JPH09163990A

JPH09163990A - ＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担う新規キナーゼ

Info

Publication number: JPH09163990A
Application number: JP8256747A
Authority: JP
Inventors: Naoto Ueno; 直人上野; Kunihiro Matsumoto; 邦弘松本; Kenji Irie; 賢児入江
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1997-06-24
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: JP3942212B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＴＧＦ−βファミリーの情報伝達系を担う新
規キナーゼ及びそれをコードする遺伝子の提供。【解決手段】配列番号：１又は配列番号：５のアミノ
酸配列中の１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸
配列を含むＴＧＦ−β活性化キナーゼ、及びそれをコー
ドするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＴＧＦ−βファミ
リーの情報伝達系を担う、トランスフォーミング成長因
子−βによって活性化されるキナーゼ（Transforming g
rowth factor- βactivated kinase ；TAK1) 、及びそ
の製造方法、並びにそれをコードする遺伝子に関する。
ＴＡＫ１は、ＭＡＰＫキナーゼのアクチベーター（Acti
vator of MAPK Kinase；AMK-1)とも称され、ＴＧＦ−β
およびＢＭＰ（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ）により活性化され且つＭＡＰＫキナ
ーゼをリン酸化して活性化する酵素である。

【０００２】

【従来の技術】ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体
は細胞質内領域にＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを含み、その
膜貫通ドメインに近いアミノ末端側にＧｌｙ，Ｓｅｒの
繰り返し配列（ＧＳｂｏｘ）を有するＩ型、及びＧＳ
ｂｏｘを有しないII型に分類される。ＴＧＦ−βの場
合、リガンドがII型受容体に結合した後にＩ型受容体と
の複合体を形成し、構成的にリン酸化されているII型受
容体のキナーゼがＩ型受容体のＧＳｂｏｘ付近をリン
酸化し、これによってＩ型受容体が活性化されることに
より前記リガンドからのシグナルが細胞内に伝達される
と考えられている。しかしながら、この受容体より下流
の伝達分子についてはほとんど知られていない。

【０００３】真核生物である出芽酵母サッカロミセス・
セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）において
は、細胞外からの接合フェロモン（Mating pheromone)
により接合が生ずるまでの情報伝達カスケードとして、
接合フェロモンによりＧプロテインが活性化され、Ｇプ
ロテインがＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）（Ｓｔ
ｅ１１）を活性化し、活性化されたＭＡＰＫＫＫがＭＡ
ＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）をリン酸化して活性化し、
次にこうして活性化されたＭＡＰＫＫ（Ｓｔｅ７）がＭ
ＡＰキナーゼ（マイトジェン−活性化プロテインキナー
ゼ；mitogen-activated protein kinase；MAPK) をリン
酸化して活性化し、最後にＭＡＰＫがＦＵＳ１蛋白質を
活性化して細胞の接合が開始されることが知られてい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、哺乳類のＴ
ＧＦ−βの受容体のシグナル伝達系において、受容体よ
りも下流に位置し、該シグナルの伝達に関与する新規な
因子、それをコードする遺伝子、及び当該因子の製造方
法を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、上記接合フェロモンの情報伝達カスケ
ードにおけるＭＡＰＫＫＫ（Ｓｔｅ１１）の活性が欠損
した酵母サッカロミセス・セレビシエーにマウス由来の
ｃＤＮＡを挿入し、活性が欠損したＭＡＰＫＫＫを補完
できるｃＤＮＡについてスクリーニングし、活性が欠損
したＭＡＰＫＫＫを補完し得るｃＤＮＡをクローニング
することに成功し、本発明を完成した。

【０００６】従って本発明は、配列番号：１に示す23位
のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該
アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付
加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾
されたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミン
グ成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供
する。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番
号：１に示す223 位のT から1893位のA までのヌクレオ
チド配列を有する。

【０００７】また、本発明は、配列番号：１に示す１位
のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該
アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付
加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾さ
れたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング
成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：
１に示す157 位のA から1893位のA までのヌクレオチド
配列を有する。

【０００８】また、本発明は、配列番号：１に示すヌク
レオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴ
ＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさ
らに、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と、60℃、
0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の
条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−β
によって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを提供する。

【０００９】本発明は更に、配列番号：５に示す23位の
Ser から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該ア
ミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付加、
除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾され
たアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング成
長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：
５に示す249 位のT から1919位のA までのヌクレオチド
配列を有する。

【００１０】また、本発明は、配列番号：５に示す１位
のMet から579 位のSer までのアミノ酸配列、又は当該
アミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸配列の付
加、除去及び又は他のアミノ酸による置換により修飾さ
れたアミノ酸配列を含んで成る、トランスフォ−ミング
成長因子（ＴＧＦ）−βによって活性化されるキナーゼ
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。その１つの態様によれば、前記ＤＮＡは配列番号：
５に示す183 位のA から1919位のA までのヌクレオチド
配列を有する。

【００１１】また、本発明は、配列番号：５に示すヌク
レオチド配列に対して80％以上の相同性を有し、且つＴ
ＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさ
らに、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と、60℃、
0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS （sodium dodecyl sulfate）の
条件下にハイブリダイズすることができ且つＴＧＦ−β
によって活性化されるキナーゼの活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを提供する。また、本発明は、
配列番号１に示す23位のMet から579 位のSer までのア
ミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化さ
れるキナーゼ活性を有するポリペプチドおよび配列番号
５に示す23位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配
列を含んでなる、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナ
ーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。

【００１２】本発明はまた、前記いずれかのＤＮＡを含
んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞を培養
し、培養物から発現生成物を採取することを特徴とす
る、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有
するポリペプチドの製造方法を提供する。本発明はま
た、この方法により製造される、ＴＧＦ−βによって活
性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを提供す
る。このポリペプチドは、配列番号：１の23位のSer か
ら579 位のSer までのアミノ酸配列、又は配列番号：５
に示す23位のSer から579 位のSer までのアミノ酸配列
を有するものと予想される。従って本発明は、かかるア
ミノ酸配列を有するＴＧＦ−βによって活性化されるキ
ナーゼ酵素を提供する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明によれば、目的とする遺伝
子のクローニングに際しては、例えば、ＭＡＰＫＫＫの
活性を欠損しており且つカスケードの末端に容易に検出
可能なリポーター遺伝子を有する酵母に哺乳類のｃＤＮ
Ａを含む発現ベクターを導入し、欠損したＭＡＰＫＫＫ
活性を補完するｃＤＮＡが挿入されたか否かを、リポー
ター遺伝子の発現により検出すればよい。さらに、例え
ば、高浸透圧シグナル伝達系のもとで機能する、Ｓｓｋ
２／Ｓｓｋ２２及びＳｈｏｌ活性を欠く他の酵母を使用
することもできる。

【００１４】この様な検出系として、サッカロミセス・
セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）中の、接
合フェロモン（Mating pheromone) の情報を伝達するＭ
ＡＰＫ経路（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, 187 (199
5)；D.E.Lein et., Curr.Opin.Cell Biol. Vol.7, 197
(1995)；J.Schulz et al., Curr.Opin.Gene Dev., Vol.
5, 31 (1995)) を用いることができる。この系における
正常な情報伝達カスケードはＳｔｅ１１キナーゼ、Ｓｔ
ｅ７キナーゼ、及びＦｕｓ３／Ｋｓｓ１キナーゼから成
り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭ
ＡＰＫに相当する。Ｓｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ
３／Ｋｓｓ１は逐次的に作用してシグナルを転写因子Ｓ
ｔｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき
接合特異的(mating specific) 遺伝子の転写を活性化す
る。

【００１５】ｃＤＮＡのスクリーニングに際しては、上
記のカスケード中Ｓｔｅ７の機能的変異（ＳＴＥ
７^P368）及びＳｔｅ１１の欠損変異（Ｓｔｅ１１Δ）を
含むカスケードを用いることができ（K.Irie et al., S
cience Vol.265, 1716 (1994))、この系においては、接
合経路に対応するリポーター遺伝子ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩ
Ｓ３により付与されるヒスチジン表現型（Ｈｉｓ）によ
りモニターする場合、哺乳類Ｒａｆ又はＭＥＫＫの活性
化形（それぞれＲａｆΔＮ又はＭＥＫＫΔＮ）がＳｔｅ
７^P368依存的にＳｔｅ１１活性の欠損を代替することが
できることが確認されている。従って、上記の変異した
カスケードを有する酵母に被験ｃＤＮＡを導入して、ヒ
スチジン表現型を検出することによりＳｔｅ１１Δ（Ｍ
ＡＫＫＫ欠損）を補完することができるｃＤＮＡを選択
することができる。

【００１６】被験ｃＤＮＡライブラリーとしては、任意
の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることが
できるが、一例として、マウスの細胞系、例えばマウス
細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｃＤＮＡ発現ライブラリー
を用いることができる。このｃＤＮＡライブラリーは、
マウスＩＬ−３依存性ｐｒｏ−β細胞系であるＢＡＦ−
ＢＯ３からｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡに対するｃＤＮＡ
を、酵母発現ベクターｐＮＶ１１のＴＤＨ３プロモータ
ーの制御下にクローニングすることにより得られる。使
用される被験ｃＤＮＡライブラリーの他の例は、ヒト細
胞系、例えばヒト細胞系ＪｕｒｋａｔからのｃＤＮＡ発
現ライブラリーである。

【００１７】上記のｃＤＮＡライブラリーを前記のスク
リーニング系によりスクリーニングすることにより１個
の陽性クローンを得た。このクローンのｃＤＮＡの塩基
配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列
番号：１のヌクレオチド番号223 〜1893、及びアミノ酸
番号23〜579 に相対する。ヒト細胞系からのｃＤＮＡラ
イブラリーは上記のスクリーニング系に従ってスクリー
ニングすることができる。あるいは、ヒト細胞系からの
ｃＤＮＡライブラリーは、前記のようにして得られたマ
ウスｃＤＮＡをプローブとして使用してスクリーニング
することができる。他の陽性クローンのｃＤＮＡ及びそ
れによりコードされるアミノ酸配列は配列番号：５に示
すヌクレオチド249 −1919及びアミノ酸23−579 に相当
する。

【００１８】さらに長いｃＤＮＡ（全長ｃＤＮＡ）を得
るため、前記のｃＤＮＡをプローブとして用いて、上記
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、複数の陽
性クローンを得た。これらのクローンは、前記のｃＤＮ
Ａに対して、約２３０bpの５′−延長部分を有してい
た。この５′−末端延長部分を有するｃＤＮＡをＴＡＫ
１ｃＤＮＡと称し、この５′−末端延長部分を有しな
い最初にクローニングしたｃＤＮＡをＴＡＫ１ΔＮｃ
ＤＮＡと称する。ＴＡＫ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を配列番号：１の1 〜2443に示し、それによりコード
されているアミノ酸配列を配列番号：１のアミノ酸番
号：１〜５７９に示す。このアミノ酸配列により示され
るタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１タンパク質又
はポリペプチドと称する。これに対して、ＴＡＫ１ΔＮ
ｃＤＮＡによりコードされているアミノ酸配列により
示されるタンパク質又はポリペプチドをＴＡＫ１ΔＮタ
ンパク質又はポリペプチドと称する。さらに、ヒトＴＡ
Ｋ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号：５のヌ
クレオチド１−2656により示され、そしてそれによりコ
ードされるアミノ酸配列は配列番号：５のアミノ酸１−
579 により示される。

【００１９】ＴＡＫ１タンパク質の１次アミノ酸配列か
ら、この蛋白質はＮ−末端側のプロテインキナーゼ触媒
ドメインと約３００アミノ酸残基のＣ−末端ドメインを
有することが示唆される。この触媒ドメインはプロテイ
ンキナーゼ・サブドメインＩ〜XI（S.K.Hanks et al.,
Science 241, 42 (1988)) に対応するコンセンサス配列
を含有する。この触媒ドメインはＲａｆ−１(T.I.Bonne
r et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 1009 (1986))
及びＭＥＫＫ(C.A.Langer-Carter et al., Science Vo
l.260, 315 (1993)) の触媒ドメインのアミノ酸配列と
約３０％の同一性を有する。前記触媒ドメインに続くＣ
−末端の３００アミノ酸残基の配列は他のタンパク質と
の顕著な相同性を有しない。

【００２０】Ｎ−末端の２２個のアミノ酸のコドンを欠
くＴＡＫ１ΔＮｃＤＮＡをｓｔｅ１１Δ変異を有する
酵母に導入すればｓｔｅ１１Δ変異（ＭＡＰＫＫＫ欠
損）を補完するが、全長のＴＡＫ１ｃＤＮＡをｓｔｅ
１１Δ変異株に導入した場合ｓｔｅ１１Δ変異を補完し
ない。従って、ＴＡＫ１キナーゼはＮ−末端の２２個の
アミノ酸の除去により活性化されると考えられる。

【００２１】従って本発明は、配列番号：１のアミノ酸
配列中の１位のMet から579 位のSer までのアミノ酸配
列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡを提供
する。このＤＮＡには、典型的な例として、23位のアミ
ノ酸Ser から579 位のアミノ酸Ser までのアミノ酸配列
から成るポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び30位の
アミノ酸Glu から295 位のアミノ酸Asp までのアミノ酸
配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれ
る。しかしながら、本発明のＤＮＡは、上記のものに限
られるものではなく、１位のMet 〜30位のGlu の間のい
ずれかのアミノ酸から295 位のアミノ酸Asp までのアミ
ノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡをも
包含する。

【００２２】延長されたＮ−末端を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡであっても、発現後のポリペプチド
のプロセシングにより活性な酵素を得ることができ、ま
たC末端のキナーゼ以外の領域を欠いていても同様のキ
ナーゼ活性を有すると容易に想像できるからである。さ
らに、本発明は、配列番号：５に示す23位のSer から57
9 位のSer までのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、典型
的な例として、配列番号：５に示す１位のMet から579
位のSer までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ及び23位のSer から579 位のSer までの
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
を包含する。

【００２３】本発明はまた、上記の種々のアミノ酸配列
を有するポリペプチドの修飾体であって、なおＴＧＦ−
βによって活性化されるキナーゼ活性（ＴＡＫ１活性と
称する）を保持しているポリペプチドをコードするＤＮ
Ａをも包含する。この修飾は、配列番号：１又は配列番
号：５に示すアミノ酸配列中の上記種々の長さのアミノ
酸配列に対して１〜少数個、例えば約１〜１０個、又は
約１〜５個のアミノ酸の付加、除去、及び／又は他のア
ミノ酸による置換を意味する。より一般的には、本発明
は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ酸配列
に対して80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましく
は９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、Ｔ
ＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを包含する。

【００２４】本発明はまた、配列番号：１又は配列番
号：５に示すヌクレオチド配列と例えば60℃、0.1 ×SS
C 、0.1 ％SDS の条件下でハイブリダイズすることがで
き、且つＴＡＫ１活性を保持しているポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡをも包含する。ここで、0.1 ×SSC
は、3MNaClおよび0.3Mクエン酸ナトリウムからなる20×
SSC を200 倍に希釈して使用することができる。

【００２５】本発明はさらに、上記種々のＤＮＡのヌク
レオチド配列に対応するアミノ酸配列を有するポリペプ
チド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を保持している
ポリペプチド又はタンパク質を提供する。より具体的な
例として、本発明は、上記種々のＤＮＡを、例えばベク
ター、特に発現ベクターに挿入した状態で宿主細胞、例
えば動物細胞又は微生物細胞に導入して発現されるポリ
ペプチド又はタンパク質、特にＴＡＫ１活性を有するポ
リペプチド又はタンパク質に関する。

【００２６】典型的には、本発明のポリペプチド又はタ
ンパク質は、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミ
ノ酸配列中の１位のMet （これを含む）〜23位のSer
（これを含む）の間のいずれかのアミノ酸から579 位の
アミノ酸Ser までのアミノ酸配列を有する。本発明はさ
らに、上記のアミノ酸配列に対して１〜少数個、例えば
１〜１０個、又は１〜５個のアミノ酸残基の付加、除去
及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたア
ミノ酸配列を有するポリペプチド又はタンパク質を包含
する。これらは好ましくはＴＡＫ１活性を有する。本発
明はまた、配列番号：１又は配列番号：５に示すアミノ
酸配列の全部又は一部分に対して80％以上、好ましくは
90％以上、そしてさらに好ましくは９５％以上の相同性
を有するアミノ酸配列を有し且つＴＡＫ１活性を保持し
ているポリペプチド又はタンパク質に関する。

【００２７】前記のごとく、ヒトＴＡＫ１をコードする
ｃＤＮＡはマウスＴＡＫ１をコードするｃＤＮＡを用い
て得ることができ、そして実施例５及び６は、ヒトＴＡ
Ｋ１をコードするｃＤＮＡの単離を示す。前記種々の本
発明のＤＮＡは、例えば実施例２に記載する方法により
動物細胞から、例えばｃＤＮＡとしてクローニングする
ことができる。生来のｃＤＮＡに対して変異又は修飾さ
れたＤＮＡは、例えば生来のｃＤＮＡを鋳型として、Ｐ
ＣＲ増幅、部位特異的変異誘発、等の常用手段により調
製することができる。

【００２８】本発明のポリペプチド又はタンパク質は、
対応するＤＮＡを適当な宿主中で発現させることにより
得られる。この場合、宿主としては、真核細胞、例えば
ヒト、サル、マウス、ハムスター、カエル等の高等真核
生物の培養細胞、例えば、THP-1 細胞、MC3T3-E1細胞、
XTC 細胞、Mv1Lu 細胞、CHO 細胞、COS 細胞、等；下等
真核細胞、例えば、糸状菌、例えばアスペルギルス（As
pergillus ）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー
（Aspergillus niger ）；あるいは酵母、例えばサッ
カロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）
等が使用される。さらに宿主としては、原核細胞、例え
ば細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）等が使用
される。

【００２９】これらの宿主において目的ＤＮＡの発現を
行う場合、宿主に応じて適当なプロモーター等の発現制
御配列が使用される。例えば動物細胞内での発現におい
てはpCDM8 、pSV 、pEF 等の各プロモーターを有するプ
ラスミドが使用され、酵母宿主においては、例えばpNV1
1 等のプラスミドが使用され、大腸菌においては例えば
pGEMEX、pUEX等のプラスミドが使用される。

【００３０】形質転換された宿主の培養は常法により行
われることができる。培養物からのポリペプチド又はタ
ンパク質の回収・精製は、酵素の精製のために常用され
ている方法、例えば、遠心分離、濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー等
により行うことができる。本発明のＴＧＦ−βファミリ
ーの情報伝達系を担うキナーゼであるＴＧＦ−βによっ
て活性化されるキナ−ゼは、多くの疾患に係わっている
ことが知られているＴＧＦ−βおよびそのスーパーファ
ミリーのシグナル伝達を抑制または促進する薬剤の検索
に使用することにおいて有用である。

【００３１】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製マウスＩＬ−３依存性細胞系ＢＡＦ−ＢＯ３からのｐｏ
ｌｙ（Ａ）−ＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを合成
し、これを図１に示す酵母発現ベクターｐＮＶ１１（Ni
nomiya-Tsuji, J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9006-9010 (1991) ）に、ＴＤＨ３プロモーターの制御
の下に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００３２】実施例２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング実施例１において調製したｃＤＮＡライブラリーを、サ
ッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae）ＳＹ１９８４−Ｐ（ｈｉｓ３Δ，ｓｔｅ１１Δ，
ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３，ＳＴＥ７P368）を用いてスク
リーニングした。この酵母では、接合フェロモンの情報
伝達系において、Ｓｔｅ１１が変異してその活性が欠損
しており、Ｓｔｅ−７の３６８位のセリンがプロリンに
より置換されており、さらにＦＵＳ１上流活性化配列が
ＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結されてレ
ポーター遺伝子を形成している。この酵母株は生来のｈ
ｉｓ３を欠失しており、従って、培地中に外来のヒスチ
ジンが存在する場合、又は変異により欠損したＳｔｅ１
１活性が補完された場合にのみ増殖し得る。

【００３３】Ｓ．セレビシエーＳＹ１９８４−Ｐを種々
のプラスミドにより形質転換した。使用したプラスミド
はＹＣｐｌａｃ２２（ベクター）、ｐＲＳ３１４ＰＧＫ
ＭＥＫＫＣＴ（ＰＧＫ１プロモーターの下流のＮ−末端
ドメインを欠くＭＥＫＫΔＮ（K.J.Blumerら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA, Vol.91, 4925 (1994))を発現する)、
及びｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮ（ＡＤＨ１プロモーターから
Ｎ−末端ドメインを欠くＲａｆΔＮを発現する） (K.Ir
ieら、Science Vol.265, 1716 (1994)) である。これら
の形質転換体をヒスチジンを欠くＳＣ−Ｈｉｓプレート
に塗布し、そして３０℃にてインキュベートした。その
結果、ＹＣｐｌａｃ２２ベクターにより形質転換された
酵母は増殖せず、ｐＲＳ３１４ＰＧＫＭＥＫＫＣＴ又は
ｐＡＤＵ−ＲａｆΔＮにより形質転換された酵母は増殖
した。これにより、このスクリーニング系は有効である
ことが確認された。

【００３４】次に、前記スクリーニング系酵母株ＹＳ１
９８４−Ｐを、実施例１において作製したｃＤＮＡライ
ブラリーにより形質転換し、ＳＣ−Ｈｉｓプレート上で
スクリーニングしたところ、１個の陽性クローンｐＮＶ
１１−ＨＵ１１が得られた。このクローンのｃＤＮＡを
ＴＡＫ１ΔＮｃＤＮＡと称する。このｃＤＮＡのヌク
レオチド配列をジデオキシヌクレオチド・チェイン・タ
ーミネーション法により決定した。そのヌクレオチド配
列は、配列番号：１中のヌクレオチド223 〜1893の配列
に相当し、それによりコードされているアミノ酸配列は
配列番号：１のアミノ酸配列中23位のSer 〜579 位のSe
r に相当する。

【００３５】次に、全長ｃＤＮＡをクローニングすべ
く、前記ＴＡＫ１ΔＮｃＤＮＡを放射能標識してプロ
ーブとして使用し、実施例１において得たｃＤＮＡライ
ブラリーをさらにスクリーニングした。こうして、複数
のポジティブクローンを得た。このクローンのｃＤＮＡ
をｐＢＳベクター（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位
にサブクローニングし、ｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′を得
た。このクローンは開始コドンＡＴＧを含有する全長ク
ローンであった。このｃＤＮＡをＴＡＫ１ｃＤＮＡと
称する。そのヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。
この配列の内ヌクレオチド番号１〜2443に全長アミノ酸
配列である１位のMet 〜579 位のSer がコードされてい
る。

【００３６】実施例３．ＴＡＫ１遺伝子の組織間分布マウスの種々の組織から全ＲＮＡを抽出し、前記ＴＡＫ
１ｃＤＮＡを放射能ラベルしたものをプローブとして
用いてノーサンブロッティングを行ったところ、ＴＡＫ
１ｃＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡは試験したす
べての組織又は器官（脾臓、胸腺、肺、心臓、肝臓及び
脳）において発現していた。脾臓、胸腺及び脳には高レ
ベルで存在し、そして肺、心臓及び肝臓には低レベルで
存在した。

【００３７】実施例４．ＴＡＫ１キナーゼの性質哺乳動物細胞でのＴＧＦ−βによって活性化されるキナ
ーゼの機能を調べるため、ＴＡＫ１ｃＤＮＡ及びＴＡＫ
１ΔＮｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ（H.Shib
uya et al., Nature Vol.357, 700 (1992)）に、ヒトエ
ロンゲーションファクター（ＥＦ）プロモーターの制御
下に挿入し、発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１及びｐＥ
Ｆ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡ
Ｋ１及びｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮはそれぞれ全長ＴＡＫ１
コード配列及びＴＡＫ１ΔＮコード配列をＥＦプロモー
ターの制御のもとに含有している。

【００３８】すなわち、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１の２．３
kbのＸｈｏＩ断片をｐＢＳのＸｈｏＩギャップに挿入し
てｐＢＳ−ＴＡＫ１ΔＮを得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１(H.S
hibuyaら、Nature Vol.357, 700 (1992)) をＥｃｏＲＩ
及びＸｂａＩにより開裂せしめ、そしてこれに、合成Ｅ
ｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカー（センス鎖：５′−AATTCG
CCACCATGGC−３′）（配列番号：２）；アンチセンス
鎖：５′−TCGAGCCATGGTGGCG−３′）（配列番号：３）
（開始コドンＡＴＧを含有する）、並びにｐＢＳ−ＴＡ
Ｋ１ΔＮからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片及びＨｉｎ
ｄIII −ＸｂａＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−Ｔ
ＡＫ１ΔＮを作製した。ｐＢＳをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏ
Ｉにより開裂せしめ、これにｐＢＳ−ＴＡＫ１−５′か
らのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片、及びｐＢＳ−ＴＡＫ１
ΔＮからのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによ
り、ＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡ（ＴＡＫ１ｃＤＮＡ）を
含有するｐＢＳ−ＴＡＫ１を得た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１を
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、これにｐＢ
Ｓ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片を挿入す
ることによりｐＥＦ−ＴＡＫ１を作製した。

【００３９】尚、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１を含有す
る大腸菌はEscherichia coli ＭＣ１０６１／Ｐ３
（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）として、そしてプラスミドｐＥＦ
−ＴＡＫ１ΔＮを含有する大腸菌はEscherichia coli
ＭＣ１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）とし
て、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に平成７年９月２８日、それぞ
れ、受託番号ＦＥＦＭ−ＢＰ−５２４６およびＦＥＲＭ
−ＢＰ−５２４５の下ブダペスト条約に基づき国際寄託
された。

【００４０】プラスミドｐＥＦ−ＴＡＫ１に含まれるＴ
ＡＫ１遺伝子は適切な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩを用いて切り出すことができる。種々のリ
ガンドによる遺伝子発現の誘導に対するＴＡＫ１の効果
を試験した結果、ＴＡＫ１はＴＧＦ−βによる遺伝子誘
導に対して効果を有することが見出された。ＴＧＦ−β
に対する初期細胞性応答はプラスミノーゲンアクチベー
ターインヒビター１（PAI-１）のｍＲＮＡレベルの上昇
を誘導する（M.R.Keeton et al., J.Biol.Chem. Vol.26
6, 23048 (1991))。

【００４１】そこで、ＴＧＦ−β応答に対するＴＡＫ１
の効果を検討するため、ＴＧＦ−βにより誘導されるＰ
ＡＩ−１プロモーターにより制御されるルシフェラーゼ
遺伝子を含有するＴＧＦ−βリポータープラスミドｐ８
００ｎｅｏＬＵＣ(M.Abe etal., Analyt.Biochem., Vo
l.216, 276 (1994) ）を、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞に、リ
ン酸カルシウム法(H.Shibuyaら、Nature Vol.357, 700
(1992)により一過性トランスフェクションした。この測
定法においては、Ｍｖ１Ｌｕ肺上皮細胞へのｐ８００ｎ
ｅｏＬＵＣのトランスフェクションによりＴＧＦ−βに
より誘導されるルシフェラーゼ活性の測定が可能とな
る。ｐ８００ｎｅｏＬＵＣにより一過性にトランスフェ
クトされたＭｖ１Ｌｕ細胞は、４〜５倍の増強されたリ
ポーター遺伝子活性をもってＴＧＦ−βに応答した。こ
の結果を図２のベクターの欄に示す。

【００４２】前に作製したＴＡＫ１又はＴＡＫ１ΔＮ発
現プラスミドをｐ８００ｎｅｏＬＵＣと共にＭｖ１Ｌｕ
細胞に一過性に同時トランスフェクトした。ＴＡＫ１の
発現によりＴＧＦ−β誘導性遺伝子発現がわずかに増強
され、そしてＴＡＫ１ΔＮはＰＡＩ−１遺伝子発現を構
成的に活性化した（図２のＴＡＫ１ΔＮの欄）。ＴＡＫ
１ΔＮによるリポーター遺伝子の構成的発現のレベルは
ＴＧＦ−βにより処理されたトランスフェクタントにお
けるレベルに匹敵する。従って、活性化されたＴＡＫ１
（すなわちＴＡＫ１ΔＮ）はＴＧＦ−βの非存在下でシ
グナルを伝達することができる。さらに、ＴＡＫ１ΔＮ
トランスフェクタントにＴＧＦ−βを添加した場合ＰＡ
Ｉ−１遺伝子の発現はさらに増加した。

【００４３】なお、図２において、白い棒はＴＧＦ−β
による誘導を行わなかった場合を示し、斜線を付した棒
はＴＧＦ−βによる誘導を行った場合を示す。上記の実
験においては、トランスフェクションの後、細胞をヒト
ＴＧＦ−β１（３０ng／ml）の存在下又は非存在下で２
０時間培養し、細胞から抽出液を調製し、そして、 H.S
hibuyaら、Mol.Cell.Biol. Vol.14, 5812 (1994)に記載
されているようにしてルシフェラーゼ測定を行った。図
２のグラフでは、ベクター（ＴＡＫ１遺伝子を含有しな
い）により形質転換された細胞をＴＧＦ−β１により誘
導しなかった場合のルシフェラーゼ活性を１として、相
対活性を示す。棒グラフの結果は、１実験につき３連の
実験結果の平均を示す。

【００４４】上記の効果がＴＡＫ１のキナーゼ活性によ
り介在されることを確認するため、触媒的に不活性なＴ
ＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗを作製した。これは、ＰＣＲを用
いて部位特異的変異誘発により行った。このベクターに
おいては、ＡＴＰ−結合部位における63位のリジンがト
リプトファンにより置換されている。この変異はＴＡＫ
１ΔＮのキナーゼ活性及びシグナル伝達活性を破壊する
と予想される。ＴＡＫ１ΔＮ−Ｋ６３Ｗをｐ８００ｎｅ
ｏＬＵＣと共に同時−トランスフェクトすると、ＰＡＩ
−１遺伝子発現を構成的に刺激する能力が失われた（図
２）。これらの結果が示唆するところによれば、ＰＡ１
−１遺伝子のＴＧＦ−β非依存的発現のためにはＴＡＫ
１ΔＮのキナーゼ活性が必要である。さらに、キナーゼ
・ネガティブＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−βによる誘導発現
の部分的低下を惹起した。これらの結果が示唆するとこ
ろによれば、ＴＡＫ１はＴＧＦ−β介在シグナル伝達経
路のメディエーターとして機能すると考えられる。

【００４５】ＴＡＫ１がＴＧＦ−β介在シグナル伝達経
路において機能することの直接的な証拠を得るために、
ＴＧＦ−βによる細胞の処理によってＴＡＫ１のキナー
ゼ活性が活性化されるか否か決定した。適当な外来性基
質の同定のため、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープに
より標識されたＴＡＫ１（ＴＡＫ１−ＨＡ）（抗−ＨＡ
モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるエピト
ープをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによりＴＡＫ１を
コードするＤＮＡの３′−末端にフレームを合わせて連
結したもの）を発現する酵母細胞から免疫沈降されたＴ
ＡＫ１のインビトロ・キナーゼ反応を行った。

【００４６】このイムノコンプレックスキナーゼ測定が
示すところによれば、活性形のＴＡＫ１のＭＡＰＫＫの
ＸＭＥＫ２／ＳＥＫ１サブファミリー（B.M.Yasher et
al.,Nature Vol.372, 794 (1994)) をリン酸化し、そし
て活性化することができた。他方、もともとのＭＡＰＫ
Ｋ−ＭＥＫ１(E.Nishida et al., Trends Biochem.Sc
i., 128 (1993)；K.J.Blumer et al., ibid Vol.19, 28
6 (1994)；R.J.Davis,ibid Vol.19, 470 (1990)；C.L.M
archall, Cell, Vol.80, 179 (1995)) 、ヒストン及び
ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化は検出されなかっ
た。従って、ＴＡＫ１キナーゼ活性は、インビトロでＸ
ＭＥＫ２を活性化するその能力について測定することが
できる。

【００４７】ＨＡエピトープ−標識化ＴＡＫ１（ＨＡ−
ＴＡＫ１）の発現用構成物を次の様にして作製した。モ
ノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるＨＡエピ
トープ Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala（配列番
号：４）をコードする合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳ
−ＴＡＫ１のＳａｌＩ部位（ＡＴＧコドンから＋３位）
及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＢＳ−ＨＡ−
ＴＡＫ１を作製した。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及
びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてそれにｐＢＳ−Ｈ
Ａ−ＴＡＫ１からのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入す
ることによりｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１を作製した。

【００４８】ｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製するた
め、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII
により消化した。この断片を単離し、そしてｐＢＳ−Ｈ
Ａ−ＴＡＫ１のＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIII 部位に挿入し
た。ｐＥＦ−ＭＳＳ１をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで開裂
せしめ、そしてそれにｐＢＳ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨから
のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入することによりｐＥＦ
−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮを作製した。これら両構成物はＥ
Ｆプロモーターから発現されるＮ−末端ＨＡエピトープ
の２つのコピーを有する。

【００４９】これらの構成物ｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１又
はｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＨをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウ
ス骨芽細胞（S.Ohtaら、FEBS Lett. Vol.314, 356 (199
2))に一過性にトランスフェクトした。ＴＧＦ−β１に
よる刺激の後、発現されたＨＡ−ＴＡＫ１を免疫沈降に
より単離し、そしてその活性をカップル・キナーゼ測定
（coupled kinase assay) (S.Matsudaら、J.Biol.Chem.
Vol.270, 12969 (1995)) により測定した。

【００５０】すなわち、トランスフェクトされた細胞を
ＴＧＦ−β１（２０ng／ml）又はＢＭＰ−４（１００ng
／ml）により０分間（未処理）〜３０分間処理した。細
胞を緩衝液中にかきとり(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. V
ol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem.
Vol.270, 12969 (1995)) 、そして細胞抽出液を１５，
０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られた上清を
抗ＨＡ抗体による免疫沈降にかけた。すなわち、前記上
清の３００μｌのアリコートを２０μｌの抗体及び２０
μｌのプロテインＡセファロースと混合し、そしてイム
ノコンプレックスをＰＢＳで２回洗浄し、そしてこれを
用いてキナーゼ測定を行った(S.Matsudaら、J.Biol.Che
m. Vol.270, 12781 (1995)； T.Moriguchiら、J.Biol.C
hem. Vol.270, 12969 (1995)) 。

【００５１】活性は刺激されていない細胞からのＨＡ−
ＴＡＫ１の活性に対する増加倍数として示す。免疫沈降
したＴＡＫ１の活性は、組換えＸＭＥＸ２／ＳＥＫ１を
活性化するその能力により測定した。なお、ＸＭＥＸ２
／ＳＥＫ１の活性は、組換えキナーゼ・ネガティブ（Ｋ
Ｎ）ｐ３８／ＭＰＫ２をリン酸化する能力により測定し
た(S.Matsudaら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (199
5)； T.Moriguchiら、J.Biol.Chem. Vol.270, 12781 (1
995)) 。ＨＡ−ＴＡＫ１がＫＮ−ｐ３８／ＭＰＫ２を直
接リン酸化しないことは確認されている。なお、各免疫
沈降の抗−ＨＡ−抗体によるイムノブロッティングによ
れば、各時点での免疫沈降においてほとんど同量のＨＡ
−ＴＡＫ１が回収された。

【００５２】上記の実験の結果、ＴＡＫ１キナーゼ活性
はＴＧＦ−βによる刺激の後５分間以内に増加しはじ
め、１０分後にピークに達し、そして３０分以内にほと
んどベースラインにもどった（図３）。さらに、ＴＧＦ
−β１はＴＡＫ１キナーゼ活性を投与量依存的に刺激し
た（図４）。次に、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファ
ミリーの１員であるＢＭＰ(A.H.Reddiら、Curr.Opin.Ge
net.Dev. Vol.4, 737 (1994)）、又は上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）により活性化されるか否かを調べた。興味あるこ
とには、ＢＭＰ−４もまたＴＡＫ１キナーゼを時間−及
び用量−依存的に活性化した（図４）。

【００５３】他方、ＥＧＦにより処理された細胞におい
てはＴＡＫ１の活性化は観察されなかった。ＥＧＦがＴ
ＡＫ１の活性化を誘導しないのはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞
がＥＧＦに応答しないためではなく、ＥＧＦのシグナル
がＴＡＫ１を介在していないためであると考えられる。
それはＥＧＦはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でｆｏｓの発現
を誘導することからもわかる。これらのデータが相俟っ
て、ＴＡＫ１がＴＧＦ−βスーパーファミリーにより活
性化されることを示している。

【００５４】ＴＡＫ１ΔＮはＴＧＦ−β非依存的にＰＡ
Ｉ−１遺伝子の発現を活性化することができ（図２）、
このことは、細胞のＴＧＦ−β処理が無くてもＴＡＫ１
ΔＮタンパク質が上昇したキナーゼ活性を有することを
示唆している。この可能性を試験するため、ＨＡエピト
ープで標識されたＴＡＫ１ΔＮ（ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮ）
（前記）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に一過性にトランスフ
ェクトし、そしてＴＡＫ１ΔＮの活性をイムノコンプレ
ックスキナーゼ測定により測定した。すなわち、ＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞をｐＥＦ−ＨＡ−ＴＡＫ１ΔＮによりト
ランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞からＨ
Ａ−ＴＡＫ１ΔＮを前記のようにして免疫沈降せしめ、
そしてその活性を測定した。

【００５５】すべてのデータを、刺激されていない細胞
からのＨＡ−ＴＡＫ１の活性に対する増加倍率により示
す。図４に示す通り、ＴＡＫ１ΔＮ蛋白質はより高いベ
ース・キナーゼ活性を示し、Ｎ−末端の２２アミノ酸残
基を欠くＴＡＫ１ΔＮは構成的に (constitutively) 活
性であるとする仮説を支持している。

【００５６】実施例５．ｃＤＮＡライブラリーの作製ヒトＴ細胞株Jurkat細胞からｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調
製し、常法に従ってｃＤＮＡを合成した。これを酵母の
発現ベクターｐＮＶ７（Ninomiya-Tsuji, J.,ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 88, 9006-9010(1991)) のＴＤＨ３
プロモーターの下流に挿入してｃＤＮＡライブラリーを
作製した。

【００５７】実施例６．ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングサッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces ce
revisiae）の高浸透圧ストレスの情報伝達系で働く、Ｓ
ｓｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させ
た変異株は、ＹＥＰＤ培地（Yeast extract(１０ｇ／
ｌ）、tryptone（２０ｇ／ｌ）、glucose(２０ｇ／
ｌ））では増殖できるが、この培地に１Ｍソルビトール
を添加した培地中では増殖できない（T.Maeda,ら、Scie
nce, 269, 554(1995))。従って、この変異株にｃＤＮＡ
を導入してスクリーニングを行うことにより、欠損した
Ｓｓｋ２／Ｓｓｋ２２活性を補完できるｃＤＮＡが単離
できる。

【００５８】実際に、上述の文献に記載されているＳｓ
ｋ２／Ｓｓｋ２２、およびＳｈｏｌの活性を欠損させた
サッカロマイセス・セレビジエー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓ
ｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を実施例２で得たｐＮＶ１１−Ｈ
Ｕ１１（マウスＴＡＫ１ΔＮ）により形質転換した。こ
の形質転換体を１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤプレー
トに塗布し、３０℃にてインキュベートした。その結
果、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１により形質転換された酵母は
高浸透圧ストレス下でも増殖した。これにより、このス
クリーニング系は有効であることが確認された。

【００５９】そこで、このサッカロマイセス・セレビジ
エー株（ｓｓｋ２Δ，ｓｓｋ２Δ，ｓｈｏｌΔ）を、実
施例５において作製したｃＤＮＡライブラリーにより形
質転換し、高浸透圧ストレス下でスクリーニングを行っ
た（１Ｍソルビトールを含むＹＥＰＤ培地中、３０℃に
てインキュベートした。）。その結果、１個の陽性クロ
ーンｐＮＶ７−ｈＴＡＫ１が得られた。このクローンに
含まれるｃＤＮＡを、PRISM Dye Terminator Cycle Seq
uencing キット（Perkin Elmer製）により増幅し、その
塩基配列を決定した。その塩基配列及びその対応アミノ
酸配列は配列番号：５に示す通りであった。このｃＤＮ
Ａの塩基配列はマウスＴＡＫ１の塩基配列と９２％の相
同性を示し、それによりコードされるアミノ酸配列はマ
ウスＴＡＫ１のアミノ酸配列と９９％の相同性を示し
た。マウスＴＡＫ１とヒトＴＡＫ１の塩基配列の対比を
図５〜図９に示し、これらのアミノ酸配列の対比を図１
０及び図１１に示す。ヒトＴＡＫ１ｃＤＮＡを、Ｓａ
ｌ１で消化したｐＵＣ１９にサブクローニングして、ヒ
トＴＡＫ１の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｈＴ
ＡＫ１を得た。このプラスミドｐｈＴＡＫ１を含有する
大腸菌は、Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）と
称し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ
ＢＰ−５５９８として、１９９６年７月１９日に、ブ
ダペスト条約に基き国際寄託された。

【００６０】微生物の寄託以下の微生物を、工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市東１丁目１番３号）の特許微生物寄託
センターに寄託し、以下の受託番号を得た。菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ１０６１／Ｐ
３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１）寄託日：１９９５年９月２８日受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５２４６

【００６１】菌名：大腸菌（Escherichia coli) ＭＣ
１０６１／Ｐ３（ｐＥＦ−ＴＡＫ１ΔＮ）寄託日：１９９５年９月２８日受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５２４５菌名：Escherichia coli JM109（ｐｈＴＡＫ１）寄託日：１９９６年７月１９日受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５５９８

【００６２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２４４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GAATTCGGCA CGAGGAGGAG CCGAAGCCGG GACTCGGCGG TGGCCCGGGT CGGTCCCGCG 60 CCACGGAGCG CCGGGCGGCG GGCTGCGGGG CTCCGGGCTG AAGGGCGCTG CGCGAGCCGG 120 AGGGCGGGCG CGGCCCCCCG GGCGCCGCGG GGGATC ATG TCG ACA GCC TCC GCC 174 Met Ser Thr Ala Ser Ala 1 5 GCC TCG TCC TCC TCC TCG TCT TCT GCC AGT GAG ATG ATC GAA GCG CCG 222 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Glu Met Ile Glu Ala Pro 10 15 20 TCG CAG GTC CTG AAC TTC GAA GAG ATC GAC TAC AAG GAG ATC GAG GTG 270 Ser Gln Val Leu Asn Phe Glu Glu Ile Asp Tyr Lys Glu Ile Glu Val 25 30 35 GAA GAG GTT GTC GGA AGA GGA GCT TTT GGA GTA GTT TGC AAA GCT AAG 318 Glu Glu Val Val Gly Arg Gly Ala Phe Gly Val Val Cys Lys Ala Lys 40 45 50 TGG AGA GCA AAA GAT GTC GCT ATT AAA CAG ATA GAA AGT GAG TCT GAG 366 Trp Arg Ala Lys Asp Val Ala Ile Lys Gln Ile Glu Ser Glu Ser Glu 55 60 65 70 AGG AAG GCT TTC ATT GTG GAG CTC CGG CAG TTG TCG CGT GTG AAC CAT 414 Arg Lys Ala Phe Ile Val Glu Leu Arg Gln Leu Ser Arg Val Asn His 75 80 85

【００６３】 CCT AAC ATT GTC AAG TTG TAC GGA GCC TGC CTG AAT CCA GTA TGT CTT 462 Pro Asn Ile Val Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Leu Asn Pro Val Cys Leu 90 95 100 GTG ATG GAA TAT GCA GAG GGG GGC TCA TTG TAT AAT GTG CTG CAT GGT 510 Val Met Glu Tyr Ala Glu Gly Gly Ser Leu Tyr Asn Val Leu His Gly 105 110 115 GCT GAA CCA TTG CCT TAC TAC ACT GCT GCT CAT GCC ATG AGC TGG TGT 558 Ala Glu Pro Leu Pro Tyr Tyr Thr Ala Ala His Ala Met Ser Trp Cys 120 125 130 TTA CAG TGT TCC CAA GGA GTG GCT TAC CTG CAC AGC ATG CAG CCC AAA 606 Leu Gln Cys Ser Gln Gly Val Ala Tyr Leu His Ser Met Gln Pro Lys 135 140 145 150 GCG CTG ATT CAC AGG GAC CTC AAG CCT CCA AAC TTG CTG CTG GTT GCA 654 Ala Leu Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Pro Asn Leu Leu Leu Val Ala 155 160 165 GGA GGG ACA GTT CTA AAA ATC TGC GAT TTT GGT ACA GCT TGT GAC ATC 702 Gly Gly Thr Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Thr Ala Cys Asp Ile 170 175 180 CAA ACA CAC ATG ACC AAT AAT AAA GGG AGT GCT GCT TGG ATG GCG CCT 750 Gln Thr His Met Thr Asn Asn Lys Gly Ser Ala Ala Trp Met Ala Pro 185 190 195 GAA GTG TTT GAA GGT AGC AAT TAC AGT GAA AAG TGT GAT GTC TTC AGC 798 Glu Val Phe Glu Gly Ser Asn Tyr Ser Glu Lys Cys Asp Val Phe Ser 200 205 210 TGG GGT ATT ATC CTC TGG GAA GTG ATA ACA CGC CGG AAA CCC TTC GAT 846 Trp Gly Ile Ile Leu Trp Glu Val Ile Thr Arg Arg Lys Pro Phe Asp 215 220 225 230

【００６４】 GAG ATC GGT GGC CCA GCT TTC AGA ATC ATG TGG GCT GTT CAT AAT GGC 894 Glu Ile Gly Gly Pro Ala Phe Arg Ile Met Trp Ala Val His Asn Gly 235 240 245 ACT CGA CCA CCA CTG ATC AAA AAT TTA CCT AAG CCC ATT GAG AGC TTG 942 Thr Arg Pro Pro Leu Ile Lys Asn Leu Pro Lys Pro Ile Glu Ser Leu 250 255 260 ATG ACA CGC TGT TGG TCT AAG GAC CCA TCT CAG CGC CCT TCA ATG GAG 990 Met Thr Arg Cys Trp Ser Lys Asp Pro Ser Gln Arg Pro Ser Met Glu 265 270 275 GAA ATT GTG AAA ATA ATG ACT CAC TTG ATG CGG TAC TTC CCA GGA GCG 1038 Glu Ile Val Lys Ile Met Thr His Leu Met Arg Tyr Phe Pro Gly Ala 280 285 290 GAT GAG CCA TTA CAG TAT CCT TGT CAG TAC TCT GAT GAA GGG CAG AGC 1086 Asp Glu Pro Leu Gln Tyr Pro Cys Gln Tyr Ser Asp Glu Gly Gln Ser 295 300 305 310 AAC TCA GCC ACC AGC ACA GGC TCG TTC ATG GAC ATT GCT TCT ACA AAT 1134 Asn Ser Ala Thr Ser Thr Gly Ser Phe Met Asp Ile Ala Ser Thr Asn 315 320 325 ACC AGT AAT AAA AGT GAC ACA AAT ATG GAA CAG GTT CCT GCC ACA AAC 1182 Thr Ser Asn Lys Ser Asp Thr Asn Met Glu Gln Val Pro Ala Thr Asn 330 335 340 GAC ACT ATT AAA CGC TTG GAG TCA AAA CTG TTG AAA AAC CAG GCA AAG 1230 Asp Thr Ile Lys Arg Leu Glu Ser Lys Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys 345 350 355 CAA CAG AGT GAA TCT GGA CGC CTG AGC TTG GGA GCC TCT CGT GGG AGC 1278 Gln Gln Ser Glu Ser Gly Arg Leu Ser Leu Gly Ala Ser Arg Gly Ser 360 365 370

【００６５】 AGT GTG GAG AGC TTG CCC CCC ACT TCC GAG GGC AAG AGG ATG AGT GCT 1326 Ser Val Glu Ser Leu Pro Pro Thr Ser Glu Gly Lys Arg Met Ser Ala 375 380 385 390 GAC ATG TCT GAA ATA GAA GCC AGG ATC GTG GCG ACT GCA GGT AAC GGG 1374 Asp Met Ser Glu Ile Glu Ala Arg Ile Val Ala Thr Ala Gly Asn Gly 395 400 405 CAA CCA AGG CGT AGA TCC ATC CAA GAC TTG ACT GTT ACT GGG ACA GAA 1422 Gln Pro Arg Arg Arg Ser Ile Gln Asp Leu Thr Val Thr Gly Thr Glu 410 415 420 CCT GGT CAG GTG AGC AGC CGG TCA TCC AGC CCT AGT GTC AGA ATG ATC 1470 Pro Gly Gln Val Ser Ser Arg Ser Ser Ser Pro Ser Val Arg Met Ile 425 430 435 ACT ACC TCA GGA CCA ACC TCA GAG AAG CCA GCT CGC AGT CAC CCA TGG 1518 Thr Thr Ser Gly Pro Thr Ser Glu Lys Pro Ala Arg Ser His Pro Trp 440 445 450 ACC CCT GAT GAT TCC ACA GAC ACC AAT GGC TCA GAT AAC TCC ATC CCA 1566 Thr Pro Asp Asp Ser Thr Asp Thr Asn Gly Ser Asp Asn Ser Ile Pro 455 460 465 470 ATG GCG TAT CTT ACA CTG GAT CAC CAG CTA CAG CCT CTA GCG CCG TGC 1614 Met Ala Tyr Leu Thr Leu Asp His Gln Leu Gln Pro Leu Ala Pro Cys 475 480 485 CCA AAC TCC AAA GAA TCC ATG GCA GTG TTC GAA CAG CAC TGT AAA ATG 1662 Pro Asn Ser Lys Glu Ser Met Ala Val Phe Glu Gln His Cys Lys Met 490 495 500 GCA CAG GAG TAT ATG AAA GTT CAA ACC GAA ATC GCA TTG TTA CTA CAG 1710 Ala Gln Glu Tyr Met Lys Val Gln Thr Glu Ile Ala Leu Leu Leu Gln 505 510 515

【００６６】 AGA AAG CAA GAA CTA GTT GCA GAA TTG GAC CAG GAT GAA AAG GAC CAG 1758 Arg Lys Gln Glu Leu Val Ala Glu Leu Asp Gln Asp Glu Lys Asp Gln 520 525 530 CAA AAT ACA TCT CGT CTG GTA CAG GAA CAT AAA AAG CTT TTA GAT GAA 1806 Gln Asn Thr Ser Arg Leu Val Gln Glu His Lys Lys Leu Leu Asp Glu 535 540 545 550 AAC AAA AGC CTT TCT ACT TAT TAC CAG CAA TGC AAA AAA CAA CTA GAG 1854 Asn Lys Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Gln Cys Lys Lys Gln Leu Glu 555 560 565 GTC ATC AGA AGC CAA CAG CAG AAA CGA CAA GGC ACT TCA TGATTCTCTG 1903 Val Ile Arg Ser Gln Gln Gln Lys Arg Gln Gly Thr Ser 570 575 GGACCGTTAC GTTTTAAAAT ATGCAAAGAC CTTTTTTTAA GAGAAGACAA ACCATTATAA 1963 CAGTTCATGA GTGTTAGCTT TTTGGCGTGT TCTGAATGCC AAATGCCTCT CTTTGCTGCA 2023 TTTGTTATGT CAGTTACCTT TCTTCTTATG GTGGATATAA AATCCACTGT CGTGTTGCAG 2083 CAGATGATGG CACCTGTGGC TTGGGAAGGC GAGSGTGCTC AGCTTCAGGG GCACATGAAG 2143 TGAACCTGGC TGTATGTGCA TGCTCCTGGA GTGAGCTACC TAACAGGAGG GGGTAGCACA 2203 CTGGCTACTG TGTGCAGGCA TCATCCTTTC TCTGTAGTAA AAGGTGGGAC CTCAAGAATT 2263 TTCTTCAAAG TGCTCATCTC AAAAATCTGA TTTTTTTCCC AGTAGATGGT ATGCTCCAAT 2323 GTAAAGACAG AGTATTAAAA TAACTTGTGG TACATTACAG AGGGACAGAA TGTTGAGGCT 2384 GAGTTCAAAG ACAGGGTTTG TGCCAACACA TCCTGGCTTT AGAGCACAAT GGATCTCGAG 2443

【００６７】配列番号：２配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AATTCGCCAC CATGGC 16

【００６８】配列番号：３配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TCGAGCCATG GTGGCG 16

【００６９】配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００７０】配列番号：５配列の長さ：２６５６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GTCGAGATCC ATTGTGCTCT AAAGACGGCT GTGGCCGCTG CCTCTACCCC CGCCACGGAT 60

【００７１】 CGCCGGGTAG TAGGACTGCG CGGCTCCAGG CTGAGGGTCG GTCCGGAGGC GGGTGGGCGC 120 GGGTCTCACC CGGATTGTCC GGGTGGCACC GTTCCCGGCC CCACCGGGCG CCGCGAGGGA 180 TC ATG TCT ACA GCC TCT GCC GCC TCC TCC TCC TCC TCG TCT TCG GCC 227 Met Ser Thr Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala 1 5 10 15 GGT GAG ATG ATC GAA GCC CCT TCC CAG GTC CTC AAC TTT GAA GAG ATC 275 Gly Glu Met Ile Glu Ala Pro Ser Gln Val Leu Asn Phe Glu Glu Ile 20 25 30 GAC TAC AAG GAG ATC GAG GTG GAA GAG GTT GTT GGA AGA GGA GCC TTT 323 Asp Tyr Lys Glu Ile Glu Val Glu Glu Val Val Gly Arg Gly Ala Phe 35 40 45 GGA GTT GTT TGC AAA GCT AAG TGG AGA GCA AAA GAT GTT GCT ATT AAA 371 Gly Val Val Cys Lys Ala Lys Trp Arg Ala Lys Asp Val Ala Ile Lys 50 55 60 CAA ATA GAA AGT GAA TCT GAG AGG AAA GCG TTT ATT GTA GAG CTT CGG 419 Gln Ile Glu Ser Glu Ser Glu Arg Lys Ala Phe Ile Val Glu Leu Arg 65 70 75 CAG TTA TCC CGT GTG AAC CAT CCT AAT ATT GTA AAG CTT TAT GGA GCC 467 Gln Leu Ser Arg Val Asn His Pro Asn Ile Val Lys Leu Tyr Gly Ala 80 85 90 95 TGC TTG AAT CCA GTG TGT CTT GTG ATG GAA TAT GCT GAA GGG GGC TCT 515 Cys Leu Asn Pro Val Cys Leu Val Met Glu Tyr Ala Glu Gly Gly Ser 100 105 110 TTA TAT AAT GTG CTG CAT GGT GCT GAA CCA TTG CCA TAT TAT ACT GCT 563 Leu Tyr Asn Val Leu His Gly Ala Glu Pro Leu Pro Tyr Tyr Thr Ala 115 120 125

【００７２】 GCC CAC GCA ATG AGT TGG TGT TTA CAG TGT TCC CAA GGA GTG GCT TAT 611 Ala His Ala Met Ser Trp Cys Leu Gln Cys Ser Gln Gly Val Ala Tyr 130 135 140 CTT CAC AGC ATG CAA CCC AAA GCG CTA ATT CAC AGG GAC CTG AAA CCA 659 Leu His Ser Met Gln Pro Lys Ala Leu Ile His Arg Asp Leu Lys Pro 145 150 155 CCA AAC TTA CTG CTG GTT GCA GGG GGG ACA GTT CTA AAA ATT TGT GAT 707 Pro Asn Leu Leu Leu Val Ala Gly Gly Thr Val Leu Lys Ile Cys Asp 160 165 170 175 TTT GGT ACA GCC TGT GAC ATT CAG ACA CAC ATG ACC AAT AAC AAG GGG 755 Phe Gly Thr Ala Cys Asp Ile Gln Thr His Met Thr Asn Asn Lys Gly 180 185 190 AGT GCT GCT TGG ATG GCA CCT GAA GTT TTT GAA GGT AGT AAT TAC AGT 803 Ser Ala Ala Trp Met Ala Pro Glu Val Phe Glu Gly Ser Asn Tyr Ser 195 200 205 GAA AAA TGT GAC GTC TTC AGC TGG GGT ATT ATT CTT TGG GAA GTG ATA 851 Glu Lys Cys Asp Val Phe Ser Trp Gly Ile Ile Leu Trp Glu Val Ile 210 215 220 ACG CGT CGG AAA CCC TTT GAT GAG ATT GGT GGC CCA GCT TTC CGA ATC 899 Thr Arg Arg Lys Pro Phe Asp Glu Ile Gly Gly Pro Ala Phe Arg Ile 225 230 235 ATG TGG GCT GTT CAT AAT GGT ACT CGA CCA CCA CTG ATA AAA AAT TTA 947 Met Trp Ala Val His Asn Gly Thr Arg Pro Pro Leu Ile Lys Asn Leu 240 245 250 255 CCT AAG CCC ATT GAG AGC CTG ATG ACT CGT TGT TGG TCT AAA GAT CCT 995 Pro Lys Pro Ile Glu Ser Leu Met Thr Arg Cys Trp Ser Lys Asp Pro 260 265 270

【００７３】 TCC CAG CGC CCT TCA ATG GAG GAA ATT GTG AAA ATA ATG ACT CAC TTG 1043 Ser Gln Arg Pro Ser Met Glu Glu Ile Val Lys Ile Met Thr His Leu 275 280 285 ATG CGG TAC TTT CCA GGA GCA GAT GAG CCA TTA CAG TAT CCT TGT CAG 1091 Met Arg Tyr Phe Pro Gly Ala Asp Glu Pro Leu Gln Tyr Pro Cys Gln 290 295 300 TAT TCA GAT GAA GGA CAG AGC AAC TCT GCC ACC AGT ACA GGC TCA TTC 1139 Tyr Ser Asp Glu Gly Gln Ser Asn Ser Ala Thr Ser Thr Gly Ser Phe 305 310 315 ATG GAC ATT GCT TCT ACA AAT ACG AGT AAC AAA AGT GAC ACT AAT ATG 1187 Met Asp Ile Ala Ser Thr Asn Thr Ser Asn Lys Ser Asp Thr Asn Met 320 325 330 335 GAG CAA GTT CCT GCC ACA AAT GAT ACT ATT AAG CGC TTA GAA TCA AAA 1235 Glu Gln Val Pro Ala Thr Asn Asp Thr Ile Lys Arg Leu Glu Ser Lys 340 345 350 TTG TTG AAA AAT CAG GCA AAG CAA CAG AGT GAA TCT GGA CGT TTA AGC 1283 Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Gln Gln Ser Glu Ser Gly Arg Leu Ser 355 360 365 TTG GGA GCC TCC CAT GGG AGC AGT GTG GAG AGC TTG CCC CCA ACC TCT 1331 Leu Gly Ala Ser His Gly Ser Ser Val Glu Ser Leu Pro Pro Thr Ser 370 375 380 GAG GGC AAG AGG ATG AGT GCT GAC ATG TCT GAA ATA GAA GCT AGG ATC 1379 Glu Gly Lys Arg Met Ser Ala Asp Met Ser Glu Ile Glu Ala Arg Ile 385 390 395 GCC GCA ACC ACA GGC AAC GGA CAG CCA AGA CGT AGA TCC ATC CAA GAC 1427 Ala Ala Thr Thr Gly Asn Gly Gln Pro Arg Arg Arg Ser Ile Gln Asp 400 405 410 415

【００７４】 TTG ACT GTA ACT GGA ACA GAA CCT GGT CAG GTG AGC AGT AGG TCA TCC 1475 Leu Thr Val Thr Gly Thr Glu Pro Gly Gln Val Ser Ser Arg Ser Ser 420 425 430 AGT CCC AGT GTC AGA ATG ATT ACT ACC TCA GGA CCA ACC TCA GAA AAG 1523 Ser Pro Ser Val Arg Met Ile Thr Thr Ser Gly Pro Thr Ser Glu Lys 435 440 445 CCA ACT CGA AGT CAT CCA TGG ACC CCT GAT GAT TCC ACA GAT ACC AAT 1571 Pro Thr Arg Ser His Pro Trp Thr Pro Asp Asp Ser Thr Asp Thr Asn 450 455 460 GGA TCA GAT AAC TCC ATC CCA ATG GCT TAT CTT ACA CTG GAT CAC CAA 1619 Gly Ser Asp Asn Ser Ile Pro Met Ala Tyr Leu Thr Leu Asp His Gln 465 470 475 CTA CAG CCT CTA GCA CCG TGC CCA AAC TCC AAA GAA TCT ATG GCA GTG 1667 Leu Gln Pro Leu Ala Pro Cys Pro Asn Ser Lys Glu Ser Met Ala Val 480 485 490 495 TTT GAA CAG CAT TGT AAA ATG GCA CAA GAA TAT ATG AAA GTT CAA ACA 1715 Phe Glu Gln His Cys Lys Met Ala Gln Glu Tyr Met Lys Val Gln Thr 500 505 510 GAA ATT GCA TTG TTA TTA CAG AGA AAG CAA GAA CTA GTT GCA GAA CTG 1763 Glu Ile Ala Leu Leu Leu Gln Arg Lys Gln Glu Leu Val Ala Glu Leu 515 520 525 GAC CAG GAT GAA AAG GAC CAG CAA AAT ACA TCT CGC CTG GTA CAG GAA 1811 Asp Gln Asp Glu Lys Asp Gln Gln Asn Thr Ser Arg Leu Val Gln Glu 530 535 540 CAT AAA AAG CTT TTA GAT GAA AAC AAA AGC CTT TCT ACT TAC TAC CAG 1859 His Lys Lys Leu Leu Asp Glu Asn Lys Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln 545 550 555

【００７５】 CAA TGC AAA AAA CAA CTA GAG GTC ATC AGA AGT CAG CAG CAG AAA CGA 1907 Gln Cys Lys Lys Gln Leu Glu Val Ile Arg Ser Gln Gln Gln Lys Arg 560 565 570 575 CAA GGC ACT TCA TGATTCTCTG GGACCGTTAC ATTTTGAAAT ATGCAAAGAA 1959 Gln Gly Thr Ser ^* 579 AGACTTTTTT TTTAAGGAAA GGAAAACCTT ATAATGACGA TTCATGAGTG TTAGCTTTTT 2019 GGCGTGTTCT GAATGCCAAC TGCCTATATT TGCTGCATTT TTTTCATTGT TTATTTTCCT 2079 TTTCTCATGG TGGACATACA ATTTTACTGT TTCATTGCAT AACATGGTAG CATCTGTGAC 2139 TTGAATGAGC AGCACTTTGC AACTTCAAAA CAGATGCAGT GAACTGTGGC TGTATATGCA 2199 TGCTCATTGT GTGAAGGCTA GCCTAACAGA ACAGGAGGTA TCAAACTAGC TGCTATGTGC 2259 AAACAGCGTC CATTTTTTCA TATTAGAGGT GGAACCTCAA GAATGACTTT ATTCTTGTAT 2319 CTCATCTCAA AATATTAATA ATTTTTTTCC CAAAAGATGG TATATACCAA GTTAAAGACA 2379 GGGTATTATA AATTTAGAGT GATTGGTGGT ATATTACGGA AATACGGAAC CTTTAGGGAT 2439 AGTTCCGTGT AAGGGCTTTG ATGCCAGCAT CCTTGGATCA GTACTGAACT CAGTTCCATC 2499 CGTAAAATAT GTAAAGGTAA GTGGCAGCTG CTCTATTTAA TGAAAGCAGT TTTACCGGAT 2559 TTTGTTAGAC TAAAATTTGA TTGTGATACA TTGAACAAAA TGGAACTCAT TTTTTTTAAG 2619 GAGTAAAGAT TTTCTTTAGA GCACAATGGA TCTCGAC 2656

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、酵母発現ベクターpNV11 を示す。

【図２】図２は、種々のＴＡＫ１遺伝子の発現に対する
ＴＧＦ−βの添加効果を、ルシフェラーゼ遺伝子をリポ
ーター遺伝子として用いて調べた結果を示すグラフであ
る。

【図３】図３は、ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＴＡＫ１遺伝
子の活性に対するＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４の効果を免
疫沈降法およびカップル・キナーゼ法により測定した結
果を示すグラフである。

【図４】図４は、ＨＡ−ＴＡＫ１遺伝子でトランスフェ
クトされた細胞におけるＴＡＫ１キナーゼ活性に対する
種々の濃度のＴＧＦ−β又はＢＭＰ−４の効果を示すグ
ラフである。ＴＡＫ１ΔＮはＴＡＫ１ΔＮ遺伝子でトラ
ンスフェクトされた細胞をＴＧＦ−β及びＢＭＰ−４の
いずれによっても刺激しなかった場合の結果を示す。

【図５】図５はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩
基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列と
の対比を示す。

【図６】図６はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩
基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列と
の対比を示す。

【図７】図７はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩
基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列と
の対比を示す。

【図８】図８はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩
基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列と
の対比を示す。

【図９】図９はマウスＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩
基配列とヒトＴＡＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列と
の対比を示す。

【図１０】図１０は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列と
ヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。

【図１１】図１１は、マウスＴＡＫ１のアミノ酸配列と
ヒトＴＡＫ１のアミノ酸配列の対比を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者松本邦弘愛知県名古屋市千種区北千種２−１−43 萱場住宅１−205 (72)発明者入江賢児愛知県名古屋市昭和区陶生町２−15−Ｂ22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に示す23位のSer から579
位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に
対して１〜少数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他
のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を
含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）
−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】配列番号：１に示す１位のMet から579
位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に
対して１〜少数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他
のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を
含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）
−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】配列番号：１に示す223 位のT から1893
位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項１に記載
のＤＮＡ。
【請求項４】配列番号：１に示す157 位のA から1893
位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項２に記載
のＤＮＡ。
【請求項５】配列番号：１に示すヌクレオチド配列に
対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによっ
て活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項６】配列番号：１に示すヌクレオチド配列
と、60℃、0.1 ×SSC、0.1 ％SDS の条件下にハイブリ
ダイズすることができ、且つＴＧＦ−βによって活性化
されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ。
【請求項７】配列番号：５に示すヌクレオチド配列を
有する、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】配列番号：５に示す23位のSer から579
位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に
対して１〜少数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他
のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を
含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）
−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】配列番号：５に示す１位のMet から579
位のSer までのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に
対して１〜少数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他
のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を
含んで成る、トランスフォ−ミング成長因子（ＴＧＦ）
−βによって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】配列番号：５に示す249 位のT から19
19位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項８に記
載のＤＮＡ。
【請求項１１】配列番号：５に示す183 位のA から19
19位のA までのヌクレオチド配列を有する請求項９に記
載のＤＮＡ。
【請求項１２】配列番号：５に示すヌクレオチド配列
に対して80％以上の相同性を有し、且つＴＧＦ−βによ
って活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ。
【請求項１３】配列番号：５に示すヌクレオチド配列
と、60℃、0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS の条件下にハイブリ
ダイズすることができ、且つＴＧＦ−βによって活性化
されるキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ。
【請求項１４】配列番号１に示す23位のMet から579
位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−β
によって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチ
ド。
【請求項１５】配列番号５に示す23位のMet から579
位のSer までのアミノ酸配列を含んでなる、ＴＧＦ−β
によって活性化されるキナーゼ活性を有するポリペプチ
ド。
【請求項１６】請求項１〜１３のいずれか１項に記載
のＤＮＡを含んで成るベクターにより形質転換された宿
主細胞を培養し、培養物から発現生成物を採取すること
を特徴とする、ＴＧＦ−βによって活性化されるキナー
ゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法により製造さ
れるＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ活性を有
するポリペプチド。
【請求項１８】配列番号：１の23位のSer から579 位
のSer までのアミノ酸配列を有するＴＧＦ−βによって
活性化されるキナーゼ。
【請求項１９】配列番号：５に示す23位のSer から57
9 位のSer までのアミノ酸配列を有する、ＴＧＦ−βに
より活性化されるキナーゼ。