, a la que se hace referencia también como el
activador de la quinasa MAPK (AMK-1), es una enzima
que es activada por TGF-\beta y BMP (proteína
morfogénica del hueso) y que fosforila y activa por ello la quinasa
MAPK.
Los receptores de la superfamilia del
TGF-\beta contienen quinasa con Ser/Thr en el
dominio intracelular y están divididos en tipo I que posee una
secuencia repetida de Gly y Ser (caja GS) en el extremo amino
terminal y cerca del dominio transmembranal, y tipo II que no tiene
la caja GS. Se opina, en el caso del TGF-\beta,
que éste forma un complejo con el receptor de tipo I después de que
un ligando se ha unido al receptor de tipo II, ya que una quinasa
forsforilada constitutivamente del receptor del tipo II, fosforila
la vecindad de la caja GS del receptor de tipo I, activando con
ello el receptor de tipo I con lo que una señal procedente del
ligando anterior es transmitida a la célula. Sin embargo, poco se
sabe acerca de las moléculas de señalización aguas abajo de este
receptor.
Para la levadura de gemación eucariótica
Saccharomyces cereviceae, se sabe, como una cascada de
transducción de la señal en que una feromona extracelular de
apareamiento causa conjugación, que la feromona de apareamiento
activa una proteína G, que a su vez activa la quinasa MAPKK (MAPKKK)
(Ste11), y la MAPKKK fosforila y activa la quinasa MAPK (MAPKK), y
luego la MAPKK así activada (Ste7) fosforila y activa una quinasa
MAP (quinasa proteína activada por mitógeno; MAPK). y finalmente la
MAPK activa la proteína FUS1 iniciando la conjugación celular.
Como tal MAPKKK, se ha conocido hasta este
punto la TAK1 (quinasa 1 activada por TGF-\beta)
que deriva del ratón (K. Yamaguchi et al., Science (1995)
270, 2008-2011).
La presente invención pretende proporcionar un
factor nuevo del sistema de señalización del receptor de
TGF-\beta de mamífero, cuyo factor está
localizado aguas abajo de dicho receptor y que está implicado en
dicho sistema de señalización; un gen que codifica dicho factor; y
un método para producir dicho factor.
En los esfuerzos llevados a cabo para resolver
los problemas anteriores, los solicitantes de la presente invención
han tenido éxito en insertar un ADNc derivado del hombre en la
levadura Saccaromyces cereviceae que es deficiente con
respecto a la actividad de MAPKKK (Ssk2/Ssk22, ShoI) de la cascada
de transducción de la señal de la feromona de apareamiento
anterior, seleccionar ADNcs que pueden complementar la MAPKKK de
deficiente actividad y clonar ADNcs que pueden complementar la
MAPKKK de deficiente actividad, y con ello han conseguido la
presente invención.
Así pues, se describe un polipéptido que posee
actividad de quinasa que es activada por el factor de crecimiento
transformante (TGF-\beta), cuyo polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos desde Ser en la posición 23 a
Ser en la posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
Se describe un polipéptido que posee actividad
de quinasa que es activada por TGF-\beta, cuyo
polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos desde Met en la
posición 1 a Ser en la posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID
NO: 5.
Se describe también ADN que codifica un
polipéptido que posee actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo polipéptido comprende una
secuencia de aminoácidos desde Ser en la posición 23 a Ser en la
posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
También se describe ADN que codifica un
polipéptido que posee actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo ADN comprende una secuencia de
ácidos nucleicos desde T en la posición 249 a A en la posición 1919,
indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
También se describe ADN que codifica un
polipéptido que posee actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo polipéptido comprende una
secuencia de aminoácidos desde Met en la posición 1 a Ser en la
posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
También se describe ADN que codifica un
polipéptido que posee actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo ADN comprende una secuencia de
ácidos nucleicos desde A en la posición 183 a A en la posición
1919, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
La presente invención proporciona también un
vector que comprende uno de los ADNs antes citados, una célula
huésped transformada con un vector que comprende uno de los ADNs
antes citados, y un método para producir un polipéptido que posee
actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo método comprende cultivar una
célula huésped transformada con un vector que comprende uno de los
ADNs antes citados, y recuperar después un producto desde el
cultivo.
También se describe un polipéptido que posee
actividad de quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuyo polipéptido es producido por el
método anterior, y una quinasa que es activada por
TGF-\beta, cuya quinasa comprende una secuencia
de aminoácidos desde Ser en la posición 23 a Ser en la posición 579,
indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
La presente invención proporciona también una
proteína de fusión del polipéptido anterior, proteína y otra
proteína.
La Fig. 1 muestra el vector de expresión de
levadura pNV11.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra los efectos
de la adición de TGF-\beta sobre la expresión de
diversos genes de TAK1, evaluada usando un gen de luciferasa como
gen informador.
La Fig. 3 es una gráfica que muestra los efectos
de TGF-\beta y BMP-4 sobre la
actividad de un gen de TAK-1 en células
MC3T3-E1, medidos mediante un método de
inmunoprecipitación y un método asociado a quinasas.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra los efectos
de varias concentraciones de TGF-\beta o
BMP-4 sobre la actividad de la quinasa TAK1 en las
células transfectadas con el gen HA-TAK1.
TAK1\DeltaN muestra el resultado obtenido cuando las células
transfectadas con el gen TAK1\DeltaN no eran estimuladas por
TGF-\beta ni BMP-4.
La Fig. 5 indica una comparación de la secuencia
de bases de ADN que codifica TAK1 del ratón y la de ADN que codifica
TAK1 humana.
La Fig. 6 indica una comparación de la secuencia
de bases de ADN que codifica TAK1 del ratón y la de ADN que codifica
TAK1 humana.
La Fig. 7 indica una comparación de la secuencia
de bases de ADN que codifica TAK1 del ratón y la de ADN que codifica
TAK1 humana.
La Fig. 8 indica una comparación de la secuencia
de bases de ADN que codifica TAK1 del ratón y la de ADN que codifica
TAK1 humana.
La Fig. 9 indica una comparación de la secuencia
de bases de ADN que codifica TAK1 del ratón y la de ADN que codifica
TAK1 humana.
La Fig. 10 indica una comparación de la
secuencia de aminoácidos de TAK1 del ratón y la de TAK1 humana.
La Fig. 11 indica una comparación de la
secuencia de aminoácidos de TAK1 del ratón y la de TAK1 humana.
Según la presente invención, la clonación del
gen deseado puede detectarse insertando, por ejemplo, un vector de
expresión que comprende un ADNc de mamífero, en una levadura que es
deficiente en la actividad de MAPKKK y que posee un gen informador
detectable con facilidad en el extremo terminal de la cascada, y
después expresando dicho gen informador para detectar la
introducción de ADNc que complementa la deficiente actividad de
MAPKKK. Además, puede usarse otra levadura deficiente en actividad
de Ssk2/Ssk22 y Sho1 y que actúa, por ejemplo, en un sistema de
señalización de alta presión osmótica.
Como un sistema de detección tal, puede usarse
la ruta del MAPK que transmite una señal de la feromona de
apareamiento en el Saccharomyces cereviceae (I. Herskowiz,
Cell, Vol. 80, 187 (1995); D.E. Lein et al., Curr. Opin.
Cell Biol. Vol. 7, 197 (1995); J. Schultz et al., Curr. Opin.
Gene Dev., Vol 5, 31 (1995)) La cascada normal de transducción de
la señal en este sistema consiste en la quinasa Ste11, la quinasa
Ste7 y la quinasa Fus3/Kss1, que corresponden a MAPKKK, MAPKK y
MAPK, respectivamente. Ste11, Ste7 y Fus3/Kss1 actúan
secuencialmente transmitiendo con ello señales al factor de
transcripción Ste12, cuyo Ste12 activa a su vez la transcripción de
un gen específico del apareamiento tal como el FUS1.
Con respecto a la selección de ADNc puede usarse
una cascada que tiene una mutación funcional de Ste7 (STE7^{P368})
y una mutación de deficiencia de Ste11 (Ste11\Delta) en la
cascada anterior (K. Irie et al., Sci3ence, Vol. 265, 1716
(1994)). En este sistema, se ha confirmado que un Raf de mamífero o
un tipo activado de MEKK (Faf\DeltaN ó MEKK\DeltaN,
respectivamente) complementa la deficiencia de actividad del Ste11
de un modo dependiente del Ste^{P368}, cuando es monitorizado
mediante un fenotipo de histidina (His) impartido por el gen
informador FUS1p::HIS3 que corresponde a la ruta de apareamiento.
Así pues, mediante la introducción del ADNc objeto en una levadura
que posee la cascada mutada anterior y detectando el fenotipo de
histidina, puede seleccionarse ADNc que puede complementar a
Ste11\Delta (deficiencia de MAKKK).
Como ADNc objeto puede usarse una genoteca de
ADNc de un origen de mamífero. Por ejemplo, una genoteca de
expresión de ADNc procedente de una línea celular del ratón tal como
la línea celular de ratón BAF-B03. Esta genoteca de
ADNc puede ser obtenida clonando ADNc que corresponde a
poli(A)-RNA desde la línea celular
BAF-B03 pro-\beta dependiente de
IL-3 del ratón, bajo el control del promotor TDH3
del vector de expresión de levadura pNV11. Otro ejemplo de la
genoteca de ADNc objeto para ser usada es una línea celular humana
tal como una genoteca de expresión de ADNc procedente de la línea
celular humana Jurkat.
Se obtuvo un clon positivo seleccionando la
genoteca de ADN anterior usando el sistema de selección anterior.
La secuencia de bases de ADNc de este clon y la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc corresponden a los números de
nucleótidos 223 a 1893 y los números de los aminoácidos 23 a 579 de
SEQ ID NO: 1.
Genotecas de ADNc que proceden de una línea
celular humana pueden ser seleccionadas mediante el método de
selección anterior, Alternativamente, genotecas de ADNc que proceden
de una línea celular humana pueden ser seleccionadas usando como
sonda un ADNc de ratón del modo descrito anteriormente.
El ADNc de otro clon positivo y la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc corresponden a los nucleótidos
249 a 1919 y los aminoácidos 23 a 579, indicados en SEQ ID NO:
5.
Con objeto de obtener un ADNc más largo (ADNc de
longitud total), las genotecas de ADNc anteriores fueron
seleccionadas usando como sonda dicho ADNc obteniendo con ello
muchos clones positivos. Estos clones tenían una extensión de 5' de
aproximadamente 230 bp para dicho ADNc. El ADNc que contiene esta
extensión de 5' fue designada como TAK1 ADNc y el ADNc que fue
clonado primeramente y que no contiene esta extensión de 5' fue
designado TAK1 \DeltaN ADNc. La secuencia de nucleótidos de TAK1
ADNc se indica en 1 a 2443 de SEQ ID NO: 1, y la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc se muestra en los números de
aminoácidos 1 a 579 de SEQ ID NO: 1. La proteína o el polipéptido
representado mediante la secuencia de aminoácidos se designa como
proteína o polipéptido de TAK1. Por el contrario, la proteína o el
polipéptido representado por la secuencia de aminoácidos codificada
por TAK1 ADNc se designa como proteína o polipéptido de TAK1
\DeltaN. Además, la secuencia de nucleótidos del TAK1 ADNc está
representada por los nucleótidos 1 a 2656 y la secuencia de
aminoácidos codificada por él está representada por los aminoácidos
1 a 579 de la SEQ ID NO: 5.
La secuencia primaria de la proteína de TAK1
sugiere que esta proteína posee un dominio de catálisis de quinasa
proteínica en el extremo N-terminal y un dominio de
aproximadamente 300 restos de aminoácidos en el extremo
C-terminal. Este dominio de catálisis contiene una
secuencia de consenso que corresponde a los subdominios de la
quinasa proteínica I a XI (S.K. Hanks et al., Science 241, 42
(1988)). Este dominio de catálisis tiene una identidad de 30%,
aproximadamente, con los aminoácidos del Raf-1 (T.I.
Bonner et al., Nucleic Acids Res. Vol. 14, 1009 (1986)) y
MEKK (C.A. Langer-Carter et al., Science Vol.
260, 315 (1993)). La secuencia de los 300 restos de aminoácidos en
el extremo C-terminal que sigue al dominio de
catálisis anterior no tiene una homología aparente con otras
proteínas.
El TAK1 \DeltaN ADNc deficiente en los
codones de 22 aminoácidos en el extremo N-terminal
que ha sido introducido en una levadura que tiene una mutación
ste11\Delta, puede complementar la mutación de ste11\Delta
(deficiencia de MAPKKK), pero el TAK1 ADNc de longitud total
introducido en un mutante ste11\Delta no complementa la mutación
ste11\Delta. Se opina, por tanto, que la quinasa TAK1 es activada
por la separación de 22 de los aminoácidos del extremo
N-terminal.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona ADN que codifica un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos desde Met en la posición 1 hasta Ser en la
posición 579, indicada en SEQ ID NO: 5. Este ADN incluye, como
ejemplo típico, ADN que codifica un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos desde el aminoácido Ser en la posición 23
hasta el aminoácido Ser en la posición 579, y ADN que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos desde un
aminoácido Glu en la posición 30 hasta un aminoácido Asp en la
posición 295. Sin embargo, el ADN puede incluir también ADN que
codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
desde cualquiera de los aminoácidos desde Met en la posición 1 hasta
Glu en la posición 30 hasta el aminoácido Asp en la posición
295.
Debido a que se opina que incluso desde ADN que
codifica un polipéptido que tiene un extremo
N-terminal extendido, podría obtenerse una enzima
activa por tratamiento del polipéptido después de expresión, y que
ella tendrá una actividad similar de quinasa incluso sin otras
regiones que la quinasa en el extremo
C-terminal.
También se describen polipéptidos o proteínas,
en especial polipéptidos o proteínas que retienen la actividad de
TAK1, que tienen las secuencias de aminoácidos que corresponden a
las secuencias de nucleótidos de varios de los ADNs antes citados.
Como un ejemplo más específico, la presente invención se refiere a
polipéptidos o proteínas expresadas por introducción de varios ADNs
antes citados a medida que son insertados en, por ejemplo, un
vector, en especial un vector de expresión, en células huésped tales
como células animales o células de microorganismos.
\newpage
Típicamente, el polipéptido o la proteína de la
presente invención posee una secuencia de aminoácidos desde
cualquiera de un aminoácido, desde Met en la posición 1 (inclusive)
hasta Ser en la posición 23 (inclusive) hasta el aminoácido Ser en
la posición 570 de SEQ ID NO: 5.
La presente invención proporciona también una
proteína de fusión del polipéptido o proteína anterior y otra
proteína. Otra proteína que esté fusionada con un polipéptido o una
proteína que posea la actividad de TAK1, puede elegirse como
apropiada además de la hemaglutinina citada en los ejemplos. ADN que
codifica una proteína de fusión de un polipéptido o de una proteína
que posee actividad de TAK1, con otra proteína, puede ser construida
y expresada mediante el método expuesto en el Ejemplo 4.
Como se ha citado anteriormente, puede obtenerse
ADNc que codifica TAK1 humana usando ADNc que codifica TAK1 del
ratón; los Ejemplos 5 y6 describen el aislamiento de ADNc que
codifica TAK1 humana.
Los diversos ADNs anteriormente citados pueden
ser clonados a partir de una célula animal tal como, por ejemplo,
ADNc mediante el método expuesto en el Ejemplo 2. Puede prepararse
ADN mutado o modificado en comparación con el ADNc original, usando
el ADNc original como molde, en un método convencional tal como el
de amplificación por PCR y mutagénesis específica del sitio.
Los polipéptidos o proteínas de la presente
invención pueden ser obtenidos por expresión del ADN correspondiente
en una célula huésped adecuada. Como la célula huésped en este
caso, pueden utilizarse células cultivadas de células eucarióticas
superiores tales como células humanas, de mono, de ratón, de hámster
y de rana, por ejemplo células THP-1, células
MC3T3-E1, células XTC, células MvILu, células CHO y
células COS; células cultivadas de células eucarióticas inferiores
que incluyen, por ejemplo, hongos tales como los hongos del género
Aspergillus, tal como el Aspergillus niger; o
levaduras incluyendo, por ejemplo, las levaduras del género
Saccharomyces tales como Saccaromyces cereviceae, y
los semejantes. Como células huésped, además, pueden usarse células
procarióticas, incluyendo, por ejemplo, bacterias tales como
Escherichia coli.
Cuando el ADN deseado ha de ser expresado en
estos hospedantes, se usa una secuencia que regula la expresión tal
como un promotor adecuado, dependiendo del hospedante. En la
expresión en células animales, por ejemplo, se usa un plásmido que
contiene cada uno de los promotores tal como pCDM8, pSV y pEP, y en
hospedantes del tipo de levaduras, se usa un plásmido tal como el
pNV11, y en Escherichia coli un plásmido tal como el pGEMEX y
el pUEX.
Los hospedantes transformados pueden ser
cultivados según un método convencional. Los polipéptidos o
proteínas de la presente invención pueden ser producidos usando un
animal transgénico (Glaser, V., SPECTRUM Biotechnology
Applications, 1993) y un insecto tal como el gusano de seda (Maeda,
S. et al., Nature (1985) 315, 592-594) como
hospedante. La recuperación y/o purificación de los polipéptidos y
proteínas producidos de este modo, puede llevarse a cabo mediante
uno de los métodos utilizados comúnmente para la purificación de
enzimas, tal como centrifugación, filtración, cromatografía de
filtración en gel y cromatografía de afinidad.
Las quinasas activadas por
TGF-\beta que lleva el sistema de transducción de
señal de la familia de TGF-\beta, son útiles para
usar en la investigación de fármacos que inhiben o promueven la
señalización de TGF-\beta y su superfamilia que se
sabe que están implicados en diversas enfermedades.
La presente invención será explicada ahora con
detalles adicionales con referencia a los Ejemplos que siguen,
Se sintetizó ADNc desde
poli(A)-RNA a partir de la línea celular
BAf-BO3 dependiente de IL-3, del
ratón, según un método convencional y luego se insertó en el vector
de expresión de levadura pNV11 (Ninomiya-Tsuji, J.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88,
9006-9010 (1991)) indicado en la Fig. 1, bajo el
control del promotor TDH3, construyendo una genoteca de ADNc.
Se seleccionó una genoteca de ADNc preparada en
el Ejemplo 5, usando Saccharomyces cereviceae SY
1984-P (his3\Delta, ste11\Delta, FUS1p::HIS3,
STE7P368). En esta levadura Ste11 se ha mutado y la actividad es
deficiente en el sistema de transducción de la señal de feromona de
apareamiento, y la secuencia de activación aguas arriba de FUS1 ha
sido ligada al marco de lectura abierto HIS3 formando un gen
informador. La cepa de levadura es deficiente en el his3 original y
por tanto solamente puede crecer cuando se encuentra presente en el
medio de cultivo histidina exógena o cuando la deficiencia de la
actividad de Ste11 que deriva de la mutación, ha sido
complementada.
El S. cereviceae SY
1984-P fue transformado con diversos plásmidos. Los
plásmidos utilizados fueron el YCplac22 (vector), el
pRS314PGKMEKKCT (expresa MEKK\DeltaN (K.J. Blumer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 91, 4925 (1994) que carece del
dominio del extremo N-terminal aguas abajo del
promotor PGK1) y el pADU-Raf\DeltaN (K. Irie
et al., Science Vol. 265 1716 (1994) que carece del dominio
del extremo N-terminal aguas abajo del promotor
ADH1). Estos transformantes fueron colocados en una placa de
SC-His que carece de histidina y fueron incubados a
30ºC. Como resultado, la levadura que había sido transformada con el
vector YCplac22 no creció, pero la levadura transformada con el
pRS314PGKMEKKCT ó el pADU-Raf\DeltaN lo hizo. Esto
confirmó que el sistema de selección es eficaz.
Luego la cepa de levadura
YS1984-P del sistema de selección anterior fue
transformada con la genoteca de ADNc construida en el Ejemplo 1 y
luego fue seleccionada sobre una placa de SC.His obteniendo un clon
positivo, el pNV11-HU11. El ADNc de este clon fue
designado como TAK1\DeltaN ADNc. La secuencia de nucleótidos de
este ADNc se determinó mediante el método didesoxi de terminación
de la cadena de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos
corresponde a la secuencia de los nucleótidos 223 a 1893, indicada
en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos codificada por ella
corresponde a Ser en la posición 23 a Ser en la posición 579 de la
secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1.
Después, con objeto de clonar el ADNc de
longitud total, el TAK1\DeltaN ADNc fue radiomarcado y usado como
sonda para seleccionar además la genoteca de ADNc obtenida en el
Ejemplo 1. Así pues, se obtuvieron muchos clones positivos. El ADNc
de este clon fue subclonado en el sitio EcoRI del vector pBS
(fabricado por Stratagene) obteniendo el
pGS-TAK1-5'. Este clon era un clon
de longitud total que contenía el codón de iniciación ATG. El ADNc
fue designado como TAK1 ADNc. La secuencia de nucleótidos del mismo
se muestra indicada en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de
longitud total de Met en la posición 1 a Ser en la posición 579 ha
sido codificada en los nucleótidos 1 a 2443 de la secuencia
anterior.
Se extrajo ARN total de diversos tejidos de
ratones y se sometió a transferencia Northern usando como sonda el
TAK1 ADNc radiomarcado anterior, para encontrar qué ARN que se
hibrida con el TAK1 ADNc era expresado en todos los tejidos u
órganos ensayados (bazo, timo, pulmones, hígado y cerebro). Éste se
encontraba presente en el bazo, el timo y el cerebro en niveles
altos, y en niveles bajos en los pulmones, el corazón y el
hígado.
Con objeto de estudiar las funciones de la
quinasa activada por TGF-\beta en células de
mamífero, TAK1 ADNc y TAK1\DeltaN ADNc se insertaron en un vector
de expresión de mamífero pEF (H. Shibuya et al., Nature Vol.
357, 700 (1992)) bajo el control del promotor del factor de
alargamiento (EF) humano, obteniendo los plásmidos de expresión
pEF-TAK1 y pEF-TAK1\DeltaN. Los
plásmidos de expresión pEF-TAK1 y
pEF-TAK1\DeltaN contienen una secuencia
codificante de TAK1 y una secuencia codificante de TAK1\DeltaN, de
longitud total, respectivamente bajo el control del promotor EF.
Por consiguiente, el fragmento XhoI de 2,3 kb
del pNV11-HU11 fue insertado en una mella XhoI del
pBS obteniendo el pBS-TAK1\DeltaN. El
pEF-MSS1 (H. Shibuya et al., Nature Vol. 357
, 700 (1992)) fue dividido con EcoRI y KbaI, en lo que se
introdujeron un engarce sintético EcoRI-XhoI (cadena
sentido: 5'-AATTCGCCACCATGGC-3')
(SEQ ID NO: 2); cadena antisentido:
5'-TCGAGCCATGGTGGCG-3') (SEQ ID NO:
3) (conteniendo el codón de iniciación ATG), y un fragmento
XhoI-HindIII y un fragmento
HindIII-XbaI procedente del
pBS-TAK1\DeltaN, construyendo el
pEF-TAK1\DeltaN. Se sometió a división pBS con
EcoRI y XhoI, en lo que se insertaron un fragmento
EcoRI-SacI procedente del
pBS-TAK1\Delta-5' y un fragmento
SacI-XhoI procedente del
pBS-TAK1\DeltaN obteniendo el
pBS-TAK1 que contiene el ADNc de TAK1 de longitud
total (TAK1 ADNc) de longitud total. El pEF-MSS1 fue
dividido con EcoRI
y SalI, en lo que se insertó un fragmento EcoRI-SacI procedente de pBS-TAK1 construyendo el pEF-TAK1.
y SalI, en lo que se insertó un fragmento EcoRI-SacI procedente de pBS-TAK1 construyendo el pEF-TAK1.
E. coli que tiene el plásmido
pEF-TAK1 ha sido depositado internacionalmente bajo
las estipulaciones del Tratado de Budapest como Escherichia
coli MC1061/P3 (pEF-TAK1) y el E. coli
que tiene el plásmido pEF-TAK1\DeltaN como
Escherichia coli MC1061/P3
(pEF-TAK1\DeltaN), el 29 de Septiembre de 1995, en
el Instituto Nacional de Ciencias Biológicas y Tecnología Humana,
la Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, de
1-3, Higashi 1-chome, ciudad de
Tsukuba. Ibalaki pref., Japón, como FERM BP-5246 y
FERM BP-5245, respectivamente.
El gen deTAK1 contenido en el plásmido
pEF-TAK1 puede ser escindido usando una enzima de
restricción apropiada tal como EcoRI y BamHI.
Un estudio de los efectos del TAK1 sobre la
inducción de expresión génica mediante diversos ligandos, ha
revelado que la quinasa TAK1 tiene efecto sobre la inducción génica
por el TGF-\beta. Una respuesta celular inicial
al TGF-\beta induce una elevación del nivel de
ARNm del inhibidor 1 activador del plasminógeno
(PAL-1) (M.R. Keeton et al., J. Biol. Chem.
Vol. 266, 23048 (1991)).
Con objeto de estudiar los efectos de TAK1 sobre
la respuesta de TGF-\beta, el plásmido informador
del TGF-\beta p800neoLUC que contenía un gen de
luciferasa regulado por el promotor PaI-1 inducido
por TGF-\beta (M. Abe et al., Analyt.
Biochem., Vol. 216, 276 (1994)) fue transfectado transitoriamente a
células epiteliales de pulmón MvILu mediante el método del fosfato
de calcio (H. Shibuya et al., Nature Vol. 357, 700 (1992). En
este método de medida, la actividad de luciferasa inducida por el
TGF-\beta puede ser medida por la transfección de
p800neoLUC sobre las células epiteliales de pulmón MvILu. Las
células MvILu transfectadas transitoriamente por p800neoLUC
respondieron al TGF-\beta con una actividad del
gen informador potenciada 4 a 5 veces. Este resultado está indicado
en la sección de vectores de la Fig. 2.
El plásmido de expresión de TAK1 ó TAK1\DeltaN
construido previamente, fue transfectado transitoriamente en
células MvILu. La expresión de TAK1 potenció ligeramente la
expresión de genes derivados de TGF-\beta y el
TAK1\DeltaN activó constitutivamente la expresión del gen
PAI-1 (la sección de TAK1\DeltaN de la Fig. 2).
El nivel de expresión constitutiva de un gen informador por el
TAK1\DeltaN es igual al de un transfectante tratado con el
TGF-\beta. Por tanto, el TAK1 activado (es decir,
el TAK1\DeltaN) puede transferir señales en ausencia de
TGF-\beta. Además, cuando se añadió
TGF-\beta a un traansfectante de TAK1\DeltaN, la
expresión del gen PAI-1 fue potenciada
adicionalmente.
En la Fig. 2 las barras en blanco representan el
caso en el que no se llevó a cabo inducción de
TGF-\beta, y las barras rayadas representan el
caso en el que se llevó a cabo la inducción de
TGF-\beta. En el experimento anterior, las
células obtenidas después de la transfección fueron cultivadas
durante 20 horas en presencia o ausencia de
TGF-\beta1 humano (30 ng/ml) para preparar un
extracto desde las células, y la luciferasa se midió según ha sido
descrito por H. Shibuya et al., en Mol. Cell. Biol. Vol. 14,
5812 (1994). En el gráfico de la Fig. 2 se muestran las actividades
relativas de luciferasa de células transformadas por un vector (que
no contenía el gen de TAK1) indicándose como 1 la actividad de
luciferasa en ausencia de inducción de TGF-\beta1.
Los resultados de los gráficos de barras representan la media de
resultados de operaciones por triplicado para cada experimento.
Con objeto de confirmar que los resultados
anteriores son obtenidos por mediación de la actividad de quinasa
de TAK1, se construyó un TAK1\DeltaN-K63W
catalíticamente inactivo. Esta construcción se llevó a cabo mediante
mutagénesis dirigida al sitio usando PCR. En este vector la lisina
en la posición 63 del sitio de unión de ATP ha sido reemplazada con
triptófano. Se espera que la mutación inactive la actividad de
quinasa y la actividad de señalización de TAK1\DeltaN. Cuando el
TAK1\DeltaN-K63W es transfectado conjuntamente con
el p800neoLUC, se perdió la capacidad de estimular
constitutivamente la expresión del gen PA1-1 (Fig.
2). Estos resultados sugieren que se requiere la actividad de
quinasa del TAK1\DeltaN para la expresión del gen
PAI-1 independiente de TGF-\beta.
Además, un TAK1\DeltaN negativo de quinasa causó la reducción
parcial de la expresión inducida por TGF-\beta.
Estos resultados sugieren que TAK1 puede actuar como mediador de una
ruta de transducción de señal con mediación de
TGF-\beta.
Con objeto de obtener evidencia directa de que
TAK1 actúa en la ruta de la transducción de señal con mediación de
TGF-\beta, se determinó si el tratamiento de
células con TGF-\beta podría activar la actividad
de quinasa de TAK1. Para la identificación de un sustrato extraño
apropiado, se llevó a cabo una reacción de quinasa in vitro
para TAK1 que se sometió a inmunoprecipitación partiendo de células
de levadura que expresan TAK1 marcada con un epítopo de
hemaglutinina (HA) (TAK1-HA) (una secuencia de ADN
que codifica un epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal
anti-HA 12CA5, fue ligada por reacción PCR al marco
del extremo terminal 3' de ADN que codifica TAK1).
Los resultados de la determinación inmunitaria
de la quinasa compleja indica que la forma activada de TAK1 puede
fosforilar y activar la subfamilia XMEK2/SEK1 del MAPKK (B.M. Yasher
et al., Nature Vol. 372, 794 (1994)). Por otra parte, no se
detectó la fosforilación del MAPKK-MEK1 original
(E. Nishida et al., Trends Biochem. Sci., 128 (1993); K.J.
Blumer et al., id. Vol. 19, 286 (1994); R.J. Davis, id. Vol.
19, 470 (1990); C.L. Marchall, Cell. Vol. 80, 179 (1995), histona y
proteína básica de mielina. Por tanto, la actividad de quinasa del
TAK1 puede medirse por su capacidad de activación de XMEK2 in
vitro.
Se hicieron construcciones para la expresión de
TAK1 marcado con el epítopo HA (HA-TAK1) del modo
siguiente. Un oligonucleótido sintético que codifica el epítopo
HA,
Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala
(SEQ ID NO: 4) que es reconocido por el anticuerpo monoclonal
12CA5, fue clonado en un sitio SalI (posición +3 desde el codón
ATG) y un sitio EcoRI del pBS-TAK1 construyendo el
pBS-HA-TAK1. El
pEF-MSS1 fue dividido con EcoRI y SalI, a lo que se
insertó un fragmento EcoRI-XhoI procedente del
pBS-HA-TAK1 construyendo el
pEF-HA-TAK1.
Con objeto de construir el
pBS-HA-TAK1\DeltaN, se sometió a
digestión el pNV11-HU11 con XhoI e HindIII. El
fragmento obtenido se aisló e insertó en un sitio
HincII-HindIII del
pBs-HA-TAK1. Se dividió
pEF-MSS1 con EcoTI y SalI, en lo que se insertó un
fragmento PsII-XhoI procedente del
pBS-HA-TAK1\DeltaH construyendo
el pBS-HA-TAK1\DeltaN. Ambas de
estas construcciones posee dos copias del epítopo HA del extremo N-
terminal expresado desde el promotor EF.
Estas construcciones
pEF-HA-TAK1 ó
pEF-HA-TAK1\DeltaH fueron
transfectadas transitoriamente al osteoblasto de ratón
MC3T3-E1 (S. Ohta et al., FEBS lett. Vol.
314, 356 (1992)). Después de estimular por
TGF-\beta1, el HA-TAK1 expresado
fue aislado por inmunoprecipitación, y se midió su actividad
mediante el ensayo de quinasa asociado (S. Matsuda et al., J.
Biol. Chem. Vol. 270, 12969 (1995)).
\newpage
Así pues, las células transfectadas fueron
tratadas con TGF-\beta1 (20 ng/ml) ó
BMP-4 (100 ng/ml) durante 0 minutos (sin tratar)
hasta 30 minutos. Las células fueron raspadas y llevadas a una
solución tampón (S. Matsuda et al., J. Biol. Chem. Vol. 270,
12781 (1995); T. Moriguchi et al., J. Biol. Chem. Vol. 270,
12969 (1995)), y el extracto celular se centrifugó a 15.000 x g
durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido de este modo se
sometió a inmunoprecipitación por el anticuerpo
anti-HA. Así, partes alícuotas de 300 \mul del
sobrenadante anterior se mezclaron con 20 \mul de anticuerpo ó 20
\mul de proteína A Sepharose, y el complejo inmunitario se lavó
dos veces con PBS, que luego se usó para la medida de quinasa (S.
Matsuda et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 12781 (1995); T.
Moriguchi et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 12969 (1995)).
La actividad se expresó como un incremento
múltiplo con relación a la actividad de HA-TAK1 de
células sin estimular. La actividad de TAK1 inmunoprecipitada se
midió por su capacidad de activación de XMEX2/SEK1 recombinante (S.
Matsuda et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 12781 (1995); T.
Moriguchi et al., J. Biol. Chem., Vol.270, 12781 (1995)).
Se ha confirmado ya que el
HA-TAK1 no fosforila directamente el
KN-p38/MPK2. De conformidad con la
inmunotransferencia de cada uno de los inmunoprecipitados por el
anticuerpo anti-HA, se recuperaron cantidades casi
idénticas de HA-TAK1 en cada punto de
inmunoprecipitación.
El resultado del experimento anterior indicó que
la actividad de quinasa de TAK1 comenzaba a subir al cabo de cinco
minutos después de estimular por TGF-\beta,
alcanzaba un máximo a los 10 minutos, y volvía a un nivel casi el
de la línea de base al cabo de 30 minutos (Fig. 3). Además, el
TGF-\beta1 estimulaba la actividad de quinasa de
TAK1 de un modo dependiente de la dosis (Fig. 4). Después, se
determinó si TAK1 podía activarse por BMP, un miembro de la
superfamilia del TGF-\beta (A.H. Reddi et
al., Curr. Opin. Genet. Dev. Vol. 4, 737 (1994)), o por el
factor del crecimiento epitelial (EFG). Interesantemente, el
BMP-4 activó también la quinasa de TAK1 de un modo
dependiente del tiempo y de la dosis (Fig. 4).
Por otra parte, la activación de TAK1 no se
observó en las células tratadas con EGF. Se opina que la carencia
de inducción de TAK1 por EGF no se debe a que las células
MC3T3-E1 no responden a EGF, sino debido a que las
señales de EGF no son mediadas por TAK1. Este hecho es evidente,
asimismo, del hecho de que EGF induce la expresión de fos en las
células MC3Ts-E1. Tomados en conjunto, estos datos
indican que TAK1 es activada por la superfamilia
TGF-\beta.
El TAK1\DeltaN puede activar la expresión del
gen PAI-1 independientemente del
TGF-\beta (Fig. 2), lo que sugiere que la
proteína de TAK1\DeltaN tiene una actividad de quinasa potenciada
incluso en ausencia de tratamiento de la célula por
TGF-\beta. Con objeto de estudiar esta
posibilidad, TAK1\DeltaN marcado con el epítopo HA
(HA-TAK1\DeltaN) (véase antes) se transfectó
transitoriamente a células MC3T3-E1 y se determinó
la actividad de TAK1\DeltaN mediante la medida de quinasa
inmunocomplejada. Así, células MC3T3-E1 fueron
transfectadas por el
pEF-HA-TAK1\DeltaN, desde las
células transfectadas se inmunoprecipitó
HA-TAK1\DeltaN según se ha descrito anteriormente.
y se midió su actividad.
Todos los datos de los resultados obtenidos se
expresan como un incremento múltiplo a partir de la actividad de
HA-TAK1 de células sin estimular.
Como muestra la Fig. 4, la proteína de
TAK1\DeltaN posee una actividad intrínseca de quinasa
considerablemente mayor, lo que apoya la hipótesis de que los 22
restos de aminoácidos del extremo N-terminal de que
carece TAK1\DeltaN son constitutivamente activos.
Partiendo de células Jurkat de una línea células
de células T humanas, se preparó poli(A)RNA y se
sintetizó ADNc mediante un método convencional. Éste se insertó en
el vector de expresión de levadura pNV7
(Ninomiya-Tsuji, J. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 88, 9006-9010 (1991)) aguas abajo
del promotor TDH3, para construir una genoteca de ADNc.
Un Saccharomyces cereviceae mutante que
carece de la actividad de Ssk2/Ssk22 y Sho1 que actúa en el sistema
de transducción de señal de esfuerzo alto de presión osmótica,
puede crecer en el medio YEPD (Extracto de levadura, 10 g/l,
triptona, 20 g/l, glucosa, 20 g/l), pero no en un medio con sorbitol
1 M añadido a éste (T. Maeda et al., Science, 269, 554
(1996)). Por consiguiente, por introducción de ADNc en este mutante
seguido de selección, puede aislarse un ADNc que puede complementar
la deficiente actividad de Ssk2/Ssk22.
En efecto, la cepa de Saccharomyces
cereviceae deficiente en la actividad de Ssk2/Ssk22 y Sho1
descrita en la referencia anterior (ssk2\Delta, ssk22\Delta,
sho1\Delta) fue transformada con pNV11-HU11
(TAK1\DeltaN del ratón) obtenido en el Ejemplo 2. El
transformante fue depositado en una placa de YEPD que contenía
sorbitol 1 M y se incubó a 30ºC durante 30 minutos. Como resultado,
la levadura transformada con el pNV11-HU11 creció
incluso bajo un esfuerzo alto de presión osmótica. Este hecho
confirmó que el sistema de selección es eficaz.
Después, la cepa de Saccharomyces
cereviceae (ssk2\Delta, ssk22\Delta, sho1\Delta) fue
transformada con la genoteca de ADNc construida en el Ejemplo 5, y
se seleccionó bajo un esfuerzo alto de presión osmótica (se incubó
a 30ºC en un medio YEPD que contenía sorbitol 1 M). Como resultado
de ello, se obtuvo el clon positivo pNV7-hTAK1. El
ADNc contenido en este clon fue amplificado usando el kit PRISM Dye
Terminator Cycle Sequencing (fabricado por Perkin Elmer) y se
determinó su secuencia de bases. La secuencia de bases y la
correspondiente secuencia de aminoácidos fueron las indicadas en
SEQ ID NO: 5, La secuencia de bases de este ADNc tenía una
homología de 92% con la de TAK1 del ratón, y la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc tenía una homología del 99% con
la de TAK1 del ratón. Comparaciones de las secuencias de bases de
TAK1 del ratón y de TAK1 humana se muestran en la Fig. 5 a la Fig.
9, y las de las secuencias de aminoácidos se muestran en la Fig. 10
y la Fig. 11.
ADNc de TAK1 humana se subclonó en pUC19 que
había sido sometido a digestión con SalI obteniendo el plásmido
phTAK1 que contenía el ADNc de longitud total de TAK1 humana. E.
coli que tenía el plásmido phTAK1 fue designado
internacionalmente como Escherichia coli JM109 (phTAK1) bajo
las estipulaciones del Tratado de Budapest, el 19 de Julio de 1996,
en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la
Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3,
Higashi-1-chome, ciudad de Tsukuba,
Ibalaki pref., Japón, como FERM BP-5598.
Los microorganismos que siguen han sido
depositados en el Depósito de Microorganismos de Patentes del
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la Agencia de
Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, ciudad de Tsukuba, Ibalaki pref., Japón, y
se les asignaron los números de Registro que siguen:
Organismo: Escherichia coli MC1061/P3
(pEF-TAK1)
Fecha de depósito: 28 de Septiembre de 1995
Número de Registro: FERM
BP-5246
Organismo. Escherichia coli MC 1061/P3
(pEF-TAK1\DeltaN)
Fecha de depósito: 28 de Septiembre de 1995
Número de Registro: FERM
BP-5245
Organismo: Escherichia coli JM109
(phTAK1)
Fecha de depósito: 19 de Julio de 1996
Número de Registro: FERM
BP-5598.
| SEQ ID NO: 1 |
| Longitud de la secuencia: 2443 |
| Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
| Catenariedad: Sencilla |
| Topología: Lineal |
| Tipo de molécula: ADNc |
| Secuencia |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| SEQ ID NO: 2 |
| Longitud de la secuencia: 16 |
| Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
| Catenariedad: Sencilla |
| Topología: Lineal |
| Tipo de molécula: ADN sintético |
| Secuencia |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID NO: 3 |
| Longitud de la secuencia: 16 |
| Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
| Catenariedad: Sencilla |
| Topología: Lineal |
| Tipo de molécula: ADN sintético |
| Secuencia |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID NO: 4 |
| Longitud de la secuencia: 27 |
| Tipo de secuencia: Aminoácido |
| Topología: Lineal |
| Tipo de molécula: Péptido |
| Secuencia |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
| SEQ ID NO: 5 |
| Longitud de la secuencia: 2656 |
| Tipo de secuencia: Ácido nucleico |
| Catenariedad: Sencilla |
| Topología: Lineal |
| Tipo de molécula: ADNc |
| Secuencia |
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos desde Met en la posición 1 a Ser en la
posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
2. Un polipéptido aislado que consiste en una
secuencia de aminoácidos desde Ser en la posición 23 a Ser en la
posición 579, indicada en la secuencia SEQ ID NO: 5.
3. ADN aislado que codifica un polipéptido según
la reivindicación 1 ó 2.
4. Un vector que comprende un ADN según la
reivindicación 3.
5. Una célula huésped transformada con un vector
según la reivindicación 4.
6. Un método para producir un polipéptido, que
comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 5, y
recuperar luego el producto desde el cultivo.
7. Un polipéptido producido mediante el método
según la reivindicación 6.
8. Una proteína de fusión de un polipéptido
según la reivindicación 1 ó 2, y otra proteína.
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