JPH1132769A - 新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ヒト大脳皮質由来の神経細胞賦活化活性を有す
る蛋白質ＨＵＣＥＰ−３と、それをコードする遺伝子ｈ
ｕｃｅｐ−３を提供する。 【解決手段】ヒト大脳皮質由来のｃＤＮＡライブラリー
からのクローニングによって神経細胞賦活化活性を有す
る新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−３をコードする遺伝子ｈｕｃ
ｅｐ−３が得られ、該遺伝子を有する発現ベクターによ
る形質転換体の培養により、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−３
が得られる。該蛋白質は、神経細胞賦活化活性物質とし
て、医薬又は医薬の開発に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、神経細胞機能に対して
賦活化活性を有する、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ（Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−３、該蛋白
質をコードする遺伝子ｈｕｃｅｐ−３、該遺伝子を発現
させるための組み換えＤＮＡ、および組み換えＤＮＡに
よって得られる形質転換体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】神経変性疾患の多くは、神経細胞または
神経細胞間の信号伝達に異変が生じることにより、神経
細胞が死滅し発症するとされている。

【０００３】このような神経変性疾患の代表例として、
パーキンソン病やアルツハイマー症が挙げられる。パー
キンソン症は、黒質神経細胞が変性して神経伝達物質の
一つであるドーパミンが産成されなくなり、ドーパミン
作動性の神経細胞が死ぬことにより発症すると言われて
いる。一方、アルツハイマー病は主に大脳皮質や海馬の
神経細胞が死ぬことによって痴呆症状を呈するとされて
いる。

【０００４】以上に述べた疾病に対しては、その原因が
明確にされていないことから有効な治療薬がなく、対症
療法しか行えないのが現状であり、現在これらの疾患に
ともなう神経細胞死の原因を明らかにすべく多くの研究
がなされているが、未だ解明されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記諸疾患の原因であ
ると考えられる神経細胞死のメカニズムを解明し、これ
に関与する蛋白質並びにそれをコードする遺伝子を特定
することは、神経細胞死に起因する疾患の根本的な治療
薬を探索する上で、きわめて重要なことである。例え
ば、神経細胞死に関与する蛋白質それ自体に有効な医薬
となり得る可能性があることは勿論、このような蛋白質
は、該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機
能を阻害または促進する作用を有する物質等を医薬とし
て開発するに際しても、極めて有用である。以上の観点
から、神経細胞死に関与する蛋白質とその機能の解明が
望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、神経細胞
の生存あるいは神経細胞の機能の維持に関与する蛋白質
の同定を目的とし、ヒト脳組織で特異的に発現している
遺伝子にコードされている蛋白質の中から、所望の神経
細胞機能の維持に関与する蛋白質を把握するべく鋭意研
究の結果、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−３の存在とそれをコ
ードする遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の単離に成功した。そし
て、このＨＵＣＥＰ−３が神経細胞機能賦活化活性を有
し、神経変性疾患に関与するものであることを突き止
め、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する蛋白質、に関
するものである。

【０００８】さらに本発明は、上記（ａ）または（ｂ）
に表された蛋白質をコードする遺伝子、に関するもので
ある。

【０００９】さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２に記
載の塩基配列からなるＤＮＡ；または、（ｄ）配列番
号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する蛋白質を
コードするＤＮＡからなる遺伝子、に関するものであ
る。

【００１０】さらに本発明は上記遺伝子を含有する組み
換えベクターを含む形質転換体、に関するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、ヒト大脳皮質
由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含んだｃ
ＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者らが
使用したｃＤＮＡライブラリーは、クローンテック社か
ら市販されているヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもとに調製
したものであるが、ストラタジーン社から市販されてい
るヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもとにしても、同様にｃＤ
ＮＡを調製することができる。上述のｃＤＮＡライブラ
リーにおいて、ヒト脳組織で特異的に発現している遺伝
子を有すると思われるｃＤＮＡを識別する方法として、
大久保らの方法（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，２，１７３（１９９２））によ
る、遺伝子発現の出現頻度を解析する方法を用いること
ができる。具体的には、ヒト大脳皮質のｍＲＮＡを鋳型
とし、適当な制限酵素で開環させたベクタープラスミド
の一端にオリゴｄＴを結合させたものをプライマーとし
てｃＤＮＡ合成を行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵
素ＢａｍＨＩで切断する。当該ベクターはｄａｍメチラ
ーゼ陽性の大腸菌を宿主として調製されたため、Ｍｂｏ
Ｉの認識配列である「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化さ
れている。従ってＭｂｏＩは新たに合成されたｃＤＮＡ
部分のみを切断する。当該ベクターはオリゴｄＴを結合
させた末端とは反対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部位
を１ヶ所だけ有しているので本酵素は当該ベクターを１
ヶ所切断し、さらに新たに合成されたｃＤＮＡ部分にも
しＢａｍＨＩ認識配列が存在すれば、その部位も切断す
る。ＢａｍＨＩとＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列から
なる、同一の付着端を生ぜしめるため、両酵素で切断し
た後、ＤＮＡリガーゼを作用させれば、プラスミドを閉
環することができる。

【００１２】本方法においてはこのようにして調製した
プラスミドを用いて大腸菌を形質転換することによって
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。従って当該ライブラ
リーは各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その５’
側部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現する部
位までの領域を含んでいる。当該ｃＤＮＡライブラリー
から無作為に適当個数の組換え体を選択し、各組換え体
中のｃＤＮＡを抽出してその全塩基配列を決定する。本
法は、このようにして決定された特定配列を有するｃＤ
ＮＡ断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾
つ確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現
遺伝子を識別する方法である。本法において、組み換え
体ｃＤＮＡの抽出並びにｃＤＮＡの塩基配列の決定は、
いずれも当業者にとって自体公知の各種操作方法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８９、その他当業者にとって標準的な方法
を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とす
る）により行うことができる。

【００１３】尚、高発現遺伝子を識別する方法では、無
作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が適
当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体を
処理すればよい。本発明者らは上記方法を実施し、７７
０個の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決
定し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとして
の出現頻度が２／７７０であったｃＤＮＡ断片を、ヒト
脳で特異的に発現している遺伝子を有するＤＮＡ断片の
候補として選別した。

【００１４】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。上記３’断片を
プローブとして、クローンテック社から市販されている
ヒト大脳皮質ｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリ
ダイゼーションで、常法に従ってスクリーニングするこ
とによって行った結果、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増
幅することができた。この際、鋳型としてはストラタジ
ーン社から市販されているヒト大脳皮質ｃＤＮＡライブ
ラリーを用いることもできる。

【００１５】上記方法によって取得したクローンを大腸
菌を宿主とすることによって増殖せしめ、常法に従って
ラムダファージ粒子を調製した。当該ファージ粒子から
ＤＮＡを抽出して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、スト
ラタジーン社から市販されているベクター、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩを同様にＥｃｏＲＩで切断したものに
組み込んで、全塩基配列を決定した。これらの操作は全
て常法に従った。

【００１６】上記方法によって選別したｃＤＮＡ断片中
に存在すると思われる遺伝子が、脳組織で特異的に発現
していることの確認は、該ｃＤＮＡ配列の臓器特異的な
発現頻度をノーザンハイブリダイゼーションで確認する
ことで行うことができる。具体的には、クローンテック
社またはストラタジーン社から市販されている、ヒトの
各臓器から抽出したｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動
で分画し、メンブレンフィルターに転写した後、上記方
法によって選別したｃＤＮＡ断片をプローブとして、常
法に従ってハイブリダイゼーションを行った。本発明者
らはこの方法を用い、該ｃＤＮＡ配列の発現についての
臓器特異性を調べた。その結果、脳以外の他の臓器、器
官、細胞等でも該ｃＤＮＡ配列の多少の発現が認められ
たものの、それに比べ大脳皮質で特異的に発現していた
ことを確認した。

【００１７】このことは、該ｃＤＮＡ配列中に、ヒト脳
で特異的に発現し正常な脳機能の維持に必須である所望
の遺伝子が存在することを、強く示唆するものである。

【００１８】塩基配列中の蛋白質をコードする領域（Ｏ
ＲＦ、open reading frame）の存在は、塩基配列をコン
ピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法によ
り確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的と
する遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピュー
ターを利用して該配列中にＯＲＦを見いだし、この遺伝
子を遺伝子ｈｕｃｅｐ−３（ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒ
ａｌ ｐｒｏｔｅｉｎの略）、該遺伝子にコードされる
蛋白質をＨＵＣＥＰ−３と命名した。

【００１９】遺伝子ｈｕｃｅｐ−３は、配列番号：２に
示される４９８塩基対（ｂｐ）からなる遺伝子である。
この遺伝子ｈｕｃｅｐ−３を用い、適当な宿主ベクター
系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組み換
え遺伝子を調製することができる。適当なベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐ
ＵＢ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来のプラスミ
ド（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファー
ジやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィ
ルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成
ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンを付加することも可能である。さらに該遺伝子を発
現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモータ
ーを接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて
適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合
には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐ
プロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチ
ルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿
主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細
胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウ
ィルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。

【００２０】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＨＵＣＥＰ−３は、適当なプ
ロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出す
ことが可能である。

【００２１】ＨＵＣＥＰ−３の発現の際に利用できる宿
主としては、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母とし
てはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨ
Ｏ細胞、ＰＣ１２細胞等が利用できる。

【００２２】上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、常法または各宿主細胞に対
して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。

【００２３】本発明者らは、ｐＧＥＸ−４Ｔ２（ファル
マシア社製）を発現ベクターとして遺伝子ｈｕｃｅｐ−
３を組み換え、ＨＵＣＥＰ−３発現ベクター、ｐＧＥｈ
ｕｃｅｐ３を調製した。このｐＧＥｈｕｃｅｐ３を用
い、常法に従って形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＤＨ５／ｐＧＥｈｕｃｅｐ３は、平成９年２
月４日に工業技術院生命工学技術研究所に寄託番号ＦＡ
ＲＭ Ｐ−１６０６２として寄託されている。

【００２４】更に本発明者らは、ｐＲＥＰ１０（インビ
トロジェン社製）を発現ベクターとして遺伝子ｈｕｃｅ
ｐ−３を組み換え、ＨＵＣＥＰ−３を培養動物細胞内で
発現させるためのベクター、ｐＲＥｈｕｃｅｐ３を調製
した。このｐＲＥｈｕｃｅｐ３を用い、ギブコ社のＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を利用して、神経細胞ＰＣ
１２を形質転換し、形質転換体、ＰＣ１２／ｐＲＥｈｕ
ｃｅｐ３を調製した。形質転換された細胞は、用いたベ
クターに存在する選択マーカー、または適当な選択マー
カーを付与又は削除し、これら選択マーカーの有無に基
づいて識別することにより、単離する事ができる。本発
明者らが行った、ＰＣ１２細胞をｐＲＥｈｕｃｅｐ３で
形質転換した場合には、抗生物質ハイグロマイシンＢ耐
性を指標として形質転換体を識別、単離することができ
る。

【００２５】上記操作の結果得られた形質転換細胞内で
の目的遺伝子の発現は、実施例において後述するよう
に、ノーザンハイブリダイゼーションにより確認するこ
とができる。宿主として用いた神経細胞ＰＣ１２および
ベクターであるｐＲＥＰ１０を導入したＰＣ１２細胞を
通常の増殖培地からＮＧＦ（神経細胞成長因子）を除去
した培地に移すと細胞死を起こすが、ｐＲＥｈｕｃｅｐ
３により形質転換された神経細胞ＰＣ１２は、ＮＧＦ除
去培地でも生育することが、例えばＭＴＴ（３−（４，
５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，
５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒ
ｏｍｉｄｅ）法（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５，５５−５９（１９８
５））により確認された。

【００２６】新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−３は、配列番号：
１に示されるごとく、総数１６６個のアミノ酸残基から
なる、分子量１７９９４ダルトンの蛋白質である。前述
のように、遺伝子ｈｕｃｅｐ−３を含有する組み換えベ
クターで形質転換させた神経細胞ＰＣ１２が、ＮＧＦ
（神経細胞成長因子）の非存在下において有意に高い生
存率を示したことから、ＨＵＣＥＰ−３は神経細胞機能
賦活化活性を有する生理活性蛋白質であることが確認さ
れた。

【００２７】尚、本発明においては、配列番号：２に示
したＤＮＡ配列の他に、該ＤＮＡとハイブリダイズしか
つ神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質をコ
ードするＤＮＡも、本発明の範囲内である。

【００２８】すなわち、遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の全長配
列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異
導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断に
よるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的に
ＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変
異体が遺伝子ｈｕｃｅｐ−３とストリンジェンドな条件
下でハイブリダイズし、かつ神経細胞機能賦活化活性を
有する生理活性蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配
列表２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明
の範囲内のものである。

【００２９】また、配列番号：２に示したＤＮＡ配列と
僅かに異なる配列からなる遺伝子が、ヒト染色体上に遺
伝子ｈｕｃｅｐ−３とは別個に存在する可能性もあり得
るが、この場合においても、そこにコードされる蛋白質
が神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質であ
れば、上記人為的変異体と同様に本発明の範囲内のもの
である。

【００３０】上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｈｕｃ
ｅｐ−３のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するも
のであれば許容範囲内である。また、遺伝子ｈｕｃｅｐ
−３とハイブリダイズする程度としては、通常の条件下
（例えば ＤＩＧ ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ
（ベーリンガー・マンハイム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１
７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃の
ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハ
イム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブ
リダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％
［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条
件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイ
ゼーションで、遺伝子ｈｕｃｅｐ−３にハイブリダイズ
する程度であればよい。

【００３１】また、上記のごとく遺伝子ｈｕｃｅｐ−３
と相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であ
って、神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質
もまた、本発明の範囲内のものである。

【００３２】すなわち、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−３のア
ミノ酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換
もしくは付加された変異体であっても、該変異体が神経
細胞機能賦活化活性を有する蛋白質であれば、該変異体
は本発明の範囲内のものである。

【００３３】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００３４】従って、配列番号：１に示した新規蛋白質
ＨＵＣＥＰ−３のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等
による変異蛋白質であっても、その変異がＨＵＣＥＰ−
３蛋白質の３次元構造において保存性が高い変異であっ
て、その変異蛋白質がＨＵＣＥＰ−３と同様に神経細胞
機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質であれば、これ
らは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。変
異の程度としては、配列番号：１に示したアミノ酸配列
との相同性が、９０％以上のものが許容し得る範囲であ
る。

【００３５】

【発明の効果】ＨＵＣＥＰ−３が神経細胞賦活化活性を
有していることから、遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の発現異
常、あるいはＨＵＣＥＰ−３の機能不全は、脳の高次機
能を維持する上で重大な障害となると推測される。

【００３６】したがってＨＵＣＥＰ−３それ自体は虚血
性脳疾患やアルツハイマー病、パーキンソン病などの神
経変性疾患の治療薬として有用と考えられる。また、当
該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を
促進する物質、あるいはまた当該遺伝子の発現を促進す
る物質等の創出に利用することができる。

【００３７】以下実施例を挙げて詳述するが、本発明は
この実施例に限定されないことは言うまでもない。

【００３８】

【実施例】

実施例１ 遺伝子ｈｕｃｅｐ−３のクローニング １）大脳の正常機能の維持に必須な遺伝子の部分配列の
決定 ヒト大脳皮質のｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型と
して、大久保らの方法（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ.，１９９２、２、ｐ１７３）に
より、大脳皮質のｃＤＮＡライブラリーを作成した。

【００３９】次いで、当該ライブラリーから無作為に７
７０個の組換え体を選択し、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８
９、以下同じ）に従って、組換えＤＮＡを抽出し、ｃＤ
ＮＡ部分の３’側の塩基配列を決定した。配列決定には
ＰＥアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キッ
トを用いた。７７０個の組み換え体中の各ＤＮＡ断片の
発現頻度を解析した結果、図１に示す配列（配列−１）
を有する遺伝子の発現頻度が２／７７０であった。

【００４０】２）配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクロー
ニング 配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方
法により行った。

【００４１】まず、配列−１の一部分よりなるオリゴヌ
クレオチド（図１；配列−２）を、ＰＥアプライドバイ
オシステムズ社製のＤＮＡ合成機（ＡＢＩ ３８０Ｂ）
で合成した。λｇｔ１１をクローニングベクターとす
る、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒ
ｔｅｘ ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａ
ｒｙ（クロンテックラボラトリーズ社製)を、大腸菌Ｋ
１２株、Ｙ１０９０を宿主として常法に従ってプラーク
を形成せしめた。プラークをメンブレンフィルター（ア
マシャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+）に転写し、ＤＩＧ
（ジゴキシゲニン）で標識した配列−２のオリゴヌクレ
オチドをプローブとして、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法によって配列−２を有するファージを取得した。
標識にはＤＩＧオリゴヌクレオチド・テイリングキット
（ベーリンガーマンハイム社製)を使用し、方法は本キ
ットの手順に従った。ハイブリダイゼーションは以下の
組成の溶液中で（濃度は全て終濃度）、５１℃で５時間
行った。

【００４２】５×ＳＳＣ １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシルナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ ５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙＡ １ｐｍｏｌ／ｍｌ ＤＩＧ標識合成ＤＮＡ ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。メンブレン洗浄後、
ＤＩＧ発光検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）
を使用し、当該キットの手順に従ってメンブレンを処理
した。シグナルの検出には、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−Ｅ
ＣＬ（アマシャム社製)フイルムを使用した。

【００４３】プローブとハイブリダイズしたプラークを
常法に従って純化し、単一クローンを取得した。当該単
一クローンを増殖せしめ、ファージ粒子よりＤＮＡを抽
出、精製した。これらの操作は全て常法に従った。

【００４４】３）塩基配列決定用ベクターへのサブクロ
ーニング ２）で精製したＤＮＡを、制限酵素、ＥｃｏＲＩで切断
し、同様にＥｃｏＲＩで切断したベクター、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）にサブクロー
ニングした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、宝酒造（株）製
のキット（タカラ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ．２）を用い、１６℃で１．５時間反応させ
た。

【００４５】上記反応溶液を用いて常法に従って大腸菌
Ｋ１２株ＤＨ５の形質転換を行った。 形質転換体をア
ンピシリン（Ａｍｐ）５０μｇ／ｍｌ、５−Ｂｒｏｍｏ
−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）４０μｇ／ｍｌ、
Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏ−Ｇａｌａｃｔ
ｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）１００μＭを含有
するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃で一晩培
養した。

【００４６】白色コロニーを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを
含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種して３７℃で一晩培養
し、遠心分離によって菌体を集めた後、ＱＩＡｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉ
ｔ（キアゲン社製）で組換えＤＮＡを精製した。

【００４７】４）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 塩基配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製
のＤＮＡシークエンサーを用い、ダイターミネーター法
を用いた。決定された塩基配列を元にしてオリゴヌクレ
オチドを合成し、プライマーウオーキング法で全塩基配
列を決定した（図２）。当該クローンのｃＤＮＡの全塩
基配列を図３から図４に示す。当該塩基配列が配列−２
を含んでいたことから、目的とする遺伝子（ｈｕｍａｎ
ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−３、ｈｕｃｅｐ
−３）がクローニングされたことを確認した。

【００４８】５）大腸菌を用いたＨＵＣＥＰ−３の生産 図３に示した配列を元にして配列−３、配列−４のオリ
ゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイ
オシステムズ社製、ＡＢＩ ３８０Ｂ）で合成した。

【００４９】 配列−３ ５’ＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣ 配列−４ ５’ＴＡＡＴＡＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＣ 実施例１−２）で調製した組換えＤＮＡを鋳型とし、配
列−３と配列−４のオリゴヌクレオチドをプライマーと
してＰＣＲを行った。当該ＰＣＲ操作は、ストラタジー
ン社製のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用い、宝酒造
（株）製のＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用して、
以下の反応条件で行った。

【００５０】 ＜反応液組成＞ １ー３）の組み換えＤＮＡ １μＬ １０×ＰＣＲ緩衝液 ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μＬ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−３） ２μＬ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−４） ２μＬ 水 ３１μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ １μＬ 総量 ５０μＬ ＜反応条件＞９４℃で１分間保持後、５３℃まで−１℃
／２秒の速度で冷却し、５３℃で１分間保持し、更に７
２℃で３分間保持した。これを３０回繰り返した後、７
２℃で１０分間保持して、目的のＤＮＡを増幅させた。

【００５１】上記方法により増幅されたＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動で分画、精製した。当該精製ｃＤ
ＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｃａＩ（共に宝酒
造製）で切断した。切断処理後、再びアガロースゲル電
気泳動で分画し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した
（断片−１）。ｐＧＥＸ−４Ｔ２（ファルマシア社製）
を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断し、開環ベク
ター（断片−２）を精製した。断片−１と断片−２を混
合し、実施例１−３）に記載した条件下で、ライゲーシ
ョンならびに大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５株の形質転換を行
い、さらに該形質転換体を培養して遠心によって集めた
菌体から、組換えＤＮＡを精製した。当該組換えＤＮＡ
に挿入された断片−１の塩基配列を、以下に示す配列−
５及び配列−６のプライマーを利用し、ＤＮＡシーケン
サーで決定した。

【００５２】 配列−５ ５’ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧ 配列−６ ５’ＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ その結果、当該断片−１の塩基配列が遺伝子ｈｕｃｅｐ
−３の塩基配列と同一であること、及び遺伝子ｈｕｃｅ
ｐ−３がｐＧＥＸ−４Ｔ２内のグルタチオンＳトランス
フェラーゼ遺伝子と同じリーディングフレームで翻訳さ
れることを確認した。このようにして構築した組換えＤ
ＮＡをｐＧＥｈｕｃｅｐ３と命名した（図５）。ｐＧＥ
ｈｕｃｅｐ３の形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉＤＨ５／ｐＧＥｈｕｃｅｐ３は、平成９年２月４
日に工業技術院生命工学技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１６０６２として寄託されている。当該組換えＤ
ＮＡを保持する菌体を培養し、適当な条件下に遺伝子発
現を誘導すればＨＵＣＥＰ−３をグルタチオンＳトラン
スフェラーゼとの融合蛋白として生産することができ
る。また、ｐＧＥｈｕｃｅｐ３に組み込まれた遺伝子ｈ
ｕｃｅｐ−３は、制限酵素ＢａｍＨＩと、ＳａｌＩまた
はＸｈｏＩとを該組み換えベクターに作用させることで
単離され、これを別の適当な発現ベクターに組み換える
こともできる。 実施例２ ＰＣ１２細胞中での遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の
発現と機能の解析 1)発現ベクターｐＲＥｈｕｃｅｐ３の構築 実施例１で取得した、ｐＧＥｈｕｃｅｐ３を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＸｈｏＩ（共に宝酒造製）で切断した。切断
処理後、アガロースゲル電気泳動で分画し、約０．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した（断片−３）。動物細胞の発
現ベクター、ｐＲＥＰ１０（インビトロジェン社製）
を、上記と同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断
し、開環ベクター（断片−４）を精製した。

【００５３】断片−３と断片−４を混合し、実施例１に
記載した条件下で、ライゲーションならびに大腸菌Ｋ１
２株ＤＨ５株の形質転換を行い、さらに該形質転換体を
培養して遠心によって集めた菌体から、組換えＤＮＡを
精製した。このようにして構築した組換えＤＮＡをｐＲ
Ｅｈｕｃｅｐ３と命名した（図６）。

【００５４】２）ＰＣ１２細胞への導入と安定な形質転
換体の取得 ＰＣ１２細胞を直径６０ｍｍのプラスチックシャーレで
培養した。シャーレはコラーゲンコートしたものを用
い、培地としては５％牛胎児血清、５％ウマ血清、５０
ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプト
マイシンを含むＤＭＥＭ（ギブコ社製、以下増殖培地と
する）を使用し、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養し
た。

【００５５】細胞密度が５０％になった時点で、１）で
構築したｐＲＥｈｕｃｅｐ３を含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡ
ＭＩＮＥ試薬（ギブコ社製）を、細胞上に重層して２４
時間培養した後、増殖培地に置換して２４時間培養し
た。ピペッティングで細胞を分散した後、細胞懸濁液を
２等分して直径１００ｍｍのプラスチックシャーレ２枚
に分注してさらに２４時間培養した。

【００５６】培地を除いた後、ハイグロマイシンＢ（カ
ルビオケム社製；終濃度４００μｇ／ｍｌ）を含有する
増殖培地に置換した。ハイグロマイシンＢ添加培地を３
日毎に交換してして２週間培養した。細胞のコロニーが
肉眼で確認できるようになった時点で、ステンレスカッ
プを用いてコロニーを５個単離した。対照として用いる
ためにＰＣ１２細胞にｐＲＥＰ１０のみを上記と同様に
して導入し、安定な形質転換体を５個単離した。

【００５７】３）遺伝子発現の確認 単離した各形質転換体を、２４穴のプレートでハイグロ
マイシンＢ添加培地（終濃度４００μｇ／ｍｌ）で培養
し、細胞密度が８０％コンフルエントになった時点でピ
ペッティングで細胞を分散して、直径１００ｍｍのプラ
スチックシャーレに接種した。細胞密度が再度８０％コ
ンフルエントになった時点で培地を除去し、ＰＢＳを添
加してセルスクレイパーを用いて細胞を回収した。遠心
によって細胞を沈殿させた後に上清を除去し、ｍＲＮＡ
抽出キット（ファルマシア バイオテク社製）を用いて
細胞からｍＲＮＡを精製した。２μｇのｍＲＮＡを定法
に従ってアガロースゲル電気泳動で分画してメンブレン
（アマシャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+）に転写し、ノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。プローブとして
はＤＩＧ（ジゴキシゲニン）で標識したｈｕｃｅｐ−３
のｃＤＮＡ断片を用いた。標識にはＤＩＧオリゴヌクレ
オチド・テイリングキット（ベーリンガーマンハイム社
製)を使用し、方法は本キットの手順に従った。ハイブ
リダイゼーションは以下の組成の溶液中で（濃度は全て
終濃度）、５１℃で５時間行った。

【００５８】 ５×ＳＳＣ １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシルナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ ５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙＡ １ｐｍｏｌ／ｍｌ ＤＩＧ標識合成ＤＮＡ ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。

【００５９】メンブレン洗浄後、ＤＩＧ発光検出キット
（ベーリンガーマンハイム社製）を使用し、当該キット
の手順に従ってメンブレンを処理した。シグナルの検出
には、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−ＥＣＬ（アマシャム社
製)フイルムを使用した。

【００６０】その結果、ｐＲＥｈｕｃｅｐ３を導入した
ＰＣ１２細胞のほうがｐＲＥＰ１０を導入したＰＣ１２
細胞よりも、ｈｕｃｅｐ−３遺伝子の発現量が多かっ
た。

【００６１】４）ＮＧＦ除去培地中での増殖 ３）でｈｕｃｅｐ３遺伝子の高発現を確認することがで
きた安定な形質転換体を増殖培地で培養した。細胞密度
が５０％になった時点で血清を含まない培地に置換して
３日間培養し、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙ
ｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍ
ｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ６５，５５−５９（１９８５））で生存細胞数を
測定した。ｐＲＥｈｕｃｅｐ３を導入したＰＣ１２細胞
は、対照として用いた、ｐＲＥＰ１０導入細胞に比べて
生存細胞数が有意に多かった。

【００６２】

【配列表】

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：１６６残基 配列の型 ：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Ser Leu His Ser Ser Pro Thr Leu Pro Thr Ser Leu Tyr Gln 5 10 15 Ser Cys Asp Leu Ser Val Gly Gly Pro Ser Leu Leu Thr Trp Val 20 25 30 Trp Arg Arg Glu Arg Arg Cys Cys Lys Val Phe Ser Val Ser His 35 40 45 Cys Leu Glu Ala Gly Pro Ala Lys Ala Trp Ala His Ser Cys Thr 50 55 60 Gly Ser Pro Arg Gly Arg Thr Gly Trp Gly Ser Arg Ala Cys Glu 65 70 75 Ala Leu Gly Lys Gly Met Gly Leu Trp Gly Arg Gly Gly Met Gly 80 85 90 Phe Arg Ser Ile Cys Thr Ile Arg Lys Val Leu Arg Ser Phe Phe 95 100 105 Leu Glu Gly Thr Leu Ser Ser Leu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gly 110 115 120 Leu Glu Leu Arg Met Gly Arg Cys Ala Gln Gly Gly Thr His Gln 125 130 135 Ser Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Leu Gly Val Ser Gln Gly Leu Cys 140 145 150 Gln Cys Leu Gln Pro Thr Ser Arg Ser Leu Glu Phe Gly Glu Trp 155 160 165 Gly 166

【００６３】

【配列表】

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ：４９８塩基 配列の型 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 １０ ２０ ３
０ ４０ ５０ ＡＴＧＴＣＴＣＴＣＣ ＡＴＴＣＣＴＣＴＣＣ ＡＡＣＣＣＴＧＣＣ
Ｃ ＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴ ＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧ ５０ ＴＧＡＴＣＴＣＴＣＧ ＧＴＧＧＧＧＧＧＣＣ ＣＡＴＣＴＣＴＧＣ
Ｔ ＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧ ＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧ １００ ＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧ ＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧ ＴＴＴＴＣＴＧＴＧ
Ｔ ＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴ ＴＧＡＡＧＣＴＧＧＧ １５０ ＣＣＴＧＣＣＡＡＡＧ ＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡ ＣＡＧＣＴＧＣＡＣ
Ｃ ＧＧＣＡＧＣＣＣＡＡ ＧＧＧＧＡＡＧＧＡＣ ２００ ＣＧＧＴＴＧＧＧＧＧ ＡＧＣＣＧＧＧＣＡＴ ＧＴＧＡＧＧＣＣＣ
Ｔ ＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧ ＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴ ２５０ ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣ ＴＴＣＡＧＡＡＧＴ
Ａ ＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴ ＴＡＧＡＡＡＡＧＴＣ ３００ ＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴ ＴＴＴＴＣＴＴＧＧＡ ＧＧＧＴＡＣＡＣＴ
Ｔ ＴＣＴＴＣＡＣＴＧＴ ＣＣＣＴＡＴＴＣＣＴ ３５０ ＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡ ＧＧＡＴＧＧＧＡＣ
Ｇ ＡＴＧＴＧＣＣＣＡＧ ＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣ ４００ ＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣ ＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴ ＧＧＣＴＡＣＣＴＧ
Ｇ ＧＧＧＴＧＴＣＣＣＡ ＧＧＧＡＣＴＣＴＧＴ ４５０ ＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣ ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧ ＣＡＧＧＡＧＣＴＴ
Ｇ ＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧ ＡＧＴＧＧＧＧＡ ４９８

【図面の簡単な説明】

【図１】図１の配列−１は、大脳皮質のｃＤＮＡライブ
ラリーより得られる組み換え体中で高い発現頻度を示す
ＤＮＡ断片を表わし、配列−２は、配列−１を含むＤＮ
Ａ断片のクローニングに用いたオリゴヌクレオチドを示
す。

【図２】遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の塩基配列決定の方法を
示す。

【図３】遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の塩基配列及びそれによ
ってコードされるアミノ酸配列を示す。

【図４】図３の続きであり、遺伝子ｈｕｃｅｐ−３の塩
基配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を示
す。

【図５】組み換えベクターｐＧＥｈｕｃｅｐ３の構築を
示す。

【図６】発現ベクターｐＲＥｈｕｃｅｐ３の構築を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＢ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＡＭ ＡＡＭ ＡＤＴ ＡＤＴ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高山 喜好 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
   質； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する
   蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の（ａ）または（ｂ）の
   蛋白質をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡから
   なる遺伝子； （ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ； （ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
   でハイブリダイズし、かつ神経細胞機能賦活化活性を有
   する蛋白質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または請求項３に記載の遺伝子
   を含有する組み換えベクターを含む形質転換体。