JP4390031B2 - 細胞増殖亢進作用を有する蛋白質 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞増殖亢進作用を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNAに関するものである。
背景技術
単球(monocyte)は単核白血球の一種であり、外来刺激等により炎症反応を起こしている組織に向かって、血中から血管基底膜を貫通して遊走する性質を有している。また、血液中から組織内に移入する際、単球はより活性化した機能を持つマクロファージへと分化することが知られている。
単球より分化したマクロファージはエステラーゼ、リゾチームなどの酵素を多量にもち、貪食消化する力が強く、老化・障害を受けた細胞や細胞片などの老廃物排除機能や侵入した微生物等を捕食する異物排除機能を有する。
さらに、高等生物においてはマクロファージは抗原情報をTリンパ球へ提示すること、インターフェロンγにより活性化されたマクロファージが細胞性免疫のエフェクターとなることなどの報告がある。
このように単球/マクロファージは老廃物排除機能、異物排除機能、特異的免疫など生体防御機構において重要な役割を担っている。
よって、単球/マクロファージの増殖・分化を調節することは、感染防御及び免疫機能の調節に重要であると考えられる。
発明の開示
本発明者らは、ヒト末梢血単球で特異的に発現している遺伝子にコードされている蛋白質を鋭意研究の結果、新規蛋白質(以下、MONP−2とする)とそれをコードする遺伝子(以下、monp−2とする)の単離に成功した。そして、このMONP−2が細胞増殖亢進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
(1)(a)配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖亢進作用を有する蛋白質、
(2)(1)に表された蛋白質をコードする遺伝子、
(3)(c)配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA;又は、(d)配列番号:2のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞増殖亢進作用を有する蛋白質をコードするDNA、
(4)(1)に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、当該蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、
(5)(2)又は(3)に記載の遺伝子を用いることを特徴とする、当該遺伝子にコードされた蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、
(6)細胞増殖亢進作用の促進又は阻害が、(2)又は(3)に記載の遺伝子の転写の促進又は抑制に基づくものである、(5)に記載のスクリーニング方法、
(7)(4)、(5)又は(6)に記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物又はその塩、
である。
発明を実施するための最良の形態
遺伝子monp−2は、ヒト末梢血単球由来のcDNAライブラリーから、該遺伝子を含んだcDNA断片として単離することができる。本発明者らが使用したcDNAライブラリーは、クローンテック社から市販されているヒト末梢血単球由来のmRNAをもとに調製することができる。
上述のcDNAライブラリーにおいて、ヒト末梢血単球で特異的に発現している遺伝子を有すると思われるcDNAを識別する方法として、大久保らの方法(Okubo et al.,Nature Genet.,2,173(1992))による、遺伝子発現の出現頻度を解析する方法を用いることができる。具体的には、ヒト末梢血単球由来のmRNAを鋳型とし、適当な制限酵素で開環させたベクタープラスミドの一端にオリゴdTを結合させたものをプライマーとしてcDNA合成を行った後、制限酵素MboIと制限酵素BamHIで切断する。当該ベクターはdamメチラーゼ陽性の大腸菌を宿主として調製されたため、MboIの認識配列である「GATC」のA残基がメチル化されている。従ってMboIは新たに合成されたcDNA部分のみを切断する。当該ベクターはオリゴdTを結合させた末端とは反対側の末端近傍にBamHI切断部位を1ヶ所だけ有しているので本酵素は当該ベクターを1ヶ所切断し、さらに新たに合成されたcDNA部分にもしBamHI認識配列が存在すれば、その部位も切断する。BamHIとMboIは「GATC」なる配列からなる、同一の付着端を生ぜしめるため、両酵素で切断した後、DNAリガーゼを作用させれば、プラスミドを閉環することができる。
本方法においてはこのようにして調製したプラスミドを用いて大腸菌を形質転換することによってcDNAライブラリーを構築した。従って当該ライブラリーは各mRNAの3’端のポリA部位から、その5’側部分のうち最初にGATCなる塩基配列が出現する部位までの領域を含んでいる。当該cDNAライブラリーから無作為に適当個数の組換え体を選択し、各組換え体中のcDNAを抽出してその全塩基配列を決定する。本法は、このようにして決定された特定配列を有するcDNA断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾つ確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現遺伝子を識別する方法である。本法において、組み換え体cDNAの抽出並びにcDNAの塩基配列の決定は、いずれも当業者にとって自体公知の各種操作方法(Molecular Cloning、2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lab.Press、1989、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とする)により行うことができる。
尚、高発現遺伝子を識別する方法では、無作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が適当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体を処理すればよい。本発明者らは上記方法を実施し、1174個の組み換え体中のcDNA断片の塩基配列を全て決定し、その中から、同一の配列を有するcDNAとしての出現頻度が2/1174以上であったcDNA断片を、ヒト末梢血単球で特異的に発現している遺伝子を有するDNA断片の候補として選別した。
上記cDNA断片は前述したとおり、mRNAの3’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本発明者らは当該領域(以下3’断片)の塩基配列情報を元にして、全鎖長cDNAを取得した。
これはクローンテック社から市販されているヒト末梢血単球cDNAライブラリーを鋳型とし、上記3’断片内の配列を有する適当な長さのオリゴヌクレオチドとベクター中の配列を有する同程度の長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして用いることによって、PCR法を用いて行った。その結果、約1.7kbのDNA断片を増幅することができた。この際、鋳型としてはストラタジーン社から市販されているヒト末梢血単球cDNAライブラリーを用いることもできる。これはまた、健常男性ドナーより採血した末梢血単球由来のmRNAを鋳型とし、クローンテック社又はギブコ社の5’RACEキットを用いることによっても行うことができる。さらにこれはまた、上記3’断片をプローブとして、上記ヒト末梢血単球cDNAライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションで、常法に従ってスクリーニングすることによっても行うことができる。
上記方法によって増幅したcDNA断片は、ノバジェン社から市販されているpTblue ベクターに組み込み、常法に従って全塩基配列を決定した。この際、組換えDNAを独立に2クローン取得して、それぞれのcDNA断片の塩基配列を決定することにより、配列の確認を行った。
塩基配列中の蛋白質をコードする領域(ORF、open reading frame)の存在は、塩基配列をコンピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法により確認することができる。該cDNA配列の中に目的とする遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピューターを利用して該配列中にORFを見いだし、この遺伝子を遺伝子monp−2(monocyte proteinの略)、該遺伝子にコードされる蛋白質をMONP−2と命名した。
遺伝子monp−2は、配列番号:2に示される1533塩基対(bp)からなる遺伝子である。この遺伝子monp−2を用い、適当な宿主ベクター系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組み換え遺伝子を調製することができる。適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322、pUC118、pTblueその他)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110、pC194その他)、酵母由来のプラスミド(例、pSH19その他)、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。さらに該遺伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、T7プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、λPLプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはSPO系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはPHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。
また該遺伝子を他の蛋白質(例、グルタチオンSトランスフェラーゼ、プロテインAその他)との融合蛋白質として発現させることも可能である。このようにして発現させた融合型MONP−2は、適当なプロテアーゼ(例、トロンビン、エンテロキナーゼその他)を用いて切り出すことが可能である。
MONP−2の発現の際に利用できる宿主としては、エシェリヒア属菌であるEscherichia coliの各種菌株、バチルス属菌であるBacillus subtilisの各種菌株、酵母としてはSaccharomyces cerevisiaeの各種菌株、動物細胞としてはCOS−7細胞、CHO細胞等が利用できる。
上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法としては、常法又は各宿主細胞に対して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。
更に本発明者らは、pTARGET(プロメガ社製)を発現ベクターとして遺伝子monp−2を組み換え、MONP−2を培養動物細胞内で発現させるためのベクター、pTARGETmonp−2を調製した。このpTARGETmonp−2を用い、ギブコ社のLIPOFECTAMINE試薬を利用して、CHO細胞を形質転換し、形質転換体、CHO/pTARGETmonp−2を調製した。形質転換された細胞は、用いたベクターに存在する選択マーカー、又は適当な選択マーカーを付与又は削除し、これら選択マーカーの有無に基づいて識別することにより、単離する事ができる。本発明者らが行った、CHO細胞をpTARGETmonp−2で形質転換した場合には、抗生物質G418耐性を指標として形質転換体を識別、単離することができる。
上記操作の結果得られた形質転換細胞内での目的遺伝子の発現は、実施例において後述するように、RT−PCR法により確認することができる。
pTARGETmonp−2により形質転換されたCHO細胞では、pTARGETを導入したCHO細胞と比較して増殖の亢進が認められた。
本発明である新規蛋白質MONP−2は、全アミノ酸511残基からなる分子量約55925ダルトンの蛋白質である。これはヒトリンパ球由来の膜蛋白質HUMAN E16とC末端250アミノ酸領域で50%程度の相同性を示す。
尚、本発明においては、配列番号:2に示したDNA配列の他に、該DNAとハイブリダイズしかつ細胞増殖亢進作用を有する生理活性蛋白質をコードするDNAも、本発明の範囲内である。
すなわち、遺伝子MONP−2の全長配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるDNA断片の変異・欠失・連結等により、部分的にDNA配列が変化したものであっても、これらDNA変異体が遺伝子monp−2とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖亢進作用を有する生理活性蛋白質をコードするDNAであれば、配列番号:2に示したDNA配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
また、配列番号:2に示したDNA配列と僅かに異なる配列からなる遺伝子が、ヒト染色体上に遺伝子monp−2とは別個に存在する可能性もあり得るが、この場合においても、そこにコードされる蛋白質が細胞増殖亢進作用を有する生理活性蛋白質であれば、上記人為的変異体と同様に本発明の範囲内のものである。
上記のDNA変異の程度は、遺伝子monp−2のDNA配列と90%以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。また、遺伝子monp−2とハイブリダイズする程度としては、通常の条件下(例えば DIG DNA Labeling kit(ベーリンガー・マンハイム社製 Cat No.1175033)でプローブをラベルした場合に、32℃のDIG Easy Hyb溶液(ベーリンガー・マンハイム社製 Cat No.1603558)中でハイブリダイズさせ、50℃の0.5xSSC溶液(0.1%[w/v]SDSを含む)中でメンブレンを洗浄する条件(1xSSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウムである)でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子monp−2にハイブリダイズする程度であればよい。
また、上記のごとく遺伝子monp−2と相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であって、細胞増殖亢進作用を有する生理活性蛋白質もまた、本発明の範囲内のものである。
すなわち、新規蛋白質MONP−2のアミノ酸配列の1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体であっても、該変異体が細胞増殖亢進作用を有する蛋白質であれば、該変異体は本発明の範囲内のものである。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の3次元構造(立体構造とも言う)に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン(Gly)とプロリン(Pro)、Glyとアラニン(Ala)又はバリン(Val)、ロイシン(Leu)とイソロイシン(Ile)、グルタミン酸(Glu)とグルタミン(Gln)、アスパラギン酸(Asp)とアスパラギン(Asn)、システイン(Cys)とスレオニン(Thr)、Thrとセリン(Ser)又はAla、リジン(Lys)とアルギニン(Arg)、等が挙げられる。
従って、配列番号:1に示した新規蛋白質MONP−2のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異がMONP−2蛋白質の3次元構造において保存性が高い変異であって、その変異蛋白質がMONP−2と同様に細胞増殖亢進作用を有する生理活性蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。変異の程度としては、配列番号:1に示したアミノ酸配列との相同性が、90%以上のものが許容し得る範囲である。
また、本発明は、本発明の蛋白質MONP−2を用いることを特徴とする、当該蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法である。具体的には本発明は、MONP−2を含有する細胞に試験化合物を接触させた場合とさせない場合における細胞増殖を比較することによる、細胞増殖亢進作用促進剤又は阻害剤のスクリーニング方法である。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物でもよい。
細胞増殖亢進作用は、試験化合物と接触した後の細胞数の変化により測定することができる。この際、本蛋白質に作用によることを確認するために本蛋白質を含有しない細胞を用いた比較試験を行うことが好ましい。
また、本発明である上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物又はその塩は、スクリーニングにより上記の試験化合物から選ばれた化合物又はその塩であり、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物でもよい。例えば、試験化合物に接触させない場合に比べて、細胞増殖が約30%以上、好ましくは約50%以上促進している場合、該試験化合物を本発明蛋白質の細胞増殖亢進作用促進物質として選択することができる。一方、試験化合物に接触させない場合に比べて、細胞増殖が約30%以上、好ましくは約50%以上阻害されている場合、該試験化合物を本発明蛋白質の細胞増殖亢進作用阻害物質として選択することができる。
また、細胞増殖亢進作用は、本遺伝子から転写されたmRNA量の変化によっても測定することができる。例えば、試験化合物に接触させない場合に比べて、本遺伝子から転写されたmRNA量が増加していれば、細胞増殖亢進作用促進物質として選択することができ、試験化合物に接触させない場合に比べて、本遺伝子から転写されたmRNA量が減少していれば、細胞増殖亢進作用阻害物質として選択することができる。
産業上の利用可能性
MONP−2が細胞増殖亢進作用を有していることから、遺伝子monp−2の発現異常、あるいはMONP−2の機能不全等は、免疫機能を維持する上で重要な障害となると推測される。
したがって、MONP−2及び遺伝子monp−2は、当該蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物、あるいは当該遺伝子の発現を促進又は阻害する化合物等の創出に利用することができ、これらの化合物は免疫系疾患及び癌に対する新たな治療薬として期待される。
以下実施例を挙げて詳述するが、本発明はこの実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例1<遺伝子monp−2のクローニング>
1)遺伝子の部分配列の決定
ヒト男性健常末梢血単球由来のmRNAを鋳型として、大久保らの方法(Okubo et al.Nature Genet.,1992、2、p173)に従い、3’末端cDNAライブラリーを作成した。当該ライブラリーから無作為に1174個の組換え体を選択し、cDNA部分の塩基配列を決定した。配列決定にはDNAシークエンサー(ABI社製PRISM377)と同社製反応キットを用いた。
1174個の組み換え体中の各DNA断片の発現頻度を解析した結果、図1に示す配列(配列−1)を有する遺伝子の発現頻度が2/1174であった。
2)配列−1を含むcDNA断片のクローニング
配列−1を含むcDNA断片のクローニングを以下の方法により行った。まず、配列−1の一部分と逆相補鎖となるオリゴヌクレオチド(図1の配列−2、4)を、DNA合成機(ABI社製380B)で合成した。次いで、ラムダファージクローニングベクター(λgt11)のcDNA挿入部位近傍の配列を有するオリゴヌクレオチド(図1の配列−3、5)を、同様に合成した。λgt11をクローニングベクターとする、Human Monocyte cDNA Iibrary(クロンテックラボラトリーズ社製)を鋳型とし、配列−2のオリゴヌクレオチドと配列−3のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタカラLA PCR Kit Ver.2とPCRサーマルサイクラーMP(いずれも宝酒造製)を用いて、以下のPCR操作を行った。
cDNA library(≧108pfu/ml) 5μl
10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む) 5μl
2.5mM dNTP 8μl
10μM 配列−2 2μl
10μM 配列−3 2μl
水 27.5μl
LA Taqポリメラーゼ 0.5μl
総量 50 μl
PCRサイクルは、94℃で2分保持後、98℃で20秒間反応させ、68℃まで−1℃/2秒の速度で冷却し、68℃で3分保持し、更に72℃で10分間保持を30回繰り返して行った。
上記PCR産物を10倍希釈したものを鋳型とし、配列−4のオリゴヌクレオチドと配列−5のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタカラLA PCR Kit Ver.2とPCRサーマルサイクラーMP(いずれも宝酒造製)を用いて、以下のPCR操作を行った。
PCR産物希釈物 1μl
10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む) 5μl
2.5mM dNTP 8μl
10μM 配列−4 2μl
10μM 配列−5 2μl
水 31.5μl
LA Taqポリメラーゼ 0.5μl
総量 50 μl
PCRサイクルは、94℃で2分保持後、98℃で20秒間反応させ、68℃まで−1℃/2秒の速度で冷却し、68℃で3分保持し、更に72℃で10分間保持を30回繰り返して行った。
上記方法により、配列−1を有するDNA断片(約1.7kb)を増幅させた。
3)塩基配列決定用ベクターへのサブクローニング
2)で増幅したDNA断片を、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)で分画した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切り出した。アガロースゲルからのDNA断片の抽出と精製は、GENECLEAN II Kit(バイオ101社製)を用いて行った。
この抽出精製したDNA断片を、塩基配列決定用ベクターpTblue(ノバジェン社製)にサブクローニングした。Ligation溶液はタカラDNA Ligation Kit ver.2(宝酒造製)を用い、以下の組成で16℃で1.5時間反応させた。
抽出精製したDNA断片 1μl(50ng)
pTblue 1μl(10ng)
水 3μl
Ligation溶液 5μl
総量 10μl
上記反応後の溶液を用いて、大腸菌K12株DH5の形質転換を行った。形質転換体をアンピシリン(Amp)50μg/ml、5−Bromo−4−Chloro−3−indolyl−β−D−galactoside40μg/ml、Isopropyl−β−D−Thio−Galactopyranoside100μMを含有するLB寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩培養した。
上記プレートに出現したコロニーを50μg/mlのAmpを含むLB液体培地10mlに接種して37℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製)で組換えDNAを精製した。
4)DNA断片の塩基配列の決定
塩基配列決定にはDNAシークエンサー(ABI社製PRISM377)を用い、ダイターミネーター法を用いた。決定された塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定した。当該クローンのcDNAの全塩基配列を配列番号:2に示す。当該塩基配列が配列−2及び配列−1のうち配列−2の上流領域を含んでいたことから、目的とする遺伝子monp−2がクローニングされたことを確認した。
当該cDNAは511残基より成る蛋白質(MONP−2)をコードするORFを含んでいる(配列番号:3)。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基をふくむ、周辺の塩基配列が、蛋白質翻訳開始点に特徴的なコザック配列と一致した。
実施例2<動物細胞発現用ベクターの構築>
1)ORFを含むcDNAの増幅
配列番号3の該蛋白質の開始コドンより上流の配列を有するオリゴヌクレオチド(図2の配列−6)と該蛋白質の終止コドンより下流の一部分と逆相補鎖と配列を有するオリゴヌクレオチド(図2の配列−7)をDNA合成機(ABI社製380B)で合成した。実施例1で単離した配列番号:3を含む組み替えcDNAを鋳型とし、配列−6のオリゴヌクレオチドと配列−7のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタカラLA PCR Kit Ver.2とPCRサーマルサイクラーMP(いずれも宝酒造製)を用いて、以下のPCR操作を行った。
cDNA 5μl(10ng)
10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む) 5μl
2.5mM dNTP 8μl
10μM 配列−6 2μl
10μM 配列−7 2μl
水 27.5μl
LA Taqポリメラーゼ 0.5μl
総量 50 μl
PCRサイクルは、94℃で2分保持後、98℃で20秒間反応させ、68℃まで−1℃/2秒の速度で冷却し、68℃で3分保持し、更に72℃で10分間保持を30回繰り返して行った。
上記方法により、配列番号3の一部を有するDNA断片(約1.6kb)を増幅させた。
2)動物細胞用発現ベクターへのサブクローニング
1)で増幅したDNA断片を、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)で分画した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切り出した。アガロースゲルからのDNA断片の抽出と精製は、GENECLEAN II Kit(バイオ 101社製)を用いて行った。
この抽出精製したDNA断片を、動物細胞用発現用ベクターpTARGET(プロメガ社製)にサブクローニングした。Ligation溶液はタカラDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造製)を用い、以下の組成で16℃で1.5時間反応させた。
抽出精製したDNA断片 1μl(50ng)
pTARGET 1μl(10ng)
水 3μl
Ligation溶液 5μl
総量 10μl
上記反応後の溶液を用いて、大腸菌K12株DH5の形質転換を行った。形質転換体をアンピシリン(Amp)50μg/ml、5−Bromo−4−Chloro−3−indolyl−β−D−galactoside40μg/ml、Isopropyl−β−D−Thio−Galactopyranoside100μMを含有するLB寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩培養した。
上記プレートに出現したコロニーを50μg/mlのAmpを含むLB液体培地10mlに接種して37℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製)で組換えDNAを精製し、pTARGET−monp−2得た。
3)導入cDNAの塩基配列の決定
塩基配列決定にはDNAシークエンサー(ABI社製PRISM377)を用い、ダイターミネーター法を用いた。決定された塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定した。当該クローンは配列番号:3の配列のうち、図2の配列−6及び配列−7に挟まれるすべての領域を含んでいたことから、目的とする遺伝子pTARGETmonp−2がクローニングされたことを確認した。
実施例3<CHOK1細胞への導入と安定な形質転換体の取得>
実施例−2で取得したpTARGETmonp−2はmonp−2断片の上流にCMVプロモーターを有しており、当該組換えDNAを動物細胞中に導入すれば、monp−2を発現させることが可能である。
CHOK1細胞を直径60mmのプラスチックシャーレで培養した。培地としては10%牛胎児血清(大日本製薬)、50ユニット/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを含むHamF−12(ギブコ社製、以下増殖培地とする)を使用し、37℃、5%CO2存在下で培養した。細胞密度が50%になった時点で、実施例−2で取得したpTARGETmonp−2を含むLIPOFECTAMINE試薬(ギブコ社製)を、細胞上に重層して6時間培養した後、増殖培地に置換して48時間培養した。トリプシンで細胞を分散した後、細胞懸濁液を直径60mmのプラスチックシャーレに分注してさらに24時間培養した。培地を除いた後、G418試薬(ギブコ社製;終濃度500μg/ml)を含有する増殖培地に置換した。G418試薬添加培地を3日毎に交換してして2週間培養した。細胞のコロニーが肉眼で確認できるようになった時点で、ステンレスカップを用いてコロニーを3個単離した。対照として用いるためにCHOK1細胞にpTARGETベクター(プロメガ社社製)のみを上記と同様にして導入し、安定な形質転換体を単離した。
2)形質転換体中の遺伝子発現の確認
単離した各形質転換体を、6穴のプレートでG418添加培地(終濃度500μg/ml)で培養し、細胞密度が再度80%コンフルエントになった時点で培地を除去し、PBSを添加し洗浄後、Trizol(ギブコ社製)を用いて細胞からtotalRNAを精製した。2μgのtotalRNA鋳型に、Superscript逆転転写酵素(ギブコ社製)を用いてcDNAを合成した。
合成した、cDNAを鋳型に実施例2−1)と同じオリゴヌクレオチド(図2配列6、7)を用いて、PCR反応を実施した。
cDNA 5μl(100ng)
10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む)5μl
2.5mM dNTP 8μl
10μM 配列−6 2μl
10μM 配列−7 2μl
水 27.5μl
LA Taqポリメラーゼ 0.5μl
総量 50 μl
PCRサイクルは、94℃で2分保持後、98℃で20秒間反応させ、68℃まで−1℃/2秒の速度で冷却し、68℃で3分保持し、更に72℃で10分間保持を30回繰り返して行った。
増幅したDNA断片を、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)で分画し、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドが増幅されるか否か調べた。
その結果、pTARGETmonp−2を導入したCHOK1細胞でのみ、目的のバンドが増幅され、コントロールベクターを導入したCHOK1細胞では、増幅は確認できなかった。
実施例4<monp−2遺伝子導入CHOK1の細胞増殖亢進活性の測定>
実施例3で確立した、monp−2遺伝子導入CHOK1(2株)とコントロールベクター導入CHOK1細胞(以下、コントロール細胞)の細胞増殖の比較を行った。
実施例3に示す増殖培地を使用して、6穴培養プレートに1穴あたり6.3×103個のmonp−2遺伝子導入CHOK1あるいは、コントロールベクター導入CHOK1細胞を巻き込んだ。その後、継時的にトリプシンで細胞を回収し細胞総数を顕微鏡にて測定した。その結果を図3に示す。
monp−2遺伝子導入CHOK1−(1)株及び(2)株ではコントロール細胞と比較して統計学的に有為に増殖の亢進が認められた。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1の配列−1は、ヒト単球由来のcDNAライブラリーより得られる組み換え体中で高い発現頻度を示すDNA断片を表わし、配列−2〜5は、配列−1を含むDNA断片のクローニングに用いたオリゴヌクレオチドを示す。
図2は、pTARGETmonp−2を構築するために用いたオリゴヌクレオチドを示す。
図3は、monp−2遺伝子導入CHOK1細胞が細胞増殖亢進活性を有することを示す。
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質;
(a)配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖亢進作用を有する蛋白質。 - 請求の範囲第1項に記載の(a)又は(b)の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の(c)又は(d)からなる遺伝子;
(c)配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号:2のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞増殖亢進作用を有する蛋白質をコードするDNA。 - 請求の範囲第1項に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、当該蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
- 請求の範囲第2項又は第3項に記載の遺伝子を用いることを特徴とする、当該遺伝子にコードされた蛋白質の細胞増殖亢進作用を促進又は阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
- 細胞増殖亢進作用の促進又は阻害が、請求の範囲第2項又は第3項に記載の遺伝子の転写の促進又は抑制によるものである、請求の範囲第5項に記載のスクリーニング方法。
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