WO1998003663A1 - Tak1 humaine et adn codant celle-ci - Google Patents

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WO1998003663A1
WO1998003663A1 PCT/JP1997/001050 JP9701050W WO9803663A1 WO 1998003663 A1 WO1998003663 A1 WO 1998003663A1 JP 9701050 W JP9701050 W JP 9701050W WO 9803663 A1 WO9803663 A1 WO 9803663A1
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tak1
tgf
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cdna
ser
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PCT/JP1997/001050
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Naoto Ueno
Kunihiro Matsumoto
Kenji Irie
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisya
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a kinase that is activated by TGF- / S, which is involved in the signaling system of transforming growth factor-3 (TGF-S) family.
  • activated kinase; TAK1 activated kinase; TAK1
  • TAK1 is also called Activator of APK Kinase (AM_1), which is activated by TGF- and an enzyme (bone morphogenetic protein) and activates MAPK kinase by phosphorylation. It is. Background art
  • the TGF-yS superfamily receptor contains Ser / Thr kinase in the cytoplasmic domain, and repeats G and Ser at the amino-terminal side near its transmembrane domain (GS box) And GS box without GS box.
  • the ligand binds to the type I receptor and then forms a complex with the type I receptor, and the constitutively phosphorylated type I receptor kinase binds to the type I receptor. It is thought that the vicinity of the GS box is phosphorylated, whereby the type I receptor is activated, whereby the signal from the ligand is transmitted into cells. However, little is known about the signaling molecules downstream of this receptor.
  • the conjugated pheromone of extracellular force (Mating pheromone), as a signal transduction cascade until conjugation occurs, G protein is activated by the conjugation pheromone, G protein tin activates MAPKK kinase (MAPKKK) (Stell), Activated MAPKKK phosphorylates and activates MAPK kinase (MAPKK), which in turn is activated by MAPKK (Ste7) to form MAP kinase (mitogen-Ichidani-fridianase; It is known that mitogen-activated protein kinase (MAPK) is phosphorylated and activated, and finally MAPK activates the FUS1 protein to initiate cell conjugation.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • TAK1 TGF-yS Acti vated inasel obtained from mice has been strongly known as such a MAPKKK (K, Yamaguchi et al., Science (1995) 270, 2008-2011). 0 ) Disclosure of the Invention
  • the present invention relates to a novel factor involved in signal transduction located downstream of a receptor in a mammalian TGF-receptor signal transduction system, a gene encoding the same, and production of the factor. It seeks to provide a way.
  • the present inventors have developed a yeast Saccharomyces cerevisiae deficient in the activity of MAPKKK (Ssk2 / Ssk22, Shol) in the signaling cascade of the conjugated pheromone.
  • the present invention successfully inserts the cDNA of the present invention, screens a cDNA capable of complementing the MAPKKK with a defective activity, and successfully clones a cDNA capable of complementing the MAPKKK with a defective activity. completed.
  • the present invention provides activation by transforming growth factor (TGF) -8 comprising the amino acid sequence from Ser at position 23 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • TGF transforming growth factor
  • the present invention provides a polypeptide having a kinase activity.
  • the present invention provides a polypeptide having a kinase activity activated by TGF- / 3, comprising the amino acid sequence from Met at position 1 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • TGF- / 3 comprising the amino acid sequence from Met at position 1 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a polypeptide having a kinase activity activated by TGF- / 3, comprising a amino acid sequence from Ser at position 23 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • a polypeptide having a kinase activity activated by TGF- / 3 comprising a amino acid sequence from Ser at position 23 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • the present invention also relates to a polynucleotide having a nucleotide sequence from T at position 249 to A at position 1919 shown in SEQ ID NO: 5, which has kinase activity activated by TGF- / 3. Provides DNA encoding the peptide.
  • the present invention also provides a polypeptide having a kinase activity activated by TGF-, which comprises an amino acid sequence from Met at position 1 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5. Provide DNA that encodes the code.
  • the present invention relates to a polynucleotide having a nucleotide sequence from A at position 183 to A at position 1919 as shown in SEQ ID NO: 5, which has a kinase activity activated by TGF-. Provides DNA encoding the peptide.
  • the present invention provides a vector comprising any one of the above DNAs, a host cell transformed by the vector comprising any one of the above DNAs, and a vector comprising any one of the above DNAs
  • a method for producing a polypeptide having a kinase activity activated by TGF-3 which comprises culturing a host cell transformed with a TGF-3, and collecting a product from the culture. .
  • the present invention provides a polypeptide having kinase activity activated by TGF- produced by the above method, and an amino acid sequence from Ser at position 23 to Ser at position 579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a fusion protein of the above-mentioned polypeptide, protein and another protein.
  • FIG. 1 shows the yeast expression vector pNVll.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the effect of adding TGF- on the expression of various TAK1 genes using the luciferase gene as a reporter gene.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the effects of TGF- / 3 and BMP-4 on the activity of the TAK1 gene in MC3T3-E1 cells by the immunoprecipitation method and the force kinase method.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of various concentrations of TGF- / 3 or BMP-4 on TAK1 kinase activity in cells transfected with the HA-TAK1 gene.
  • ⁇ 1 ⁇ shows the results when cells transfected with the ⁇ 1 ⁇ gene were not stimulated by either TGF- / 5 or BMP-4.
  • FIG. 5 shows a comparison between the nucleotide sequence of DNA encoding mouse TAK1 and the nucleotide sequence of DNA encoding human TAK1.
  • FIG. 6 shows a comparison between the nucleotide sequence of the DNA encoding mouse TAK1 and the nucleotide sequence of the DNA encoding human TAK1.
  • FIG. 7 shows a comparison between the nucleotide sequence of DNA encoding mouse TAK1 and the nucleotide sequence of DNA encoding human TAK1.
  • FIG. 8 shows a comparison between the nucleotide sequence of DNA encoding mouse TAK1 and the nucleotide sequence of DNA encoding human TAK1.
  • FIG. 9 shows a comparison between the nucleotide sequence of DNA encoding mouse TAK1 and the nucleotide sequence of DNA encoding human TAK1.
  • FIG. 10 shows a comparison between the amino acid sequence of mouse TAK1 and the amino acid sequence of human TAK1.
  • FIG. 11 shows a comparison between the amino acid sequence of mouse TAK1 and the amino acid sequence of human TAK1.
  • a mammalian cDNA when cloning a target gene, for example, a mammalian cDNA is deleted from a yeast lacking MAPKKK activity and having a reporter gene that can be easily detected at the end of the cascade.
  • the expression vector may be used to detect whether a cDNA complementing the deficient MAPKKK activity has been inserted or not, based on the expression of the reporter gene.
  • Ssk2 / Ssk22 and other yeasts lacking Shol activity that function under a hyperosmolar signaling system can be used.
  • Such a detection system includes a MAPK pathway (I. Herskowi tz, Cell, Vol., 1988) which transmits information on mating pheromone (Mating pheromone) in Saccharomyces cerevisiae. 80, 187 (1995); DB Lein et., Curr. Opin. Cel 1 Biol. Vol. 7, 197 (1995); J. Schulz et al., Curr. Opin. Gene Dev., Vol. (1995)) can be used.
  • the normal signaling cascade in this system consists of Stell kinase, Ste7 kinase, and Fus3Kss1 kinase, which correspond to MAPKKK, MAPKK and MAPK, respectively. Stell, Ste7, and Fus3 / Kssl act sequentially to transmit a signal to the transcription factor Ste12, which in turn activates the transcription of mating specific genes such as FUS1.
  • a cascade containing a functional mutation of Ste7 (STE7 P3 ") and a deletion mutation of Stell (StellA) in the above force scale can be used (K. Irie et al., Science Vol. 265, 17 16 (1994)).
  • the histidine phenotype (His) conferred by the reporter gene FUSlp :: HIS3 corresponding to the junctional pathway is monitored.
  • the activated form of mammalian Raf or MEKK Rai ⁇ or ⁇ , respectively
  • can complement the Stel1 activity deficiency in a Ste7 P 368- dependent manner Scum
  • a cDNA library derived from any mammal can be used.
  • cDNA expression from a mouse cell line for example, mouse cell line BAF-B03.
  • Libraries can be used. This cDNA library clones the cDNA for po (A) -RNA from the mouse 1- 3-dependent pro-cell line, BAF-B03, under the control of the TDH3 promoter in the yeast expression vector pNVll. This is obtained.
  • Another example of a test cDNA library used is the cDNA expression library 0 "from a human cell line, such as the human cell line Jurkat.
  • One positive clone was obtained by screening the above cDNA library with the above-mentioned screening system.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of this clone and the amino acid sequence encoded thereby correspond to nucleotide numbers 223 to 1893 of SEQ ID NO: 1 and amino acid numbers 23 to 579.
  • a cDNA library from a human cell line can be screened according to the screening system described above.
  • a cDNA library from a human cell line can be screened using the mouse cDNA obtained as described above as a probe.
  • the cDNA of the other positive clone and the amino acid sequence encoded thereby correspond to nucleotides 249-1919 and amino acids 23-579 shown in SEQ ID NO: 5.
  • TAKl cDNA The cDNA having the 5'-terminal extension is referred to as TAKl cDNA, and the first cloned cDNA having no 5'-terminal extension is referred to as TAK1 ⁇ N cDNA.
  • the nucleotide sequence of TAK1 cDNA is shown in SEQ ID NO: 1 from 1 to 2443, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid number of 1 to 579.
  • TAK1 protein or polypeptide Shown in The protein or polypeptide represented by this amino acid sequence is referred to as a TAK1 protein or polypeptide.
  • the protein or polypeptide represented by the amino acid sequence encoded by the ⁇ 1 ⁇ cDNA is referred to as TAK1 ⁇ N protein or polypeptide.
  • the nucleotide sequence of the human TAK1 cDNA is represented by nucleotides 1-2656 of SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence encoded thereby is SEQ ID NO: 5. Indicated by amino acids 11-579 of 5.
  • the primary amino acid sequence of the TAK1 protein suggests that this protein has an N-terminal protein kinase catalytic domain and a C-terminal domain of about 300 amino acid residues. .
  • This catalytic domain contains a consensus sequence corresponding to protein kinase subdomains I-XI (S. K. Hanks et al., Science 241, 42 (1988)).
  • This catalytic domain also Raf-1 (T. 1. Bonner et al., Ucleic Acids Res. Vol. 14, 1009 (1986)) and K (CA Langer-Carter et al., Science Vol. 260, 315 (1993)) has about 30% identity with the amino acid sequence of the catalytic domain.
  • the sequence of the 300 amino acid residue at the C-terminal following the catalytic domain is other than that. Does not have significant homology to the protein.
  • TAK1mN cDNA lacking the N-terminal 22 amino acid codons into yeast having the stellum mutation will complement the stellA mutation (MAPKKK deletion), but will replace the full-length TAKl cDNA with the stellA mutation. Does not complement the ste 11 ⁇ mutation when introduced into a strain. Therefore, TAK1 kinase has 22 N-terminal It is thought to be activated by removal of amino acid.
  • the present invention relates to a DNA encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence from Met at position 1 to Ser at position 579 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence from the amino acid Ser at position 23 to the amino acid Ser at position 579 is coded.
  • the DNA of the present invention is not limited to those described above, and may be any amino acid between Met at position 1 to Glu at position 30 to amino acid As at position 295. It also includes DNAs encoding polypeptides consisting of amino acid sequences up to p.
  • an active enzyme can be obtained by processing the polypeptide after expression, and the C-terminus can be obtained. This is because it is easy to imagine having the same kinase activity even if a region other than the above kinase is lacked.
  • the present invention also provides polypeptides or proteins having an amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequences of the various DNAs described above, particularly polypeptides or proteins having TAK1 activity.
  • the above-described various DNAs are expressed by being inserted into a vector, particularly an expression vector, and then introduced into a host cell, for example, an animal cell or a microorganism cell.
  • the present invention relates to a polypeptide or protein, particularly a polypeptide or protein having TAK1 activity.
  • the polypeptide or the protein of the present invention is a polypeptide or a protein of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 which has a position between Met at position 1 (including this) to Se at position 23 (including this). Has an amino acid sequence from any one of the above to the amino acid Ser at position 579.
  • the present invention further relates to the above-described polypeptide or protein and other proteins.
  • Polypeptide having TAK1 activity or another protein fused with the protein can be appropriately selected in addition to hemagglutinin described in Examples.
  • DNA encoding a polypeptide having TAK1 activity or a fusion protein of a protein and another protein can be constructed and expressed by the method described in Example 4.
  • cDNA encoding human TAK1 can be obtained using cDNA encoding mouse TAK1, and Examples 5 and 6 encode human TAK1. 3 shows the isolation of cDNA.
  • DNAs of the present invention can be cloned from animal cells, for example, as cDNA, for example, by the method described in Example 2.
  • DNA mutated or modified from native cDNA can be prepared by conventional means such as PCR amplification, site-directed mutagenesis and the like using native cDNA as type III.
  • the polypeptide or protein of the present invention can be obtained by expressing the corresponding DNA in an appropriate host.
  • the host may be eukaryotic cells, for example, cultured cells of higher eukaryotes such as humans, monkeys, mice, hamsters, and chickens, for example, THP-1 cells, MC3T3-E1, and XTC cells MvlLu cells, CH0 cells, COS cells, etc .; lower eukaryotic cells, eg, filamentous fungi, eg, Aspergillus genus fungi, eg, Aspergillus niger, or yeast, eg, saccharomyces Yeasts of the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, are used extensively.
  • Prokaryotic cells for example, bacteria, for example, Escherichia coli, are used as hosts.
  • an expression control sequence such as an appropriate promoter is used depending on the host.
  • an expression control sequence such as an appropriate promoter is used depending on the host.
  • Plasmids having promoters such as pCDM8, pSV, and pEF are used for expression in cells
  • plasmids such as pNVll are used in yeast hosts
  • pGEMEX and pUEX are used in Escherichia coli. Of the plus is used.
  • the transformed host can be cultured by a conventional method.
  • the polypeptide or protein of the present invention can be used for transgenic animals (Glaser, V., SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) and insects such as silkworms (Maeda, S, et al., Ature (1985) 315). , 592-594) can be produced as a host.
  • Recovery and purification of the produced polypeptide or protein may be performed by a method commonly used for enzyme purification, for example, centrifugation, filtration, gel filtration chromatography, affinity, and the like. This can be done by chromatograph or the like.
  • TGF- / 3 which is a kinase responsible for the TGF-family signaling system of the present invention, is known to be involved in many diseases. And its use in the search for drugs that suppress or enhance the signal transmission of its superfamily. .
  • CDNA was synthesized from poly (A) -RNA from the mouse-3-dependent cell line BAF-B03 according to a conventional method, and this was expressed in the yeast expression vector pNVlKNinomiya-Tsuji, J. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9006-9010 (1991)) under the control of the TDH3 promoter to produce a cDNA library.
  • Example 2 Screening of cDNA library
  • the cDNA library prepared in Example 1 was screened using Saccharomyces cerevisiae SY1984-P (is3 ⁇ , stellA, FUSlp :: HIS3, STE7P368).
  • Stell is mutated to lack its activity in the signaling system of the mating pheromone, and serine at position 368 of Ste-7 has been replaced by proline.
  • the FUS1 upstream activation sequence is linked to the HIS3 open reading frame to form a reporter gene.
  • This yeast strain is deficient in native hi S3 and can therefore only grow if foreign histidine is present in the medium or if the mutated Ste11 activity is complemented.
  • S. cerevisiae SY1984-P was transformed with various plasmids.
  • the plasmids used were YCplac22 (vector), pRS314PGKMEKKC T ( ⁇ lacking the N-terminal domain downstream of the PGK1 promoter ( ⁇ . J. Blumer et al., Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 4925 (1994)), and pADU-Raf AN (expressing Raf ⁇ N lacking the N-terminal domain from the ADH1 promoter) (K. Irie et al., Science Vol. 265, 1716). (1994)). These transformants were spread on SC-His plates lacking histidine and incubated at 30 ° C.
  • the yeast transformed with the YCplac22 vector did not grow, and the yeast transformed with pRS314P GKMEKKCT or pADU-Raf ⁇ grew. This confirmed that the screening system was effective.
  • the screening system yeast strain YS1984-P was transformed with the cDNA library prepared in Example 1, and SC- Screening on the His plate yielded one positive clone, pNVU-HUll.
  • the cDNA of this clone is referred to as TAK1 N cDNA.
  • the nucleotide sequence of this cDNA was converted to dideoxynucleotide chain terminator. — Determined by the shot method.
  • the nucleotide sequence corresponds to the sequence of nucleotides 223 to 1893 in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded thereby is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. This corresponds to Ser at position 23 to Ser at position 579 in the acid sequence.
  • the above-mentioned ⁇ 1 ⁇ cDNA was radiolabeled and used as a probe, and the cDNA library obtained in Example 1 was further screened. In this way, multiple positive clones were obtained.
  • the cDNA of this clone was subcloned into the EcoRI site of pBS vector (Stratagene) to obtain pBS-TAK1-5 '.
  • This clone was a full-length clone containing the start codon ATG.
  • This cDNA is called TAK1 cDNA.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. In this sequence, nucleotide numbers 1 to 2443 encode Met at position 1 to Ser at position 579, which is the full-length amino acid sequence.
  • RNA hybridizing with the TAKl cDNA was determined in all tissues tested. Or it was expressed in organs (spleen, thymus, lung, heart, liver and brain). High levels were found in spleen, thymus and brain, and low levels in lung, heart and liver.
  • TAKl cDNA and ⁇ 1 ⁇ cDNA were expressed in mammalian expression vector pEF (H. Shibuya et al., Nature Vol. 357, 700 (1992) )
  • pEF human promoter
  • the expression plasmids pEF-TAKl and pEF-TAKl ⁇ are the full-length TAKl code sequence and TAK1 It contains an N-code sequence under the control of the EF promoter.
  • pBS- ⁇ 1 ⁇ PEF-TAK1mN was prepared by inserting the Xhol-HindII fragment and the HindII-XbaI fragment.
  • the pBS is cleaved by EcoR I and Xho I, and the EcoR I -Sac I fragment from pBS-TAIU-5 'and the Sac I-Xho I fragment from pBS- ⁇ 1 ⁇ are inserted into it, thereby obtaining TAK1.
  • PBS-TAK1 containing full-length cDNA (TAK1 cDNA) was obtained.
  • pEF-MSSl was cleaved with EcoRI and SalI, and the EcoRI-Sacl fragment from pBS-TAK1 was inserted into it to produce pEF-TAK1.
  • Escherichia coli containing plasmid pEF-TAK1 is referred to as Escherichia coli MC1061 / P3 (pEF-TAKl), and Escherichia coli containing plasmid pEF-TAK1 mu N is Escherichia coli MC1061 / P3 (pEF-TAK1).
  • TAKl ⁇ N at the National Institute of Bioscience and Human Technology (I 1-3, Tsukuba East, Ibaraki Prefecture) on September 28, 1995, under the accession numbers FEFM-BP-5246 and Deposited internationally under the Budapest Treaty under FERM-BP-5245.
  • the TAK1 gene contained in the plasmid pEF-TAK1 can be cut out using appropriate restriction enzymes, for example, EcoRI and BamHI.
  • TAK1 had an effect on the induction of genes by TGF-3.
  • TGF-1 genactivator inhibitor 1 ( ⁇ 1-1) (MR Keeton et al., J. Biol. Chem. Vol. 266, 23048 (1991)).
  • TGF- / 3 reporter plasmid p800neoLUC containing the luciferase gene controlled by the PA1 promoter driven by TGF- / 3 was used.
  • M. Abe et al., Analyt. Biochem., Vol. 216, 276 (1994) was applied to vlLu lung epithelial cells using the calcium phosphate method (H. Shibuya et al., Nature Vol. 357, 700 (1992). ))
  • TAK1 or ⁇ 1 ⁇ expression plasmid was transiently co-transfected into MvlLu cells together with p800neoLUC.
  • TAK1 expression slightly increased TGF- ⁇ induced gene expression, and ⁇ 1 ⁇ constitutively activated PAI-1 gene expression (Fig. 2, column ⁇ 1 ⁇ ).
  • the level of constitutive expression of the reporter gene by TAK1mN is comparable to that in transfectants treated with TGF-) ⁇ .
  • activated TAK1 ie, ⁇ 1 ⁇
  • TGF-3 was added to the transfectant, the expression of the PAI-1 gene was further increased.
  • Fig. 2 the white bar indicates the case where the guidance was not performed, and the shaded bar indicates the case where the guidance was performed with TGF-.
  • cells were transfected after the transfusion. The cells were cultured for 20 hours in the presence or absence of tol (30 ng / ml), an extract was prepared from the cells, and H. Shibuya et al., Mo 1. Ce 11. Bio 1. 14 Luciferase assay was performed as described in, 5812 (1994).
  • the graph in FIG. 2 shows the relative activity, where the luciferase activity when the cells transformed with the vector (containing no TAK1 gene) were not induced by TGF-31 was defined as 1.
  • the results of the bar graph show the average of the results of three experiments per experiment.
  • ⁇ 1 ⁇ -K63W a catalytically inactive ⁇ 1 ⁇ -K63W was prepared. This was done by site-directed mutagenesis using PCR. In this vector, the lysine at position 63 in the ATP binding site has been replaced by tributane. This mutation is expected to abolish ⁇ 1 ⁇ kinase activity and signal transduction activity.
  • TAK1AN-K63W was co-transfected with p800neoLUC—the ability to constitutively stimulate PA1-1 gene expression was lost (FIG. 2).
  • TAK1 ( ⁇ - ⁇ ) labeled with hemagglutinin (HA) epitope (identified by anti-HA monoclonal antibody 12CA5) to identify appropriate exogenous substrate
  • HA hemagglutinin
  • TAK1 kinase activity can be measured for its ability to activate XMEK2 in vitro.
  • a construct for expression of HA epitope-labeled TAKKHA-TAK1 was prepared as follows. Synthetic oligonucleic acid encoding HA epitope Tyr-Pro-Tyr-Asp-Vat Pro-Asp-Tyr-Ala (SEQ ID NO: 4) recognized by monoclonal antibody 12CA5 Leotide was cloned into the SalI site (+3 position from the ATG codon) and EcoRI site of pBS-TAK1 to prepare pBS-HA-TAK1. pEF-MSS1 was cleaved with EcoRI and SalI, and the EcoRI-XhoI fragment from pBS-HA-TAK1 was inserted into it to produce pEF-HA-TAK1.
  • pNVll-HU11 was digested with Xhol and HindIII. This fragment was isolated and inserted into the HincII-Hindm site of pBS-HA-TAK1.
  • pEF-HA- ⁇ 1 ⁇ was generated by cleaving pEF-MSS1 with EcoR I and Sail, and inserting the Pst I-Xho I fragment from pBS-HA- ⁇ 1 ⁇ into it. Both of these constructs have two copies of the N-terminal HA epitope expressed from the EF promoter.
  • pEF-HA-TAK1 or pEF-HA-TAK1 ⁇ H were transferred to MC3T3-El We transiently transfected into mouse osteoblasts (S. Ohta et al., FEBS Lett. Vol. 314, 356 (1992)). After stimulation with TGF-1, the expressed HA-TAK1 was isolated by immunoprecipitation and its activity was measured by a coupled kinase assay (S. Matsuda et al., J. Biol. Chem.
  • the transfected cells were treated with TGF- / 3K20ngZml) or BMP-4 (100ng / ml) for 0 minute (untreated) for 30 minutes.
  • Cells are scraped into buffer (S. Matsuda et al., J. Bio 1. Chem. Vol. 270, 12781 (1995); T. Moriguchi et al., J. Bio 1. Chem. Vol. 270, 12969 (1 995)), and the cell extract was centrifuged at 15, OOOxg for 10 minutes. The obtained supernatant was subjected to immunoprecipitation with an anti-HA antibody.
  • Activity is shown as fold increase over HA-TAK1 activity from unstimulated cells.
  • the activity of immunoprecipitated TAK1 was measured by its ability to activate recombinant XMEX2ZSEK1.
  • the activity of XMEX2ZSEK1 was measured by its ability to phosphorylate the recombinant kinase-negative (KN) P38ZMPK2 (S. Matsuda et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 12781 (1959); T Moriguchi et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 12781 (1995)).
  • HA-TAK1 does not directly phosphorylate KN-P38 / MPK2. According to immunoblotting of each immunoprecipitation with anti-HA-antibody, almost the same amount of HA-TAK1 was recovered by immunoprecipitation at each time point.
  • TAK1 kinase activity was It began to increase within minutes, peaked after 10 minutes, and almost returned to baseline within 30 minutes (Figure 3).
  • TGF- / S1 stimulated TAK1 kinase activity in a dose-dependent manner (FIG. 4).
  • TAK1 is a member of the TGF-superfamily, BMP (AH Reddi et al., Curr. Opin. Genet. Dev. Vol. 4, 737 (1994)), or epidermal growth factor (EGF).
  • BMP-4 also activated TAK1 kinase in a time- and dose-dependent manner (Figure 4).
  • TAK1 activation was not observed in cells treated with EGF. It is considered that EGF does not induce TAK1 activation not because it does not respond to MC3T3-E1 cells and does not respond to EGF, but because it does not signal TAK1 because of EGulin's signal. This is also evident from the fact that EGF induces fos expression in MC3T3-E1 cells. Together, these data indicate that TAK1 is activated by the TGF-yS superfamily.
  • ⁇ 1 ⁇ can activate the expression of the PA1 gene in a TGF-independent manner (Fig. 2), indicating that kinases with elevated TAK1 mN protein even without TGF-3 treatment of cells. It suggests that it has activity.
  • TAK1 umN protein has higher intrinsic kinase activity ⁇ 1 ⁇ , which lacks the N-terminal 22 amino acid residue, supports the hypothesis that it is connsti tutively active.
  • RNA was prepared from human T cell line Jurkat cells, and cDNA was synthesized according to a conventional method. This was inserted downstream of the TDH3 promoter in the yeast expression vector pNV7 (Ninomiya-Tsuji, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9006-9010 (1991)) to obtain a cDNA. A library was created. Example 6. Screening of cDNA library
  • a mutant strain deficient in Ssk2ZSsk22 and Shol which acts in the hyperosmotic stress signal transduction system of Saccharomyces_cerevisiae, is a YEPD medium (Yeast extract (10 g / ⁇ ), Tryptone (20 g /), glucose (20 g /)), but not in a medium supplemented with 1 M sorbitol (T. Maeda, et al., Science, 269, 554). (1995)). Therefore, by introducing a cDNA into this mutant strain and performing screening, a cDNA capable of complementing the deleted Ssk2 / Ssk22 activity can be isolated.
  • Saccharomyces cerevisiae strain (ssk2 mu, ssk22A, sholA) deficient in Ssk2 / Ssk22 and Shol activities described in the above-mentioned literature was obtained from pNVl 1 -HU11 (mouse) obtained in Example 2. ⁇ ). This transformant was spread on a YEPD plate containing 1 M sorbitol, and incubated at 30 ° C. As a result, yeast transformed with pNVI HU11 grew even under high osmotic stress. As a result, it was confirmed that this screening system was effective.
  • this Saccharomyces cerevisiae strain (ssk2A, ssk22 mu, shol mu) was transformed with the cDNA library prepared in Example 5, and screened under high osmotic pressure. went ( The cells were incubated at 30 ° C in YEPD medium containing 1 M sorbitol. ). As a result, one positive clone pNV7-hTAKl was obtained.
  • the cDNA contained in this clone was amplified using a PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer), and its nucleotide sequence was determined. Its nucleotide sequence and its corresponding amino acid sequence were as shown in SEQ ID NO: 5.
  • the nucleotide sequence of this cDNA shows 92% homology with the nucleotide sequence of mouse TAK1, and the amino acid sequence encoded thereby shows 99% homology with the amino acid sequence of mouse TAK1.
  • the comparison of the nucleotide sequences of mouse TAK1 and human TAK1 is shown in FIGS. 5 to 9, and the comparison of these amino acid sequences is shown in FIGS.
  • the human TAK1 cDNA was subcloned to pUC19 digested with Sail to obtain a plasmid phTAKl containing the full-length human TAK1 cDNA.
  • Escherichia coli JM109 (hTAKl) containing the plasmid phTAKl was named Escherichia coli JM109 (hTAKl), and was sent to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Budapest on July 19, 1996 as FERM BP-5598. Deposited internationally under the Treaty.
  • Bacteria name Escherichia col i JM109 (phTAKl) Deposit date : 19 / Apr / 1996 Accession number : FERM BP-5598
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • VOO IVI 110 OVV VXO ILV IVV 100 1V3 3VV 910 100 DDI VIL 9V0
  • CAA TGC AAA AAA CAA CTA GAG GTC ATC AGA AGT CAG CAG CAG AAA CGA 1907 Gin Cys Lys Lys Gi n Leu Gl u Val lie Arg Ser G in Gi n G in Lys Arg

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Description

明 細 書 ヒ ト TAK1およびそれをコー ドする DNA 技術分野
本発明は、 ト ラ ンスフ ォ ー ミ ング成長因子— 3 (TGF- S ) フ ア ミ リ ーの情報伝達系を担う、 TGF-/Sによって活性化されるキナーゼ（T ransf orming growth factor- β activated k i nasel； TAK1) 、 及ひ その製造方法、 並びにそれをコ一 ドする ヒ 卜の遺伝子に関する。 TA K1は、 MAPKキナーゼのァクチベータ一 （Activator of APK Kinase ； AM_1)と も称され、 TGF- および酵（bone morphogenet i c prote in) により活性化され且つ MAPKキナーゼを リ ン酸化して活性化する 酵素である。 背景技術
TGF-ySスーパ一フ ア ミ リ ーの受容体は細胞質内領域に Ser/Thr キナーゼを含み、 その膜貫通 ドメ イ ンに近いア ミ ノ末端側に G ， S erの繰り返し配列 （GS box) を有する I 型、 及び GS boxを有しない II型に分類される。 TGF- の場合、 リ ガン ドが Π型受容体に結合し た後に I 型受容体との複合体を形成し、 構成的に リ ン酸化されてい る Π型受容体のキナーゼが I 型受容体の GS box付近を リ ン酸化し、 これによつて I 型受容体が活性化されるこ とにより前記リ ガン ドか らのシグナルが細胞内に伝達されると考えられている。 しかしなが ら、 この受容体より下流の伝達分子についてはほとんど知られてい ない。
真核生物である出芽酵母サッカロ ミ セス ' セレビシエー (Saccha romyces cerevisiae) においては、 細胞外力ヽらの接合フ ェ ロモ ン (Mating pheromone) により接合が生ずるまでの情報伝達カスケ一 ドと して、 接合フ ヱ ロモンにより Gプロテイ ンが活性化され、 Gプ 口ティ ンが MAPKKキナーゼ（MAPKKK)(Stell) を活性化し、 活性化さ れた MAPKKKが MAPKキナーゼ（MAPKK) を リ ン酸化して活性化し、 次に こ う して活性化された MAPKK (Ste7)が MAPキナーゼ （マイ ト ジェ ン 一活性ィ匕フロティ ンャナーセ ； mi togen-act i vated protein kinase ； MAPK) をリ ン酸化して活性化し、 最後に MAPKが FUS1蛋白質を活性 化して細胞の接合が開始されるこ とが知られている。
このよ うな MAPKKKと して、 マウスより得られた TAK1 (TGF-yS Act i vated inasel) 力くこれまでに知られている （K， Yamaguch i et al .， Science ( 1995) 270, 2008-2011) 0 発明の開示
本発明は、 哺乳類の TGF- の受容体のシグナル伝達系において、 受容体より も下流に位置し、 該シグナルの伝達に関与する新規な因 子、 それをコー ドする遺伝子、 及び当該因子の製造方法を提供しよ う とする ものである。
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく 、 上記接合フ ェ ロ モ ンの 情報伝達カスケー ドにおける MAPKKK (Ssk2/Ssk22, Shol)の活性が 欠損した酵母サッカロ ミ セス ' セレビンエーにヒ ト由来の cDNAを挿 入し、 活性が欠損した MAPKKKを補完できる cDNAについてスク リ一二 ングし、 活性が欠損した MAPKKKを補完し得る cDNAをク ロ一ニ ングす ることに成功し、 本発明を完成した。
従って、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 23位の Serから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 ト ラ ンスフ ォ ー ミ ング成長 因子 （TGF)— 8によって活性化されるキナーゼ活性を有するポ リべ プチ ドを提供する。 また、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 1 位の Me tから 579位の S e rまでのァ ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF - /3によって活性化される キナーゼ活性を有するポ リべプチ ドを提供する。
また、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 23位の Se rから 579位の S e rまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF- /3によって活性化される キナーゼ活性を有するポ リべプチ ドをコ一ドする DNAを提供する。
また、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 249位の Tから 1919位の A までのヌ ク レオチ ド配列を有する、 TGF- /3によって活性化されるキ ナ一ゼ活性を有するポ リべプチ ドをコ一ドする DNAを提供する。
また、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 1 位の Me tから 579位の S e rまでのァ ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF - によって活性化される キナーゼ活性を有するポ リべプチ ドをコ一 ドする DNAを提供する。
また、 本発明は、 配列番号 ： 5 に示す 183位の Aから 1919位の A までのヌ ク レオチ ド配列を有する、 TGF- によつて活性化されるキ ナ一ゼ活性を有するポ リべプチ ドをコ一 ドする DNAを提供する。
また、 本発明は、 上記のいずれかの DNAを含んでなるベク ター、 上記のいずれかの DNAを含んでなるベク ターにより形質転換された 宿主細胞、 上記のいずれかの DNAを含んでなるベク ターにより形質 転換された宿主細胞を培養し、 培養物から産生物を採取するこ とか らなる、 TGF- 3によつて活性化されるキナーゼ活性を有するポ リぺ プチ ドの製造方法を提供する。
また、 本発明は、 上記の方法により製造される TGF- によって活 性化されるキナーゼ活性を有するポ リペプチ ド、 また、 配列番号 ： 5 に示す 23位の Serから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んで なる、 TGF- 3によって活性化されるキナーゼを提供する。
さ らに、 本発明は上記のポ リペプチ ド、 蛋白質と他の蛋白質との 融合蛋白質を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 酵母発現べク タ一 pNVllを示す。
図 2 は、 種々の TAK1遺伝子の発現に対する TGF- の添加効果を、 ルシフ ユラーゼ遺伝子をリ ポーター遺伝子と して用いて調べた結果 を示すグラフである。
図 3 は、 MC3T3- E1細胞における TAK1遺伝子の活性に対する TGF- /3 及び BMP- 4の効果を免疫沈降法および力 ップル · キナーゼ法により 測定した結果を示すグラ フである。
図 4 は、 HA- TAK1遺伝子で トラ ンスフ ヱ ク 卜 された細胞における TAK1キナーゼ活性に対する種々の濃度の TGF-/3又は BMP-4の効果を 示すグラ フである。 ΤΑΚ1ΔΝ は ΤΑΚ1ΔΝ 遺伝子で ト ラ ンスフ エ ク ト された細胞を TGF- /5及び BMP-4のいずれによつても刺激しなかつた 場合の結果を示す。
図 5 はマウス TAK1をコ ー ドする DNAの塩基配列と ヒ ト TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列との対比を示す。
図 6 はマウス TAK1をコー ドする DNAの塩基配列と ヒ ト TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列との対比を示す。
図 7 はマウス TAK1をコー ドする DNAの塩基配列と ヒ ト TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列との対比を示す。
図 8 はマウス TAK1をコ一ドする DNAの塩基配列と ヒ ト TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列との対比を示す。
図 9 はマウス TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列と ヒ ト TAK1をコ一 ドする DNAの塩基配列との対比を示す。
図 10は、 マウス TAK1のァ ミ ノ酸配列と ヒ ト ΤΑΠのァ ミ ノ酸配列の 対比を示す。
図 11は、 マウス TAK1のァ ミ ノ酸配列と ヒ ト TAK1のァ ミ ノ酸配列の 対比を示す。 発明の実施の形態
本発明によれば、 目的とする遺伝子のク ローニ ングに際しては、 例えば、 MAPKKKの活性を欠損しており且つカスケ一ドの末端に容易 に検出可能な リ ポーター遺伝子を有する酵母に哺乳類の cDNAを含む 発現べク タ一を導入し、 欠損した MAPKKK活性を補完する cDNAが挿入 されたか否かを、 リ ポーター遺伝子の発現により検出すればよい。 さ らに、 例えば、 高浸透圧シグナル伝達系のもとで機能する、 Ssk2 /Ssk22 及び Shol活性を欠く他の酵母を使用するこ と もできる。
この様な検出系と して、 サッ カロ ミ セス ' セレピシェ一 （ Saccha romyces cerevi siae) 中の、 接合フ ェ ロモン （Mating pheromone ) の情報を伝達する MAPK経路 （ I. Herskowi tz, Cell, Vol.80, 187 (1995) ； D. B. Lein et. , Curr. Opin. Cel 1 Biol. Vol.7, 197 (1995) ； J. Schul z et al.， Curr. Opin. Gene Dev. , Vol.5, 31 (1995)) を 用いるこ とができる。 この系における正常な情報伝達カスケー ドは Stellキナーゼ、 Ste7キナーゼ、 及び Fus3ノ Kss 1キナーゼから成り 、 これらはそれぞれ MAPKKK, MAPKK及び MAPKに相当する。 Stell, Ste7、 及び Fus3/Ksslは逐次的に作用 してシグナルを転写因子 Ste 12に伝達し、 この Stel2は FUS1のごとき接合特異的（mating specif ic) 遺伝子の転写を活性化する。
cDNAのスク リ ーニングに際しては、 上記の力スケ一 ド中 Ste7の機 能的変異 （STE7P3") 及び Stellの欠損変異（StellA ) を含むカス ケ一 ドを用いるこ とができ （K. Irie et al. , Science Vol.265, 17 16 (1994))、 この系においては、 接合経路に対応する リ ポーター遺 伝子 FUSlp: :HIS3により付与される ヒスチジ ン表現型（His) によ り モニターする場合、 哺乳類 Raf又は MEKKの活性化型 （それぞれ Rai ΔΝ 又は ΜΕΚΚΔΝ)が Ste7P 368依存的に S t el 1活性の欠損を補完する こ とができることが確認されている。 従って、 上記の変異したカス ケー ドを有する酵母に被験 cDNAを導入して、 ヒ スチジ ン表現型を検 出するこ とにより S t e l l A (MAKKK欠損） を補完することができ る cD NAを選択するこ とができる。
被験 cDNAライブラ リ ーと しては、 任意の哺乳動物由来の cDNAライ ブラ リ ーを用いるこ とができるが、 一例と して、 マウスの細胞系、 例えばマウス細胞系 BAF-B03からの cDNA発現ライ ブラ リ ーを用いる こ とができる。 この cDNAライブラ リ 一は、 マウス 1い 3依存性 pro - 細胞系である BAF- B03から po （A) - RNAに対する cDNAを、 酵母発現 ベク タ一 pNV l lの TDH3プロモーターの制御下にク ローニングするこ とにより得られる。 使用される被験 cDNAライブラ リ ーの他の例は、 ヒ ト細胞系、 例えばヒ ト細胞系 J u rka tからの cDNA発現ラィ ブラ リ ー 0"、ある。
上記の cDNAライブラ リ ーを前記のスク リ 一ニング系により スク リ 一二ングすることにより 1 個の陽性ク ローンを得た。 このク ローン の cDNAの塩基配列及びそれにより コー ドされるァ ミ ノ酸配列は、 配 列番号 ： 1 のヌ ク レオチ ド番号 223〜1893、 及びア ミ ノ酸番号 23〜 579 に相対する。
ヒ ト細胞系からの cDNAライブラ リ ーは上記のスク リ ーニング系に 従ってスク リ ーニングすることができる。 あるいは、 ヒ ト細胞系か らの cDNAライブラ リ ーは、 前記のようにして得られたマウス cDNAを プローブと して使用 してスク リ ーニングするこ とができる。
他の陽性ク ローンの cDNA及びそれにより コー ドされるア ミ ノ酸配 列は配列番号 ： 5 に示すヌ ク レオチ ド 249— 1919及びァ ミ ノ酸 23— 579 に相当する。
さ らに長い cDNA (全長 cDNA) を得るため、 前記の cDNAをプローブ と して用いて、 上記の cDNAライブラ リ ーをスク リ ーニングし、 複数 の陽性ク ローンを得た。 これらのク ローンは、 前記の cDNAに対して 、 約 230bpの 5 ' —延長部分を有していた。 この 5 ' —末端延長部 分を有する cDNAを TAKl cDNAと称し、 この 5 ' —末端延長部分を有 しない最初にク ローニングした cDNAを TAK1 Δ N cDNAと称する。 TAK 1 cDNAのヌ ク レオチ ド配列を配列番号 ： 1 の 1 〜2443に示し、 それ により コ一 ドされているァ ミ ノ酸配列を配列番号 ： 1 のァ ミ ノ酸番 号 ： 1 〜579 に示す。 このア ミ ノ酸配列により示される蛋白質又は ポ リべプチ ドを TAK1蛋白質又はポ リペプチ ドと称する。 これに対し て、 ΤΑΚ1ΔΝ cDNAにより コ一 ドされているァ ミ ノ酸配列により示さ れる蛋白質又はポ リ ペプチ ドを TAK1 Δ N 蛋白質又はポ リ ペプチ ドと 称する。 さ らに、 ヒ ト TAKl cDNAのヌ ク レオチ ド配列は配列番号 ： 5 のヌ ク レオチ ド 1 — 2656により示され、 そ してそれによ り コー ド されるァ ミ ノ酸配列は配列番号 ： 5 のァ ミ ノ酸 1 一 579 によ り示さ れる。
TAK1蛋白質の 1 次ァ ミ ノ酸配列から、 この蛋白質は N—末端側の プロティ ンキナーゼ触媒 ドメ ィ ンと約 300ア ミ ノ酸残基の C 一末端 ドメ イ ンを有するこ とが示唆される。 この触媒 ドメ イ ンはプロティ ンキナーゼ · サブ ドメ イ ン I 〜 X I (S. K. Hanks et al.， Science 241, 42 (1988)) に対応するコ ンセンサス配列を含有する。 この触 媒 ドメ イ ン（ま Raf - 1 (T. 1. Bonner et al. , ucleic Acids Res. Vol .14, 1009 (1986)) 及び隨 K (C. A. Langer - Carter et al. , Scienc e Vol.260， 315 (1993))の触媒 ドメ ィ ンのァ ミ ノ酸配列と約 30%の 同一性を有する。 前記触媒 ドメ イ ンに続く C一末端の 300ァ ミ ノ酸 残基の配列は他の蛋白質との顕著な相同性を有しない。
N—末端の 22個のァ ミ ノ酸のコ ドンを欠く TAK1厶 N cDNAを stell 厶変異を有する酵母に導入すれば stellA変異 （MAPKKK欠損） を補 完するが、 全長の TAKl cDNAを stellA変異株に導入した場合 ste 11Δ変異を補完しない。 従って、 TAK1キナーゼは N—末端の 22個の ア ミ ノ酸の除去により活性化されると考えられる。
従つて本発明は、 配列番号 ： 5 のァ ミ ノ酸配列中の 1 位の Me tか ら 579位の S e rまでのア ミ ノ酸配列を含んで成るポ リペプチ ドをコ — ドする DNAを提供する。 この DNAには、 典型的な例と して、 23位 のア ミ ノ酸 Se rから 579位のァ ミ ノ酸 S e rまでのァ ミ ノ酸配列から 成るポ リ べプチ ドをコ一 ドする DNA、 及び 30位のァ ミ ノ酸 G 1 uから 295位のァ ミ ノ酸 A s pまでのァ ミ ノ酸配列からなるポ リべプチ ドを コー ドする DNAが含まれる。 しかしながら、 本発明の DNAは、 上記 のものに限られる ものではな く 、 1 位の Me t〜 30位の G l uの間のい ずれかのァ ミ ノ酸から 295位のア ミ ノ酸 As pまでのア ミ ノ酸配列か ら成るポ リ ペプチ ドをコー ドする DNAをも包含する。
延長された N—末端を有するポ リ べプチ ドをコ一 ドする D NAであ つても、 発現後のポ リべプチ ドのプロセシ ングにより活性な酵素を 得るこ とができ、 また C末端のキナーゼ以外の領域を欠いていても 同様のキナーゼ活性を有すると容易に想像できるからである。
本発明はまた、 上記種々の DNAのヌ ク レオチ ド配列に対応するァ ミ ノ酸配列を有するポリ べプチ ド又は蛋白質、 特に TAK 1活性を保持 しているポリ ペプチ ド又は蛋白質を提供する。 よ り具体的な例と し て、 本発明は、 上記種々の DNAを、 例えばベク ター、 特に発現べク ターに挿入した状態で宿主細胞、 例えば動物細胞又は微生物細胞に 導入して発現されるポリペプチ ド又は蛋白質、 特に TAK1活性を有す るポ リペプチ ド又は蛋白質に関する。
典型的には、 本発明のポ リペプチ ド又は蛋白質は、 配列番号 ： 5 に示すァ ミ ノ酸配列中の 1 位の Me t (これを含む） 〜23位の S e これ を含む） の間のいずれかのア ミ ノ酸から 579位のァ ミ ノ酸 S e rまで のァ ミ ノ酸配列を有する。
また、 本発明はさ らに、 上記のポ リペプチ ド又は蛋白質と他の蛋 白質との融合蛋白質を提供する。 TAK1活性を有するポ リベプチ ド又 は蛋白質と融合される他の蛋白質は、 実施例に記載されているへマ グルチニ ンの他、 適宜選択するこ とができる。 TAK1活性を有するポ リ ペプチ ド又は蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質をコー ドする D NAは、 実施例 4 に記載の方法により構築され、 発現させる こ とがで きる。
前記のごと く 、 ヒ ト TAK1をコ一 ドする cDNAはマゥス TAK1をコ一ド する cDNAを用いて得るこ とができ、 そ して実施例 5及び 6 は、 ヒ ト TAK1をコ一 ドする cDNAの単離を示す。
前記種々の本発明の DNAは、 例えば実施例 2 に記載する方法によ り動物細胞から、 例えば cDNAと してク ローニングするこ とができる 。 生来の cDNAに対して変異又は修飾された DNAは、 例えば生来の cD NAを铸型と して、 PCR増幅、 部位特異的変異誘発、 等の常用手段に よ り調製するこ とができる。
本発明のポ リペプチ ド又は蛋白質は、 対応する DNAを適当な宿主 中で発現させるこ とにより得られる。 この場合、 宿主と しては、 真 核細胞、 例えばヒ ト、 サル、 マウス、 ハムスター、 力エル等の高等 真核生物の培養細胞、 例えば、 THP- 1細胞、 MC3T3- E1細胞、 XTC細 胞、 MvlLu細胞、 CH0細胞、 COS細胞、 等 ； 下等真核細胞、 例えば 、 糸状菌、 例えばァスペルギルス (Aspergillus ) 属糸状菌、 例え ばァスペルギルス ' 二ガー （Aspergillus niger ) ； あるいは酵 母、 例えばサッカロ ミ セス （Saccharomyces ) 属酵母、 例えばサッ カ ロ ミ セス - セ レ ビンエー ( Saccharomy ces cerev i s i ae) 等力く ί史 用される。 さ らに宿主と しては、 原核細胞、 例えば細菌、 例えば大 腸菌 (Escherichia col i) 等が使用される。
これらの宿主において目的 DNAの発現を行う場合、 宿主に応じて 適当なプロモーター等の発現制御配列が使用される。 例えば動物細 胞内での発現においては pCDM8, pSV, pEF等の各プロモーターを有 するプラス ミ ドが使用され、 酵母宿主においては、 例えば pNVll等 のプラス ミ ドが使用され、 大腸菌においては例えば pGEMEX, pUEX等 のプラス ミ ドが使用される。
形質転換された宿主の培養は常法により行われるこ とができる。 また、 本発明のポ リペプチ ド又は蛋白質は、 ト ラ ンスジヱニッ ク動 物（Glaser, V.， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) や カイ コ等の昆虫 （Maeda, S， et al. , ature (1985) 315, 592-594 ) を宿主と して産生させるこ とができる。 産生されたポ リ ペプチ ド 又は蛋白質の回収 · 精製は、 酵素の精製のために常用されている方 法、 例えば、 遠心分離、 濾過、 ゲル濾過ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ァフ ィ ニティ ー · ク ロマ 卜グラフ ィ 一等により行う こ とができる。
本発明の TGF- フ ァ ミ リ ーの情報伝達系を担うキナーゼである TG F-/3によって活性化されるキナーゼは、 多く の疾患に関わっている こ とが知られている TGF- /3およびそのスーパーフ ァ ミ リ ーのシグナ ル伝達を抑制または促進する薬剤の検索に使用するこ とにおいて有 用であ。。 実施例
次に、 本発明を実施例により さ らに具体的に説明する。
実施例 1 . cDNAライブラ リ ーの作製
マウ ス - 3依存性細胞系 BAF-B03からの poly(A)-RNAから常法に 従つて cDNAを合成し、 これを図 1 に示す酵母発現べク タ一 pNVlKNi nomiya-Tsu j i, J. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 9006 - 9010 (1 991)) に、 TDH3プロモーターの制御の下に挿入して cDNAライブラ リ 一を作製した。
実施例 2. cDNAライブラ リ ーのスク リ ーニング 実施例 1 において調製した cDNAライブラ リ ーを、 サッ カロ ミ セス • セレビシェ一 ( Saccharomyces cerev i s i ae) SY1984 - P ( i s3 Δ ， stellA, FUSlp: :HIS3， STE7P368)を用いてスク リ ーニングした 。 この酵母では、 接合フ ヱ ロモンの情報伝達系において、 Stellが 変異してその活性が欠損しており、 Ste- 7の 368位のセ リ ンがプロ リ ンにより置換されており、 さ らに FUS1上流活性化配列が HIS3ォ一 プン リ ーディ ングフ レームに連結されてレポーター遺伝子を形成し ている。 この酵母株は生来の hi S3を欠失しており、 従って、 培地中 に外来のヒスチジンが存在する場合、 又は変異により欠損した Ste 11活性が補完された場合にのみ増殖し得る。
S . セレビシエー SY1984-Pを種々のプラス ミ ドにより形質転換し た。 使用 したプラス ミ ドは YCplac22 (ベク ター） 、 pRS314PGKMEKKC T(PGK1プロモーターの下流の N—末端 ドメ イ ンを欠く ΜΕΚΚΔΝ(Κ. J. Blumerら、 Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, Vol.91, 4925 (1994)) を発 現する） 、 及び pADU-Raf AN(ADH1プロモータ一から N—末端 ドメ ィ ンを欠く Raf Δ N を発現する）（K. Irieら、 Science Vol.265， 1716 (1994)) である。 これらの形質転換体をヒスチジンを欠く SC-Hisプ レー トに塗布し、 そして 30°Cにてイ ンキュベー ト した。 その結果、 YCplac22ベク タ一により形質転換された酵母は増殖せず、 pRS314P GKMEKKCT又は pADU- Raf ΔΝ により形質転換された酵母は増殖した。 これにより、 このスク リ ーニング系は有効であるこ とが確認された 次に、 前記スク リ ーニング系酵母株 YS1984- Pを、 実施例 1 におい て作製した cDNAライブラ リ ーにより形質転換し、 SC- Hisプレー ト上 でスク リ ーニングしたところ、 1 個の陽性ク ロ一ン pNVU-HUllが得 られた。 このク ローンの cDNAを TAK1厶 N cDNAと称する。 この cDNAの ヌ ク レオチ ド配列をジデォキシヌ ク レオチ ド · チェイ ン · ター ミ ネ —シ ョ ン法により決定した。 そのヌ ク レオチ ド配歹 ljは、 配列番号 ： 1 中のヌ ク レオチ ド 223〜 1893の配列に相当 し、 それにより コー ド されているア ミ ノ酸配列は配列番号 ： 1 のア ミ ノ酸配列中 23位の S er~ 579位の Serに相当する。
次に、 全長 cDNAをク ローニングすべく 、 前記 ΤΑΚ1ΔΝ cDNAを放射 能標識してプローブと して使用 し、 実施例 1 において得た cDNAラィ ブラ リ ーをさ らにスク リ ーニングした。 こ う して、 複数の陽性ク ロ —ンを得た。 このク ローンの cDNAを pBSベク ター （Stratagene社製 ) の EcoR I 部位にサブク ロ一ニングし、 pBS- TAK1-5' を得た。 この ク ローンは開始コ ドン ATGを含有する全長ク ローンであった。 この cDNAを TAKl cDNAと称する。 そのヌ ク レオチ ド配列を配列番号 ： 1 に示す。 この配列の内ヌ ク レオチ ド番号 1 ~ 2443に全長ァ ミ ノ酸配 列である 1 位の Met〜 579位の Serがコー ドされている。
実施例 3. TAK1遺伝子の組織分布
マウスの種々の組織から全 RNAを抽出 し、 前記 TAKl cDNAを放射 能ラベルしたものをプローブと して用いてノ ーザンプロ ッティ ング を行ったところ、 TAKl cDNAとハイブリ ダィズする RNAは試験した すべての組織又は器官 （脾臓、 胸腺、 肺、 心臓、 肝臓及び脳） にお いて発現していた。 脾臓、 胸腺及び脳には高レベルで存在し、 そ し て肺、 心臓及び肝臓には低レベルで存在した。
実施例 4 . TAK1キナーゼの性質
哺乳動物細胞での TGF- によって活性化されるキナーゼの機能を 調べるため、 TAKl cDNA及び ΤΑΚ1ΔΝ cDNAを哺乳類発現べク タ一 pE F (H. Shibuya et al. , Nature Vol.357, 700 (1992))に、 ヒ 卜エロ ンゲーシ ヨ ンフ ァ ク ター （EF) プロモーターの制御下に挿入し、 発 現プラス ミ ド pEF- TAK1及び pEF-ΤΑΚΙΔΝ を得た。 発現プラス ミ ド pE F- TAKl及び pEF- TAKl ΔΝ はそれぞれ全長 TAKlコ— ド配列及び TAK1厶 N コー ド配列を EFプロモーターの制御のもとに含有している。
すなわち、 pNVll- HU11の 2.3kbの Xho l 断片を pBSの Xho I ギヤ ップに揷入して pBS- ΤΑΚ1ΔΝ を得た。 pEF- MSSl li. Shibuyaら、 Natu re Vol.357， 700 (1992)) を EcoR I 及び Xba I により開裂せしめ、 そ してこれに、 合成 EcoR I — Xho I リ ンカ一 （センス鎖 ： 5 ' - AA TTCGCCACCATGGC- 3 ' ) (配列番号 ： 2 ) ； ア ンチセ ンス鎖 ： 5 ' - TCGAGCCATGGTGGCG- 3 ' ) (配列番号 ： 3 ) (開始コ ドン ATGを含有す る） 、 並びに pBS- ΤΑΚ1ΔΝ からの Xho l — H i nd Πί断片及び H i nd ΠΙ— Xba I 断片を挿入するこ とにより pEF- TAK1厶 N を作製した。 pBSを EcoR I 及び Xho I により開裂せしめ、 これに pBS- TAIU-5' からの Ec oR I - Sac I 断片、 及び pBS- ΤΑΚ1ΔΝ からの Sac I — Xho I 断片を 挿入するこ とにより、 TAK1の全長 cDNA TAKl cDNA) を含有する pBS - TAK1を得た。 pEF-MSSlを EcoR I 及び Sal I により開裂せしめ、 これ に pBS- TAK1からの EcoR I — Sac l 断片を揷入するこ とによ り pEF-TA K1を作製した。
尚、 プラス ミ ド pEF- TAK1を含有する大腸菌は Escherichia col i MC1061/P3 (pEF-TAKl) と して、 そしてプラス ミ ド pEF- TAK1厶 N を含有する大腸菌 Escherichia col i MC1061/P3 (pEF-TAKl Δ N) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3号） に平成 7年 9 月 28日、 それぞれ、 受託番号 FEFM- BP - 5246および FERM- BP- 5245の下ブダぺス ト条約に基づき国際寄託され た。
プラス ミ ド pEF- TAK1に含まれる TAK1遺伝子は適切な制限酵素、 例 えば EcoR I および BamH I を用いて切り出すこ とができる。
種々の リガン ドによる遺伝子発現の誘導に対する TAK1の効果を試 験した結果、 TAK1は TGF- 3による遺伝子誘導に対して効果を有する こ とが見出された。 TGF- に対する初期細胞性応答はプラス ミ ノ 一 ゲンァクチべ一ターィ ンヒ ビタ一 1 (ΡΛ1- 1) の mRNAレベルの上昇を 誘導する (M. R. Keeton et al. , J. Biol. Chem. Vol.266, 23048 (19 91))。
そこで、 TGF- /3応答に対する TAKlの効果を検討するため、 TGF- /3 により誘導される PA卜 1プロモーターにより制御されるルシフ エラ —ゼ遺伝子を含有する TGF- /3 リ ポータープラス ミ ド p800neoLUC (M. Abe et al. , Analy t. Biochem. , Vol.216, 276 (1994)) を、 vlLu 肺上皮細胞に、 リ ン酸カルシウム法（H. Shibuyaら、 Nature Vol.357 ， 700 (1992)) により一過性 トラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した。 この測定 法においては、 MvlLu肺上皮細胞への p800neoLUCの 卜ラ ンスフ エ ク シ ョ ンにより TGF- 5により誘導されるルシフ ヱラ一ゼ活性の測定が 可能となる。 p800neoLUCにより一過性に ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 された M V 1 Lu細胞は、 4〜 5倍の増強されたリ ポーター遺伝子活性をもって TGF- Sに応答した。 この結果を図 2 のベク ターの欄に示す。
前に作製した TAK1又は ΤΑΚ1ΔΝ 発現プラス ミ ドを p800neoLUCと共 に MvlLu細胞に一過性に同時 トラ ンスフ ヱ ク ト した。 TAK1の発現に より TGF -^誘導性遺伝子発現がわずかに増強され、 そ して ΤΑΚ1ΔΝ は PAI-1遺伝子発現を構成的に活性化した （図 2 の ΤΑΚ1ΔΝ の欄） 。 TAK1厶 N による リ ポーター遺伝子の構成的発現のレベルは TGF- )δ により処理された 卜ラ ンスフ ヱ ク タ ン 卜における レベルに匹敵する 。 従って、 活性化された TAK1 (すなわち ΤΑΚ1ΔΝ)は TGF- Sの非存在 下でシグナルを伝達する こ とができる。 さ らに、 ΤΑΚΙΑΝ ト ラ ンス フ エ ク タ ン トに TGF- 3を添加した場合 PAI- 1遺伝子の発現はさ らに 増加した。
なお、 図 2 において、 白い棒は による誘導を行わなかった 場合を示し、 斜線を付した棒は TGF- による誘導を行った場合を示 す。 上記の実験においては、 トラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ンの後、 細胞をヒ ト l(30ng/ml) の存在下又は非存在下で 20時間培養し、 細胞 から抽出液を調製し、 そ して、 H. Shibuyaら、 Mo 1. Ce 11. B i o 1. Vol .14， 5812 (1994)に記載されているようにしてルシフ iラーゼ測定 を行った。 図 2のグラフでは、 ベク ター （TAK1遺伝子を含有しない ) により形質転換された細胞を TGF- 31 により誘導しなかった場合 のルシフ ェラーゼ活性を 1 と して、 相対活性を示す。 棒グラフの結 果は、 1 実験につき 3連の実験結果の平均を示す。
上記の結果が TAK1のキナーゼ活性により介在されることを確認す るため、 触媒的に不活性な ΤΑΚ1ΔΝ- K63Wを作製した。 これは、 PCR を用いて部位特異的変異誘発により行った。 このベク ターにおいて は、 ATP結合部位における 63位の リ ジンが ト リ ブ トフ ァ ンにより置 換されている。 この変異は ΤΑΚ1ΔΝ のキナーゼ活性及びシグナル伝 達活性を失活させる と予想される。 TAK1AN-K63Wを p800neoLUCと共 に同時— ト ラ ンスフ エ ク トすると、 PA1- 1遺伝子発現を構成的に刺 激する能力が失われた （図 2 ) 。 これらの結果が示唆するところに よれば、 PA卜 1遺伝子の 非依存的発現のためには ΤΑΚ1ΔΝ の キナーゼ活性が必要である。 さ らに、 キナーゼ ， ネガティ ブ TAK1 Δ N は TGF-;Sによる誘導発現の部分的低下を惹起した。 これらの結果 が示唆する と ころによれば、 TAK1は TGF- /3介在シグナル伝達経路の メディ エーターと して機能すると考えられる。
TAK1が TGF- 3介在シグナル伝達経路において機能するこ との直接 的な 正拠を得るために、 TGF- による細胞の処理によつて TAK1のキ ナ一ゼ活性が活性化されるか否か決定した。 適当な外来性基質の同 定のため、 へマグルチニン （HA) ェピ トープによ り標識された TAK1 (ΤΑΠ-ΗΑ) (抗— HAモノ ク ローナル抗体 12CA5により認識されるェピ トープをコー ドする DNA配列を PCRにより TAK1をコー ドする DNAの 3 ' —末端にフ レームを合わせて連結したもの） を発現する酵母細 W 9 6 胞から免疫沈降された TAKlのイ ンビ ト ロ · キナーゼ反応を行った。
このィムノ コ ンプレ ッ クスキナーゼ測定が示すと ころによれば、 活性形の TAK1は MAPKKの XMEK2/SEK1サブフ ァ ミ リ 一 （B. M. Yasher et al. , Nature Vol.372, 794 ( 1994) )をリ ン酸化し、 そ して活性 化することができた。 他方、 もと もとの MAPKK-MEK1 (B. Nishida et al. , Trends Biochem. Sci. , 128 (1993) ； . J. Bl umer et al. , i bid Vol.19， 286 (1994) ； R. J. Davis, ibid Vol.19, 470 (1990) ； C. L. Marchal 1, Cell, Vol.80, 179 (1995)) 、 ヒ ス 卜 ン及びミ エリ ン塩基性蛋白質のリ ン酸化は検出されなかった。 従って、 TAK1キナ —ゼ活性は、 イ ンビ ト ロで XMEK2を活性化するその能力について測 定する ことができる。
HAェピ ト一ブー標識化 TAKKHA- TAK1) の発現用構成物を次の様に して作製した。 モ ノ ク ローナル抗体 12CA5により認識される HAェピ ト―プ Tyr- Pro- Tyr- Asp- Va卜 Pro- Asp- Tyr- Ala (配列番号 ： 4 ) をコ 一ドする合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドを pBS- TAK1の Sal I 部位（ATGコ ド ンから + 3位） 及び EcoR I 部位にク ローニ ングして pBS- HA- TAK1を 作製した。 pEF- MSS1を EcoR I 及び Sal I により開裂せしめ、 そ して それに pBS- HA-TAK1からの EcoR I — Xho I 断片を挿入する こ とによ り pEF- HA- TAK1を作製した。
pBS-HA- ΤΑΚ1ΔΝ を作製するため、 pNVll- HU11を Xho l 及び Hind ΙΠにより消化した。 この断片を単離し、 そ して pBS- HA- TAK1の Hinc Π — Hindm部位に揷入した。 pEF- MSS1を EcoR I 及び Sai l で開裂せ しめ、 そしてそれに pBS- HA- ΤΑΚ1ΔΗ からの Pst I - Xho I 断片を 挿入することにより pEF- HA- ΤΑΚ1ΔΝ を作製した。 これら両構成物 は EFプロモーターから発現される N—末端 HAェピ トープの 2 つのコ ピーを有する。
これらの構成物 pEF-HA- TAK1又は pEF- HA- TAK1 Δ H を MC3T3- Elマ ウス骨芽細胞 （S.Ohtaら、 FEBS Lett. Vol.314, 356 (1992)) に一 過性に トラ ンスフ ヱ ク 卜 した。 TGF- 1 による刺激の後、 発現され た HA- TAK1を免疫沈降により単離し、 そ してその活性をカ ップル ' キナーゼ測定 (coupled kinase assay) (S. Matsudaら、 J. Biol. Chem.
Vol.270, 12969 (1995)) により測定した。
すなわち、 ト ラ ンスフ エ ク 卜された細胞を TGF- /3 K20ngZml) 又 は BMP- 4 (100ng/ml) により 0分間 （未処理） 〜30分間処理した。 細胞を緩衝液中にかきと り （S. Matsudaら、 J. B i o 1. Chem. Vol.270, 12781 (1995) ； T. Mor i guch iら、 J. B i o 1. Chem. Vol.270, 12969 (1 995)) 、 そ して細胞抽出液を 15， OOOx gにて 10分間遠心分離した。 得られた上清を抗 HA抗体による免疫沈降にかけた。 すなわち、 前記 上清の 300〃 1 のァ リ コ一 トを 20 1 の抗体及び 20 1 のプロティ ン Aセフ ァ ロ一スと混合し、 そ してィムノ コ ンプレ ッ クスを PBSで 2 回洗浄し、 そ してこれを用いてキナーゼ測定を行った（S. Matsuda ら、 J. Biol. Chem. Vol.270, 12781 (1995) ； T. Mor i guch iら、 J. Bi ol. Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 。
活性は刺激されていない細胞からの HA-TAK1の活性に対する増加 倍数と して示す。 免疫沈降した TAK1の活性は、 組換え XMEX2ZSEK1 を活性化するその能力によ り測定した。 なお、 XMEX2ZSEK1の活性 は、 組換えキナーゼ · ネガティ ブ（KN) P38ZMPK2をリ ン酸化する能 力により測定した（S. Matsudaら、 J. Biol. Chem. Vol.270, 12781 (1 995) ； T. Moriguchiら、 J. Biol. Chem. Vol.270, 12781 (1995)) 。
HA- TAK1が KN- P38/MPK2を直接リ ン酸化しないこ とは確認されてい る。 なお、 各免疫沈降の抗一 HA—抗体によるィムノ ブロ ッテイ ング によれば、 各時点での免疫沈降においてほとんど同量の HA-TAK1が 回収された。
上記の実験の結果、 TAK1キナーゼ活性は TGF- による刺激の後 5 分間以内に増加しはじめ、 10分後にピークに達し、 そ して 30分以内 にほとんどベースライ ンにもどった （図 3 ) 。 さ らに、 TGF- /S 1 は TAK1キナーゼ活性を投与量依存的に刺激した （図 4 ) 。 次に、 TAK1 が TGF- スーパ一フ ァ ミ リ ーの 1 員である BMP (A. H. Reddiら、 Curr . Opin. Genet. Dev. Vol.4, 737 (1994)) 、 又は上皮成長因子（EGF) により活性化されるか否かを調べた。 興味あることには、 BMP- 4も また TAK1キナーゼを時間一及び用量一依存的に活性化した （図 4 ) o
他方、 EGFにより処理された細胞においては TAK1の活性化は観察 されなかつた。 EGFが TAK1の活性化を誘導しないのは MC3T3- E1細胞 力く EGFに応答しないためではなく 、 EG卩のシグナル力く TAK1を介在し ていないためであると考えられる。 それは EGFは MC3T3- E1細胞中で f osの発現を誘導する こ とからもわかる。 これらのデータが相俟っ て、 TAK1が TGF-ySスーパ一フ ァ ミ リ 一により活性化されるこ とを示 している。
ΤΑΚ1ΔΝ は TGF- 非依存的に PA卜 1遺伝子の発現を活性化する こ とができ （図 2 ) 、 このこ とは、 細胞の TGF- 3処理が無く ても TAK1 厶 N 蛋白質が上昇したキナーゼ活性を有する ことを示唆している。 この可能性を試験するため、 HAェピ ト一プで標識された TAK1厶 N (H Α-ΤΑΚ1ΔΝ) (前記） を MC3T3- E1細胞に一過性に ト ラ ンスフ ヱ ク ト し 、 そ して TAK1厶 N の活性をィムノ コ ンプレッ クスキナーゼ測定によ り測定した。 すなわち、 MC3T3- E1細胞を pEF-HA- ΤΑΚ1ΔΝ により 卜 ラ ンスフ ヱ ク ト し、 ト ラ ンスフヱ ク トされた細胞から HA- TAK1厶 N を前記のようにして免疫沈降せしめ、 そしてその活性を測定した。 すべてのデータを、 刺激されていない細胞からの HA- TAK1の活性 に対する増加倍率により示す。
図 4 に示す通り、 TAK1厶 N 蛋白質はより高い本質的キナーゼ活性 を示し、 N—末端の 22ア ミ ノ酸残基を欠く ΤΑΚ1ΔΝ は構成的に （co nsti tutively) 活性であるとする仮説を支持している。
実施例 5. cDNAラィづ リ 一の作製
ヒ ト T細胞株 Jurkat細胞から poly(A)RNAを調製し、 常法に従って cDNAを合成した。 これを酵母の発現ベク ター pNV7 (Ninomiya-Tsu j i ， J. , ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 9006-9010 (1991)) の TD H3プロモータ一の下流に揷入して cDNAライブラ リ ーを作製した。 実施例 6. cDNAラィブラ リ 一のスク リ ニング
サッ 力口マイセス · セレヒ ジエー ( Saccharomyces_ cerevisiae ) の高浸透圧ス ト レスの情報伝達系で働く 、 Ssk2ZSsk22 、 および Sholの活性を欠損させた変異株は、 YEPD培地 （Yeast ex tract (10 g / ί ) 、 tryptone (20 g / ) 、 glucose(20 g / ))では増殖でき るが、 この培地に 1 Mソルビ トールを添加した培地中では増殖でき ない （T. Maeda, ら、 Science, 269, 554 (1995)) 。 従って、 この変 異株に cDNAを導入してスク リ ーニングを行う こ とにより、 欠損した Ssk2/Ssk22 活性を補完できる cDNAが単離できる。
実際に、 上述の文献に記載されている Ssk2/Ssk22 、 および Shol の活性を欠損させたサッ カロマイセス · セレビジェ一株 （ssk2厶， ssk22A , sholA) を実施例 2で得た pNVl 1 - HU11 (マウス ΤΑΚΙΔΝ) により形質転換した。 この形質転換体を 1 Mソルビ トールを含む YE PDプレー 卜に塗布し、 30°Cにてイ ンキュベー ト した。 その結果、 pN VI卜 HU11によ り形質転換された酵母は高浸透圧ス ト レス下でも増殖 した。 これにより、 このスク リ ーニング系は有効であるこ とが確認 された。
そこで、 このサッ カ ロマイセス ' セレビジェ一株 （ssk2A， ssk 22厶， shol厶） を、 実施例 5 において作製した cDNAライブラ リ ーに より形質転換し、 高浸透圧ス ト レス下でスク リ ーニングを行った （ 1 Mソルビ トールを含む YEPD培地中、 30°Cにてィ ンキュベー ト した 。 ） 。 その結果、 1 個の陽性ク ロー ン pNV7-hTAKlが得られた。 この ク ロ ー ンに含まれる cDNAを、 PRISM Dye Terminator Cycle Sequen cingキッ 卜 （Perkin Elmer製） により増幅し、 その塩基配列を決定 した。 その塩基配列及びその対応ア ミ ノ酸配列は配列番号 ： 5 に示 す通りであった。 この cDNAの塩基配列はマウス TAK1の塩基配列と 92 %の相同性を示し、 それにより コ 一 ドされるァ ミ ノ酸配列はマウ ス TAK1のァ ミ ノ酸配列と 99%の相同性を示した。 マウス TAK1と ヒ 卜 TA K1の塩基配列の対比を図 5〜図 9 に示し、 これらのァ ミ ノ酸配列の 対比を図 10及び図 Πに示す。
ヒ 卜 TAK1 cDNAを、 Sailで消化した pUC19にサブク ロ一ニ ングし て、 ヒ ト TAK1の全長 cDNAを含有するプラス ミ ド phTAKlを得た。 この プラ ス ミ ド phTAKlを含有する大腸菌は、 Escherichia col i JM109 ( hTAKl) と称し、 工業技術院生命工学工業技術研究所に、 FERM BP - 5598と して、 1996年 7 月 19日に、 ブダペス ト条約に基き国際寄託さ れた。
微生物の寄託
以下の微生物を、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号） の特許微生物寄託セ ンターに寄託し、 以 下の受託番号を得た。
菌 名 ： 大腸菌 (Escherichia col i) MC1061/P3 (pEF-TA l) 寄託日 ： 1995年 9 月 28日
受託番号 ： FERM BP- 5246
® 名 ： 大腸菌 (Escherichia col i) MC1061/P3 (pEF-ΤΑΚΙΔ N) 寄託日 ： 1995年 9 月 28日
受託番号 ： FERM BP- 5245
菌 名 ： Escherichia col i JM109 (phTAKl) 寄託日 ： 1996年 Ί月 19日 受託番号 ： FERM BP- 5598
配 列 表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 2443
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA
配 列
GAATTCGGCA CGAGGAGGAG CCGAAGCCGG GACTCGGCGG TGGCCCGGGT CGGTCCCGCG 60 CCACGGAGCG CCGGGCGGCG GGCTGCGGGG CTCCGGGCTG AAGGGCGCTG CGCGAGCCGG 120 AGGGCGGGCG CGGCCCCCCG GGCGCCGCGG GGGATC ATG TCG ACA GCC TCC GCC 174
Met Ser Thr Ala Ser Ala
1 5
GCC TCG TCC TCC TCC TCG TCT TCT GCC AGT GAG ATG ATC GAA GCG CCG 222 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Glu Met l ie Glu Ala Pro
10 15 20
TCG CAG GTC CTG AAC TTC GAA GAG ATC GAC TAC AAG GAG ATC GAG GTG 270 Ser Gin Val Leu Asn Phe Gl u Glu l ie Asp Tyr Lys Glu l ie Glu Val
25 30 35
GAA GAG GTT GTC GGA AGA GGA GCT TTT GGA GTA GTT TGC AAA GCT AAG 318 Glu Glu Val Val Gly Arg Gly Ala Phe Gly Val Val Cys Lys Ala Lys
40 45 50
TGG AGA GCA AAA GAT GTC GCT ATT AAA CAG ATA GAA AGT GAG TCT GAG 366 Trp Arg Ala Lys Asp Val Ala 〗le Lys Gin l ie Glu Ser Glu Ser Glu 55 60 65 70 ε ζ
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520 525 530
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555 560 565
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570 575
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配列の長さ ： 16
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DNA
配 列
AATTCGCCAC CATGGC 16 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 16
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
卜ポロ ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DNA
配 列
TCGAGCCATG GTGGCG 16 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 27
配列の型 ： ア ミ ノ酸
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配 列
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
配列番号 ： 5
配列の長さ ： 2656
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA 8 Z
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545 550 555
CAA TGC AAA AAA CAA CTA GAG GTC ATC AGA AGT CAG CAG CAG AAA CGA 1907 Gin Cys Lys Lys Gi n Leu Gl u Val l ie Arg Ser G in Gi n G i n Lys Arg
560 565 570 575
CAA GGC ACT TCA TGATTCTCTG GGACCGTTAC ATTTTGAAAT ATGCAAAGAA 1959 Gin G l y Thr Ser
AGACTTTTTT TTTAAGGAAA GGAAAACCTT ATAATGACGA TTCATGAGTG TTAGCTTTTT 2019 GGCGTGTTCT GAATGCCAAC TGCCTATATT TGCTGCATTT TTTTCATTGT TTATTTTCCT 2079 TTTCTCATGG TGGACATACA ATTTTACTGT TTCATTGCAT AACATGGTAG CATCTGTGAC 2139 TTGAATGAGC AGCACTTTGC AACTTCAAAA CAGATGCAGT GAACTGTGGC TGTATATGCA 2199 TGCTCAHGT GTGAAGGCTA GCCTAACAGA ACAGGAGGTA TGAAACTAGC TGCTATGTGC 2259 AAACAGCGTC CATTTTTTCA TATTAGAGGT GGAACCTCAA GAATGACTTT ATTCTTGTAT 2319 CTCATCTCAA AATATTAATA ATTTTTTTCC CAAAAGATGG TATATACCAA GTTAAAGACA 2379 GGGTAHATA AATTTAGAGT GATTGGTGGT ATATTACGGA AATACGGAAC CTTTAGGGAT 2439 AGTTCCGTGT AAGGGCTTTG ATGCCAGCAT CCTTGGATCA GTACTGAACT CAGTTCCATC 2499 CGTAAAATAT GTAAAGGTAA GTGGCAGCTG CTCTATTTAA TGAAAGCAGT THACCGGAT 2559 TTTGTTAGAC TAAAATTTGA TTGTGATACA TTGAACAAAA TGGAACTCAT TTTTTTTAAG 2619 GAGTAAAGAT TTTCTTTAGA GCACAATGGA TCTCGAC 2656

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 ： 5 に示す 23位の Serから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 ト ラ ンスフ ォ ー ミ ング成長因子 （TGF)— /5 によって活性化されるキナーゼ活性を有するポ リ べプチ ド。
2. 配列番号 ： 5 に示す 1 位の Metから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF- 3によって活性化されるキナーゼ活性 を有するポ リ ペプチ ド。
3. 配列番号 ： 5 に示す 23位の Serから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF- 5によって活性化されるキナーゼ活性 を有するポ リべプチ ドをコ一 ドする DNA。
4. 配列番号 ： 5 に示す 249位の Tから 1919位の Aまでのヌ ク レ ォチ ド配列を有する請求項 3 に記載の DNA。
5. 配列番号 ： 5 に示す 1 位の Metから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF- ;Sによつて活性化されるキナーゼ活性 を有するポ リべプチ ドをコ一ドする DNA。
6. 配列番号 ： 5 に示す 183位の Aから 1919位の Aまでのヌ ク レ ォチ ド配列を有する請求項 5 に記載の DNA。
7. 請求項 3 — 6 のいずれか 1 項に記載の DNAを含んでなるべク タ―。
8. 請求項 3 — 6のいずれか 1 項に記載の DNAを含んでなるべク ターにより形質転換された宿主細胞。
9. 請求項 3 — 6のいずれか 1 項に記載の DNAを含んでなるべク ターにより形質転換された宿主細胞を培養し、 培養物から産生物を 採取するこ とからなる、 TGF- ;3によつて活性化されるキナーゼ活性 を有するポ リべプチ ドの製造方法。
10. 請求項 9 に記載の方法により製造される TGF- /3によって活性 化されるキナーゼ活性を有するポ リべプチ ド。
11. 配列番号 ： 5 に示す 23位の Serから 579位の Serまでのア ミ ノ酸配列を含んでなる、 TGF- 5によ って活性化されるキナーゼ。
12. 請求項 1 ， 2 , 10および 11のいずれか 1 項に記載の蛋白質と 他の蛋白質との融合蛋白質。
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