JPH11221075A - 新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト大脳皮質由来の転写調節活性を有する新
規蛋白質ＨＵＣＥＰ−４と、それをコードする遺伝子ｈ
ｕｃｅｐ−４を提供する。 【解決手段】 ヒト大脳皮質由来のｃＤＮＡライブラリ
ーからのクローニングによって転写調節活性を有する新
規蛋白質ＨＵＣＥＰ−４をコードする遺伝子ｈｕｃｅｐ
−４が得られ、該遺伝子を有する発現ベクターによる形
質転換体の培養により、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−４が得
られる。該蛋白質は転写調節因子として、医薬又は医薬
の開発に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、遺伝子の転写調節機能
を有する、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒ
ｅｂｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−４、該蛋白質をコード
する遺伝子ｈｕｃｅｐ−４に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生物を取り巻く外界には、重金属やアミ
ノ酸の化学物質、熱や浸透圧等の物理的要因、ビタミン
やホルモン等の生理活性物質、ウイルスや細菌等の生物
学的要因などの、多種の環境因子が存在する。生物を構
成する細胞は、この環境因子を特定のシグナルとして感
知する機能を有し、このシグナルに応じた特定の遺伝子
の転写を調節することで、外界変化に対応する。この遺
伝子の転写制御メカニズムに関わる蛋白質（転写制御蛋
白質）は、機能的に大きく二種類に分けられる。

【０００３】第一に、例えばプロモーター配列等の転写
制御領域の塩基配列に特異的に親和性を示すＤＮＡ結合
蛋白質が挙げられる。これらＤＮＡ結合蛋白質は、転写
制御領域に存在する特定の塩基配列を認識してこれに結
合することで、遺伝子の転写を促進または抑制する機能
を有する。これまで明らかにされたＤＮＡ結合蛋白質
は、蛋白化学上特徴的な構造を有するものが多い。例え
ば、λリプレッサ−等に見られるヘリックス・ターン・
ヘリックス構造、ＧＣＮ−４に見られるロイシンジッパ
ー構造、ＧＡＴＡ因子に見られるＺｎフィンガー構造等
が代表例であり、この他にもＴＢＰ（TATA binding pro
tein）、ＮＦ−κＢ、ＰＯＵドメイン転写因子等が挙げ
られる。

【０００４】第二に、直接ＤＮＡと結合してその転写を
制御するのではなく、ＤＮＡ結合蛋白質と結合すること
でＤＮＡ結合蛋白質の転写能を調節する因子（転写調節
因子）が挙げられる。これらは一方で細胞内外からの各
種シグナル、例えば蛋白質リン酸化、アロステリック因
子等のエフェクター等の複雑なシグナル伝達を受ける機
能を有することが多く、シグナルに対応してＤＮＡ結合
蛋白質の活性を促進、抑制して、目的遺伝子を必要量だ
け転写させるように働く。

【０００５】例えば、Ｅ２Ｆと結合してその活性を調節
するＲＢ（retinoblastoma gene；Weinberg, Science
(1991) 254, 1138）、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢなどと結合
しその活性を調節するＨＴＬＶ−１由来のＴａｘ（tran
scriptional trans-activator coded in X-region；Yos
hida et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79, 203
1）等が挙げられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、細胞機
能の発現は、種々の遺伝子の発現制御、即ち遺伝子発現
の促進または抑制に依存し、これらを通じて細胞は生
存、増殖または死滅するものと考えられている。従っ
て、臓器特異的な分化細胞でのみ発現しているＤＮＡ結
合蛋白質や転写調節因子は、その分化細胞に固有の機
能、生存または死滅に深く関与していると考えられる。
この様なＤＮＡ結合蛋白質または転写調節因子を単離同
定することは、臓器特異的な分化細胞生理に起因する病
態の解明、治療法の開発や薬物の探索等に、極めて重要
な意義を有するものと考えられる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、神経細胞
内での各種遺伝子の転写制御蛋白質の同定を目的とし、
ヒト脳組織で特異的に発現している遺伝子の中から、所
望の蛋白質を把握するべく鋭意研究の結果、新規蛋白質
ＨＵＣＥＰ−４の存在とそれをコードする遺伝子ｈｕｃ
ｅｐ−４の単離に成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ活性を有する蛋白質に関するものである。さら
に本発明は、（ｃ）配列番号：２に記載のＤＮＡからな
る遺伝子、または、（ｄ）配列番号：２のＤＮＡとスト
リンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する
ものである。

【０００９】本発明であるＨＵＣＥＰ−４は、全８０９
アミノ酸残基からなる分子量９２５１４ダルトン（Ｄ
ａ）の蛋白質である。そのアミノ酸配列上の特徴とし
て、５７番目から１２２番目に転写調節領域（SCAN BO
X;Williams et.al., J.Biol.Chem., Vol.270(38), 2213
4-22152(1995)）を、３４０番目から３４９番目に核内
移行シグナル（Arg-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-
Arg）を、またＰＫＣ（Protein Kinase C)により特異的
にリン酸化される部位を１２個、それぞれ有しているこ
とが認められる。以上から、ＨＵＣＥＰ−４は、ＰＫＣ
の作用によるリン酸化を受けつつ遺伝子の転写制御を行
う、核内移行蛋白質であると推察される。

【００１０】

【発明の実施の形態】遺伝子ｈｕｃｅｐ−４は、ヒト大
脳皮質由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含
んだｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明
者らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、クローンテッ
ク社から市販されているヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもと
に調製したものであるが、ストラタジーン社から市販さ
れているヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもとにしても、同様
にｃＤＮＡを調製することができる。

【００１１】上述のｃＤＮＡライブラリーにおいて、ヒ
ト脳組織で特異的に発現している遺伝子を有すると思わ
れるｃＤＮＡを識別する方法として、大久保らの方法
（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔ．，２，１７３（１９９２））による、遺伝子発現の
出現頻度を解析する方法を用いることができる。具体的
には、ヒト大脳皮質のｍＲＮＡを鋳型とし、適当な制限
酵素で開環させたベクタープラスミドの一端にオリゴｄ
Ｔを結合させたものをプライマーとしてｃＤＮＡ合成を
行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵素ＢａｍＨＩで切
断する。当該ベクターはｄａｍメチラーゼ陽性の大腸菌
を宿主として調製されたため、ＭｂｏＩの認識配列であ
る「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化されている。従って
ＭｂｏＩは新たに合成されたｃＤＮＡ部分のみを切断す
る。当該ベクターはオリゴｄＴを結合させた末端とは反
対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部位を１ヶ所だけ有し
ているので本酵素は当該ベクターを１ヶ所切断し、さら
に新たに合成されたｃＤＮＡ部分にもしＢａｍＨＩ認識
配列が存在すれば、その部位も切断する。ＢａｍＨＩと
ＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列からなる、同一の付着
端を生ぜしめるため、両酵素で切断した後、ＤＮＡリガ
ーゼを作用させれば、プラスミドを閉環することができ
る。

【００１２】本方法においてはこのようにして調製した
プラスミドを用いて大腸菌を形質転換することによって
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。従って当該ライブラ
リーは各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その５’
側部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現する部
位までの領域を含んでいる。当該ｃＤＮＡライブラリー
から無作為に適当個数の組換え体を選択し、各組換え体
中のｃＤＮＡを抽出してその全塩基配列を決定する。本
法は、このようにして決定された特定配列を有するｃＤ
ＮＡ断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾
つ確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現
遺伝子を識別する方法である。本法において、組み換え
体ｃＤＮＡの抽出並びにｃＤＮＡの塩基配列の決定は、
いずれも当業者にとって自体公知の各種操作方法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８９、その他当業者にとって標準的な方法
を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とす
る）により行うことができる。

【００１３】尚、高発現遺伝子を識別する方法では、無
作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が適
当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体を
処理すればよい。本発明者らは上記方法を実施し、７７
０個の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決
定し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとして
の出現頻度が２／７７０であったｃＤＮＡ断片を、ヒト
脳で特異的に発現している遺伝子を有するＤＮＡ断片の
候補として選別した。

【００１４】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。これは上記３’
断片をプローブとして、λＤＲ２をクローニングベクタ
ーとするヒト大脳皮質ｃＤＮＡライブラリー（クローン
テック社製）をプラークハイブリダイゼーションで、常
法に従ってスクリーニングすることによって行った。そ
の結果、約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅することがで
きた。

【００１５】上記方法によって取得したクローンをＣｒ
ｅリコンビナーゼを有する大腸菌にトランスフェクトす
ることにより、該クローンから当該ｃＤＮＡを含む断片
を環状プラスミドとして切り出して全塩基配列を決定し
た。

【００１６】上記方法によって選別したｃＤＮＡ断片中
に存在すると思われる遺伝子が、脳組織で特異的に発現
していることの確認は、該ｃＤＮＡ配列の臓器特異的な
発現頻度をノーザンハイブリダイゼーションで確認する
ことで行うことができる。具体的には、クローンテック
社またはストラタジーン社から市販されている、ヒトの
各臓器から抽出したｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動
で分画し、メンブレンフィルターに転写した後、上記方
法によって選別したｃＤＮＡ断片をプローブとして、常
法に従ってハイブリダイゼーションを行った。本発明者
らはこの方法を用い、該ｃＤＮＡ配列の発現についての
臓器特異性を調べた。その結果、脳以外の他の臓器、器
官、細胞等でも該ｃＤＮＡ配列の多少の発現が認められ
たものの、それに比べ大脳皮質で特異的に発現していた
ことを確認した。このことは、該ｃＤＮＡ配列中に、ヒ
ト脳で特異的に発現し正常な脳機能の維持に必須である
所望の遺伝子が存在することを、強く示唆するものであ
る。

【００１７】塩基配列中の蛋白質をコードする領域（Ｏ
ＲＦ、open reading frame）の存在は、塩基配列をコン
ピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法によ
り確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的と
する遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピュー
ターを利用して該配列中に一つのＯＲＦを見いだし、こ
の遺伝子を遺伝子ｈｕｃｅｐ−４、該遺伝子にコードさ
れる蛋白質をＨＵＣＥＰ−４と命名した。

【００１８】遺伝子ｈｕｃｅｐ−４は、配列番号：２に
示される２４２７塩基対（ｂｐ）からなる遺伝子であ
る。この遺伝子ｈｕｃｅｐ−４を用い、適当な宿主ベク
ター系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組
み換え遺伝子を調製することができる。適当なベクター
としては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来の
プラスミド（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリ
オファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の
動物ウィルス等が利用できる。組み換えに際しては、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻
訳終止コドンを付加することも可能である。さらに該遺
伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プ
ロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿主
に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌で
ある場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、
宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモータ
ー等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモータ
ー、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿
主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモータ
ー、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用で
きる。

【００１９】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＨＵＣＥＰ−４は、適当なプ
ロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出す
ことが可能である。

【００２０】ＨＵＣＥＰ−４の発現の際に利用できる宿
主としては、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母とし
てはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨ
Ｏ細胞、ＰＣ１２細胞等が利用できる。

【００２１】上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、常法または各宿主細胞に対
して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。

【００２２】前述した方法によって、取得したラムダフ
ァージクローンからｈｕｃｅｐ−４を含む断片を切り出
して得られた環状プラスミド、ｐＤＲｈｕｃｅｐ−４を
用い、常法に従って形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉＤＨ５／ｐＤＲｈｕｃｅｐ−４は、平成９
年３月１４日に工業技術院生命工学技術研究所に寄託番
号ＦＡＲＭ Ｐ−１６１３４として寄託されている。

【００２３】新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−４は、配列番号：
１に示されるごとく、総数８０９個のアミノ酸残基から
なる、分子量９２５１４Ｄａの蛋白質である。

【００２４】尚、本発明においては、配列番号：２に示
したＤＮＡ配列の他に、該ＤＮＡとハイブリダイズしか
つ活性を有する生理活性蛋白質をコードするＤＮＡも、
本発明の範囲内である。

【００２５】すなわち、遺伝子ｈｕｃｅｐ−４の全長配
列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異
導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断に
よるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的に
ＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変
異体が遺伝子ｈｕｃｅｐ−４とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ活性を有する生理活性蛋白
質をコードするＤＮＡであれば、配列表２に示したＤＮ
Ａ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものであ
る。

【００２６】また、配列番号：２に示したＤＮＡ配列と
僅かに異なる配列からなる遺伝子が、ヒト染色体上に遺
伝子ｈｕｃｅｐ−４とは別個に存在する可能性もあり得
るが、この場合においても、そこにコードされる蛋白質
が活性を有する生理活性蛋白質であれば、上記人為的変
異体と同様に本発明の範囲内のものである。

【００２７】上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｈｕｃ
ｅｐ−４のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するも
のであれば許容範囲内である。また、遺伝子ｈｕｃｅｐ
−４とハイブリダイズする程度としては、通常の条件下
（例えば ＤＩＧ ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ
（ベーリンガー・マンハイム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１
７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃の
ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハ
イム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブ
リダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％
［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条
件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイ
ゼーションで、遺伝子ｈｕｃｅｐ−４にハイブリダイズ
する程度であればよい。

【００２８】また、上記のごとく遺伝子ｈｕｃｅｐ−４
と相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であ
って、活性を有する生理活性蛋白質もまた、本発明の範
囲内のものである。

【００２９】すなわち、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−４のア
ミノ酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換
もしくは付加された変異体であっても、該変異体が活性
を有する蛋白質であれば、該変異体は本発明の範囲内の
ものである。

【００３０】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００３１】従って、配列番号：１に示した新規蛋白質
ＨＵＣＥＰ−４のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等
による変異蛋白質であっても、その変異がＨＵＣＥＰ−
４蛋白質の３次元構造において保存性が高い変異であっ
て、その変異蛋白質がＨＵＣＥＰ−４と同様に活性を有
する生理活性蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内
にあるものと言うことができる。変異の程度としては、
配列番号：１に示したアミノ酸配列との相同性が、９０
％以上のものが許容し得る範囲である。

【００３２】

【発明の効果】ＨＵＣＥＰ−４が転写調節活性を有して
いることから、遺伝子ｈｕｃｅｐ−４の発現異常、ある
いはＨＵＣＥＰ−４の機能不全は、脳の高次機能を維持
する上で重大な障害となると推測される。

【００３３】したがってＨＵＣＥＰ−４それ自体は虚血
性脳疾患やアルツハイマー病、パーキンソン病などの神
経変性疾患の治療薬として有用と考えられる。また、当
該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を
促進する物質、あるいはまた当該遺伝子の発現を促進す
る物質等の創出に利用することができる。

【００３４】

【実施例】以下実施例を挙げて詳述するが、本発明はこ
の実施例に限定されないことは言うまでもない。

【００３５】＜実施例１＞ 遺伝子ｈｕｃｅｐ−４のク
ローニング １）大脳の正常機能の維持に必須な遺伝子の部分配列の
決定 ヒト大脳皮質のｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型と
して、大久保らの方法（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ.，１９９２、２、ｐ１７３）に
より、大脳皮質のｃＤＮＡライブラリーを作成した。

【００３６】次いで、当該ライブラリーから無作為に７
７０個の組換え体を選択し、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８
９、以下同じ）に従って、組換えＤＮＡを抽出し、ｃＤ
ＮＡ部分の３’側の塩基配列を決定した。配列決定には
ＰＥアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キッ
トを用いた。７７０個の組み換え体中の各ＤＮＡ断片の
発現頻度を解析した結果、図１に示す配列（配列−１）
を有する遺伝子の発現頻度が２／７７０であった。

【００３７】２）配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクロー
ニング 配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方
法により行った。

【００３８】まず、配列−１の一部分よりなるオリゴヌ
クレオチド（図１；配列−２）を、ＰＥアプライドバイ
オシステムズ社製のＤＮＡ合成機（ＡＢＩ ３８０Ｂ）
で合成した。λＤＲ２をクローニングベクターとする、
Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔ
ｅｘ ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒ
ｙ（クロンテックラボラトリーズ社製)を、大腸菌Ｋ１
２株、Ｋ８０２を宿主として常法に従ってプラークを形
成せしめた。プラークをメンブレンフィルター（アマシ
ャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+）に転写し、ＤＩＧ（ジゴ
キシゲニン）で標識した配列−２のオリゴヌクレオチド
をプローブとして、プラークハイブリダイゼーション法
によって配列−２を有するファージを取得した。標識に
はＤＩＧオリゴヌクレオチド・テイリングキット（ベー
リンガーマンハイム社製)を使用し、方法は本キットの
手順に従った。ハイブリダイゼーションは以下の組成の
溶液中で（濃度は全て終濃度）、５１℃で５時間行っ
た。

【００３９】５×ＳＳＣ １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシルナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ ５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙＡ １ｐｍｏｌ／ｍｌ ＤＩＧ 標識合成ＤＮＡ ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。メンブレン洗浄後、
ＤＩＧ発光検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）
を使用し、当該キットの手順に従ってメンブレンを処理
した。シグナルの検出には、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−Ｅ
ＣＬ（アマシャム社製)フイルムを使用した。

【００４０】プローブとハイブリダイズしたプラークを
常法に従って純化し、単一クローンを取得した。

【００４１】当該単一クローンを大腸菌Ｋ１２株、Ｋ８
０２を宿主として増殖せしめた後、大腸菌Ｋ１２株、Ａ
Ｍ１にトランスフェクトして、当該菌体を培養した。こ
れらの操作は「λＤＲ２＆ｐＤＲ２ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｂ
ｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ク
ローンテック社製）に従って行った。遠心分離によって
菌体を集めた後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓ
ｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で
組換えＤＮＡを精製した。このような方法によって、取
得したラムダファージクローンからｈｕｃｅｐ−４を含
む断片を切り出して得られた環状プラスミドをｐＤＲｈ
ｕｃｅｐ−４と命名した。このプラスミドｐＤＲｈｕｃ
ｅｐ４の構造を図２に示す。

【００４２】ｐＤＲｈｕｃｅｐ−４を用い、常法に従っ
て形質転換したＥｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ
５／ｐＤＲｈｕｃｅｐ−４は、平成９年３月１２日に工
業技術院生命工学技術研究所に寄託番号ＦＡＲＭ Ｐ−
１６１３４として寄託されている。

【００４３】３）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 塩基配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製
のＤＮＡシークエンサーを用い、ダイターミネーター法
を用いた。決定された塩基配列を元にしてオリゴヌクレ
オチドを合成し、プライマーウオーキング法で両鎖の全
塩基配列を決定した（図３）。当該クローンのｃＤＮＡ
の全塩基配列を配列番号３に示す。当該塩基配列が配列
−２を含んでいたことから、目的とする遺伝子ｈｕｃｅ
ｐ−４がクローニングされたことを確認した。

【００４４】当該ｃＤＮＡは８０９残基より成る蛋白質
（ＨＵＣＥＰ−４）をコードする翻訳領域（ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）を含んでいた。

【００４５】＜実施例２＞ヒト組織中での遺伝子ｈｕｃ
ｅｐ−４の発現の確認 ノ−ザンハイブリダイゼ−ションを実施して、ヒト組織
中での遺伝子ｈｕｃｅｐ−４の発現を確認した。

【００４６】ヒト大脳皮質からｍＲＮＡ抽出キット（フ
ァルマシア バイオテク社製）を用いてｍＲＮＡを精製
した。２μｇのｍＲＮＡを定法に従ってアガロースゲル
電気泳動で分画してメンブレン（アマシャム社製Ｈｙｂ
ｏｎｄ−Ｎ+）に転写し、ハイブリダイゼーションを行
った。プローブとしてはＤＩＧ（ジゴキシゲニン）で標
識したｈｕｃｅｐ−４のｃＤＮＡ断片を用いた。標識に
はＤＩＧオリゴヌクレオチド・テイリングキット（ベー
リンガーマンハイム社製)を使用し、方法は本キットの
手順に従った。ハイブリダイゼーションは以下の組成の
溶液中で（濃度は全て終濃度）、５１℃で５時間行っ
た。

【００４７】５×ＳＳＣ １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシルナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ ５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙＡ １ｐｍｏｌ／ｍｌ ＤＩＧ 標識合成ＤＮＡ ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。

【００４８】メンブレン洗浄後、ＤＩＧ発光検出キット
（ベーリンガーマンハイム社製）を使用し、当該キット
の手順に従ってメンブレンを処理した。シグナルの検出
には、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−ＥＣＬ（アマシャム社
製)フイルムを使用した。

【００４９】プロ−ブとハイブリダイズするｍＲＮＡ
は、大脳皮質に豊富であった。

【００５０】＜実施例３＞ ＰＣ１２細胞中でのｈｕｃ
ｅｐ−４遺伝子の発現 １）ＰＣ１２細胞への導入と安定な形質転換体の取得 実施例−１で取得したｐＤＲｈｕｃｅｐ−４はｈｕｃｅ
ｐ−４断片の上流にＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを有し
ており、当該組換えＤＮＡを動物細胞中に導入すれば、
ｈｕｃｅｐ−４を発現させることが可能である。

【００５１】ＰＣ１２細胞を直径６０ｍｍのプラスチッ
クシャーレで培養した。シャーレはコラーゲンコートし
たものを用い、培地としては５％牛胎児血清、５％ウマ
血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ギブコ社製、以下
増殖培地とする）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2存在下
で培養した。

【００５２】細胞密度が５０％になった時点で、１）で
構築したｐＤＲｈｕｃｅｐ−４を含むＬＩＰＯＦＥＣＴ
ＡＭＩＮＥ試薬（ギブコ社製）を、細胞上に重層して５
時間培養した後、増殖培地に置換して２４時間培養し
た。ピペッティングで細胞を分散した後、細胞懸濁液を
２等分して直径１００ｍｍのプラスチックシャーレ２枚
に分注してさらに２４時間培養した。

【００５３】培地を除いた後、ハイグロマイシンＢ（カ
ルビオケム社製；終濃度４００μｇ／ｍｌ）を含有する
増殖培地に置換した。ハイグロマイシンＢ添加培地を３
日毎に交換してして２週間培養した。細胞のコロニーが
肉眼で確認できるようになった時点で、ステンレスカッ
プを用いてコロニーを５個単離した。対照として用いる
ためにＰＣ１２細胞にｐＤＲ２（クローンテック社製）
のみを上記と同様にして導入し、安定な形質転換体を５
個単離した。

【００５４】２）形質転換体中の遺伝子発現の確認 単離した各形質転換体を、２４穴のプレートでハイグロ
マイシンＢ添加培地（終濃度４００μｇ／ｍｌ）で培養
し、細胞密度が８０％コンフルエントになった時点でピ
ペッティングで細胞を分散して、直径１００ｍｍのプラ
スチックシャーレに接種した。細胞密度が再度８０％コ
ンフルエントになった時点で培地を除去し、ＰＢＳを添
加してセルスクレイパーを用いて細胞を回収した。遠心
によって細胞を沈殿させた後に上清を除去し、ｍＲＮＡ
抽出キット（ファルマシア バイオテク社製）を用いて
細胞からｍＲＮＡを精製した。２μｇのｍＲＮＡを定法
に従ってアガロースゲル電気泳動で分画してメンブレン
（アマシャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+）に転写し、ノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。プローブとして
はＤＩＧ（ジゴキシゲニン）で標識したｈｕｃｅｐ−４
のｃＤＮＡ断片を用いた。標識にはＤＩＧオリゴヌクレ
オチド・テイリングキット（ベーリンガーマンハイム社
製)を使用し、方法は本キットの手順に従った。ハイブ
リダイゼーションは以下の組成の溶液中で（濃度は全て
終濃度）、５１℃で５時間行った。

【００５５】５×ＳＳＣ １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシルナトリウム ０．０２％ ＳＤＳ ５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙＡ １ｐｍｏｌ／ｍｌ ＤＩＧ 標識合成ＤＮＡ ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。

【００５６】メンブレン洗浄後、ＤＩＧ発光検出キット
（ベーリンガーマンハイム社製）を使用し、当該キット
の手順に従ってメンブレンを処理した。シグナルの検出
には、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−ＥＣＬ（アマシャム社
製)フイルムを使用した。

【００５７】その結果、ｐＤＲｈｕｃｅｐ−４を導入し
たＰＣ１２細胞のほうがｐＤＲ２（クローンテック社
製）を導入したＰＣ１２細胞よりも、遺伝子ｈｕｃｅｐ
−４の発現量が多かった。

【００５８】

【配列表】

出願人氏名：大正製薬株式会社 発明の名称：新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質 整理番号：００ＨＩ−Ｐ２６１５ 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：８０９残基 配列の型 ：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Tyr Glu Ala Leu Pro Gly Pro Ala Pro Glu Asn Glu Asp Gly 5 10 15 Leu Val Lys Val Lys Glu Glu Asp Pro Thr Trp Glu Gln Val Cys 20 25 30 Asn Ser Gln Glu Gly Ser Ser His Thr Gln Glu Ile Cys Arg Leu 35 40 45 Arg Phe Arg His Phe Cys Tyr Gln Glu Ala His Gly Pro Gln Glu 50 55 60 Ala Leu Ala Gln Leu Arg Glu Leu Cys His Gln Trp Leu Arg Pro 65 70 75 Glu Met His Thr Lys Glu Gln Ile Met Glu Leu Leu Val Leu Glu 80 85 90 Gln Phe Leu Thr Ile Leu Pro Lys Glu Leu Gln Pro Cys Val Lys 95 100 105 Thr Tyr Pro Leu Glu Ser Gly Glu Glu Ala Val Thr Val Leu Glu 110 115 120 Asn Leu Glu Thr Gly Ser Gly Asp Thr Gly Gln Gln Ala Ser Val 125 130 135 Tyr Ile Gln Gly Gln Asp Met His Pro Met Val Ala Glu Tyr Gln 140 145 150 Gly Val Ser Leu Glu Cys Gln Ser Leu Gln Leu Leu Pro Gly Ile 155 160 165 Thr Thr Leu Lys Cys Glu Pro Pro Gln Arg Pro Gln Gly Asn Pro 170 175 180 Gln Glu Val Ser Gly Pro Val Pro His Gly Ser Ala His Leu Gln 185 190 195 Glu Lys Asn Pro Arg Asp Lys Ala Val Val Pro Val Phe Asn Pro 200 205 210 Val Arg Ser Gln Thr Leu Val Lys Thr Glu Glu Glu Thr Ala Gln 215 220 225 Ala Val Ala Ala Glu Lys Trp Ser His Leu Ser Leu Thr Arg Arg 230 235 240 Asn Leu Cys Gly Asn Ser Ala Gln Glu Thr Val Met Ser Leu Ser 245 250 255 Pro Met Thr Glu Glu Ile Val Thr Lys Asp Arg Leu Phe Lys Ala 260 265 270 Lys Gln Glu Thr Ser Glu Glu Met Glu Gln Ser Gly Glu Ala Ser 275 280 285 Gly Lys Pro Asn Arg Glu Cys Ala Pro Gln Ile Pro Cys Ser Thr 290 295 300 Pro Ile Ala Thr Glu Arg Thr Val Ala His Leu Asn Thr Leu Lys 305 310 315 Asp Arg His Pro Gly Asp Leu Trp Ala Arg Met His Ile Ser Ser 320 325 330 Leu Glu Tyr Ala Ala Gly Asp Ile Thr Arg Lys Gly Arg Lys Lys 335 340 345 Asp Lys Ala Arg Val Ser Glu Leu Leu Gln Gly Leu Ser Phe Ser 350 355 360 Gly Asp Ser Asp Val Glu Lys Asp Asn Glu Pro Glu Ile Gln Pro 365 370 375 Ala Gln Lys Lys Leu Lys Val Ser Cys Phe Pro Glu Lys Ser Trp 380 385 390 Thr Lys Arg Asp Ile Lys Pro Asn Phe Pro Ser Trp Ser Ala Leu 395 400 405 Asp Ser Gly Leu Leu Asn Leu Lys Ser Glu Lys Leu Asn Pro Val 410 415 420 Glu Leu Phe Glu Leu Phe Phe Asp Asp Glu Thr Phe Asn Leu Ile 425 430 435 Val Asn Glu Thr Asn Asn Tyr Ala Ser Gln Lys Asn Val Ser Leu 440 445 450 Glu Val Thr Val Gln Glu Met Arg Cys Val Phe Gly Val Leu Leu 455 460 465 Leu Ser Gly Phe Met Arg His Pro Arg Arg Glu Met Tyr Trp Glu 470 475 480 Val Ser Asp Thr Asp Gln Asn Leu Val Arg Asp Ala Ile Arg Arg 485 490 495 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Phe Ser Asn Leu His Phe Ala Asp Asn 500 505 510 Gly His Leu Asp Gln Lys Asp Lys Phe Thr Lys Leu Arg Pro Leu 515 520 525 Ile Lys Gln Met Asn Lys Asn Phe Leu Leu Tyr Ala Pro Leu Glu 530 535 540 Glu Tyr Tyr Cys Phe Asp Lys Ser Met Cys Glu Cys Phe Asp Ser 545 550 555 Asp Gln Phe Leu Asn Gly Lys Pro Ile Arg Ile Gly Tyr Lys Ile 560 565 570 Trp Cys Gly Thr Thr Thr Gln Gly Tyr Leu Val Trp Phe Glu Pro 575 580 585 Tyr Gln Glu Glu Ser Thr Met Lys Val Asp Glu Asp Pro Asp Leu 590 595 600 Gly Leu Gly Gly Asn Leu Val Met Asn Phe Ala Asp Val Leu Leu 605 610 615 Glu Arg Gly Gln Tyr Pro Tyr His Leu Cys Phe Asp Ser Phe Phe 620 625 630 Thr Ser Val Lys Leu Leu Ser Ala Leu Lys Lys Lys Gly Val Arg 635 640 645 Ala Thr Gly Thr Ile Arg Glu Asn Arg Thr Glu Lys Cys Pro Leu 650 655 660 Met Asn Val Glu His Met Lys Lys Met Lys Arg Gly Tyr Phe Asp 665 670 675 Phe Arg Ile Glu Glu Asn Asn Glu Ile Ile Leu Cys Arg Trp Tyr 680 685 690 Gly Asp Gly Ile Ile Ser Leu Cys Ser Asn Ala Val Gly Ile Glu 695 700 705 Pro Val Asn Glu Val Ser Cys Cys Asp Ala Asp Asn Glu Glu Ile 710 715 720 Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ser Ile Val Lys Val Tyr Asp Glu Cys 725 730 735 Lys Glu Gly Val Ala Lys Met Asp Gln Ile Ile Ser Lys Tyr Arg 740 745 750 Val Arg Ile Arg Ser Lys Lys Trp Tyr Ser Ile Leu Val Ser Tyr 755 760 765 Met Ile Asp Val Ala Met Asn Asn Ala Trp Gln Leu His Arg Ala 770 775 780 Cys Asn Pro Gly Ala Ser Leu Asp Pro Leu Asp Phe Arg Arg Phe 785 790 795 Val Ala His Phe Tyr Leu Glu His Asn Ala His Leu Ser Asp 800 805 809 出願人氏名：大正製薬株式会社 発明の名称：新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質 整理番号：００ＨＩ−Ｐ２６１５ 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ：２４２７塩基 配列の型 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 10 20 30 40 50 ATGTATGAAG CTTTGCCAGG CCCTGCTCCT GAAAATGAAG ATGGCCTTGT 50 GAAAGTGAAG GAGGAAGATC CCACCTGGGA GCAGGTGTGC AACTCACAGG 100 AGGGCAGCTC CCACACTCAG GAGATTTGCC GCCTGCGCTT TCGGCACTTC 150 TGCTACCAGG AGGCTCACGG ACCCCAGGAA GCTCTGGCCC AACTCCGAGA 200 ACTTTGTCAT CAATGGCTGA GACCGGAGAT GCACACCAAG GAACAGATAA 250 TGGAACTGCT GGTGCTGGAG CAGTTCCTGA CCATCCTGCC CAAGGAGCTC 300 CAGCCCTGTG TGAAGACATA TCCTCTGGAG AGTGGAGAGG AGGCAGTGAC 350 AGTGCTGGAG AATCTAGAGA CAGGAAGTGG AGACACAGGA CAACAGGCCT 400 CTGTCTATAT TCAGGGACAG GACATGCACC CAATGGTGGC AGAATATCAA 450 GGAGTCTCTT TGGAGTGTCA GAGCCTCCAG CTCCTGCCTG GGATAACCAC 500 CCTGAAGTGT GAACCTCCAC AGCGTCCTCA AGGGAACCCC CAAGAAGTGA 550 GTGGGCCTGT TCCCCACGGA TCAGCTCATC TCCAGGAAAA AAACCCCAGA 600 GACAAGGCTG TAGTGCCTGT GTTTAACCCA GTCAGGTCCC AGACATTGGT 650 GAAGACTGAG GAAGAAACAG CCCAGGCCGT TGCTGCAGAG AAGTGGTCAC 700 ATCTGAGTCT GACTCGGAGG AACCTCTGTG GGAACTCAGC TCAGGAGACA 750 GTTATGAGCC TCAGTCCGAT GACTGAAGAA ATTGTAACTA AAGATAGATT 800 GTTTAAAGCA AAGCAAGAAA CTTCTGAAGA AATGGAACAA AGTGGAGAAG 850 CCTCAGGAAA GCCCAACAGA GAGTGTGCAC CCCAGATTCC TTGTAGTACT 900 CCTATTGCTA CTGAAAGGAC AGTTGCACAT TTGAACACTC TGAAGGACCG 950 TCACCCAGGT GATTTGTGGG CCCGCATGCA CATTTCATCC CTGGAATATG 1000 CTGCAGGAGA CATTACCCGA AAAGGGAGAA AAAAAGACAA AGCTCGAGTG 1050 AGTGAACTGC TCCAAGGCCT CTCATTCTCT GGTGACTCAG ATGTGGAAAA 1100 AGATAATGAG CCTGAGATCC AGCCTGCTCA AAAGAAGTTA AAGGTATCAT 1150 GTTTCCCAGA AAAGAGTTGG ACCAAAAGAG ACATTAAACC CAATTTTCCA 1200 AGCTGGTCAG CACTGGATTC TGGACTTTTG AATCTCAAGA GCGAAAAGTT 1250 GAACCCAGTA GAGCTTTTTG AATTATTTTT TGATGATGAA ACATTCAACT 1300 TAATTGTCAA TGAAACCAAT AATTATGCTT CTCAGAAAAA TGTCAGCTTG 1350 GAAGTCACAG TTCAGGAAAT GAGGTGTGTG TTTGGTGTCT TACTTTTGAG 1400 TGGATTTATG AGGCATCCTA GAAGGGAAAT GTATTGGGAA GTCTCTGACA 1450 CCGATCAGAA CCTGGTTAGA GATGCAATCA GAAGGGACAG ATTTGAATTG 1500 ATTTTCTCAA ACCTGCACTT TGCAGATAAT GGCCACCTAG ATCAAAAAGA 1550 TAAGTTTACA AAGTTGAGAC CTCTCATAAA ACAAATGAAT AAAAATTTCC 1600 TCTTGTATGC TCCCCTGGAA GAATACTATT GCTTTGATAA GTCAATGTGT 1650 GAATGCTTTG ATAGTGACCA ATTCCTGAAT GGAAAGCCTA TTAGAATTGG 1700 CTATAAAATT TGGTGTGGTA CAACCACACA GGGTTATCTG GTTTGGTTTG 1750 AACCCTATCA AGAAGAATCA ACTATGAAGG TAGATGAGGA TCCTGATCTT 1800 GGGTTAGGTG GAAATCTAGT GATGAACTTC GCTGATGTTC TTTTAGAGAG 1850 AGGTCAGTAT CCCTATCACC TGTGTTTTGA TAGCTTCTTT ACAAGTGTCA 1900 AATTGTTGTC AGCCTTGAAA AAGAAGGGGG TGAGGGCAAC AGGAACAATT 1950 CGTGAGAACA GGACCGAAAA ATGTCCCCTT ATGAATGTAG AACATATGAA 2000 AAAAATGAAG AGAGGGTATT TTGATTTCCG AATAGAAGAA AACAATGAGA 2050 TAATTTTGTG TCGTTGGTAT GGGGATGGCA TTATCAGTCT GTGCTCCAAT 2100 GCTGTGGGCA TAGAACCAGT CAATGAGGTA AGCTGTTGTG ATGCTGATAA 2150 CGAAGAAATC CCTCAGATAA GTCAACCATC CATAGTAAAA GTGTATGATG 2200 AATGCAAGGA AGGTGTAGCT AAAATGGATC AAATTATTTC GAAATACAGG 2250 GTGAGGATAA GAAGCAAGAA ATGGTACTCA ATTTTGGTGA GCTACATGAT 2300 TGATGTAGCC ATGAACAATG CATGGCAACT ACACAGAGCC TGTAACCCAG 2350 GTGCTTCTCT AGACCCCTTG GATTTTCGGA GATTTGTTGC ACATTTCTAC 2400 TTGGAACACA ATGCTCATCT GTCAGAT 2427 出願人氏名：大正製薬株式会社 発明の名称：新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質 整理番号：００ＨＩ−Ｐ２６１５ 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３ 配列の長さ：４０８９塩基 配列の型 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 GCGCGGTGCT AGATGCTGGG TGTAATCTCA GAAAAATACA TTCAGGGGCG CGCCTGAGGG 60 TGCTGGCTGC TGGCATCTCA GGTGCTTTAC GTGCATTCGT GAAGAAGCCC ATCAGTATTT 120 CTTGAATACC AGACCCCAAG CTAAGTGAAG CTTTAGCCTC TAAGCTCAAC ATG TAT GAA 179 Met Tyr Glu 1 GCT TTG CCA GGC CCT GCT CCT GAA AAT GAA GAT GGC CTT GTG AAA 224 Ala Leu Pro Gly Pro Ala Pro Glu Asn Glu Asp Gly Leu Val Lys 5 10 15 GTG AAG GAG GAA GAT CCC ACC TGG GAG CAG GTG TGC AAC TCA CAG 269 Val Lys Glu Glu Asp Pro Thr Trp Glu Gln Val Cys Asn Ser Gln 20 25 30 GAG GGC AGC TCC CAC ACT CAG GAG ATT TGC CGC CTG CGC TTT CGG 314 Glu Gly Ser Ser His Thr Gln Glu Ile Cys Arg Leu Arg Phe Arg 35 40 45 CAC TTC TGC TAC CAG GAG GCT CAC GGA CCC CAG GAA GCT CTG GCC 359 His Phe Cys Tyr Gln Glu Ala His Gly Pro Gln Glu Ala Leu Ala 50 55 60 CAA CTC CGA GAA CTT TGT CAT CAA TGG CTG AGA CCG GAG ATG CAC 404 Gln Leu Arg Glu Leu Cys His Gln Trp Leu Arg Pro Glu Met His 65 70 75 ACC AAG GAA CAG ATA ATG GAA CTG CTG GTG CTG GAG CAG TTC CTG 449 Thr Lys Glu Gln Ile Met Glu Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Leu 80 85 90 ACC ATC CTG CCC AAG GAG CTC CAG CCC TGT GTG AAG ACA TAT CCT 494 Thr Ile Leu Pro Lys Glu Leu Gln Pro Cys Val Lys Thr Tyr Pro 95 100 105 CTG GAG AGT GGA GAG GAG GCA GTG ACA GTG CTG GAG AAT CTA GAG 539 Leu Glu Ser Gly Glu Glu Ala Val Thr Val Leu Glu Asn Leu Glu 110 115 120 ACA GGA AGT GGA GAC ACA GGA CAA CAG GCC TCT GTC TAT ATT CAG 584 Thr Gly Ser Gly Asp Thr Gly Gln Gln Ala Ser Val Tyr Ile Gln 125 130 135 GGA CAG GAC ATG CAC CCA ATG GTG GCA GAA TAT CAA GGA GTC TCT 629 Gly Gln Asp Met His Pro Met Val Ala Glu Tyr Gln Gly Val Ser 140 145 150 TTG GAG TGT CAG AGC CTC CAG CTC CTG CCT GGG ATA ACC ACC CTG 674 Leu Glu Cys Gln Ser Leu Gln Leu Leu Pro Gly Ile Thr Thr Leu 155 160 165 AAG TGT GAA CCT CCA CAG CGT CCT CAA GGG AAC CCC CAA GAA GTG 719 Lys Cys Glu Pro Pro Gln Arg Pro Gln Gly Asn Pro Gln Glu Val 170 175 180 AGT GGG CCT GTT CCC CAC GGA TCA GCT CAT CTC CAG GAA AAA AAC 764 Ser Gly Pro Val Pro His Gly Ser Ala His Leu Gln Glu Lys Asn 185 190 195 CCC AGA GAC AAG GCT GTA GTG CCT GTG TTT AAC CCA GTC AGG TCC 809 Pro Arg Asp Lys Ala Val Val Pro Val Phe Asn Pro Val Arg Ser 200 205 210 CAG ACA TTG GTG AAG ACT GAG GAA GAA ACA GCC CAG GCC GTT GCT 854 Gln Thr Leu Val Lys Thr Glu Glu Glu Thr Ala Gln Ala Val Ala 215 220 225 GCA GAG AAG TGG TCA CAT CTG AGT CTG ACT CGG AGG AAC CTC TGT 899 Ala Glu Lys Trp Ser His Leu Ser Leu Thr Arg Arg Asn Leu Cys 230 235 240 GGG AAC TCA GCT CAG GAG ACA GTT ATG AGC CTC AGT CCG ATG ACT 944 Gly Asn Ser Ala Gln Glu Thr Val Met Ser Leu Ser Pro Met Thr 245 250 255 GAA GAA ATT GTA ACT AAA GAT AGA TTG TTT AAA GCA AAG CAA GAA 989 Glu Glu Ile Val Thr Lys Asp Arg Leu Phe Lys Ala Lys Gln Glu 260 265 270 ACT TCT GAA GAA ATG GAA CAA AGT GGA GAA GCC TCA GGA AAG CCC 1034 Thr Ser Glu Glu Met Glu Gln Ser Gly Glu Ala Ser Gly Lys Pro 275 280 285 AAC AGA GAG TGT GCA CCC CAG ATT CCT TGT AGT ACT CCT ATT GCT 1079 Asn Arg Glu Cys Ala Pro Gln Ile Pro Cys Ser Thr Pro Ile Ala 290 295 300 ACT GAA AGG ACA GTT GCA CAT TTG AAC ACT CTG AAG GAC CGT CAC 1124 Thr Glu Arg Thr Val Ala His Leu Asn Thr Leu Lys Asp Arg His 305 310 315 CCA GGT GAT TTG TGG GCC CGC ATG CAC ATT TCA TCC CTG GAA TAT 1169 Pro Gly Asp Leu Trp Ala Arg Met His Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 320 325 330 GCT GCA GGA GAC ATT ACC CGA AAA GGG AGA AAA AAA GAC AAA GCT 1214 Ala Ala Gly Asp Ile Thr Arg Lys Gly Arg Lys Lys Asp Lys Ala 335 340 345 CGA GTG AGT GAA CTG CTC CAA GGC CTC TCA TTC TCT GGT GAC TCA 1259 Arg Val Ser Glu Leu Leu Gln Gly Leu Ser Phe Ser Gly Asp Ser 350 355 360 GAT GTG GAA AAA GAT AAT GAG CCT GAG ATC CAG CCT GCT CAA AAG 1304 Asp Val Glu Lys Asp Asn Glu Pro Glu Ile Gln Pro Ala Gln Lys 365 370 375 AAG TTA AAG GTA TCA TGT TTC CCA GAA AAG AGT TGG ACC AAA AGA 1349 Lys Leu Lys Val Ser Cys Phe Pro Glu Lys Ser Trp Thr Lys Arg 380 385 390 GAC ATT AAA CCC AAT TTT CCA AGC TGG TCA GCA CTG GAT TCT GGA 1394 Asp Ile Lys Pro Asn Phe Pro Ser Trp Ser Ala Leu Asp Ser Gly 395 400 405 CTT TTG AAT CTC AAG AGC GAA AAG TTG AAC CCA GTA GAG CTT TTT 1439 Leu Leu Asn Leu Lys Ser Glu Lys Leu Asn Pro Val Glu Leu Phe 410 415 420 GAA TTA TTT TTT GAT GAT GAA ACA TTC AAC TTA ATT GTC AAT GAA 1484 Glu Leu Phe Phe Asp Asp Glu Thr Phe Asn Leu Ile Val Asn Glu 425 430 435 ACC AAT AAT TAT GCT TCT CAG AAA AAT GTC AGC TTG GAA GTC ACA 1529 Thr Asn Asn Tyr Ala Ser Gln Lys Asn Val Ser Leu Glu Val Thr 440 445 450 GTT CAG GAA ATG AGG TGT GTG TTT GGT GTC TTA CTT TTG AGT GGA 1574 Val Gln Glu Met Arg Cys Val Phe Gly Val Leu Leu Leu Ser Gly 455 460 465 TTT ATG AGG CAT CCT AGA AGG GAA ATG TAT TGG GAA GTC TCT GAC 1619 Phe Met Arg His Pro Arg Arg Glu Met Tyr Trp Glu Val Ser Asp 470 475 480 ACC GAT CAG AAC CTG GTT AGA GAT GCA ATC AGA AGG GAC AGA TTT 1664 Thr Asp Gln Asn Leu Val Arg Asp Ala Ile Arg Arg Asp Arg Phe 485 490 495 GAA TTG ATT TTC TCA AAC CTG CAC TTT GCA GAT AAT GGC CAC CTA 1709 Glu Leu Ile Phe Ser Asn Leu His Phe Ala Asp Asn Gly His Leu 500 505 510 GAT CAA AAA GAT AAG TTT ACA AAG TTG AGA CCT CTC ATA AAA CAA 1754 Asp Gln Lys Asp Lys Phe Thr Lys Leu Arg Pro Leu Ile Lys Gln 515 520 525 ATG AAT AAA AAT TTC CTC TTG TAT GCT CCC CTG GAA GAA TAC TAT 1799 Met Asn Lys Asn Phe Leu Leu Tyr Ala Pro Leu Glu Glu Tyr Tyr 530 535 540 TGC TTT GAT AAG TCA ATG TGT GAA TGC TTT GAT AGT GAC CAA TTC 1844 Cys Phe Asp Lys Ser Met Cys Glu Cys Phe Asp Ser Asp Gln Phe 545 550 555 CTG AAT GGA AAG CCT ATT AGA ATT GGC TAT AAA ATT TGG TGT GGT 1889 Leu Asn Gly Lys Pro Ile Arg Ile Gly Tyr Lys Ile Trp Cys Gly 560 565 570 ACA ACC ACA CAG GGT TAT CTG GTT TGG TTT GAA CCC TAT CAA GAA 1934 Thr Thr Thr Gln Gly Tyr Leu Val Trp Phe Glu Pro Tyr Gln Glu 575 580 585 GAA TCA ACT ATG AAG GTA GAT GAG GAT CCT GAT CTT GGG TTA GGT 1979 Glu Ser Thr Met Lys Val Asp Glu Asp Pro Asp Leu Gly Leu Gly 590 595 600 GGA AAT CTA GTG ATG AAC TTC GCT GAT GTT CTT TTA GAG AGA GGT 2024 Gly Asn Leu Val Met Asn Phe Ala Asp Val Leu Leu Glu Arg Gly 605 610 615 CAG TAT CCC TAT CAC CTG TGT TTT GAT AGC TTC TTT ACA AGT GTC 2069 Gln Tyr Pro Tyr His Leu Cys Phe Asp Ser Phe Phe Thr Ser Val 620 625 630 AAA TTG TTG TCA GCC TTG AAA AAG AAG GGG GTG AGG GCA ACA GGA 2114 Lys Leu Leu Ser Ala Leu Lys Lys Lys Gly Val Arg Ala Thr Gly 635 640 645 ACA ATT CGT GAG AAC AGG ACC GAA AAA TGT CCC CTT ATG AAT GTA 2159 Thr Ile Arg Glu Asn Arg Thr Glu Lys Cys Pro Leu Met Asn Val 650 655 660 GAA CAT ATG AAA AAA ATG AAG AGA GGG TAT TTT GAT TTC CGA ATA 2204 Glu His Met Lys Lys Met Lys Arg Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile 665 670 675 GAA GAA AAC AAT GAG ATA ATT TTG TGT CGT TGG TAT GGG GAT GGC 2249 Glu Glu Asn Asn Glu Ile Ile Leu Cys Arg Trp Tyr Gly Asp Gly 680 685 690 ATT ATC AGT CTG TGC TCC AAT GCT GTG GGC ATA GAA CCA GTC AAT 2294 Ile Ile Ser Leu Cys Ser Asn Ala Val Gly Ile Glu Pro Val Asn 695 700 705 GAG GTA AGC TGT TGT GAT GCT GAT AAC GAA GAA ATC CCT CAG ATA 2339 Glu Val Ser Cys Cys Asp Ala Asp Asn Glu Glu Ile Pro Gln Ile 710 715 720 AGT CAA CCA TCC ATA GTA AAA GTG TAT GAT GAA TGC AAG GAA GGT 2384 Ser Gln Pro Ser Ile Val Lys Val Tyr Asp Glu Cys Lys Glu Gly 725 730 735 GTA GCT AAA ATG GAT CAA ATT ATT TCG AAA TAC AGG GTG AGG ATA 2429 Val Ala Lys Met Asp Gln Ile Ile Ser Lys Tyr Arg Val Arg Ile 740 745 750 AGA AGC AAG AAA TGG TAC TCA ATT TTG GTG AGC TAC ATG ATT GAT 2474 Arg Ser Lys Lys Trp Tyr Ser Ile Leu Val Ser Tyr Met Ile Asp 755 760 765 GTA GCC ATG AAC AAT GCA TGG CAA CTA CAC AGA GCC TGT AAC CCA 2519 Val Ala Met Asn Asn Ala Trp Gln Leu His Arg Ala Cys Asn Pro 770 775 780 GGT GCT TCT CTA GAC CCC TTG GAT TTT CGG AGA TTT GTT GCA CAT 2565 Gly Ala Ser Leu Asp Pro Leu Asp Phe Arg Arg Phe Val Ala His 785 790 795 TTC TAC TTG GAA CAC AAT GCT CAT CTG TCA GAT TAG GGTACATAAA 2610 Phe Tyr Leu Glu His Asn Ala His Leu Ser Asp 800 805 809 ATGGACATAG TGCAGACATT AATAAGACAT AGAAAAATAA TAATTATACA TGCTGTTGTA 2670 CCCTCCCAAA GTAAATCTGA TATATGTAAT GAAGTTATTA AATAATACTT TTAAAAATCA 2730 GACATTTATA TAGAGTTTCA AAGACTATTG TAACAAGTAA TGTTAAAAAT TGTCTGTGAG 2790 AATGTTGAAC TGTAGTACCT TTTTCTATGT CAAGTTTTGT GTCAGACATG GGAAATCATG 2850 TATTTGTTCA ATTGACTACT TTGTGCACTT ATTTATTTAT TTTTTGAGAC ACAGTCTCGC 2910 TCTGCGGCCA AGCTGGAGTG CAGTGGCACG ATCTTGGCTC ACTGCAACCT CTGACACCCT 2970 AGTTCAAGCG ATTCTCCTGC CTCAGCCTCC CAAGTAGCTG GGATTACAGG CACGTGCTGC 3030 CATGCCTAGC TAATTTTTGT ATTTTTAGTA GAGACAGGGT TTCACCATGT TGGCCAGGAT 3090 GGTCTCGATC TGACCTCGTG ATCTGCCTGC CTTGGCCTCC CAAAGTGCTG GGATTACAGG 3150 CGTGAGCCAC CATGCCCAGC TATTTTGTGC ATTTAAAGAA GGAAATCCTA CCTCTTAAAA 3210 AAAATTATCT GGAGAATGCC ATTTTTAAGA TGCAAGCAAT GTTACAGAAA CCATAGAATG 3270 GTGCTGACTC AATAGTTCAA ACTAGTGACA CAGCCTATGA AGTAAGAATG ATCTAAACAA 3330 AACATAGGTG GTAAGAGACT AAAAACCTTA GCATTGGTGT AAAACTGGAT CGGATTGTGT 3390 GTAAGTGAGA AGGGTCAGGC ATGGATATTG AAGGAGAGTG CTATAAAGGA AAAACCAGAG 3450 GTGAAGCAGT GCCTTTGAAT ATTGAAATGA TAGGTGTATC CTATGGTGAC TGTGTGAGTT 3510 GGCAGCAGAA GTCAGAAGAG TAAAGAAAAC CAAGGAAACA GGCAAATCAG GGTAACAAGT 3570 AACCAGGAGA GTGAAGGAAA AGATAGGCAT AAAGTCAACA TAAAGGCCAA GTTGAAATCA 3630 CCTGAGGAGA TGTCTAGGCT TAAGGCCATC AGTGATAGGT AACTGAAGGA GAAACACTTG 3690
GAAAAGTGAA TGATACGGAC TGTGACTCCT TAGTGTTGAA GTCTAGCATT GGTGGATTAG 3750 TCTGGAGGGT AGAGAAGACA GGCTCCACCT CATTTCTGTG AGTTGTAGCC ACAACAGCTC 3810 TTTGCCTTTC TTTCATATCC TAATATTTAC AGTCCCTTTC CTGGCTGGAA GGCAGGTGGT 3870 CAGGTTTGAA TTCTTTCAAC AGGTATGTTT CTTATGTGGA TGACTGGTGA AAGTGTAAGC 3930 TGCGTGTAAT GTAGTCACAG ATTCACCTAT TCCATGCAAG ATGTTCAAAG AAAATATAAG 3990 TTCATTATTT CCTGTAATTG ATCTGATATT CTTTGTGAAA TACATCACCA GCGTGGGTTG 4050 GTTTCACTTT TAAATGAAAA AAAAAAAAAA AAAATCTAG 4089

【図面の簡単な説明】

【図１】図１の配列−１は、大脳皮質のｃＤＮＡライブ
ラリーより得られる組み換え体中で高い発現頻度を示す
ＤＮＡ断片を表わし、配列−２は、配列−１を含むＤＮ
Ａ断片のクローニングに用いたオリゴヌクレオチドを示
す。

【図２】図２は、組み換えベクターｐＤＲｈｕｃｅｐ４
の構造を示す。

【図３】図３は、遺伝子ｈｕｃｅｐ−４の塩基配列決定
の方法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高山 喜好 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
   質； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ遺伝子の転写調節機能を有する蛋
   白質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ （ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ （ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
   でハイブリダイズし、 かつ遺伝子の転写調節機能を有する蛋白質をコードする
   ＤＮＡ。