JPH10257891A - 神経細胞機能賦活化活性を有する新規蛋白質ｈｕｃｅｐ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト大脳皮質由来の神経細胞賦活化活性を有
する新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−１と、それをコードする遺
伝子ｈｕｃｅｐ−１を提供する。 【解決手段】 ヒト大脳皮質由来のｃＤＮＡライブラリ
ーからのクローニングによって神経細胞賦活化活性を有
する新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−１をコードする遺伝子ｈｕ
ｃｅｐ−１が得られ、該遺伝子を有する発現ベクターに
よる形質転換体の培養により、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−
１が得られる。該蛋白質は、神経細胞賦活化活性物質と
して、医薬または医薬の開発に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、神経細胞機能に対
して賦活化活性を有する、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ（Ｈｕ
ｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、該
蛋白質をコードするＤＮＡ、該遺伝子を発現させるため
の組み換えＤＮＡ、および組み換えＤＮＡによって得ら
れる形質転換体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】神経変性疾患の多くは、神経細胞または
神経細胞間の信号伝達に異変が生じることにより、神経
細胞が死滅し発症するとされている。このような神経変
性疾患の代表例として、パーキンソン病やアルツハイマ
ー症が挙げられる。パーキンソン症は、黒質神経細胞が
変性して神経伝達物質の一つであるドーパミンが産生さ
れなくなり、ドーパミン作動性の神経細胞が死ぬことに
より発症すると言われている。一方、アルツハイマー病
は主に大脳皮質や海馬の神経細胞が死ぬことによって痴
呆症状を呈するとされている。以上に述べた疾病に対し
ては、その原因が明確にされていないことから有効な治
療薬がなく、対症療法しか行えないのが現状であり、現
在これらの疾患にともなう神経細胞死の原因を明らかに
すべく多くの研究がなされているが、未だ解明されてい
ない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記諸疾患の原因であ
ると考えられる神経細胞死のメカニズムを解明し、これ
に関与する蛋白質並びにそれをコードする遺伝子を特定
することは、神経細胞死に起因する疾患の根本的な治療
薬を探索する上で、きわめて重要なことである。例え
ば、神経細胞死に関与する蛋白質それ自体に有効な医薬
となり得る可能性があることは勿論、このような蛋白質
は、該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機
能を阻害または促進する作用を有する物質等を医薬とし
て開発するに際しても、極めて有用である。以上の観点
から、神経細胞死に関与する蛋白質とその機能の解明が
望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、神経細胞
の生存あるいは神経細胞の機能の維持に関与する蛋白質
の同定を目的とし、ヒト脳組織で特異的に発現している
遺伝子にコードされている蛋白質の中から、所望の神経
細胞機能の維持に関与する蛋白質を把握するべく鋭意研
究の結果、新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−１の存在とそれをコ
ードする遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の単離に成功した。そし
て、このＨＵＣＥＰ−１が神経細胞機能賦活化活性を有
し、神経変性疾患に関与するものであることを突き止
め、本発明を完成するに至った。

【０００５】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる、神経細胞機能賦活化活性を
有する新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−１、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する蛋白質、に関
するものである。さらに本発明は、上記（ａ）または
（ｂ）に表された蛋白質をコードする遺伝子、に関する
ものである。さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２に記
載の塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）配列番号：
２のＤＮＡとストリンジェンドな条件でハイブリダイズ
し、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する蛋白質をコー
ドするヒト由来のＤＮＡ、に関するものである。さらに
本発明は上記遺伝子を含有する組み換えベクターを含む
形質転換体、に関するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１は、ヒト大
脳皮質由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含
んだｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明
者らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、クローンテッ
ク社から市販されているヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもと
に調製したものであるが、ストラタジーン社から市販さ
れているヒト大脳皮質のｍＲＮＡをもとにしても、同様
にｃＤＮＡを調製することができる。

【０００７】上述のｃＤＮＡライブラリーにおいて、ヒ
ト脳組織で特異的に発現している遺伝子を有すると思わ
れるｃＤＮＡを識別する方法として、大久保らの方法
（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔ．，２，１７３（１９９２））による、遺伝子発現の
出現頻度を解析する方法を用いることができる。具体的
には、ヒト大脳皮質のｍＲＮＡを鋳型とし、適当な制限
酵素で開環させたベクタープラスミドの一端にオリゴｄ
Ｔを結合させたものをプライマーとしてｃＤＮＡ合成を
行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵素ＢａｍＨＩで切
断する。当該ベクターはｄａｍメチラーゼ陽性の大腸菌
を宿主として調製されたため、ＭｂｏＩの認識配列であ
る「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化されている。従って
ＭｂｏＩは新たに合成されたｃＤＮＡ部分のみを切断す
る。当該ベクターはオリゴｄＴを結合させた末端とは反
対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部位を１ヶ所だけ有し
ているので本酵素は当該ベクターを１ヶ所切断し、さら
に新たに合成されたｃＤＮＡ部分にもしＢａｍＨＩ認識
配列が存在すれば、その部位も切断する。ＢａｍＨＩと
ＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列からなる、同一の付着
端を生ぜしめるため、両酵素で切断した後、ＤＮＡリガ
ーゼを作用させれば、プラスミドを閉環することができ
る。

【０００８】本方法においてはこのようにして調製した
プラスミドを用いて大腸菌を形質転換することによって
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。従って当該ライブラ
リーは各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その５’
側部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現する部
位までの領域を含んでいる。当該ｃＤＮＡライブラリー
から無作為に適当個数の組換え体を選択し、各組換え体
中のｃＤＮＡを抽出してその全塩基配列を決定する。本
法は、このようにして決定された特定配列を有するｃＤ
ＮＡ断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾
つ確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現
遺伝子を識別する方法である。本法において、組み換え
体ｃＤＮＡの抽出並びにｃＤＮＡの塩基配列の決定は、
いずれも当業者にとって自体公知の各種操作方法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅ
ｓｓ、１９８９、その他当業者にとって標準的な方法を
紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とする）
により行うことができる。

【０００９】尚、高発現遺伝子を識別する方法では、無
作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が適
当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体を
処理すればよい。本発明者らは上記方法を実施し、７７
０個の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決
定し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとして
の出現頻度が２／７７０であったｃＤＮＡ断片を、ヒト
脳で特異的に発現している遺伝子を有するＤＮＡ断片の
候補として選別した。

【００１０】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。これはクローン
テック社から市販されているヒト大脳皮質ｃＤＮＡライ
ブラリーを鋳型とし、上記３’断片内の配列を有する適
当な長さのオリゴヌクレオチドとベクター中の配列を有
する同程度の長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成
し、これらをプライマーとして用いることによって、Ｐ
ＣＲ法を用いて行った。その結果、約１．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を増幅することができた。この際、鋳型としては
ストラタジーン社から市販されているヒト大脳皮質ｃＤ
ＮＡライブラリーを用いることもできる。これはまた、
クローンテック社またはストラタジーン社から市販され
ているヒト大脳皮質のｍＲＮＡを鋳型とし、クローンテ
ック社またはギブコ社の５’ＲＡＣＥキットを用いるこ
とによっても行うことができる。さらにこれはまた、上
記３’断片をプローブとして、上記ヒト大脳皮質ｃＤＮ
Ａライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションまた
はプラークハイブリダイゼーションで、常法に従ってス
クリーニングすることによっても行うことができる。

【００１１】上記方法によって増幅したｃＤＮＡ断片
は、ノバジェン社から市販されているｐＴ７Ｂｌｕｅ
Ｔ−ベクターに組み込み、常法に従って全塩基配列を決
定した。この際、組換えＤＮＡを独立に２クローン取得
して、それぞれのｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定するこ
とにより、配列の確認を行った。上記方法によって選別
したｃＤＮＡ断片中に存在すると思われる遺伝子が、脳
組織で特異的に発現していることの確認は、該ｃＤＮＡ
配列の臓器特異的な発現頻度をノーザンハイブリダイゼ
ーションで確認することで行うことができる。具体的に
は、クローンテック社またはストラタジーン社から市販
されている、ヒトの各臓器から抽出したｍＲＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動で分画し、メンブレンフィルターに
転写した後、上記方法によって選別したｃＤＮＡ断片を
プローブとして、常法に従ってハイブリダイゼーション
を行った。本発明者らはこの方法を用い、該ｃＤＮＡ配
列の発現についての臓器特異性を調べた。その結果、脳
以外の他の臓器、器官、細胞等でも該ｃＤＮＡ配列の多
少の発現が認められたものの、それに比べ大脳皮質で特
異的に発現していたことを確認した。さらに、該ｃＤＮ
Ａ配列の発現の有無を、アルツハイマー病の大脳皮質で
確認したところ、このような神経変性疾患に罹患した大
脳では該ｃＤＮＡ配列の発現は認められなかった。この
ことは、該ｃＤＮＡ配列中に、ヒト脳で特異的に発現し
正常な脳機能の維持に必須である所望の遺伝子が存在す
ることを、強く示唆するものである。

【００１２】塩基配列中の蛋白質をコードする領域（Ｏ
ＲＦ、open reading frame）の存在は、塩基配列をコン
ピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法によ
り確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的と
する遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピュー
ターを利用して該配列中に一つのＯＲＦを見いだし、こ
の遺伝子を遺伝子ｈｕｃｅｐ−１（ｈｕｍａｎ ｃｅｒ
ｅｂｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎの略）、該遺伝子にコード
される蛋白質をＨＵＣＥＰ−１と命名した。

【００１３】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１は、配列番号：２に
示される１３６８塩基対（ｂｐ）からなる遺伝子であ
る。この遺伝子ｈｕｃｅｐ−１を用い、適当な宿主ベク
ター系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組
み換え遺伝子を調製することができる。適当なベクター
としては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来の
プラスミド（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリ
オファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の
動物ウィルス等が利用できる。組み換えに際しては、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻
訳終止コドンを付加することも可能である。さらに該遺
伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プ
ロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿主
に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌で
ある場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、
宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモータ
ー等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモータ
ー、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿
主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモータ
ー、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用で
きる。

【００１４】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＨＵＣＥＰ−１は、適当なプ
ロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出す
ことが可能である。ＨＵＣＥＰ−１の発現の際に利用で
きる宿主としては、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であ
るＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵
母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細
胞、ＣＨＯ細胞、ＰＣ１２細胞等が利用できる。上記組
み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法と
しては、常法または各宿主細胞に対して一般に用いられ
る形質転換方法が適用できる。本発明者らは、ｐＧＥＸ
−４Ｔ２（ファルマシア社製）を発現ベクターとして遺
伝子ｈｕｃｅｐ−１を組み換え、ＨＵＣＥＰ−１発現ベ
クター、ｐＧＥｈｕｃｅｐ１を調製した。このｐＧＥｈ
ｕｃｅｐ１を用い、常法に従って形質転換したＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ５／ｐＧＥｈｕｃｅｐ１
は、平成９年１月８日に工業技術院生命工学技術研究所
に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０２９として寄託されて
いる。

【００１５】更に本発明者らは、ｐＲＥＰ１０（インビ
トロジェン社製）を発現ベクターとして遺伝子ｈｕｃｅ
ｐ−１を組み換え、ＨＵＣＥＰ−１を培養動物細胞内で
発現させるためのベクター、ｐＲＥｈｕｃｅｐ１を調製
した。このｐＲＥｈｕｃｅｐ１を用い、ギブコ社のＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を利用して、神経細胞ＰＣ
１２を形質転換し、形質転換体、ＰＣ１２／ｐＲＥｈｕ
ｃｅｐ１を調製した。形質転換された細胞は、用いたベ
クターに存在する選択マーカー、または適当な選択マー
カーを付与又は削除し、これら選択マーカーの有無に基
づいて識別することにより、単離する事ができる。本発
明者らが行った、ＰＣ１２細胞をｐＲＥｈｕｃｅｐ１で
形質転換した場合には、抗生物質ハイグロマイシンＢ耐
性を指標として形質転換体を識別、単離することができ
る。

【００１６】上記操作の結果得られた形質転換細胞内で
の目的遺伝子の発現は、実施例において後述するよう
に、ノーザンハイブリダイゼーションにより確認するこ
とができる。宿主として用いた神経細胞ＰＣ１２および
ベクターであるｐＲＥＰ１０を導入したＰＣ１２細胞を
通常の増殖培地からＮＧＦ（神経細胞成長因子）を除去
した培地に移すと細胞死を起こすが、ｐＲＥｈｕｃｅｐ
１により形質転換された神経細胞ＰＣ１２は、ＮＧＦ除
去培地でも生育することが、例えばＭＴＴ（３−（４，
５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，
５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒ
ｏｍｉｄｅ）法（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５, ５５−５９（１９８
５））により確認された。

【００１７】新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−１は、配列番号：
１に示されるごとく、総数４５６個のアミノ酸残基から
なる、分子量５０、６５７ダルトンの蛋白質である。前
述のように、遺伝子ｈｕｃｅｐ−１を含有する組み換え
ベクターで形質転換させた神経細胞ＰＣ１２が、ＮＧＦ
（神経細胞成長因子）の非存在下において有意に高い生
存率を示したことから、ＨＵＣＥＰ−１は神経細胞機能
賦活化活性を有する生理活性蛋白質であることが確認さ
れた。

【００１８】尚、本発明においては、配列番号：２に示
したＤＮＡ配列の他に、該ＤＮＡとハイブリダイズしか
つ神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質をコ
ードするＤＮＡも、本発明の範囲内である。すなわち、
遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の全長配列において、種々の人為
的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理による
ランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・
欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したも
のであっても、これらＤＮＡ変異体が遺伝子ｈｕｃｅｐ
−１とストリンジェンドな条件下でハイブリダイズし、
かつ神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質を
コードするＤＮＡであれば、配列表２に示したＤＮＡ配
列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。

【００１９】また、配列番号：２に示したＤＮＡ配列と
僅かに異なる配列からなる遺伝子が、ヒト染色体上に遺
伝子ｈｕｃｅｐ−１とは別個に存在する可能性もあり得
るが、この場合においても、そこにコードされる蛋白質
が神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質であ
れば、上記人為的変異体と同様に本発明の範囲内のもの
である。上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｈｕｃｅｐ
−１のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するもので
あれば許容範囲内である。また、遺伝子ｈｕｃｅｐ−１
とハイブリダイズする程度としては、通常の条件下（例
えば ＤＩＧ ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベー
リンガー・マンハイム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０
３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ
Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社
製 Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイ
ズさせ、５０℃の０．５ｘＳＳＣ溶液（０．１％[ ｗ／
ｖ] ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１
ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエ
ン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーシ
ョンで、遺伝子ｈｕｃｅｐ−１にハイブリダイズする程
度であればよい。

【００２０】また、上記のごとく遺伝子ｈｕｃｅｐ−１
と相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であ
って、神経細胞機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質
もまた、本発明の範囲内のものである。すなわち、新規
蛋白質ＨＵＣＥＰ−１のアミノ酸配列の１もしくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体で
あっても、該変異体が神経細胞機能賦活化活性を有する
蛋白質であれば、該変異体は本発明の範囲内のものであ
る。蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水
性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであ
るが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも
言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つ
かの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知ら
れている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グ
リシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラ
ニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌ
ｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌ
ｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）
とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）ま
たはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒ
ｇ）、等が挙げられる。

【００２１】従って、配列番号：１に示した新規蛋白質
ＨＵＣＥＰ−１のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等
による変異蛋白質であっても、その変異がＨＵＣＥＰ−
１蛋白質の３次元構造において保存性が高い変異であっ
て、その変異蛋白質がＨＵＣＥＰ−１と同様に神経細胞
機能賦活化活性を有する生理活性蛋白質であれば、これ
らは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。変
異の程度としては、配列表１に示したアミノ酸配列との
相同性が、９０％以上のものが許容し得る範囲である。

【００２２】

【発明の効果】ＨＵＣＥＰ−１が神経細胞賦活化活性を
有していることから、遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の発現異
常、あるいはＨＵＣＥＰ−１の機能不全は、脳の高次機
能を維持する上で重大な障害となると推測される。した
がってＨＵＣＥＰ−１それ自体は虚血性脳疾患やアルツ
ハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療
薬として有用と考えられる。また、当該蛋白質の機能と
同様の機能を有する物質、当該機能を促進する物質、あ
るいはまた当該遺伝子の発現を促進する物質等の創出に
利用することができる。以下実施例を挙げて詳述する
が、本発明はこの実施例に限定されないことは言うまで
もない。

【００２３】

【実施例】

実施例１ 遺伝子ｈｕｃｅｐ−１のクローニング １）大脳の正常機能の維持に必須な遺伝子の部分配列の
決定 ヒト大脳皮質のｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型と
して、大久保らの方法（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ. Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ. １９９２、２、ｐ１７３）によ
り、大脳皮質のｃＤＮＡライブラリーを作成した。次い
で、当該ライブラリーから無作為に７７０個の組換え体
を選択し、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９、以下同じ）に
従って、組換えＤＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ部分の３’側
の塩基配列を決定した。配列決定にはＰＥアプライドバ
イオシステムズ社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ ３７７）と同社製反応キットを用いた。７
７０個の組み換え体中の各ＤＮＡ断片の発現頻度を解析
した結果、図１に示す配列（配列−１）を有する遺伝子
の発現頻度が２／７７０であった。

【００２４】２）配列−１を含むＤＮＡ断片の増幅 配列−１を含むＤＮＡ断片の増幅を以下の方法により行
った。まず、配列−１の一部分よりなるオリゴヌクレオ
チド（図１；配列−２及び配列−３）を、ＰＥアプライ
ドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機（ＡＢＩ ３８
０Ｂ）で合成した。次いで、ラムダファージクローニン
グベクター（λＤＲ２）のｃＤＮＡ挿入部位近傍の配列
を有するオリゴヌクレオチド（図１；配列−４及び配列
−５）を、同様に合成した。λＤＲ２をクローニングベ
クターとする、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃｅｒｅｂｒ
ａｌ ｃｏｒｔｅｘ ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ｃＤＮＡ
ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテックラボラトリーズ社製）
を鋳型とし、配列−２のオリゴヌクレオチドと配列−４
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行っ
た。当該反応には宝酒造（株）製のキット（タカラ Ｌ
ＡＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）を用い、宝酒造（株）
製のＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用した。 反応組成液 cDNA library( ≧10⁸ pfu/ml) 5 μl 10×PCR 緩衝液(25mM Mg⁺⁺含有) 5 μl 2.5mM dNTP 1 μl 10μM オリコ゛ヌクレオチト゛(配列-2) 2 μl 10μM オリコ゛ヌクレオチト゛(配列-4) 2 μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl 反応条件 ９４℃で２分保持後、９８℃で２０秒間反応させ、６８
℃まで−１℃／２秒の速度で冷却し、６８℃で３分保持
し、更に７２℃で１０分間保持した。これを３０回繰り
返して、目的配列を増幅させた。

【００２５】さらに、上記ＰＣＲ反応液の一部を鋳型と
し、配列−３のオリゴヌクレオチドと配列−５のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、以下の方法により再
度ＰＣＲを行った。 反応組成液 一回目のPCR 反応液 1 μl 10×PCR 緩衝液(25mM Mg⁺⁺含有) 5 μl 2.5mM dNTP 1 μl 10μM オリコ゛ヌクレオチト゛(配列-3) 2 μl 10μM オリコ゛ヌクレオチト゛(配列-5) 2 μl 水 38.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl 反応条件 ９４℃で２分保持後、９８℃で２０秒間反応させ、６８
℃まで−１℃／２秒の速度で冷却し、６８℃で３分保持
し、更に７２℃で１０分間保持した。これを３０回繰り
返して、目的配列を増幅させた。 上記方法により、配列−１の一部を有するＤＮＡ断片
（約１．７ｋｂ）を特異的に増幅させた（図２）。

【００２６】３）塩基配列決定用ベクターへのサブクロ
ーニング ２）で増幅したＤＮＡ断片を、常法に従ってアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％）で分画した。ゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して目的と
するバンドを含むゲルを切り出した。アガロースゲルか
らのＤＮＡ断片の抽出と精製は、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮII
Ｋｉｔ（バイオ １０１社製）を用いて行った。この
精製ＤＮＡ断片を、以下の方法により塩基配列決定用ベ
クター、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェ
ン社製）にサブクローニングした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶
液は、宝酒造（株）製のキット（タカラ ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２）を用い、１６℃で
１．５時間反応させた。 反応組成液 PCR 産物 1μl(50ng) T7 Blue T-vector 1μl(17ng) 水 3μlLigation溶液 5μl 総量 10μl

【００２７】上記反応溶液を用いて常法に従って大腸菌
Ｋ１２株ＤＨ５の形質転換を行った。形質転換体をアン
ピシリン（Ａｍｐ）５０μｇ／ｍｌ、５−Ｂｒｏｍｏ−
４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）４０μｇ／ｍｌ、Ｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏ−Ｇａｌａｃｔｏ
ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）１００μＭを含有す
るＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃で一晩培養
した。白色コロニーを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬ
Ｂ液体培地１０ｍｌに接種して３７℃で一晩培養し、遠
心分離によって菌体を集めた後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐ
ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キ
アゲン社製）で組換えＤＮＡを精製した。

【００２８】４）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 塩基配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製
のＤＮＡシークエンサーを用い、ダイターミネーター法
を用いた。決定された塩基配列を元にしてオリゴヌクレ
オチドを合成し、プライマーウオーキング法で全塩基配
列を決定した（図３）。両鎖の塩基配列を決定し、また
独立した２クローンの塩基配列を決定することにより、
配列を確認した。上記２クローンの塩基配列は全く同一
であった。当該クローンのｃＤＮＡの全塩基配列を図４
Ａ〜Ｃに示す。当該塩基配列が配列−３、及び配列−１
のうち配列−３の上流領域を含んでいたことから、目的
とする遺伝子（ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ−１、ｈｕｃｅｐ−１）がクローニングされた
ことを確認した。当該ｃＤＮＡは４５６残基より成る蛋
白質（ＨＵＣＥＰ−１）をコードする翻訳領域（ｏｐｅ
ｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）を含んでい
る（図４）。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残
基の上流域に同じｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅで終止コド
ンが出現した（図４）ことから、当該ｃＤＮＡ断片がコ
ードする蛋白質のアミノ酸配列は図４に示したものが唯
一のものであることが確認された。

【００２９】５）大腸菌を用いたＨＵＣＥＰ−１の生産 図４に示した配列を元にして配列−６、配列−７のオリ
ゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイ
オシステムズ社製、ＡＢＩ ３８０Ｂ）で合成した。 配列−６ 5'TCTAGGATCCATGTTCGAAGAGCCTGAG 配列−７ 5'TAGTGAATTCTATCACCTGCGCTTGTAGAG λＤＲ２をクローニングベクターとする、Ｈｕｍａｎ
Ｂｒａｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ５’−
ＳＴＲＥＴＣＨ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテ
ックラボラトリーズ社製）を鋳型とし、配列−６と配列
−７のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを
行った。ＰＣＲは実施例１−２）に記載した条件で行っ
た。上記方法により増幅されたＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動で分画、精製した。当該精製ｃＤＮＡ断片
を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（共に宝酒製造）
で切断した。切断処理後、再びアガロースゲル電気泳動
で分画し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した（断片
−１）。ｐＧＥＸ−４Ｔ２（ファルマシア社製）を、上
記と同様に制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、
開環ベクター（断片−２）を精製した。断片−１と断片
−２を混合し、実施例１−３）に記載した条件下で、ラ
イゲーションならびに大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５株の形質転
換を行い、さらに該形質転換体を培養して遠心によって
集めた菌体から、組換えＤＮＡを精製した。当該組換え
ＤＮＡに挿入された断片−１の塩基配列を、以下に示す
配列−８及び配列−９のプライマー、及び実施例１−
４）で塩基配列を決定する際に用いたプライマーを利用
し、ＤＮＡシーケンサーで決定した。 配列−８ 5'GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 配列−９ 5'CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG その結果、当該断片−１の塩基配列がｈｕｃｅｐ−１の
塩基配列と同一であること、及びｈｕｃｅｐ−１がｐＧ
ＥＸ−４Ｔ２内のグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺
伝子と同じリーディングフレームで翻訳されることを確
認した。このようにして構築した組換えＤＮＡをｐＧＥ
ｈｕｃｅｐ１と命名した（図５）。ｐＧＥｈｕｃｅｐ１
の形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ
５／ｐＧＥｈｕｃｅｐ１は、平成９年１月８日に工業技
術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６
０２９として寄託されている。当該組換えＤＮＡを保持
する菌体を培養し、適当な条件下に遺伝子発現を誘導す
ればＨＵＣＥＰ−１をグルタチオンＳトランスフェラー
ゼとの融合蛋白として生産することができる。また、ｐ
ＧＥｈｕｃｅｐ１に組み込まれた遺伝子ｈｕｃｅｐ−１
は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを該組み換えベク
ターに作用させることで単離され、これを別の適当な発
現ベクターに組み換えることもできる。

【００３０】実施例２ ＰＣ１２細胞中でのｈｕｃｅｐ
−１遺伝子の発現と機能の解析 1)発現ベクターｐＲＥｈｕｃｅｐ１の構築 実施例１で取得した、ｈｕｃｅｐ−１を含むｃＤＮＡ断
片を配列−６のプライマーと以下に示す配列−１０のプ
ライマーを用い、ＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは
実施例１に記載した条件で行った。 配列−１０ 5'TAGTAAGCTTCACCTGCGCTTGTAGAG ＰＣＲ産物を実施例１と同様にアガロースゲル電気泳動
で分画、精製した。当該精製ｃＤＮＡ断片を、制限酵素
ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩ（共に宝酒造製）で切断し
た。切断処理後、再びアガロースゲル電気泳動で分画
し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した（断片−
３）。動物細胞の発現ベクター、ｐＲＥＰ１０（インビ
トロジェン社製）を、上記と同様に制限酵素ＨｉｎｄII
I とＢａｍＨＩで切断し、開環ベクター（断片−４）を
精製した。

【００３１】断片−１と断片−２を混合し、実施例１に
記載した条件下で、ライゲーションならびに大腸菌Ｋ１
２株ＤＨ５株の形質転換を行い、さらに該形質転換体を
培養して遠心によって集めた菌体から、組換えＤＮＡを
精製した。当該組換えＤＮＡに挿入された断片−３の塩
基配列を、以下に示すプライマー、及び実施例１で塩基
配列を決定する際に用いたプライマーを利用し、ＤＮＡ
シーケンサーで決定した。 配列−１１ 5'TTGCAGCTTATAATGGTTAC 配列−１２ 5'ACTGAATTCCGCATTGCAG その結果、当該断片−３の塩基配列がｈｕｃｅｐ−１の
塩基配列と同一であることを確認した。このようにして
構築した組換えＤＮＡをｐＲＥｈｕｃｅｐ１と命名した
（図６）。

【００３２】２）ＰＣ１２細胞への導入と安定な形質転
換体の取得 ＰＣ１２細胞を直径６０ｍｍのプラスチックシャーレで
培養した。シャーレはコラーゲンコートしたものを用
い、培地としては５％牛胎児血清、５％ウマ血清、５０
ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプト
マイシンを含むＤＭＥＭ（ギブコ社製、以下増殖培地と
する）を使用し、３７℃、５％ＣＯ₂ 存在下で培養し
た。細胞密度が５０％になった時点で、１）で構築した
ｐＲＥｈｕｃｅｐ１を含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ
試薬（ギブコ社製）を、細胞上に重層して２４時間培養
した後、増殖培地に置換して２４時間培養した。ピペッ
ティングで細胞を分散した後、細胞懸濁液を２等分して
直径１００ｍｍのプラスチックシャーレ２枚に分注して
さらに２４時間培養した。培地を除いた後、ハイグロマ
イシンＢ（カルビオケム社製；終濃度４００μｇ／ｍ
ｌ）を含有する増殖培地に置換した。ハイグロマイシン
Ｂ添加培地を３日毎に交換して２週間培養した。細胞の
コロニーが肉眼で確認できるようになった時点で、ステ
ンレスカップを用いてコロニーを５個単離した。対照と
して用いるためにＰＣ１２細胞にｐＲＥＰ１０のみを上
記と同様にして導入し、安定な形質転換体を５個単離し
た。

【００３３】３）遺伝子発現の確認 単離した各形質転換体を、２４穴のプレートでハイグロ
マイシンＢ添加培地（終濃度４００μｇ／ｍｌ）で培養
し、細胞密度が８０％コンフルエントになった時点でピ
ペッティングで細胞を分散して、直径１００ｍｍのプラ
スチックシャーレに接種した。細胞密度が再度８０％コ
ンフルエントになった時点で培地を除去し、ＰＢＳを添
加してセルスクレイパーを用いて細胞を回収した。遠心
によって細胞を沈殿させた後に上清を除去し、ｍＲＮＡ
抽出キット（ファルマシア バイオテク社製）を用いて
細胞からｍＲＮＡを精製した。２μｇのｍＲＮＡを定法
に従ってアガロースゲル電気泳動で分画してメンブレン
（アマシャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+ ）に転写し、ノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。プローブとして
はＤＩＧ（ジゴキシゲニン）で標識したｈｕｃｅｐ−１
のｃＤＮＡ断片を用いた。標識にはＤＩＧオリゴヌクレ
オチド・テイリングキット（ベーリンガーマンハイム社
製）を使用し、方法は本キットの手順に従った。ハイブ
リダイゼーションは以下の組成の溶液中で（濃度は全て
終濃度）、５１℃で５時間行った。 5xSSC 1% Blocking Buffer 0.1% N-ラウロイルサルコシルナトリウム 0.02% SDS 50 μg/ml polyA 1pmol/ml DIG 標識合成DNA

【００３４】ハイブリダイゼーション終了後、メンブレ
ンを２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．５ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。メンブ
レン洗浄後、ＤＩＧ発光検出キット（ベーリンガーマン
ハイム社製）を使用し、当該キットの手順に従ってメン
ブレンを処理した。シグナルの検出には、Ｈｙｐｅｒｆ
ｉｌｍ^TM- ＥＣＬ（アマシャム社製）フイルムを使用し
た。その結果、ｐＲＥｈｕｃｅｐ１を導入したＰＣ１２
細胞のほうがｐＲＥＰ１０を導入したＰＣ１２細胞より
も、ｈｕｃｅｐ−１遺伝子の発現量が多かった。

【００３５】４）ＮＧＦ除去培地中での増殖 ３）でｈｕｃｅｐ１遺伝子の高発現を確認することがで
きた安定な形質転換体を増殖培地で培養した。細胞密度
が５０％になった時点で血清を含まない培地に置換して
３日間培養し、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙ
ｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍ
ｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ６５, ５５−５９（１９８５））で生存細胞数を
測定した。ｐＲＥｈｕｃｅｐ１を導入したＰＣ１２細胞
は、対照として用いた、ｐＲＥＰ１０導入細胞に比べて
生存細胞数が有意に多かった。

【００３６】

【配列表】

【００３７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１の配列−１は、大脳皮質のｃＤＮＡライブ
ラリーより得られる組み換え体中で高い発現頻度を示す
ＤＮＡ断片を表わし、配列−２，３，４及び５は、配列
−１を含むＤＮＡ断片の増幅に用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す。

【図２】配列−１を含むＤＮＡ断片を示す。

【図３】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の塩基配列決定の方法を
示す。

【図４Ａ】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の塩基配列及びそれに
よってコードされるアミノ酸配列を示す。

【図４Ｂ】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の塩基配列及びそれに
よってコードされるアミノ酸配列を示す。

【図４Ｃ】遺伝子ｈｕｃｅｐ−１の塩基配列及びそれに
よってコードされるアミノ酸配列を示す。

【図５】組み換えベクターｐＧＥｈｕｃｅｐ１の構築を
示す。

【図６】発現ベクターｐＲＥｈｕｃｅｐ−１の構築を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高山 喜好 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質： （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる、神
   経細胞機能賦活化活性を有する新規蛋白質ＨＵＣＥＰ−
   １； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ神経細胞機能賦活化活性を有する
   蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の（ａ）または（ｂ）の
   蛋白質をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）からなる遺伝
   子： （ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ； （ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェンドな条件
   でハイブリダイズし、かつ神経細胞機能賦活化活性を有
   する蛋白質をコードするヒト由来のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または請求項３に記載の遺伝子
   を含有する組み換えベクターを含む形質転換体。