JP3942212B2 - ＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担う新規キナーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担う、トランスフォーミング成長因子−βによって活性化されるキナーゼ（Transforming growth factor- β activated kinase ；TAK1) 、及びその製造方法、並びにそれをコードする遺伝子に関する。ＴＡＫ１は、ＭＡＰＫキナーゼのアクチベーター（Activator of MAPK Kinase；AMK-1)とも称され、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）により活性化され且つＭＡＰＫキナーゼをリン酸化して活性化する酵素である。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体は細胞質内領域にＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを含み、その膜貫通ドメインに近いアミノ末端側にＧｌｙ，Ｓｅｒの繰り返し配列（ＧＳ ｂｏｘ）を有するＩ型、及びＧＳ ｂｏｘを有しないII型に分類される。ＴＧＦ−βの場合、リガンドがII型受容体に結合した後にＩ型受容体との複合体を形成し、構成的にリン酸化されているII型受容体のキナーゼがＩ型受容体のＧＳ ｂｏｘ付近をリン酸化し、これによってＩ型受容体が活性化されることにより前記リガンドからのシグナルが細胞内に伝達されると考えられている。しかしながら、この受容体より下流の伝達分子についてはほとんど知られていない。
【０００３】
真核生物である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）においては、細胞外からの接合フェロモン（Mating pheromone) により接合が生ずるまでの情報伝達カスケードとして、接合フェロモンによりＧプロテインが活性化され、ＧプロテインがＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）（Ｓｔｅ１１）を活性化し、活性化されたＭＡＰＫＫＫがＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）をリン酸化して活性化し、次にこうして活性化されたＭＡＰＫＫ（Ｓｔｅ７）がＭＡＰキナーゼ（マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ；mitogen-activated protein kinase；MAPK) をリン酸化して活性化し、最後にＭＡＰＫがＦＵＳ１蛋白質を活性化して細胞の接合が開始されることが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、哺乳類のＴＧＦ−βの受容体のシグナル伝達系において、受容体よりも下流に位置し、該シグナルの伝達に関与する新規な因子、それをコードする遺伝子、及び当該因子の製造方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、上記接合フェロモンの情報伝達カスケードにおけるＭＡＰＫＫＫ（Ｓｔｅ１１）の活性が欠損した酵母サッカロミセス・セレビシエーにマウス由来のｃＤＮＡを挿入し、活性が欠損したＭＡＰＫＫＫを補完できるｃＤＮＡについてスクリーニングし、活性が欠損したＭＡＰＫＫＫを補完し得るｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
従って本発明は、配列番号：１に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：１に示す223 位のT から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【０００７】
また、本発明は、配列番号：１に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：１に示す157 位のA から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【０００８】
また、本発明は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と、60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
【０００９】
本発明は更に、配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：５に示す249 位のT から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
また、本発明は、配列番号：５に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：５に示す183 位のA から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
また、本発明は、配列番号：５に示すヌクレオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と、60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
また、本発明は、配列番号１に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドおよび配列番号５に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、前記いずれかのＤＮＡを含んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、培養物から発現生成物を採取することを特徴とする、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。本発明はまた、この方法により製造される、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号：１の23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するものと予想される。従って本発明は、かかるアミノ酸配列を有するＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ酵素を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、目的とする遺伝子のクローニングに際しては、例えば、ＭＡＰＫＫＫの活性を欠損しており且つカスケードの末端に容易に検出可能なリポーター遺伝子を有する酵母に哺乳類のｃＤＮＡを含む発現ベクターを導入し、欠損したＭＡＰＫＫＫ活性を補完するｃＤＮＡが挿入されたか否かを、リポーター遺伝子の発現により検出すればよい。さらに、例えば、高浸透圧シグナル伝達系のもとで機能する、Ｓｓｋ２／Ｓｓｋ２２及びＳｈｏｌ活性を欠く他の酵母を使用することもできる。
【００１４】
この様な検出系として、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）中の、接合フェロモン（Mating pheromone) の情報を伝達するＭＡＰＫ経路（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, 187 (1995)；D.E.Lein et., Curr.Opin.Cell Biol. Vol.7, 197 (1995)；J.Schulz et al., Curr.Opin.Gene Dev., Vol.5, 31 (1995)) を用いることができる。この系における正常な情報伝達カスケードはＳｔｅ１１キナーゼ、Ｓｔｅ７キナーゼ、及びＦｕｓ３／Ｋｓｓ１キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに相当する。Ｓｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３／Ｋｓｓ１は逐次的に作用してシグナルを転写因子Ｓｔｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接合特異的(mating specific) 遺伝子の転写を活性化する。
【００１５】
ｃＤＮＡのスクリーニングに際しては、上記のカスケード中Ｓｔｅ７の機能的変異（ＳＴＥ７P368）及びＳｔｅ１１の欠損変異（Ｓｔｅ１１Δ）を含むカスケードを用いることができ（K.Irie et al., Science Vol.265, 1716 (1994))、この系においては、接合経路に対応するリポーター遺伝子ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３により付与されるヒスチジン表現型（Ｈｉｓ）によりモニターする場合、哺乳類Ｒａｆ又はＭＥＫＫの活性化形（それぞれＲａｆΔＮ又はＭＥＫＫΔＮ）がＳｔｅ７P368依存的にＳｔｅ１１活性の欠損を代替することができることが確認されている。従って、上記の変異したカスケードを有する酵母に被験ｃＤＮＡを導入して、ヒスチジン表現型を検出することによりＳｔｅ１１Δ（ＭＡＫＫＫ欠損）を補完することができるｃＤＮＡを選択することができる。
【００１６】
被験ｃＤＮＡライブラリーとしては、任意の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることができるが、一例として、マウスの細胞系、例えばマウス細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いることができる。このｃＤＮＡライブラリーは、マウスＩＬ−３依存性ｐｒｏ−β細胞系であるＢＡＦ−ＢＯ３からｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡに対するｃＤＮＡを、酵母発現ベクターｐＮＶ１１のＴＤＨ３プロモーターの制御下にクローニングすることにより得られる。使用される被験ｃＤＮＡライブラリーの他の例は、ヒト細胞系、例えばヒト細胞系ＪｕｒｋａｔからのｃＤＮＡ発現ライブラリーである。
【００１７】
上記のｃＤＮＡライブラリーを前記のスクリーニング系によりスクリーニングすることにより１個の陽性クローンを得た。このクローンのｃＤＮＡの塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド番号223 〜1893、及びアミノ酸番号23〜579 に相対する。
ヒト細胞系からのｃＤＮＡライブラリーは上記のスクリーニング系に従ってスクリーニングすることができる。あるいは、ヒト細胞系からのｃＤＮＡライブラリーは、前記のようにして得られたマウスｃＤＮＡをプローブとして使用してスクリーニングすることができる。
他の陽性クローンのｃＤＮＡ及びそれによりコードされるアミノ酸配列は配列番号：５に示すヌクレオチド249 −1919及びアミノ酸23−579 に相当する。
【００１８】
さらに長いｃＤＮＡ（全長ｃＤＮＡ）を得るため、前記のｃＤＮＡをプローブとして用いて、上記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、複数の陽性クローンを得た。これらのクローンは、前記のｃＤＮＡに対して、約２３０bpの５′−延長部分を有していた。この５′−末端延長部分を有するｃＤＮＡをＴＡＫ１ ｃＤＮＡと称し、この５′−末端延長部分を有しない最初にクローニングしたｃＤＮＡをＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡと称する。ＴＡＫ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１の1 〜2443に示し、それによりコードされているアミノ酸配列を配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５７９に示す。このアミノ酸配列により示されるタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１タンパク質又はポリペプチドと称する。これに対して、ＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡによりコードされているアミノ酸配列により示されるタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１ΔＮタンパク質又はポリペプチドと称する。さらに、ヒトＴＡＫ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号：５のヌクレオチド１−2656により示され、そしてそれによりコードされるアミノ酸配列は配列番号：５のアミノ酸１−579 により示される。
【００１９】
ＴＡＫ１タンパク質の１次アミノ酸配列から、この蛋白質はＮ−末端側のプロテインキナーゼ触媒ドメインと約３００アミノ酸残基のＣ−末端ドメインを有することが示唆される。この触媒ドメインはプロテインキナーゼ・サブドメインＩ〜XI（S.K.Hanks et al., Science 241, 42 (1988)) に対応するコンセンサス配列を含有する。この触媒ドメインはＲａｆ−１(T.I.Bonner et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 1009 (1986)) 及びＭＥＫＫ(C.A.Langer-Carter et al., Science Vol.260, 315 (1993)) の触媒ドメインのアミノ酸配列と約３０％の同一性を有する。前記触媒ドメインに続くＣ−末端の３００アミノ酸残基の配列は他のタンパク質との顕著な相同性を有しない。
【００２０】
Ｎ−末端の２２個のアミノ酸のコドンを欠くＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡをｓｔｅ１１Δ変異を有する酵母に導入すればｓｔｅ１１Δ変異（ＭＡＰＫＫＫ欠損）を補完するが、全長のＴＡＫ１ ｃＤＮＡをｓｔｅ１１Δ変異株に導入した場合ｓｔｅ１１Δ変異を補完しない。従って、ＴＡＫ１キナーゼはＮ−末端の２２個のアミノ酸の除去により活性化されると考えられる。
【００２１】
従って本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列中の１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡには、典型的な例として、23位のアミノ酸Ser から579 位のアミノ酸Ser までのアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び30位のアミノ酸Glu から295 位のアミノ酸Asp までのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。しかしながら、本発明のＤＮＡは、上記のものに限られるものではなく、１位のMet 〜30位のGlu の間のいずれかのアミノ酸から295 位のアミノ酸Asp までのアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡをも包含する。
【００２２】
延長されたＮ−末端を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであっても、発現後のポリペプチドのプロセシングにより活性な酵素を得ることができ、またC 末端のキナーゼ以外の領域を欠いていても同様のキナーゼ活性を有すると容易に想像できるからである。
さらに、本発明は、配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、典型的な例として、配列番号：５に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００２３】
本発明はまた、上記の種々のアミノ酸配列を有するポリペプチドの修飾体であって、なおＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性（ＴＡＫ１活性と称する）を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡをも包含する。この修飾は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列中の上記種々の長さのアミノ酸配列に対して１〜少数個、例えば約１〜１０個、又は約１〜５個のアミノ酸の付加、除去、及び／又は他のアミノ酸による置換を意味する。より一般的には、本発明は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００２４】
本発明はまた、配列番号：１又は配列番号：５に示すヌクレオチド配列と例えば60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS の条件下でハイブリダイズすることができ、且つＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコードしているＤＮＡをも包含する。ここで、0.1 ×SSC は、3MNaClおよび0.3Mクエン酸ナトリウムからなる20×SSC を200 倍に希釈して使用することができる。
【００２５】
本発明はさらに、上記種々のＤＮＡのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチド又はタンパク質を提供する。より具体的な例として、本発明は、上記種々のＤＮＡを、例えばベクター、特に発現ベクターに挿入した状態で宿主細胞、例えば動物細胞又は微生物細胞に導入して発現されるポリペプチド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を有するポリペプチド又はタンパク質に関する。
【００２６】
典型的には、本発明のポリペプチド又はタンパク質は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列中の１位のMet （これを含む）〜23位のSer （これを含む）の間のいずれかのアミノ酸から579 位のアミノ酸Ser までのアミノ酸配列を有する。
本発明はさらに、上記のアミノ酸配列に対して１〜少数個、例えば１〜１０個、又は１〜５個のアミノ酸残基の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質を包含する。これらは好ましくはＴＡＫ１活性を有する。本発明はまた、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列の全部又は一部分に対して80％以上、好ましくは90％以上、そしてさらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し且つＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチド又はタンパク質に関する。
【００２７】
前記のごとく、ヒトＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡはマウスＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡを用いて得ることができ、そして実施例５及び６は、ヒトＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡの単離を示す。
前記種々の本発明のＤＮＡは、例えば実施例２に記載する方法により動物細胞から、例えばｃＤＮＡとしてクローニングすることができる。生来のｃＤＮＡに対して変異又は修飾されたＤＮＡは、例えば生来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅、部位特異的変異誘発、等の常用手段により調製することができる。
【００２８】
本発明のポリペプチド又はタンパク質は、対応するＤＮＡを適当な宿主中で発現させることにより得られる。この場合、宿主としては、真核細胞、例えばヒト、サル、マウス、ハムスター、カエル等の高等真核生物の培養細胞、例えば、THP-1 細胞、MC3T3-E1細胞、XTC 細胞、Mv1Lu 細胞、CHO 細胞、COS 細胞、等；下等真核細胞、例えば、糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）；あるいは酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）等が使用される。さらに宿主としては、原核細胞、例えば細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）等が使用される。
【００２９】
これらの宿主において目的ＤＮＡの発現を行う場合、宿主に応じて適当なプロモーター等の発現制御配列が使用される。例えば動物細胞内での発現においてはpCDM8 、pSV 、pEF 等の各プロモーターを有するプラスミドが使用され、酵母宿主においては、例えばpNV11 等のプラスミドが使用され、大腸菌においては例えばpGEMEX、pUEX等のプラスミドが使用される。
【００３０】
形質転換された宿主の培養は常法により行われることができる。培養物からのポリペプチド又はタンパク質の回収・精製は、酵素の精製のために常用されている方法、例えば、遠心分離、濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明のＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担うキナーゼであるＴＧＦ−βによって活性化されるキナ−ゼは、多くの疾患に係わっていることが知られているＴＧＦ−βおよびそのスーパーファミリーのシグナル伝達を抑制または促進する薬剤の検索に使用することにおいて有用である。
【００３１】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製
マウスＩＬ−３依存性細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを合成し、これを図１に示す酵母発現ベクターｐＮＶ１１（Ninomiya-Tsuji, J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9006-9010 (1991) ）に、ＴＤＨ３プロモーターの制御の下に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００３２】
実施例２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例１において調製したｃＤＮＡライブラリーを、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）ＳＹ１９８４−Ｐ（ｈｉｓ３Δ，ｓｔｅ１１Δ，ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３，ＳＴＥ７P368）を用いてスクリーニングした。この酵母では、接合フェロモンの情報伝達系において、Ｓｔｅ１１が変異してその活性が欠損しており、Ｓｔｅ−７の３６８位のセリンがプロリンにより置換されており、さらにＦＵＳ１上流活性化配列がＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結されてレポーター遺伝子を形成している。この酵母株は生来のｈｉｓ３を欠失しており、従って、培地中に外来のヒスチジンが存在する場合、又は変異により欠損したＳｔｅ１１活性が補完された場合にのみ増殖し得る。
【００３３】
Ｓ．セレビシエーＳＹ１９８４−Ｐを種々のプラスミドにより形質転換した。使用したプラスミドはＹＣｐｌａｃ２２（ベクター）、ｐＲＳ３１４ＰＧＫＭＥＫＫＣＴ（ＰＧＫ１プロモーターの下流のＮ−末端ドメインを欠くＭＥＫＫΔＮ（K.J.Blumerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.91, 4925 (1994))を発現する) 、及びｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮ（ＡＤＨ１プロモーターからＮ−末端ドメインを欠くＲａｆΔＮを発現する） (K.Irieら、Science Vol.265, 1716 (1994)) である。これらの形質転換体をヒスチジンを欠くＳＣ−Ｈｉｓプレートに塗布し、そして３０℃にてインキュベートした。その結果、ＹＣｐｌａｃ２２ベクターにより形質転換された酵母は増殖せず、ｐＲＳ３１４ＰＧＫＭＥＫＫＣＴ又はｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮにより形質転換された酵母は増殖した。これにより、このスクリーニング系は有効であることが確認された。
【００３４】
次に、前記スクリーニング系酵母株ＹＳ１９８４−Ｐを、実施例１において作製したｃＤＮＡライブラリーにより形質転換し、ＳＣ−Ｈｉｓプレート上でスクリーニングしたところ、１個の陽性クローンｐＮＶ１１−ＨＵ１１が得られた。このクローンのｃＤＮＡをＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡと称する。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により決定した。そのヌクレオチド配列は、配列番号：１中のヌクレオチド223 〜1893の配列に相当し、それによりコードされているアミノ酸配列は配列番号：１のアミノ酸配列中23位のSer 〜579 位のSer に相当する。
【００３５】
次に、全長ｃＤＮＡをクローニングすべく、前記ＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡを放射能標識してプローブとして使用し、実施例１において得たｃＤＮＡライブラリーをさらにスクリーニングした。こうして、複数のポジティブクローンを得た。このクローンのｃＤＮＡをｐＢＳベクター（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′を得た。このクローンは開始コドンＡＴＧを含有する全長クローンであった。このｃＤＮＡをＴＡＫ１ ｃＤＮＡと称する。そのヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。この配列の内ヌクレオチド番号１〜2443に全長アミノ酸配列である１位のMet 〜579 位のSer がコードされている。
【００３６】
実施例３．ＴＡＫ１遺伝子の組織間分布
マウスの種々の組織から全ＲＮＡを抽出し、前記ＴＡＫ１ ｃＤＮＡを放射能ラベルしたものをプローブとして用いてノーサンブロッティングを行ったところ、ＴＡＫ１ ｃＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡは試験したすべての組織又は器官（脾臓、胸腺、肺、心臓、肝臓及び脳）において発現していた。脾臓、胸腺及び脳には高レベルで存在し、そして肺、心臓及び肝臓には低レベルで存在した。
【００３７】
実施例４．ＴＡＫ１キナーゼの性質
哺乳動物細胞でのＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの機能を調べるため、ＴＡＫ１ｃＤＮＡ及びＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ（H.Shibuya et al., Nature Vol.357, 700 (1992)）に、ヒトエロンゲーションファクター（ＥＦ）プロモーターの制御下に挿入し、発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１及びｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１及びｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮはそれぞれ全長ＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１ΔＮコード配列をＥＦプロモーターの制御のもとに含有している。
【００３８】
すなわち、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１の２．３kbのＸｈｏＩ断片をｐＢＳのＸｈｏＩギャップに挿入してｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１(H.Shibuyaら、Nature Vol.357, 700 (1992)) をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより開裂せしめ、そしてこれに、合成ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカー（センス鎖：５′−AATTCGCCACCATGGC−３′）（配列番号：２）；アンチセンス鎖：５′−TCGAGCCATGGTGGCG−３′）（配列番号：３）（開始コドンＡＴＧを含有する）、並びにｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片及びＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを作製した。ｐＢＳをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより開裂せしめ、これにｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片、及びｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮからのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することにより、ＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡ（ＴＡＫ１ ｃＤＮＡ）を含有するｐＢＳ−ＴＡＫ１を得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、これにｐＢＳ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＫ１を作製した。
【００３９】
尚、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１を含有する大腸菌はEscherichia coli ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）として、そしてプラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを含有する大腸菌はEscherichia coli ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成７年９月２８日、それぞれ、受託番号ＦＥＦＭ−ＢＰ−５２４６およびＦＥＲＭ−ＢＰ−５２４５の下ブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【００４０】
プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１に含まれるＴＡＫ１遺伝子は適切な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて切り出すことができる。
種々のリガンドによる遺伝子発現の誘導に対するＴＡＫ１の効果を試験した結果、ＴＡＫ１はＴＧＦ−βによる遺伝子誘導に対して効果を有することが見出された。ＴＧＦ−βに対する初期細胞性応答はプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI-１）のｍＲＮＡレベルの上昇を誘導する（M.R.Keeton et al., J.Biol.Chem. Vol.266, 23048 (1991))。
【００４１】
そこで、ＴＧＦ−β応答に対するＴＡＫ１の効果を検討するため、ＴＧＦ−βにより誘導されるＰＡＩ−１プロモーターにより制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＴＧＦ−βリポータープラスミドｐ８００ｎｅｏＬＵＣ(M.Abe et al., Analyt.Biochem., Vol.216, 276 (1994) ）を、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞に、リン酸カルシウム法(H.Shibuyaら、Nature Vol.357, 700 (1992)により一過性トランスフェクションした。この測定法においては、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞へのｐ８００ｎｅｏＬＵＣのトランスフェクションによりＴＧＦ−βにより誘導されるルシフェラーゼ活性の測定が可能となる。ｐ８００ｎｅｏＬＵＣにより一過性にトランスフェクトされたＭｖ１Ｌｕ細胞は、４〜５倍の増強されたリポーター遺伝子活性をもってＴＧＦ−βに応答した。この結果を図２のベクターの欄に示す。
【００４２】
前に作製したＴＡＫ１又はＴＡＫ１ΔＮ発現プラスミドをｐ８００ｎｅｏＬＵＣと共にＭｖ１Ｌｕ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。ＴＡＫ１の発現によりＴＧＦ−β誘導性遺伝子発現がわずかに増強され、そしてＴＡＫ１ΔＮはＰＡＩ−１遺伝子発現を構成的に活性化した（図２のＴＡＫ１ΔＮの欄）。ＴＡＫ１ΔＮによるリポーター遺伝子の構成的発現のレベルはＴＧＦ−βにより処理されたトランスフェクタントにおけるレベルに匹敵する。従って、活性化されたＴＡＫ１（すなわちＴＡＫ１ΔＮ）はＴＧＦ−βの非存在下でシグナルを伝達することができる。さらに、ＴＡＫ１ΔＮトランスフェクタントにＴＧＦ−βを添加した場合ＰＡＩ−１遺伝子の発現はさらに増加した。
【００４３】
なお、図２において、白い棒はＴＧＦ−βによる誘導を行わなかった場合を示し、斜線を付した棒はＴＧＦ−βによる誘導を行った場合を示す。上記の実験においては、トランスフェクションの後、細胞をヒトＴＧＦ−β１（３０ng／ml）の存在下又は非存在下で２０時間培養し、細胞から抽出液を調製し、そして、 H.Shibuyaら、Mol.Cell.Biol. Vol.14, 5812 (1994)に記載されているようにしてルシフェラーゼ測定を行った。図２のグラフでは、ベクター（ＴＡＫ１遺伝子
を含有しない）により形質転換された細胞をＴＧＦ−β１により誘導しなかった場合のルシフェラーゼ活性を１として、相対活性を示す。棒グラフの結果は、
１実験につき３連の実験結果の平均を示す。
【００４４】
上記の効果がＴＡＫ１のキナーゼ活性により介在されることを確認するため、触媒的に不活性なＴＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗを作製した。これは、ＰＣＲを用いて部位特異的変異誘発により行った。このベクターにおいては、ＡＴＰ−結合部位における63位のリジンがトリプトファンにより置換されている。この変異はＴＡＫ１ΔＮのキナーゼ活性及びシグナル伝達活性を破壊すると予想される。ＴＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗをｐ８００ｎｅｏＬＵＣと共に同時−トランスフェクトすると、ＰＡＩ−１遺伝子発現を構成的に刺激する能力が失われた（図２）。これらの結果が示唆するところによれば、ＰＡ１−１遺伝子のＴＧＦ−β非依存的発現のためにはＴＡＫ１ΔＮのキナーゼ活性が必要である。さらに、キナーゼ・ネガティブＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−βによる誘導発現の部分的低下を惹起した。これらの結果が示唆するところによれば、ＴＡＫ１はＴＧＦ−β介在シグナル伝達経路のメディエーターとして機能すると考えられる。
【００４５】
ＴＡＫ１がＴＧＦ−β介在シグナル伝達経路において機能することの直接的な証拠を得るために、ＴＧＦ−βによる細胞の処理によってＴＡＫ１のキナーゼ活性が活性化されるか否か決定した。適当な外来性基質の同定のため、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープにより標識されたＴＡＫ１（ＴＡＫ１−ＨＡ）（抗−ＨＡモノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによりＴＡＫ１をコードするＤＮＡの３′−末端にフレームを合わせて連結したもの）を発現する酵母細胞から免疫沈降されたＴＡＫ１のインビトロ・キナーゼ反応を行った。
【００４６】
このイムノコンプレックスキナーゼ測定が示すところによれば、活性形のＴＡＫ１のＭＡＰＫＫのＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１サブファミリー（Sanchez et al., Nature Vol.372, 794 (1994)) をリン酸化し、そして活性化することができた。他方、もともとのＭＡＰＫＫ−ＭＥＫ１(E.Nishida et al., Trends Biochem.Sci., 128 (1993)；K.J.Blumer et al., ibid Vol.19, 286 (1994)；R.J.Davis, ibid Vol.19, 470 (1990)；C.L.Marchall, Cell, Vol.80, 179 (1995)) 、ヒストン及びミエリン塩基性タンパク質のリン酸化は検出されなかった。従って、ＴＡＫ１キナーゼ活性は、インビトロでＸＭＥＫ２を活性化するその能力について測定することができる。
【００４７】
ＨＡエピトープ−標識化ＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）の発現用構成物を次の様にして作製した。モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるＨＡエピトープ Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala（配列番号：４）をコードする合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳ−ＴＡＫ１のＳａｌＩ部位（ＡＴＧコドンから＋３位）及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１を作製した。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてそれにｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１を作製した。
【００４８】
ｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製するため、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII により消化した。この断片を単離し、そしてｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１のＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIII 部位に挿入した。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで開裂せしめ、そしてそれにｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨからのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製した。これら両構成物はＥＦプロモーターから発現されるＮ−末端ＨＡエピトープの２つのコピーを有する。
【００４９】
これらの構成物ｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１又はｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス骨芽細胞（S.Ohtaら、FEBS Lett. Vol.314, 356 (1992)) に一過性にトランスフェクトした。ＴＧＦ−β１による刺激の後、発現されたＨＡ−ＴＡＫ１を免疫沈降により単離し、そしてその活性をカップル・キナーゼ測定（coupled kinase assay) (S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) により測定した。
【００５０】
すなわち、トランスフェクトされた細胞をＴＧＦ−β１（２０ng／ml）又はＢＭＰ−４（１００ng／ml）により０分間（未処理）〜３０分間処理した。細胞を緩衝液中にかきとり(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 、そして細胞抽出液を１５，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られた上清を抗ＨＡ抗体による免疫沈降にかけた。すなわち、前記上清の３００μｌのアリコートを２０μｌの抗体及び２０μｌのプロテインＡセファロースと混合し、そしてイムノコンプレックスをＰＢＳで２回洗浄し、そしてこれを用いてキナーゼ測定を行った(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 。
【００５１】
活性は刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の活性に対する増加倍数として示す。免疫沈降したＴＡＫ１の活性は、組換えＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１を活性化するその能力により測定した。なお、ＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１の活性は、組換えキナーゼ・ネガティブ（ＫＮ）ｐ３８／ＭＰＫ２をリン酸化する能力により測定した(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 。ＨＡ−ＴＡＫ１がＫＮ−ｐ３８／ＭＰＫ２を直接リン酸化しないことは確認されている。なお、各免疫沈降の抗−ＨＡ−抗体によるイムノブロッティングによれば、各時点での免疫沈降においてほとんど同量のＨＡ−ＴＡＫ１が回収された。
【００５２】
上記の実験の結果、ＴＡＫ１キナーゼ活性はＴＧＦ−βによる刺激の後５分間以内に増加しはじめ、１０分後にピークに達し、そして３０分以内にほとんどベースラインにもどった（図３）。さらに、ＴＧＦ−β１はＴＡＫ１キナーゼ活性を投与量依存的に刺激した（図４）。次に、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファミリーの１員であるＢＭＰ(A.H.Reddiら、Curr.Opin.Genet.Dev. Vol.4, 737 (1994)）、又は上皮成長因子（ＥＧＦ）により活性化されるか否かを調べた。興味あることには、ＢＭＰ−４もまたＴＡＫ１キナーゼを時間−及び用量−依存的に活性化した（図４）。
【００５３】
他方、ＥＧＦにより処理された細胞においてはＴＡＫ１の活性化は観察されなかった。ＥＧＦがＴＡＫ１の活性化を誘導しないのはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がＥＧＦに応答しないためではなく、ＥＧＦのシグナルがＴＡＫ１を介在していないためであると考えられる。それはＥＧＦはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でｆｏｓの発現を誘導することからもわかる。これらのデータが相俟って、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファミリーにより活性化されることを示している。
【００５４】
ＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−β非依存的にＰＡＩ−１遺伝子の発現を活性化することができ（図２）、このことは、細胞のＴＧＦ−β処理が無くてもＴＡＫ１ΔＮタンパク質が上昇したキナーゼ活性を有することを示唆している。この可能性を試験するため、ＨＡエピトープで標識されたＴＡＫ１ΔＮ（ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮ）（前記）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に一過性にトランスフェクトし、そしてＴＡＫ１ΔＮの活性をイムノコンプレックスキナーゼ測定により測定した。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮによりトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞からＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを前記のようにして免疫沈降せしめ、そしてその活性を測定した。
【００５５】
すべてのデータを、刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の活性に対する増加倍率により示す。
図４に示す通り、ＴＡＫ１ΔＮ蛋白質はより高いベース・キナーゼ活性を示し、Ｎ−末端の２２アミノ酸残基を欠くＴＡＫ１ΔＮは構成的に (constitutively) 活性であるとする仮説を支持している。
【００５６】
実施例５．ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒトＴ細胞株Jurkat細胞からｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製し、常法に従ってｃＤＮＡを合成した。これを酵母の発現ベクターｐＮＶ７（Ninomiya-Tsuji, J., ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 9006-9010(1991)) のＴＤＨ３プロモーターの下流に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５７】
実施例６．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
サッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces cerevisiae）の高浸透圧ストレスの情報伝達系で働く、Ｓｓｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させた変異株は、ＹＥＰＤ培地（Yeast extract(１０ｇ／ｌ）、tryptone（２０ｇ／ｌ）、glucose(２０ｇ／ｌ））では増殖できるが、この培地に１Ｍソルビトールを添加した培地中では増殖できない（T.Maeda,ら、Science, 269, 554(1995))。従って、この変異株にｃＤＮＡを導入してスクリーニングを行うことにより、欠損したＳｓｋ２／Ｓｓｋ２２活性を補完できるｃＤＮＡが単離できる。
【００５８】
実際に、上述の文献に記載されているＳｓｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させたサッカロマイセス・セレビジエー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を実施例２で得たｐＮＶ１１−ＨＵ１１（マウスＴＡＫ１ΔＮ）により形質転換した。この形質転換体を１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤプレートに塗布し、３０℃にてインキュベートした。その結果、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１により形質転換された酵母は高浸透圧ストレス下でも増殖した。これにより、このスクリーニング系は有効であることが確認された。
【００５９】
そこで、このサッカロマイセス・セレビジエー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を、実施例５において作製したｃＤＮＡライブラリーにより形質転換し、高浸透圧ストレス下でスクリーニングを行った（１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤ培地中、３０℃にてインキュベートした。）。その結果、１個の陽性クローンｐＮＶ７−ｈＴＡＫ１が得られた。このクローンに含まれるｃＤＮＡを、PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing キット（Perkin Elmer製）により増幅し、その塩基配列を決定した。その塩基配列及びその対応アミノ酸配列は配列番号：５に示す通りであった。このｃＤＮＡの塩基配列はマウスＴＡＫ１の塩基配列と９２％の相同性を示し、それによりコードされるアミノ酸配列はマウスＴＡＫ１のアミノ酸配列と９９％の相同性を示した。マウスＴＡＫ１とヒトＴＡＫ１の塩基配列の対比を図５〜図９に示し、これらのアミノ酸配列の対比を図１０及び図１１に示す。
ヒトＴＡＫ１ ｃＤＮＡを、Ｓａｌ１で消化したｐＵＣ１９にサブクローニングして、ヒトＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｈＴＡＫ１を得た。このプラスミドｐｈＴＡＫ１を含有する大腸菌は、Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９８として、１９９６年７月１９日に、ブダペスト条約に基き国際寄託された。
【００６０】
微生物の寄託
以下の微生物を、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）の特許微生物寄託センターに寄託し、以下の受託番号を得た。
菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）
寄託日：１９９５年９月２８日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４６
【００６１】
菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）
寄託日：１９９５年９月２８日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４５
菌名：Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）
寄託日：１９９６年７月１９日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９８
【００６２】
【配列表】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、酵母発現ベクターpNV11 を示す。
【図２】図２は、種々のＴＡＫ１遺伝子の発現に対するＴＧＦ−βの添加効果を、ルシフェラーゼ遺伝子をリポーター遺伝子として用いて調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＴＡＫ１遺伝子の活性に対するＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４の効果を免疫沈降法およびカップル・キナーゼ法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＨＡ−ＴＡＫ１遺伝子でトランスフェクトされた細胞におけるＴＡＫ１キナーゼ活性に対する種々の濃度のＴＧＦ−β又はＢＭＰ−４の効果を示すグラフである。ＴＡＫ１ΔＮはＴＡＫ１ΔＮ遺伝子でトランスフェクトされた細胞をＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４のいずれによっても刺激しなかった場合の結果を示す。
【図５】図５はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図６】図６はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図７】図７はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図８】図８はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図９】図９はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図１０】図１０は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列とヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。
【図１１】図１１は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列とヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担う、トランスフォーミング成長因子−βによって活性化されるキナーゼ（Transforming growth factor- β activated kinase ；TAK1) 、及びその製造方法、並びにそれをコードする遺伝子に関する。ＴＡＫ１は、ＭＡＰＫキナーゼのアクチベーター（Activator of MAPK Kinase；AMK-1)とも称され、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）により活性化され且つＭＡＰＫキナーゼをリン酸化して活性化する酵素である。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体は細胞質内領域にＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを含み、その膜貫通ドメインに近いアミノ末端側にＧｌｙ，Ｓｅｒの繰り返し配列（ＧＳ ｂｏｘ）を有するＩ型、及びＧＳ ｂｏｘを有しないII型に分類される。ＴＧＦ−βの場合、リガンドがII型受容体に結合した後にＩ型受容体との複合体を形成し、構成的にリン酸化されているII型受容体のキナーゼがＩ型受容体のＧＳ ｂｏｘ付近をリン酸化し、これによってＩ型受容体が活性化されることにより前記リガンドからのシグナルが細胞内に伝達されると考えられている。しかしながら、この受容体より下流の伝達分子についてはほとんど知られていない。
【０００３】
真核生物である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）においては、細胞外からの接合フェロモン（Mating pheromone) により接合が生ずるまでの情報伝達カスケードとして、接合フェロモンによりＧプロテインが活性化され、ＧプロテインがＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）（Ｓｔｅ１１）を活性化し、活性化されたＭＡＰＫＫＫがＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）をリン酸化して活性化し、次にこうして活性化されたＭＡＰＫＫ（Ｓｔｅ７）がＭＡＰキナーゼ（マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ；mitogen-activated protein kinase；MAPK) をリン酸化して活性化し、最後にＭＡＰＫがＦＵＳ１蛋白質を活性化して細胞の接合が開始されることが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、哺乳類のＴＧＦ−βの受容体のシグナル伝達系において、受容体よりも下流に位置し、該シグナルの伝達に関与する新規な因子、それをコードする遺伝子、及び当該因子の製造方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、上記接合フェロモンの情報伝達カスケードにおけるＭＡＰＫＫＫ（Ｓｔｅ１１）の活性が欠損した酵母サッカロミセス・セレビシエーにマウス由来のｃＤＮＡを挿入し、活性が欠損したＭＡＰＫＫＫを補完できるｃＤＮＡについてスクリーニングし、活性が欠損したＭＡＰＫＫＫを補完し得るｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
従って本発明は、配列番号：１に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：１に示す223 位のT から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【０００７】
また、本発明は、配列番号：１に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：１に示す157 位のA から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【０００８】
また、本発明は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と、60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
【０００９】
本発明は更に、配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：５に示す249 位のT から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
また、本発明は、配列番号：５に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：５に示す183 位のA から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
また、本発明は、配列番号：５に示すヌクレオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と、60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
また、本発明は、配列番号１に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドおよび配列番号５に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、前記いずれかのＤＮＡを含んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、培養物から発現生成物を採取することを特徴とする、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。本発明はまた、この方法により製造される、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号：１の23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するものと予想される。従って本発明は、かかるアミノ酸配列を有するＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ酵素を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、目的とする遺伝子のクローニングに際しては、例えば、ＭＡＰＫＫＫの活性を欠損しており且つカスケードの末端に容易に検出可能なリポーター遺伝子を有する酵母に哺乳類のｃＤＮＡを含む発現ベクターを導入し、欠損したＭＡＰＫＫＫ活性を補完するｃＤＮＡが挿入されたか否かを、リポーター遺伝子の発現により検出すればよい。さらに、例えば、高浸透圧シグナル伝達系のもとで機能する、Ｓｓｋ２／Ｓｓｋ２２及びＳｈｏｌ活性を欠く他の酵母を使用することもできる。
【００１４】
この様な検出系として、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）中の、接合フェロモン（Mating pheromone) の情報を伝達するＭＡＰＫ経路（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, 187 (1995)；D.E.Lein et., Curr.Opin.Cell Biol. Vol.7, 197 (1995)；J.Schulz et al., Curr.Opin.Gene Dev., Vol.5, 31 (1995)) を用いることができる。この系における正常な情報伝達カスケードはＳｔｅ１１キナーゼ、Ｓｔｅ７キナーゼ、及びＦｕｓ３／Ｋｓｓ１キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに相当する。Ｓｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３／Ｋｓｓ１は逐次的に作用してシグナルを転写因子Ｓｔｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接合特異的(mating specific) 遺伝子の転写を活性化する。
【００１５】
ｃＤＮＡのスクリーニングに際しては、上記のカスケード中Ｓｔｅ７の機能的変異（ＳＴＥ７P368）及びＳｔｅ１１の欠損変異（Ｓｔｅ１１Δ）を含むカスケードを用いることができ（K.Irie et al., Science Vol.265, 1716 (1994))、この系においては、接合経路に対応するリポーター遺伝子ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３により付与されるヒスチジン表現型（Ｈｉｓ）によりモニターする場合、哺乳類Ｒａｆ又はＭＥＫＫの活性化形（それぞれＲａｆΔＮ又はＭＥＫＫΔＮ）がＳｔｅ７P368依存的にＳｔｅ１１活性の欠損を代替することができることが確認されている。従って、上記の変異したカスケードを有する酵母に被験ｃＤＮＡを導入して、ヒスチジン表現型を検出することによりＳｔｅ１１Δ（ＭＡＫＫＫ欠損）を補完することができるｃＤＮＡを選択することができる。
【００１６】
被験ｃＤＮＡライブラリーとしては、任意の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることができるが、一例として、マウスの細胞系、例えばマウス細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いることができる。このｃＤＮＡライブラリーは、マウスＩＬ−３依存性ｐｒｏ−β細胞系であるＢＡＦ−ＢＯ３からｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡに対するｃＤＮＡを、酵母発現ベクターｐＮＶ１１のＴＤＨ３プロモーターの制御下にクローニングすることにより得られる。使用される被験ｃＤＮＡライブラリーの他の例は、ヒト細胞系、例えばヒト細胞系ＪｕｒｋａｔからのｃＤＮＡ発現ライブラリーである。
【００１７】
上記のｃＤＮＡライブラリーを前記のスクリーニング系によりスクリーニングすることにより１個の陽性クローンを得た。このクローンのｃＤＮＡの塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド番号223 〜1893、及びアミノ酸番号23〜579 に相対する。
ヒト細胞系からのｃＤＮＡライブラリーは上記のスクリーニング系に従ってスクリーニングすることができる。あるいは、ヒト細胞系からのｃＤＮＡライブラリーは、前記のようにして得られたマウスｃＤＮＡをプローブとして使用してスクリーニングすることができる。
他の陽性クローンのｃＤＮＡ及びそれによりコードされるアミノ酸配列は配列番号：５に示すヌクレオチド249 −1919及びアミノ酸23−579 に相当する。
【００１８】
さらに長いｃＤＮＡ（全長ｃＤＮＡ）を得るため、前記のｃＤＮＡをプローブとして用いて、上記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、複数の陽性クローンを得た。これらのクローンは、前記のｃＤＮＡに対して、約２３０bpの５′−延長部分を有していた。この５′−末端延長部分を有するｃＤＮＡをＴＡＫ１ ｃＤＮＡと称し、この５′−末端延長部分を有しない最初にクローニングしたｃＤＮＡをＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡと称する。ＴＡＫ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１の1 〜2443に示し、それによりコードされているアミノ酸配列を配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５７９に示す。このアミノ酸配列により示されるタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１タンパク質又はポリペプチドと称する。これに対して、ＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡによりコードされているアミノ酸配列により示されるタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１ΔＮタンパク質又はポリペプチドと称する。さらに、ヒトＴＡＫ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号：５のヌクレオチド１−2656により示され、そしてそれによりコードされるアミノ酸配列は配列番号：５のアミノ酸１−579 により示される。
【００１９】
ＴＡＫ１タンパク質の１次アミノ酸配列から、この蛋白質はＮ−末端側のプロテインキナーゼ触媒ドメインと約３００アミノ酸残基のＣ−末端ドメインを有することが示唆される。この触媒ドメインはプロテインキナーゼ・サブドメインＩ〜XI（S.K.Hanks et al., Science 241, 42 (1988)) に対応するコンセンサス配列を含有する。この触媒ドメインはＲａｆ−１(T.I.Bonner et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 1009 (1986)) 及びＭＥＫＫ(C.A.Langer-Carter et al., Science Vol.260, 315 (1993)) の触媒ドメインのアミノ酸配列と約３０％の同一性を有する。前記触媒ドメインに続くＣ−末端の３００アミノ酸残基の配列は他のタンパク質との顕著な相同性を有しない。
【００２０】
Ｎ−末端の２２個のアミノ酸のコドンを欠くＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡをｓｔｅ１１Δ変異を有する酵母に導入すればｓｔｅ１１Δ変異（ＭＡＰＫＫＫ欠損）を補完するが、全長のＴＡＫ１ ｃＤＮＡをｓｔｅ１１Δ変異株に導入した場合ｓｔｅ１１Δ変異を補完しない。従って、ＴＡＫ１キナーゼはＮ−末端の２２個のアミノ酸の除去により活性化されると考えられる。
【００２１】
従って本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列中の１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡには、典型的な例として、23位のアミノ酸Ser から579 位のアミノ酸Ser までのアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び30位のアミノ酸Glu から295 位のアミノ酸Asp までのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。しかしながら、本発明のＤＮＡは、上記のものに限られるものではなく、１位のMet 〜30位のGlu の間のいずれかのアミノ酸から295 位のアミノ酸Asp までのアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡをも包含する。
【００２２】
延長されたＮ−末端を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであっても、発現後のポリペプチドのプロセシングにより活性な酵素を得ることができ、またC 末端のキナーゼ以外の領域を欠いていても同様のキナーゼ活性を有すると容易に想像できるからである。
さらに、本発明は、配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、典型的な例として、配列番号：５に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００２３】
本発明はまた、上記の種々のアミノ酸配列を有するポリペプチドの修飾体であって、なおＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性（ＴＡＫ１活性と称する）を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡをも包含する。この修飾は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列中の上記種々の長さのアミノ酸配列に対して１〜少数個、例えば約１〜１０個、又は約１〜５個のアミノ酸の付加、除去、及び／又は他のアミノ酸による置換を意味する。より一般的には、本発明は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００２４】
本発明はまた、配列番号：１又は配列番号：５に示すヌクレオチド配列と例えば60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS の条件下でハイブリダイズすることができ、且つＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコードしているＤＮＡをも包含する。ここで、0.1 ×SSC は、3MNaClおよび0.3Mクエン酸ナトリウムからなる20×SSC を200 倍に希釈して使用することができる。
【００２５】
本発明はさらに、上記種々のＤＮＡのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチド又はタンパク質を提供する。より具体的な例として、本発明は、上記種々のＤＮＡを、例えばベクター、特に発現ベクターに挿入した状態で宿主細胞、例えば動物細胞又は微生物細胞に導入して発現されるポリペプチド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を有するポリペプチド又はタンパク質に関する。
【００２６】
典型的には、本発明のポリペプチド又はタンパク質は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列中の１位のMet （これを含む）〜23位のSer （これを含む）の間のいずれかのアミノ酸から579 位のアミノ酸Ser までのアミノ酸配列を有する。
本発明はさらに、上記のアミノ酸配列に対して１〜少数個、例えば１〜１０個、又は１〜５個のアミノ酸残基の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質を包含する。これらは好ましくはＴＡＫ１活性を有する。本発明はまた、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列の全部又は一部分に対して80％以上、好ましくは90％以上、そしてさらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し且つＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチド又はタンパク質に関する。
【００２７】
前記のごとく、ヒトＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡはマウスＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡを用いて得ることができ、そして実施例５及び６は、ヒトＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡの単離を示す。
前記種々の本発明のＤＮＡは、例えば実施例２に記載する方法により動物細胞から、例えばｃＤＮＡとしてクローニングすることができる。生来のｃＤＮＡに対して変異又は修飾されたＤＮＡは、例えば生来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅、部位特異的変異誘発、等の常用手段により調製することができる。
【００２８】
本発明のポリペプチド又はタンパク質は、対応するＤＮＡを適当な宿主中で発現させることにより得られる。この場合、宿主としては、真核細胞、例えばヒト、サル、マウス、ハムスター、カエル等の高等真核生物の培養細胞、例えば、THP-1 細胞、MC3T3-E1細胞、XTC 細胞、Mv1Lu 細胞、CHO 細胞、COS 細胞、等；下等真核細胞、例えば、糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）；あるいは酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）等が使用される。さらに宿主としては、原核細胞、例えば細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）等が使用される。
【００２９】
これらの宿主において目的ＤＮＡの発現を行う場合、宿主に応じて適当なプロモーター等の発現制御配列が使用される。例えば動物細胞内での発現においてはpCDM8 、pSV 、pEF 等の各プロモーターを有するプラスミドが使用され、酵母宿主においては、例えばpNV11 等のプラスミドが使用され、大腸菌においては例えばpGEMEX、pUEX等のプラスミドが使用される。
【００３０】
形質転換された宿主の培養は常法により行われることができる。培養物からのポリペプチド又はタンパク質の回収・精製は、酵素の精製のために常用されている方法、例えば、遠心分離、濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明のＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担うキナーゼであるＴＧＦ−βによって活性化されるキナ−ゼは、多くの疾患に係わっていることが知られているＴＧＦ−βおよびそのスーパーファミリーのシグナル伝達を抑制または促進する薬剤の検索に使用することにおいて有用である。
【００３１】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製
マウスＩＬ−３依存性細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを合成し、これを図１に示す酵母発現ベクターｐＮＶ１１（Ninomiya-Tsuji, J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9006-9010 (1991) ）に、ＴＤＨ３プロモーターの制御の下に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００３２】
実施例２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例１において調製したｃＤＮＡライブラリーを、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）ＳＹ１９８４−Ｐ（ｈｉｓ３Δ，ｓｔｅ１１Δ，ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３，ＳＴＥ７P368）を用いてスクリーニングした。この酵母では、接合フェロモンの情報伝達系において、Ｓｔｅ１１が変異してその活性が欠損しており、Ｓｔｅ−７の３６８位のセリンがプロリンにより置換されており、さらにＦＵＳ１上流活性化配列がＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結されてレポーター遺伝子を形成している。この酵母株は生来のｈｉｓ３を欠失しており、従って、培地中に外来のヒスチジンが存在する場合、又は変異により欠損したＳｔｅ１１活性が補完された場合にのみ増殖し得る。
【００３３】
Ｓ．セレビシエーＳＹ１９８４−Ｐを種々のプラスミドにより形質転換した。使用したプラスミドはＹＣｐｌａｃ２２（ベクター）、ｐＲＳ３１４ＰＧＫＭＥＫＫＣＴ（ＰＧＫ１プロモーターの下流のＮ−末端ドメインを欠くＭＥＫＫΔＮ（K.J.Blumerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.91, 4925 (1994))を発現する) 、及びｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮ（ＡＤＨ１プロモーターからＮ−末端ドメインを欠くＲａｆΔＮを発現する） (K.Irieら、Science Vol.265, 1716 (1994)) である。これらの形質転換体をヒスチジンを欠くＳＣ−Ｈｉｓプレートに塗布し、そして３０℃にてインキュベートした。その結果、ＹＣｐｌａｃ２２ベクターにより形質転換された酵母は増殖せず、ｐＲＳ３１４ＰＧＫＭＥＫＫＣＴ又はｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮにより形質転換された酵母は増殖した。これにより、このスクリーニング系は有効であることが確認された。
【００３４】
次に、前記スクリーニング系酵母株ＹＳ１９８４−Ｐを、実施例１において作製したｃＤＮＡライブラリーにより形質転換し、ＳＣ−Ｈｉｓプレート上でスクリーニングしたところ、１個の陽性クローンｐＮＶ１１−ＨＵ１１が得られた。このクローンのｃＤＮＡをＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡと称する。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により決定した。そのヌクレオチド配列は、配列番号：１中のヌクレオチド223 〜1893の配列に相当し、それによりコードされているアミノ酸配列は配列番号：１のアミノ酸配列中23位のSer 〜579 位のSer に相当する。
【００３５】
次に、全長ｃＤＮＡをクローニングすべく、前記ＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡを放射能標識してプローブとして使用し、実施例１において得たｃＤＮＡライブラリーをさらにスクリーニングした。こうして、複数のポジティブクローンを得た。このクローンのｃＤＮＡをｐＢＳベクター（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′を得た。このクローンは開始コドンＡＴＧを含有する全長クローンであった。このｃＤＮＡをＴＡＫ１ ｃＤＮＡと称する。そのヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。この配列の内ヌクレオチド番号１〜2443に全長アミノ酸配列である１位のMet 〜579 位のSer がコードされている。
【００３６】
実施例３．ＴＡＫ１遺伝子の組織間分布
マウスの種々の組織から全ＲＮＡを抽出し、前記ＴＡＫ１ ｃＤＮＡを放射能ラベルしたものをプローブとして用いてノーサンブロッティングを行ったところ、ＴＡＫ１ ｃＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡは試験したすべての組織又は器官（脾臓、胸腺、肺、心臓、肝臓及び脳）において発現していた。脾臓、胸腺及び脳には高レベルで存在し、そして肺、心臓及び肝臓には低レベルで存在した。
【００３７】
実施例４．ＴＡＫ１キナーゼの性質
哺乳動物細胞でのＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼの機能を調べるため、ＴＡＫ１ｃＤＮＡ及びＴＡＫ１ΔＮ ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ（H.Shibuya et al., Nature Vol.357, 700 (1992)）に、ヒトエロンゲーションファクター（ＥＦ）プロモーターの制御下に挿入し、発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１及びｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１及びｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮはそれぞれ全長ＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１ΔＮコード配列をＥＦプロモーターの制御のもとに含有している。
【００３８】
すなわち、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１の２．３kbのＸｈｏＩ断片をｐＢＳのＸｈｏＩギャップに挿入してｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１(H.Shibuyaら、Nature Vol.357, 700 (1992)) をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより開裂せしめ、そしてこれに、合成ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカー（センス鎖：５′−AATTCGCCACCATGGC−３′）（配列番号：２）；アンチセンス鎖：５′−TCGAGCCATGGTGGCG−３′）（配列番号：３）（開始コドンＡＴＧを含有する）、並びにｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片及びＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを作製した。ｐＢＳをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより開裂せしめ、これにｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片、及びｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮからのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することにより、ＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡ（ＴＡＫ１ ｃＤＮＡ）を含有するｐＢＳ−ＴＡＫ１を得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、これにｐＢＳ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＫ１を作製した。
【００３９】
尚、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１を含有する大腸菌はEscherichia coli ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）として、そしてプラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮを含有する大腸菌はEscherichia coli ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成７年９月２８日、それぞれ、受託番号ＦＥＦＭ−ＢＰ−５２４６およびＦＥＲＭ−ＢＰ−５２４５の下ブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【００４０】
プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１に含まれるＴＡＫ１遺伝子は適切な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて切り出すことができる。
種々のリガンドによる遺伝子発現の誘導に対するＴＡＫ１の効果を試験した結果、ＴＡＫ１はＴＧＦ−βによる遺伝子誘導に対して効果を有することが見出された。ＴＧＦ−βに対する初期細胞性応答はプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI-１）のｍＲＮＡレベルの上昇を誘導する（M.R.Keeton et al., J.Biol.Chem. Vol.266, 23048 (1991))。
【００４１】
そこで、ＴＧＦ−β応答に対するＴＡＫ１の効果を検討するため、ＴＧＦ−βにより誘導されるＰＡＩ−１プロモーターにより制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＴＧＦ−βリポータープラスミドｐ８００ｎｅｏＬＵＣ(M.Abe et al., Analyt.Biochem., Vol.216, 276 (1994) ）を、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞に、リン酸カルシウム法(H.Shibuyaら、Nature Vol.357, 700 (1992)により一過性トランスフェクションした。この測定法においては、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞へのｐ８００ｎｅｏＬＵＣのトランスフェクションによりＴＧＦ−βにより誘導されるルシフェラーゼ活性の測定が可能となる。ｐ８００ｎｅｏＬＵＣにより一過性にトランスフェクトされたＭｖ１Ｌｕ細胞は、４〜５倍の増強されたリポーター遺伝子活性をもってＴＧＦ−βに応答した。この結果を図２のベクターの欄に示す。
【００４２】
前に作製したＴＡＫ１又はＴＡＫ１ΔＮ発現プラスミドをｐ８００ｎｅｏＬＵＣと共にＭｖ１Ｌｕ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。ＴＡＫ１の発現によりＴＧＦ−β誘導性遺伝子発現がわずかに増強され、そしてＴＡＫ１ΔＮはＰＡＩ−１遺伝子発現を構成的に活性化した（図２のＴＡＫ１ΔＮの欄）。ＴＡＫ１ΔＮによるリポーター遺伝子の構成的発現のレベルはＴＧＦ−βにより処理されたトランスフェクタントにおけるレベルに匹敵する。従って、活性化されたＴＡＫ１（すなわちＴＡＫ１ΔＮ）はＴＧＦ−βの非存在下でシグナルを伝達することができる。さらに、ＴＡＫ１ΔＮトランスフェクタントにＴＧＦ−βを添加した場合ＰＡＩ−１遺伝子の発現はさらに増加した。
【００４３】
なお、図２において、白い棒はＴＧＦ−βによる誘導を行わなかった場合を示し、斜線を付した棒はＴＧＦ−βによる誘導を行った場合を示す。上記の実験においては、トランスフェクションの後、細胞をヒトＴＧＦ−β１（３０ng／ml）の存在下又は非存在下で２０時間培養し、細胞から抽出液を調製し、そして、 H.Shibuyaら、Mol.Cell.Biol. Vol.14, 5812 (1994)に記載されているようにしてルシフェラーゼ測定を行った。図２のグラフでは、ベクター（ＴＡＫ１遺伝子
を含有しない）により形質転換された細胞をＴＧＦ−β１により誘導しなかった場合のルシフェラーゼ活性を１として、相対活性を示す。棒グラフの結果は、
１実験につき３連の実験結果の平均を示す。
【００４４】
上記の効果がＴＡＫ１のキナーゼ活性により介在されることを確認するため、触媒的に不活性なＴＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗを作製した。これは、ＰＣＲを用いて部位特異的変異誘発により行った。このベクターにおいては、ＡＴＰ−結合部位における63位のリジンがトリプトファンにより置換されている。この変異はＴＡＫ１ΔＮのキナーゼ活性及びシグナル伝達活性を破壊すると予想される。ＴＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗをｐ８００ｎｅｏＬＵＣと共に同時−トランスフェクトすると、ＰＡＩ−１遺伝子発現を構成的に刺激する能力が失われた（図２）。これらの結果が示唆するところによれば、ＰＡ１−１遺伝子のＴＧＦ−β非依存的発現のためにはＴＡＫ１ΔＮのキナーゼ活性が必要である。さらに、キナーゼ・ネガティブＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−βによる誘導発現の部分的低下を惹起した。これらの結果が示唆するところによれば、ＴＡＫ１はＴＧＦ−β介在シグナル伝達経路のメディエーターとして機能すると考えられる。
【００４５】
ＴＡＫ１がＴＧＦ−β介在シグナル伝達経路において機能することの直接的な証拠を得るために、ＴＧＦ−βによる細胞の処理によってＴＡＫ１のキナーゼ活性が活性化されるか否か決定した。適当な外来性基質の同定のため、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープにより標識されたＴＡＫ１（ＴＡＫ１−ＨＡ）（抗−ＨＡモノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによりＴＡＫ１をコードするＤＮＡの３′−末端にフレームを合わせて連結したもの）を発現する酵母細胞から免疫沈降されたＴＡＫ１のインビトロ・キナーゼ反応を行った。
【００４６】
このイムノコンプレックスキナーゼ測定が示すところによれば、活性形のＴＡＫ１のＭＡＰＫＫのＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１サブファミリー（Sanchez et al., Nature Vol.372, 794 (1994)) をリン酸化し、そして活性化することができた。他方、もともとのＭＡＰＫＫ−ＭＥＫ１(E.Nishida et al., Trends Biochem.Sci., 128 (1993)；K.J.Blumer et al., ibid Vol.19, 286 (1994)；R.J.Davis, ibid Vol.19, 470 (1990)；C.L.Marchall, Cell, Vol.80, 179 (1995)) 、ヒストン及びミエリン塩基性タンパク質のリン酸化は検出されなかった。従って、ＴＡＫ１キナーゼ活性は、インビトロでＸＭＥＫ２を活性化するその能力について測定することができる。
【００４７】
ＨＡエピトープ−標識化ＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）の発現用構成物を次の様にして作製した。モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるＨＡエピトープ Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala（配列番号：４）をコードする合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳ−ＴＡＫ１のＳａｌＩ部位（ＡＴＧコドンから＋３位）及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１を作製した。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてそれにｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１を作製した。
【００４８】
ｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製するため、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII により消化した。この断片を単離し、そしてｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１のＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIII 部位に挿入した。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで開裂せしめ、そしてそれにｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨからのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製した。これら両構成物はＥＦプロモーターから発現されるＮ−末端ＨＡエピトープの２つのコピーを有する。
【００４９】
これらの構成物ｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１又はｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス骨芽細胞（S.Ohtaら、FEBS Lett. Vol.314, 356 (1992)) に一過性にトランスフェクトした。ＴＧＦ−β１による刺激の後、発現されたＨＡ−ＴＡＫ１を免疫沈降により単離し、そしてその活性をカップル・キナーゼ測定（coupled kinase assay) (S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) により測定した。
【００５０】
すなわち、トランスフェクトされた細胞をＴＧＦ−β１（２０ng／ml）又はＢＭＰ−４（１００ng／ml）により０分間（未処理）〜３０分間処理した。細胞を緩衝液中にかきとり(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 、そして細胞抽出液を１５，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られた上清を抗ＨＡ抗体による免疫沈降にかけた。すなわち、前記上清の３００μｌのアリコートを２０μｌの抗体及び２０μｌのプロテインＡセファロースと混合し、そしてイムノコンプレックスをＰＢＳで２回洗浄し、そしてこれを用いてキナーゼ測定を行った(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 。
【００５１】
活性は刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の活性に対する増加倍数として示す。免疫沈降したＴＡＫ１の活性は、組換えＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１を活性化するその能力により測定した。なお、ＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１の活性は、組換えキナーゼ・ネガティブ（ＫＮ）ｐ３８／ＭＰＫ２をリン酸化する能力により測定した(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12969 (1995)) 。ＨＡ−ＴＡＫ１がＫＮ−ｐ３８／ＭＰＫ２を直接リン酸化しないことは確認されている。なお、各免疫沈降の抗−ＨＡ−抗体によるイムノブロッティングによれば、各時点での免疫沈降においてほとんど同量のＨＡ−ＴＡＫ１が回収された。
【００５２】
上記の実験の結果、ＴＡＫ１キナーゼ活性はＴＧＦ−βによる刺激の後５分間以内に増加しはじめ、１０分後にピークに達し、そして３０分以内にほとんどベースラインにもどった（図３）。さらに、ＴＧＦ−β１はＴＡＫ１キナーゼ活性を投与量依存的に刺激した（図４）。次に、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファミリーの１員であるＢＭＰ(A.H.Reddiら、Curr.Opin.Genet.Dev. Vol.4, 737 (1994)）、又は上皮成長因子（ＥＧＦ）により活性化されるか否かを調べた。興味あることには、ＢＭＰ−４もまたＴＡＫ１キナーゼを時間−及び用量−依存的に活性化した（図４）。
【００５３】
他方、ＥＧＦにより処理された細胞においてはＴＡＫ１の活性化は観察されなかった。ＥＧＦがＴＡＫ１の活性化を誘導しないのはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がＥＧＦに応答しないためではなく、ＥＧＦのシグナルがＴＡＫ１を介在していないためであると考えられる。それはＥＧＦはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でｆｏｓの発現を誘導することからもわかる。これらのデータが相俟って、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファミリーにより活性化されることを示している。
【００５４】
ＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−β非依存的にＰＡＩ−１遺伝子の発現を活性化することができ（図２）、このことは、細胞のＴＧＦ−β処理が無くてもＴＡＫ１ΔＮタンパク質が上昇したキナーゼ活性を有することを示唆している。この可能性を試験するため、ＨＡエピトープで標識されたＴＡＫ１ΔＮ（ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮ）（前記）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に一過性にトランスフェクトし、そしてＴＡＫ１ΔＮの活性をイムノコンプレックスキナーゼ測定により測定した。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮによりトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞からＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを前記のようにして免疫沈降せしめ、そしてその活性を測定した。
【００５５】
すべてのデータを、刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の活性に対する増加倍率により示す。
図４に示す通り、ＴＡＫ１ΔＮ蛋白質はより高いベース・キナーゼ活性を示し、Ｎ−末端の２２アミノ酸残基を欠くＴＡＫ１ΔＮは構成的に (constitutively) 活性であるとする仮説を支持している。
【００５６】
実施例５．ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒトＴ細胞株Jurkat細胞からｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製し、常法に従ってｃＤＮＡを合成した。これを酵母の発現ベクターｐＮＶ７（Ninomiya-Tsuji, J., ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 9006-9010(1991)) のＴＤＨ３プロモーターの下流に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５７】
実施例６．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
サッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces cerevisiae）の高浸透圧ストレスの情報伝達系で働く、Ｓｓｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させた変異株は、ＹＥＰＤ培地（Yeast extract(１０ｇ／ｌ）、tryptone（２０ｇ／ｌ）、glucose(２０ｇ／ｌ））では増殖できるが、この培地に１Ｍソルビトールを添加した培地中では増殖できない（T.Maeda,ら、Science, 269, 554(1995))。従って、この変異株にｃＤＮＡを導入してスクリーニングを行うことにより、欠損したＳｓｋ２／Ｓｓｋ２２活性を補完できるｃＤＮＡが単離できる。
【００５８】
実際に、上述の文献に記載されているＳｓｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させたサッカロマイセス・セレビジエー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を実施例２で得たｐＮＶ１１−ＨＵ１１（マウスＴＡＫ１ΔＮ）により形質転換した。この形質転換体を１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤプレートに塗布し、３０℃にてインキュベートした。その結果、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１により形質転換された酵母は高浸透圧ストレス下でも増殖した。これにより、このスクリーニング系は有効であることが確認された。
【００５９】
そこで、このサッカロマイセス・セレビジエー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を、実施例５において作製したｃＤＮＡライブラリーにより形質転換し、高浸透圧ストレス下でスクリーニングを行った（１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤ培地中、３０℃にてインキュベートした。）。その結果、１個の陽性クローンｐＮＶ７−ｈＴＡＫ１が得られた。このクローンに含まれるｃＤＮＡを、PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing キット（Perkin Elmer製）により増幅し、その塩基配列を決定した。その塩基配列及びその対応アミノ酸配列は配列番号：５に示す通りであった。このｃＤＮＡの塩基配列はマウスＴＡＫ１の塩基配列と９２％の相同性を示し、それによりコードされるアミノ酸配列はマウスＴＡＫ１のアミノ酸配列と９９％の相同性を示した。マウスＴＡＫ１とヒトＴＡＫ１の塩基配列の対比を図５〜図９に示し、これらのアミノ酸配列の対比を図１０及び図１１に示す。
ヒトＴＡＫ１ ｃＤＮＡを、Ｓａｌ１で消化したｐＵＣ１９にサブクローニングして、ヒトＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｈＴＡＫ１を得た。このプラスミドｐｈＴＡＫ１を含有する大腸菌は、Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９８として、１９９６年７月１９日に、ブダペスト条約に基き国際寄託された。
【００６０】
微生物の寄託
以下の微生物を、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）の特許微生物寄託センターに寄託し、以下の受託番号を得た。
菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）
寄託日：１９９５年９月２８日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４６
【００６１】
菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）
寄託日：１９９５年９月２８日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５２４５
菌名：Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）
寄託日：１９９６年７月１９日
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９８
【００６２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、酵母発現ベクターpNV11 を示す。
【図２】図２は、種々のＴＡＫ１遺伝子の発現に対するＴＧＦ−βの添加効果を、ルシフェラーゼ遺伝子をリポーター遺伝子として用いて調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＴＡＫ１遺伝子の活性に対するＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４の効果を免疫沈降法およびカップル・キナーゼ法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＨＡ−ＴＡＫ１遺伝子でトランスフェクトされた細胞におけるＴＡＫ１キナーゼ活性に対する種々の濃度のＴＧＦ−β又はＢＭＰ−４の効果を示すグラフである。ＴＡＫ１ΔＮはＴＡＫ１ΔＮ遺伝子でトランスフェクトされた細胞をＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４のいずれによっても刺激しなかった場合の結果を示す。
【図５】図５はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図６】図６はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図７】図７はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図８】図８はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図９】図９はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列との対比を示す。
【図１０】図１０は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列とヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。
【図１１】図１１は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列とヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。
Claims (16)
- 配列番号：１に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（TGF）−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号：１に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（TGF）−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号：１に示す223 位のT から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のDNA。
- 配列番号：１に示す157 位のA から1893位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のDNA。
- 配列番号：１に示すヌクレオチド配列に対して90％以上の相同性を有し、且つTGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（TGF）−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号：５に示す１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（TGF）−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号：５に示す249 位のT から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項６に記載のDNA。
- 配列番号：５に示す183 位のA から1919位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項７に記載のDNA。
- 配列番号：５に示すヌクレオチド配列に対して90％以上の相同性を有し、且つTGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号１に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、TGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチド。
- 配列番号５に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、TGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチド。
- 請求項１〜10のいずれか１項に記載のDNAを含んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、培養物から発現生成物を採取することを特徴とする、TGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
- 請求項13に記載の方法により製造されるTGF−βによって活性化され、XMEK2/SEK1をリン酸化するキナーゼ活性を有するポリペプチド。
- 配列番号：１の23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有するTGF−βによって活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ。
- 配列番号：５に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列を有する、TGF−βにより活性化され、 XMEK2/SEK1 をリン酸化するキナーゼ。
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| JPH09163990A (ja) | 1997-06-24 |
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