JPH10503652A - インターロイキン−１β転換酵素に関連するヒトタンパク質ＴｘおよびＴｙをコードしているＤＮＡ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プロテアーゼ活性を有しアポトーシスを誘発できるヒトポリペプチドをコードする、インターロイキン−１β転換酵素に関連したＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−１β転換酵素に関連するヒトタンパク質ＴｘおよびＴｙをコ ードしているＤＮＡ配列 本発明は、インターロイキン−１β転換酵素に関連する新規なヒトタンパク質 ＴｘをコードしているＤＮＡ配列、タンパク質Ｔｘ、それらの製造法、それを含 有する製剤組成物、および医薬としてのそれらの用途に関する。 インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、リウマチ様関節炎、腸の炎症性疾 患または敗血症ショックのような、多種類の急性または慢性炎症性疾患の病態形 成に関与する前炎症性サイトカインである［Dinarello ら（1992）、Immunologi cal Reviews、127 ：119〜146 ］。 ヒトの単核球やマクロファージは、ＩＬ−１βを３１kDの不活性前駆体の形態 （ｐＩＬ−１β）で合成する。ｐＩＬ−１βは従来のシグナル配列を保有せず、 １１６番目のアスパラギン酸と１１７番目のアラニンとの間での切断後にのみ、 細胞が有効に分泌できる。この切断は、１７kDの活性ＩＬ−１β形態を生じ、イ ンターロイキン−１β転換酵素（ＩＣＥ）と呼ばれる特異的酵素によって実施さ れる［Thornberryら（1992）、Nature、356 ：768 〜774 ；Cerrettiら（1992） 、Science、256 ：97〜100 ］。この酵素は、ヒトおよびマウスで特徴付けられ 、かつクローニングされている［Nettら（1992）、Journal of Immunology、149 ：3,254 〜3,259 ；Molineaux ら（1993）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90 ：1,809 〜1,813 ］。これは、他の公知のチオールプロテアーゼとの相同性が皆 無である、独自のシステインプロテアーゼである。またｐＩＬ−１βの特定のＡ ｓｐ−Ｘのペプチド結合との特別な特異性を有する。 ＩＣＥという酵素は、２０kD（ｐ２０）と１０kD（ｐ１０）との２サブユニッ トで構成され、その結合が酵素活性に必要である。これらのサブユニットは、４ ５kDのプロ酵素形態（ｐ４５）のタンパク質分解による切断に由来する。ＩＣＥ という酵素自体が、その前駆体であるｐ４５、またはこのプロ酵素のＮ末端部分 の１１９個のアミノ酸を保有しない３０kDのｐ３０という形態を、ｐ２０プラス ｐ１０という活性形態に切断できる。ｐ４５の完全な配列は、そのｃＤＮＡはも とより、アミノ酸配列によっても特徴付けられている［Thornberryら、前掲］。 ヒトＩＣＥの遺伝子の特徴付けは、記載されている［Cerrettiら（1994）、Geno mics、20：468 〜473 ］。 最近の研究は、プログラム細胞死またはアポトーシスの調節におけるＩＣＥの 可能な役割を明らかにした［Yuanら（1993）、Cell、75：641 〜652 ］。実際に は、ＩＣＥは、ラット線維芽細胞でのアポトーシスやマウスＩＣＥの過発現に関 与するカエノラーブジチス・エレガンスC．elegansのタンパク質で、アポトーシ スを誘発するＣｅｄ−３との２８％の相同性を有する［Miura ら（1993）、Cell 、75：653 〜660 ］。その上、ＩＣＥの阻害性ウイルスセルピンserpine である タンパク質ｃｒｍＡの、感染されたニワトリの神経節ニューロンでの発現は、成 長因子（神経成長因子）の抑制が誘発するアポトーシスによる死からこれらの細 胞を保護する［Gagliardini ら（1994）、Science、263 ：826 〜828 ］。これ らの所見は、ＩＣＥまたはこのタンパク質の相同体が、特にアルツハイマー病ま たはパーキンソン病のような退行性神経疾患や、脳虚血に見られるプログラム細 胞死の調節に関与し得ることを示唆している［M．Barinaga（1993）、Science、 259 ：762 ］。 ＩＬ−１βの成熟またはアポトーシスのいずれかに役割を果たす、ＩＣＥに関 連する新規タンパク質の呈示は、ＩＬ−１βまたはアポトーシスが関与する状況 での新規な治療もしくは診断剤の開発に寄与する可能性がある。 本発明は、ＩＣＥのヒト前駆体ｐ４５との約５２％の相同性を有し、活性サイ トカインへとＩＬ−１βの前駆体を成熟させない新規なヒトタンパク質Ｔｘに関 する。タンパク質Ｔｘは、二つの予想外の機能を有する。すなわち、一方で、そ れはプロテアーゼであり、特に、ＩＣＥの前駆体ｐ３０をｐ１０およびｐ２０の サブユニットへと切断できるが、他方では、細胞、例えば核酸移入されたＣｏｓ 細胞でアポトーシスを誘発できる。 これらの生物学的特性は、ＩＬ−１βに応答するか、またはアポトーシスが生 じる病理学的状況の治療へのタンパク質Ｔｘの使用を予期させる。 本発明は、タンパク質Ｔｘとの７０％を越える相同性を有する新規なヒトタン パク質Ｔｙにも関する。タンパク質Ｔｙは、細胞、例えば核酸移入されたＣｏｓ 細胞でアポトーシスを誘発できる。タンパク質Ｔｙは、分子間の方式で自己切断 ができるプロテアーゼである。 したがって、本発明の主題は、プロテアーゼ活性を有するヒトポリペプチドを コードし、配列番号１： の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列、およびアポト ーシスを誘発できる能力を有するヒトポリペプチドをコードし、上記配列番号１ の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列である。 本発明の特定の主題は、プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発で きるヒトポリペプチドをコードし、上記配列番号１の配列のヌクレオチド配列を 有するＤＮＡ配列である。 ３７７個のアミノ酸を有するタンパク質をコードしている上記ＤＮＡ配列は、 ＬＰＳで活性化される単核球、またはヒトの多核細胞もしくは胎盤のＲＮＡから 出発し、ＩＣＥの配列、および下記にその詳細な説明を示す操作条件に従って、 既に同定されている相同遺伝子の配列のオリゴヌクレオチド誘導体を援用する、 ＰＣＲを用いる増幅によって得ることができるｃＤＮＡ配列である。 プロテアーゼ活性の呈示と、アポトーシスを誘発できる能力のそれとは、下記 に実験の部で例示する。 本発明の、より特定の主題は、プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを 誘発できるヒトポリペプチドをコードし、配列番号１の配列のヌクレオチド第４ ２番に始まり、ヌクレオチド第１，１７２番に終る配列を有するＤＮＡ配列、お よびそれとハイブリッド形成し、同じ機能を有するＤＮＡ配列である。 ハイブリッド形成する配列には、高度の緊縮条件下でハイブリッド形成し、同 じ活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列が包含される。緊縮条 件は、例えば、Maniatisら［Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laborato ry Press（1989）］による、６５℃で、５ｘＳＳＰＥ；１０ｘデンハート溶液； １００μg ／mlのＤＮＡｓｓ；１％ＳＤＳ溶液中に１８時間、次いで２ｘＳＳＣ ；０．０５％ＳＤＳで５分ずつ３回洗浄、次いで６５℃で、１ｘＳＳＣ；０．１ ％ＳＤＳで１５分ずつ３回洗浄というハイブリッド形成を包含する。 本発明の全く特定の主題は、配列番号１の配列のヌクレオチド第４２番に始ま り、ヌクレオチド第１，１７２番に終る配列を有するＤＮＡ配列である。 配列番号１の配列の知見は、本発明を、例えば化学合成の公知の方法によって か、または公知のハイブリッド形成手法による合成オリゴヌクレオチドプローブ を用いる遺伝子ライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのふるい分けによっ て、再現できるようにする。 本発明は、プロテアーゼ活性を有し、アポトーシスを誘発でき、そして配列番 号２： の配列のアミノ酸配列を有するヒトポリペプチド、ならびに該配列の対立遺伝子 および類似体にも関する。 対立遺伝子および類似体には、１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換、削除 または付加によって修飾された配列が、これらの生成物が同じ機能を保持してい る限り包含される。 本発明の特別な主題は、配列番号２の配列のアミノ酸配列を有し、タンパク質 Ｔｘと称されるポリペプチドである。 本発明の態様の一つは、宿主細胞での、配列番号２の配列のアミノ酸配列をコ ードしているＤＮＡの発現によって得られるような、本発明によるポリペプチド にも関する。 本発明によるポリペプチドを宿主細胞での発現によって得るときは、遺伝子工 学および細胞培養の公知の方法に従って、それを実施する。 発現は、本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を適当なプロモー ター配列に先行されて含む原核細胞、例えば大腸菌、または真核細胞、例えばＣ ｏｓ細胞で実施することができる。 本発明は、特に、真核宿主細胞での発現によって得られるような、本発明によ るポリペプチドに関する。 全く特定的には、本発明は、そのプロテアーゼ活性がＩＬ−１βの転換酵素の 成熟のための能力に対応する、本発明によるポリペプチドに関する。この特定の プロテアーゼ活性の決定の例は、下記に説明する。 本発明の主題は、プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発できるヒ トポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクター、および上記ベ クターによって形質転換された宿主細胞にも関する。 発現ベクターは、適当なプロモーターの制御下でタンパク質を発現させる公知 のベクターである。原核細胞に対しては、プロモーターは、例えばｌａｃプロモ ーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼプロモー ターまたはＰＬプロモーターであることができる。酵母細胞に対しては、プロモ ーターは、例えばＰＧＫプロモーターまたはＡＤプロモーターであることができ る。哺乳類細胞に対しては、プロモーターは、例えばＳＶ４０プロモーター、ま たはアデノウイルスのプロモーターであることができる。バキュロウイルス型の ベクターも、昆虫細胞での発現に用いることができる。 宿主細胞は、例えば原核細胞または真核細胞である。原核細胞は、例えば大腸 菌、桿菌、ストレプトマイセス菌である。真核宿主細胞は、酵母とならんで、高 等生物の細胞、例えば哺乳類細胞または昆虫細胞を包含する。哺乳類細胞は、例 えば、ハムスターのＣＨＯまたはＢＨＫ細胞やサルのＣｏｓ細胞のような線維芽 細胞である。昆虫細胞は、例えばＳＦ９細胞である。 本発明は、配列番号２の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡによって 形質転換された宿主細胞での、タンパク質Ｔｘの発現を包含する方法、特に、宿 主細胞が真核細胞である方法に関する。 本発明の主題は、本発明によるポリペプチドに仕向けた抗体でもある。 本発明によるポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、公知の方法に従っ て調製することができ、例えば、例えばＥＬＩＳＡ試験でのタンパク質Ｔｘの検 定に、また診断剤としても用いることができる。 本発明による新規なタンパク質Ｔｘは、下記に述べる結果に示されるとおり、 顕著な生物学的特性、特にプロテアーゼ活性、特にＩＬ−１βの転換酵素を成熟 させ得る能力、およびアポトーシスを誘発できる能力を有する。 これらの生物学的特性は、本発明によるタンパク質Ｔｘを、例えば自己免疫疾 患の治療、傷害の治癒、またはＩＬ−１βが関与する照射による治療の、もしく は、例えばアポトーシスが関与する癌や感染の部域でのそれの副作用の軽減に役 立たせる。 したがって、本発明の主題は、医薬としての、本発明によるポリペプチドであ る。 本発明は、上記に定義の医薬を活性成分として含有する製剤組成物に及び、特 に、ＩＬ−１βの生産を変調するか、またはアポトーシスを変調するための製剤 組成物に関する。 活性成分は、上記製剤組成物の調製のための通常の賦形剤とともに調合するこ とができる。該組成物は、非経口的、経口的または局所的な経路で投与すること ができる。 本発明によるポリペプチドは、これらのポリペプチドの阻害剤で構成される新 規な治療剤、および、例えば自己免疫疾患、敗血症ショックまたは神経退行性疾 患に付随する炎症の治療での、医薬としてそれらの使用も構想させる。 本発明の主題は、配列番号１の配列のヌクレオチド第４２番に始まり、ヌクレ オチド第１，１７２番で終るＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、かつ同じ機能を 有するＤＮＡ配列でもある。 ハイブリッド形成は、例えば、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハート溶液、１００μ g ／mlのサケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で、６５℃で一晩にて 達成される。次いで洗浄を、例えば、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する緩 衝液中で、６０℃で３０分ずつ２回実施する。 本発明は、特に、プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発できるポ リペプチドをコードし、配列番号２２の配列のヌクレオチド配列、より特定的に は、配列番号２２の配列のヌクレオチド第１０４番に始まり、ヌクレオチド第１ ，１９５番で終る配列を有するＤＮＡ配列に関する。 上記配列番号２２のＤＮＡ配列は、３６４個のアミノ酸を有するタンパク質を コードしていて、例えば、ＴｘのｃＤＮＡ配列（配列番号１）のオリゴヌクレオ チド誘導体を援用する、ＰＣＲを用いた増幅によって、ヒトの脾臓または胎盤の ｃＤＮＡから得られるｃＤＮＡ配列である。詳細な調製例は、下記に実験の部で 示す。配列番号２２の配列の知見は、本発明を、例えば化学合成の公知の方法に よってか、またはハイブリッド形成手法を用いたオリゴヌクレオチドプローブに よる遺伝子ライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのふるい分けによって、 再現できるようにする。 本発明の主題は、プロテアーゼ活性を有し、アポトーシスを誘発でき、配列番 号２３の配列のアミノ酸配列を有し、そしてタンパク質Ｔｘと称されるヒトポリ ペプチドでもある。 本発明の態様の一つは、宿主細胞での、配列番号２３の配列のアミノ酸配列を コードしているＤＮＡの発現によって得られるような、本発明によるポリペプチ ドにも関する。 本発明は、得ようとするタンパク質Ｔｙを発現させ、その例をタンパク質Ｔｘ の発現について上記に示した、宿主細胞および発現ベクターも包含する。 本発明は、配列番号２３の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡによっ て形質転換された宿主細胞での、タンパク質Ｔｙの発現を含む方法にも関する。 本発明は、タンパク質Ｔｙに仕向けたポリクローナル抗体またはモノクローナ ル抗体も包含する。 本発明は、医薬としての、タンパク質Ｔｙを含有する製剤組成物にも関する。 添付の図は、本発明の一定の態様を示している： 図１は、制限酵素のＢｇｌII（Ａ列）；ＰｓｔＩ（Ｂ列）；ＨｉｎｄIII（Ｃ 列）；ＢａｍＨＩ（Ｄ列）で消化されたＰＢＭＣに由来するヒトゲノムＤＮＡで の、サザンブロットによるＩＣＥと相同な配列の検出を示す。検出は、³²Ｐで標 識したＩＣＥの第６エキソンというプローブとのハイブリッド形成によって実施 する。 図２は、遺伝子Ｔ２の第６エキソンのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す 。 図３は、ＴｘのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）および対応するア ミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図４は、脾臓（列Ａ）；胸腺（列Ｂ）；前立腺（列Ｃ）；精巣（列Ｄ）；卵巣 （列Ｅ）；小腸（列Ｆ）；結腸（列Ｇ）；末梢白血球（列Ｈ）の組織での、ノー ザンブロットによるＴｘｍＲＮＡの検出を示す。検出は、³²Ｐで標識した「Ｔｘ の第６エキソン」というプローブとのハイブリッド形成によって実施する。 図５は、ｐＩＬ−１βを構成的に含み、そしてＩＣＥｐ４５またはＴｘを含む ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（それぞれ列２または列３）、ベクターｐｃＤ Ｌ−ＳＲα２９６のみ（列４）、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐのみ（列５）、 ＴｘまたはＩＣＥｐ３０を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（それぞれ列６ま たは列７）で核酸移入したＣｏｓ−１細胞での成熟ＩＬ−１βの分泌を、ＤＮＡ を含まない対照培養体（列１）と比較して示す。成熟ＩＬ−１βは、ＥＬＩＳＡ を用いて、細胞上清のpg／mlとして測定する（Ａ：１６時間温置；Ｂ：２４時間 温置）。 図６は、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６のみ（列Ａ）、または標識された突 然変異体Ｔ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ２８５Ｓを含むそれ（列Ｂ）で核酸移入したか、 あるいは標識された突然変異体Ｔ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ２８５Ｓを含むベクターｐ ｃＤＬ−ＳＲα２９６と、ＩＣＥｐ３０、ＩＣＥｐ４５またはＴｘを含むベクタ ーとで（それぞれ列Ｃ、列Ｄまたは列Ｅ）同時核酸移入したＣｏｓ−１細胞での 前駆体ＩＣＥｐ３０の切断を示す。検出は、抗Ｔ７抗体によるウエスタンブロッ トを用い、Ｔｘのみを含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６によるトランスフェ クションに対応する対照（列Ｆ）を用いて実施する。 図７は、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６のみ（７Ｂ）、またはＴｘもしくは ＩＣＥｐ４５を含むそれ（それぞれ７Ｃもしくは７Ｄ）で核酸移入したＣｏｓ− １細胞でのタンパク質Ｔｘによるアポトーシスの誘発を、２２時間の培養後に、 ＤＮＡを含まない対照培養体（７Ａ）と比較して示す（倍率：ｘ４００）。 図８は、ＩＣＥｐ４５もしくはＴｘを含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（ それぞれ列Ｂもしくは列Ｃ）、またはベクターのみ（列Ｄ）で核酸移入したＣｏ ｓ−１細胞のＤＮＡを、ＤＮＡを含まない対照培養体（列Ａ）と比較して示す。 検出は、ＨｉｎｄIII で消化したλファージ（Ｍ１）、およびＨｉｎｄIII で消 化したφＸ１７４ファージ（Ｍ２）のＤＮＡをＤＮＡのサイズマーカーとして、 アガロースゲル上の移動後にＢＥＴで染色することによって、実施する。 図９は、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６のみ（列Ｂ）またはベクターｐｃＤ ＮＡＩ／Ａｍｐのみ（列Ｃ）またはベクターｐＴ７ＴＹΔ６７Ｃ２４５Ｓ（列Ｅ ）で核酸移入したか、あるいはベクターｐＴ７ＴＹとベクターｐＴ７ＴＹΔ６７ Ｃ２４５Ｓとで同時核酸移入した（列Ｆ：２３時間および列Ｇ：４３時間）Ｃｏ ｓ−１細胞での突然変異させたタンパク質Ｔｙ（Ｔ７ＴＹΔ６７Ｃ２４５Ｓ）の 切断を示す。検出は、ウエスタンブロットにより、ＤＮＡを含まない対照培養体 （列Ａ）および分子量マーカー（列Ｄ：検出不能）と比較して実施する。 下記の実施例は、本発明を、それを限定することなく例示する。 実施例１：配列Ｔｘの同定 Ａ−ヒトＩＣＥと相同な遺伝子の呈示 ＩＣＥ遺伝子の第６エキソンに相当するＤＮＡプローブを用い、サザンブロッ トによって、ＩＣＥと相同な遺伝子を同定した。 （ａ）ＩＣＥ第６エキソンのプローブの調製 ヒトＩＣＥの第６エキソンの限界は、ヒトＩＣＥ遺伝子の完全なイントロン／ エキソン構成とともに記載されている［Cerrettiら、前掲］。第６エキソン（２ ３５bp）は、記載されたＩＣＥのｃＤＮＡ配列ｐ４５のヌクレオチド第６３５〜 ８６８番に相当する［Thornberryら、前掲］。 第６エキソンＩＣＥプローブは、下記のオリゴヌクレオチドによるＰＣＲ増幅 によって調製した： これらは、刊行データ［Thornberryら、前掲］を用いて選び、合成し、そして、 ヒト血中単核球に由来し、ＲＮＡキット（商品名：Bioprobe社）を用いて抽出・ 精製したＲＮＡを下記の増幅条件：Biotaq酵素（BioProbe社）；３０サイクル（ ９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、１分）；ＰＣＲ装置：Perkin-Elmer社（ GeneAmp PCRsystem 9600）下にてＲＴ−ＰＣＲによって増幅するのに用いた。 得られたＤＮＡである第６エキソンは、スピンＸカラム（Costar社）で遠心分 離し、オリゴラベリングキット（Pharmacia Biotech 社）を用いたランダムプラ イムの手法を用いて、³²Ｐで標識した。 （ｂ）ゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成：サザンブロット 得られた放射能標識第６エキソンＩＣＥプローブを、ヒトゲノムＤＮＡでのハ イブリッド形成用プローブとして用いた。 ヒトゲノムＤＮＡは、TurboGenキット（Invitrogen社）を用いて末梢血単核細 胞（ＰＢＭＣ）から調製し、次いで、それぞれ制限酵素のＢｇｌII、ＰｓｔＩ、 ＨｉｎｄIII またはＢａｍＨＩ（Boehringer-Mannheim 社）によって切断し、１ ｘＴＡＥへの０．９％アガロースゲル上で移動させ、ナイロン製GeneScreen Plu s 膜（NEN Dupont社）に移転し、次いで第６エキソンＩＣＥプローブとハイブリ ッド形成させた。 ハイブリッド形成条件は、Maniatisら［前掲］が記載した、５ｘＳＳＰＥ、１ ０ｘデンハート溶液、１００μg ／mlのＤＮＡｓｓ、１％ＳＤＳ、６５℃で一晩 で実施し、その後、２ｘＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ、環境温度で３０分、次いで １ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で３０分で連続して洗浄を実施する、高い 緊縮度に相当するそれである。洗浄用緩衝液は、下記の原液から調製した。２０ ｘＳＳＣ：すなわち３モルの塩化ナトリウム水溶液、０．３モルのクエン酸ナト リウム、 ・１０％ＳＤＳ：すなわちドデシル硫酸ナトリウムの水溶液。 洗浄後、膜をHyperfilm-MPフィルム（Amersham社）に露光させた。 図１に示したとおり、各制限酵素に対して３〜４条の異なる帯域が認められる が、これらは異なるサイズのＤＮＡフラグメントに対応し、おそらく、それらの うちのあるものについては、ＩＣＥと高度に相同であるがそれとは異なる遺伝子 に対応するが、それは、１個の遺伝子は、１個のエキソンに対応するプローブと のハイブリッド形成の際には、１条または多くとも２条の別個の帯域のみを生じ 得るにすぎないからである。 Ｂ−ＩＣＥと相同な遺伝子のクローニング （ａ）ＩＣＥと相同なゲノム配列のクローニング 上記で得られたＤＮＡの異なるフラグメントを同定するために、末梢血単核細 胞（ＰＢＭＣ）から抽出し、次いでＨｉｎｄIII なる酵素（Boehringer-Mannhei m 社）で消化したヒトゲノムＤＮＡのフラグメントを、Maniatisら［前掲］が記 載した条件に従って、１．５％アガロースゲル、１ｘＴＡＥでの調製的電気泳動 によって分離した。このゲルを、２．３kb未満の分子量に相当する部域で２０個 の分画に切断し、次いで、各分画から溶出させたＤＮＡに対し、上記のオリゴヌ クレオチドのＩＣＥ６．５（配列番号３）およびＩＣＥ６．３（配列番号４）を 用い、下記の増幅条件：９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、１分；３０サイ クル；BioTaqなるポリメラーゼを用いる、ＰＣＲを用いた増幅を実施した。 上記の２０の分画のうち、ＰＣＲを用いて最良の増幅を生じた８分画を保持し た。増幅した材料は、ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）により、供給者 の指示に従って、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ酵素を用いてベクターｐＣＲIIにクロー ニングし、Macrophor 電気泳動装置（Pharmacia System社）を用いたシークエナ ーゼ酵素によるサンガーの手法を用いて配列決定した。決定された配列は、ＧＣ Ｇソフトウエア［Devereuxら、Nuclei Acids Research、12：387 〜395（1984） ］を用いて分析した。 得られたヌクレオチド配列のうち、ＩＣＥの第６エキソンの配列と９２％のヌ クレオチドの同一性を有する、Ｔ２と呼ばれる配列を本発明者らは同定した。 ヌクレオチド配列Ｔ２は、図２に示した第６エキソン（配列番号５）の全部に わたる開放読み枠を有し、タンパク質Ｔ２をコードしているメッセンジャーＲＮ Ａを同定し、Ｔ２に対応するｃＤＮＡをクローニングする試みへと導く。 （ｂ）ＩＣＥと相同なｃＤＮＡのクローニング ＬＰＳによって１８時間活性化した単核球、または胎盤、または、末梢血から 単離した多核細胞のいずれかで出発し、ＲＮＡキット（商品名：Bioprobe社）を 用いて総ＲＮＡを抽出・精製した。対応するｃＤＮＡの各々を、ポリｄＴオリゴ ヌクレオチドおよび逆転写酵素なる酵素を用い、GeneAmp ＲＮＡＰＣＲキット（ Perkin-Elmer社）を用い、供給者の指示に従って合成し、次いで、下記の２種類 のオリゴヌクレオチド：すなわち、Ｔ２型であるがＩＣＥ配列ではない配列を特 異的に増幅するために、Ｔ２の第６エキソンをコードする配列から選んだ および、ＩＣＥのｃＤＮＡのコード化領域（相補鎖）の３’末端から選んだ を用いたＰＣＲを用いて、増幅した。 下記の増幅条件：すなわち９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、３０秒 ；GeneAmp ＲＮＡＰＣＲキット（Perkin-Elmer社）による３０サイクルを用い、 ３種類のＲＮＡ調製物のそれぞれから、それぞれ約６００塩基対のフラグメント を得た。このフラグメントを、ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用い てクローニングし、上記のとおり配列決定した。こうして決定されたヌクレオチ ド配列は、予測されたＴ２ｃＤＮＡではなく、Ｔｘと呼ぶことにした新規なｃＤ ＮＡに対応する。 Ｃ−ＴｘｃＤＮＡの同定 （ａ）ＴｘｃＤＮＡの共通配列の決定 ＴｘのｃＤＮＡの５’および３’末端のヌクレオチド配列を、アンカードＰＣ Ｒなる手法によって胎盤のｃＤＮＡから得た。 ＴｘのｃＤＮＡの５’末端を、5'-Race-Ready ｃＤＮＡキット（ヒト高速クロ ーンｃＤＮＡ：Clontech社）、および下記の増幅用オリゴヌクレオチドを用いて 増幅した： ＴｘｃＤＮＡの３’末端を、３’RACEシステムキット（Gibco-BRL 社）、およ び下記の増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅した： これらのそれぞれ２対のプライマーは、上記で得られたＴｘの部分配列から定 義した。 次いで、得られた増幅フラグメントを、ＴＡクローニングキット（Invitrogen 社）を用いてクローニングし、上記のとおり配列決定した。 ヌクレオチド配列は、上記のＴｘＡオリゴヌクレオチド（配列番号１０）およ びＴｘＢオリゴヌクレオチド（配列番号１１）、ならびにＴｘをコードしている 配列（コード化鎖または相補鎖）から選んだ下記のオリゴヌクレオチド： を援用して確認した。 得られたすべての配列の編集は、図３に示したＴｘｃＤＮＡ（配列番号１）の 共通ヌクレオチド配列を生じた。こうして決定された配列は、ポリアデニル化配 列で終る１，２９１個のヌクレオチドを含む。これは、ヌクレオチド第４２番の メチオニンイニシエーターに始まり、ヌクレオチド第１，１７２番の終止コドン で終る開放読み枠を有する。結果は、３７７アミノ酸のタンパク質をコードして いる１，１３１ヌクレオチドの開放読み枠である。 ｂ−ＴｘｃＤＮＡのコード化領域のクローニング： ＴｘｃＤＮＡ（配列番号１）のコード化領域を、単核球、多核細胞または胎盤 のいずれかの総ＲＮＡから、下記のオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲに よって増幅した： これらの増幅プライマーは、予め決定したＴｘｃＤＮＡ共通配列（または相補 鎖）に従って選び、それぞれオリゴヌクレオチドＴｘＰ５に対するＢａｍＨＩお よびＮｃｏＩクローニング部位、ならびにオリゴヌクレオチドＴｘＰ３に対する ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位を付加することによって合成した。 約１，１５０塩基対の長さを有する得られた増幅生成物を、酵素のＢａｍＨＩ およびＸｂａＩ（Boehringer-Mannheim 社）で消化し、Amersham結合キットを用 いて、同じ制限酵素のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで前もって消化しておいたベク ターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社）にクローニングした。クローニング した生成物を、上記のオリゴヌクレオチドＴｘＡ、ＴｘＢ、ＴｘＣ、ＴｘＤ、Ｔ ｘ１、Ｔｘ２、Ｔｘ３、Ｔｘ４、Ｔｘ５およびＴｘ６を用いて、２本の鎖にわた って完全に配列決定した。 用いた各出発ＲＮＡについて、得られたヌクレオチド配列は、上記のＴｘｃＤ ＮＡ共通配列（配列番号１）をコードしている配列と同一である。したがって、 異なる個体に由来する、用いた異なる組織の間に認められる差は皆無である。 ＴｘｃＤＮＡのコード化領域は、タンパク質のＴｘをコードしていて、その推 定アミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。タンパク質Ｔｘの配列は、４３． ２６kDという算定分子量を有する３７７アミノ酸を含む。 タンパク質Ｔｘの配列と前駆体ＩＣＥｐ４５との相同性は、配列の整合に不連 続性を導入することによって、アミノ酸に関しては多くとも５２％だけ同一であ る。 ＴｘｃＤＮＡ（配列番号１）をコードしている領域をベクターｐｃＤＮＡＩ／ Ａｍｐ中に含む大腸菌ＸＬ−１ブルーの標本（ＴｘｃＤＮＡ／ｐｃＤＮＡＩ、13 /07/94）を、Ｉ−１４６２なる番号の下に１９９４年７月２２日付でＣＮＣＭに 寄託した。 ｃ−ヒトの様々な組織でのＴｘｍＲＮＡの発現： タンパク質ＴｘをコードしているｍＲＮＡの発現を、ＩＣＥの第６エキソンに 整合させたＴｘの部分に相当するＤＮＡプローブ（「Ｔｘ第６エキソン」）を用 いたノーザンブロットによって、異なる８組織で調べた。このプローブは、配列 番号１のヌクレオチド第５９５〜８１１番に相当する。 プローブ「Ｔｘ第６エキソン」は、上記のオリゴヌクレオチドＴ２．Ａ（配列 番号６）およびＴｘＣ（配列番号１２）をプライマーとして用い、この配列をＴ ｘｃＤＮＡを含むプラスミドから始めて増幅することによって、調製した。 このプローブは、オリゴラベリングキット（Pharmacia BioTech 社）によるラ ンダムプライム法なる方法によって³²Ｐで標識し、次いで、多組織ノーザンブロ ットIIという膜（Clontech社）上のヒトの異なる組織の、それぞれＲＮＡである ポリＡ⁺２μg を含有する膜上で、供給者が与えたハイブリッド形成条件による ハイブリッド形成によって、ＴｘｍＲＮＡを検出するのに用いた。 図４に示したとおり、ｍＲＮＡシグナルは、試験した組織のほとんどで、様々 な強さで検出された。末梢血白血球（Ｈ）は、最も強いシグナルを生じた。脾臓 （Ａ）、小腸（Ｆ）、胸腺（Ｂ）および卵巣（Ｅ）は、中間的なシグナルを生じ た。前立腺（Ｃ）および結腸（Ｇ）は、非常に弱いシグナルを生じ、最後に、精 巣ｍＲＮＡ（Ｄ）では、信号は全く検出されなかった。 したがって、タンパク質ＴｘをコードしているｍＲＮＡは、多くの組織で、そ して全く特定的には血液細胞で発現される。 実施例２：タンパク質Ｔｘの機能の研究 Ａ−プレＩＬ−１βの切断 タンパク質Ｔｘが随意にヒトＩＬ−１βの前駆体を切断できる能力を、発現ベ クターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐおよびｐｃＤＬ−ＳＲα２９６の一方または他方に よる真核細胞トランスフェクション系で試験した。 初めに、ＴｘｃＤＮＡ（配列番号１）をコードしている領域を、真核発現ベク ターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社）のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位で クローニングした。酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、約１，１５ ０塩基対の挿入断片を単離し、次いで精製した。末端の制限部位は、Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim 社）を用いて充填した。得られたｃＤＮＡ を、結合キット（Amersham社）を用いて、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にサ ブクローニングし［Takebeら、Molecular and Cellular Biology、８：466 （19 88）］、ＸｂａＩ酵素で開裂し、次いで、その末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで 充填した。プラスミドマキシーキット（QIAGEN社）を用いた精製の後、２ベクタ ー中のＴｘプラスミドＤＮＡ調製物を得た。 トランスフェクションに用いた真核細胞は、ｐＩＬ−１βを構成的に発現し、 ヒトｐＩＬ−１βの遺伝子を有するプラスミドのトランスフェクションによって 得られたＣｏｓ−１細胞系である。ｐＩＬ−１βの合成は、ＤＭＥＭへの０．５ mg／mlのＧ−４１８硫酸塩、１０％ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、ピルビン酸塩 、ＨＥＰＥＳ培養液の存在下で細胞を培養することによって、この細胞系で維持 される。 ３ｘ１０⁶個のＣｏｓ−１細胞を、ペトリ皿中で、５％のＣＯ₂を有する湿潤雰 囲気中、３７℃で温置し、予めＤＥＡＥ−デキストラン２００μl と混合し、Ｐ ＢＳ４mlで希釈してから皿に加えたプラスミドＤＮＡ１５μg で、核酸移入する 。３７℃、３０分間の細胞の温置、および血清を含まないＤＭＥＭへの８０μM のクロロキン溶液８mlの添加の後、細胞を２．５時間温置する。次いで、上清溶 液を吸引し、血清を含まないＤＭＥＭへの１０％のＤＭＳＯで２分間、細胞を処 理する。血清を含まないこの培養液で洗浄した後、上記の完全培養液１０mlを加 える。温置の後、核酸移入した細胞の上清を、１６〜４５時間からなる異なる時 間に捕集する。 上清中に存在する成熟ＩＬ−１βを、成熟ＩＬ−１βを特異的に検出できるＥ ＬＩＳＡによるＩＬ−１β試験（R&D Systems 社）を用いて、測定する。 トランスフェクションは、上記の２ベクターのうち一方または他方に挿入した ＴｘｃＤＮＡのコード化領域を用い、それぞれＩＣＥｐ４５またはＩＣＥｐ３０ のｃＤＮＡのコード化領域を含むトランスフェクション、およびプラスミドを含 まない対応するベクターのみによる対照トランスフェクションと比較して、実施 した。 図５に示したとおり、ＩＣＥのｐ４５またはｐ３０のｃＤＮＡのトランスフェ クション（列２または列７）は、成熟ＩＬ−１βを分泌できる能力を細胞に与え る。対照的に、ＴｘのｃＤＮＡを同じ条件下で核酸移入したとき（列３および６ ）は、対照トランスフェクション（列１、４、５）についてと同様に、ＩＬ−１ βの分泌は全く認められない。トランスフェクション後の温置時間がどうであれ （１６時間：図５Ａ；２４時間：図５Ｂ；２９時間および４４時間まで）、２種 類の発現ベクターで同様な結果が得られる。 タンパク質Ｔｘは、ＩＬ−１βの転換酵素特性を保有しない。 Ｂ−タンパク質Ｔｘのプロテアーゼ活性：ＩＣＥの３０kD前駆体の切断 タンパク質ＴｘがＩＣＥの３０kD前駆体（ＩＣＥｐ３０）を随意に切断できる 能力を、真核細胞での同時トランスフェクション系で、各ＤＮＡが上記の発現ベ クターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にそれぞれ挿入された、ＴｘｃＤＮＡ（配列番号 １）のコード化領域を含むベクター、および修飾されたＩＣＥタンパク質をコー ドしているＤＮＡを含むベクターをＣｏｓ−１に同時に導入することによって、 試験した。 タンパク質ＩＣＥを二重に修飾した：一方では、タンパク質Ｔｘの存在下でタ ンパク質ＩＣＥの特異的検出を許すために、小さいＴ７ペプチドをタンパク質Ｉ ＣＥｐ３０のＮ末端に融合させた。こうして標識したタンパク質またはその成熟 生成物は、Ｔ７ペプチドに特異的なモノクローナル抗体によるウエスタンブロッ トによって検出可能である［Tsaiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、89：8,864 （1992）］。他方では、それ自体の成熟を誘導できない形態でこの酵素を発現さ せるために、その活性部位のシステインである第２８５位Ｃｙｓをセリンに置き 換えた、ＩＣＥｐ３０の突然変異体を用いた［K.P．Wilson ら、Nature、370 （ 1994年７月28）：370 ］。したがって、この酵素は不活性であり、それ自体の成 熟を誘導することも、ｐＩＬ−１βを切断することもできない。この突然変異体 は、適切なオリゴヌクレオチド、およびTransformer （登録商標）部位指向性突 然変異誘発キット（Clontech社）を用いた部位指向性突然変異誘発によって調製 した。得られた配列を全体的に検証した。このようにして、標識し、突然変異さ せたＩＣＥｐ３０が得られ、これをＴ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ２８５Ｓと称する。 Ｃｏｓ−１細胞を、上記の操作条件に従って、Ｔ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ２８５Ｓ を含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６、またはベクターＴ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ ２８５Ｓ含有体Ｔｘのいずれかで核酸移入するか、あるいは該２ベクターで同時 核酸移入した。２２時間の培養の後、細胞を捕集し、洗浄し、１０mMＮａＣｌ、 １０mMＨＥＰＥＳ（pH７．４）、１mMＥＤＴＡ、５０mMＮａＦ、０．２％トリト ンＸ−１００、１μg ／mlのロイペプチン、２０Ｕ／μl のアプロチニン（apro tinin ）および１mMＰＭＳＦを含有する緩衝液中で溶解した。細胞溶解物を４０ ０ｘｇ、４℃で遠心分離し、次いで、上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた１６％ ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付した。次いで、ゲルのタンパク質をニ トロセルロース膜に移転し、抗Ｔ７マウスモノクローナル抗体（Navagen 社）と ともに環境温度で２時間温置した。膜を洗浄し、次いで、アルカリ性ホスファタ ーゼと複合させたマウス抗免疫グロブリンヤギ抗体とともに、環境温度で１時間 温置した。次いで、膜に固着した抗体を、アルカリ性ホスファターゼの基質（Pr omega 社）によって呈示した。 同時トランスフェクションは、Ｔ７−ＩＣＥｐ３０Ｃ２８５Ｓを含むベクター ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６と、Ｔｘに代えてＩＣＥｐ３０またはＩＣＥｐ４５のい ずれかを含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６とで、同様にして実施した。 図６に示したとおり、突然変異させたタンパク質ＩＣＥｐ３０（Ｔ７−ＩＣＥ ｐ３０Ｃ２８５Ｓ）を、核酸移入したＣｏｓ細胞で単独に発現させたとき、Ｔ７ −ｐ３０の形態の酵素（見かけＭＷは３５kD）が検出できる。 ｐ２０の形態に相当する帯域の不在は、突然変異させた酵素が自己切断できな いことを示す。ＩＣＥｐ３０の酵素またはｐ４５の酵素を含むベクターによって 細胞を同時核酸移入したときは（列Ｃまたは列Ｄ）、活性酵素によるＴ７−ｐ２ ０という切断生成物に相当する２６kDの見かけＭＷに、帯域が認められる。Ｔｘ を含むベクターによって、細胞を同時核酸移入したときは（列Ｅ）、主要な帯域 の出現がやはり２６kDの見かけＭＷで認められ、約３１kDおよび２８kDの２条の 副次的な帯域を伴う。異なる帯域は、細胞で発現されたタンパク質Ｔｘによる、 ｐ３０の形態のＩＣＥの切断生成物に相当する。 これらの結果は、タンパク質Ｔｘは、一方では核酸移入されたＣｏｓ細胞で発 現され、他方ではプロテアーゼ活性を有することを示す。加えて、タンパク質Ｔ ｘは、ＩＣＥの３０kD前駆体を切断することができ、こうして、ＩＣＥのプロ酵 素の生体内での成熟、および活性形態での酵素の生成に寄与できる。 Ｃ−タンパク質Ｔｘによるアポトーシスの誘発 タンパク質Ｔｘがアポトーシスを誘発できる能力を、Ｃｏｓ細胞でのトランス フェクション、および培養細胞の形態学的検査によって試験した。 異なる細胞型でのＩＣＥのトランスフェクションは、アポトーシスによるこれ らの細胞の死を招くことが、記載されている［Miura ら、前掲］。 ＴｘｃＤＮＡ（配列番号１）のコード化領域を含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα ２９６によるＣｏｓ−１細胞のトランスフェクション、およびＩＣＥｐ４５を含 むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６によるトランスフェクションを、上記のとお り実施した。細胞の形態学的性状を、２２時間の温置後に観察した。 図７に示したとおり、円形の細胞の出現が認められ、それらは、支持体から脱 着し、その形態学的外見は、ＩＣＥのｃＤＮＡで核酸移入したＣｏｓ細胞の培養 体でのアポトーシスの際の細胞に特徴的である（７Ｄ）。形態学上の同じ変化が 、ＴｘｃＤＮＡで核酸移入したＣｏｓ細胞の培養体で認められる（７Ｃ）。 同一の形態学的結果が、上記のベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを用いて、核酸 移入したＣｏｓ−１細胞でＩＣＥおよびＴｘを発現したときに得られた。 これらの結果は、核酸移入したＣｏｓ−１細胞から単離し、トランスフェクシ ョン後に４０時間温置したＤＮＡの観察によって確認された。細胞のＤＮＡは、 microTurboGen キット（Invitrogen社）を用い、１．５％アガロースゲル上で移 動させ、ＢＥＴで染色して、調製した。 図８に示したとおり、ＩＣＥｐ４５およびＴｘで核酸移入した細胞のＤＮＡ（ 列Ｂおよび列Ｃ）は、アポトーシスの際の細胞に特徴的な、「梯子状の」外見を 有する。 ＤＮＡなしで（７Ａおよび８Ａ）、またはｃＤＮＡを含まないベクターで（７ Ｂおよび８Ｂ）核酸移入した細胞は、アポトーシスの際の細胞の形態学的性状も ＤＮＡも保有しない。 これらの結果は、タンパク質Ｔｘがアポトーシスの誘発に関与していることを 示す。 実施例３：Ｔｙ配列の同定 Ａ−Ｔｘと相同な遺伝子のクローニング 末梢血単核細胞から抽出したヒトゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄIII 酵素（Boehri nger-Mannheim 社）で消化し、次いで、Maniatisら［前掲］が記載した条件に従 い、１％アガロース、１ｘＴＡＥゲル中での調製的電気泳動によって、フラグメ ントを分離した。ゲルを、沈澱ウエルの、１．９kbより大きい分子量に相当する 部域で２４分画に切断し、次いで、ＰＣＲを用いる増幅を、各分画から溶出させ たＤＮＡに対して既述のＴ２Ａ（配列番号６）およびＴｘＣ（配列番号１２）オ リゴヌクレオチドを用い、下記の増幅条件：９４℃、３０秒；５５℃、３０秒； ７２℃、１分；３０サイクル；BioTaqポリメラーゼ（BioProbe社）を用いて実施 した。 上記の２４分画のうち、ＰＣＲを用いて最良の増幅を生じた１０分画を保持し た。増幅した材料をアガロースゲル上で精製し、ＴＡクローニングキット（Invi trogen社）でベクターｐＣＲII中にクローニングし、Macrophor 電気泳動システ ム（Pharmacia System社）を用いるシーケナーゼ酵素（バージョン２．０のＤＮ Ａ配列決定キット）でのサンガーの手法によって、配列決定した。決定した配列 は、実施例１で示したとおり、ＧＣＧソフトウエアを用いて分析した。 ヌクレオチドに関してＴｘｃＤＮＡ配列（配列番号１）との９４．９％の同一 性を有する、Ｔｙと呼ぶヌクレオチド配列を同定したが、これは、Ｔｙに対応す るｃＤＮＡをクローニングする試みを導く。 Ｂ−ＴｙｃＤＮＡのクローニングおよび同定 （ａ）ＴｙｃＤＮＡの共通配列の決定 ＴｙのｃＤＮＡの５’および３’末端のヌクレオチド配列を、アンカードＰＣ Ｒの手法を用いて、それぞれヒト脾臓および胎盤のｃＤＮＡから得た。 ＴｙのｃＤＮＡの３’末端を、３’ＲＡＣＥシステムキット（Gibco-BRL 社） 、および下記の増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅した： これら二つのプライマーは、上記で得られたＴｙ配列の第６エキソンの部分配列 から定義した。増幅したフラグメントをアガロースゲル上で精製し、ベクターｐ ＣＲIIにクローニングし、上記のとおり配列決定した。得られた配列の編集は、 ＴｙｃＤＮＡのコード化領域の３’部分はもとより、非コード化３’領域も定義 できるようにした。 ＴｙのｃＤＮＡの５’末端を、ヒト脾臓5'-RACE-Ready ｃＤＮＡキット（Clon tech社）、および下記の増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅した： および これら二つのプライマーは、上記で得られたＴｙｃＤＮＡの３’領域の配列から 、Ｔｙ５Ａ１に対する制限部位ＸｂａＩおよびＸｈｏＩを付加することによって 定義した。次いで、該増幅用フラグメントをＴＡクローニングキット（Invitrog en社）を用いてクローニングし、上記のとおり配列決定した。 ヌクレオチド配列は、上記のＴｙ５Ａ１（配列番号２６）およびＴｙ３．１（ 配列番号２５）オリゴヌクレオチド、ならびに下記のオリゴヌクレオチドを用い て確認した： これらのオリゴヌクレオチドは、Ｔｙのコード化配列（コード化鎖または相補鎖 ）から選んだ。 得られたすべての配列の編集は、ＴｙｃＤＮＡ（配列番号２２）の共通ヌクレ オチド配列を生じた。 （ｂ）ＴｙｃＤＮＡのコード化領域のクローニング ＴｙｃＤＮＡ（配列番号２２）のコード化領域を、ヒト脾臓または胎盤のｃＤ ＮＡから始めるＰＣＲを用い、対応する5'-RACE-ready ｃＤＮＡキット（Clonte ch社）、上記のオリゴヌクレオチドＴｙ５Ａ１（配列番号２６）、および下記の オリゴヌクレオチドを用いて増幅した： これらの増幅用プライマーは、上記で決定されたＴｙｃＤＮＡ（配列番号２２） の共通配列に従い、ＴｙＰ５に対するクローニング部位であるＢａｍＨＩを付加 することによって選んだ。 増幅し、アガロースゲル上で精製した、約１，１００塩基対の長さを有する生 成物を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、実施例１に記載 のとおり、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローニングし、上記のとおり配列 決定した。クローニングした生成物を、上記に定義したオリゴヌクレオチドの配 列番号２８〜３８を用いて、２本の鎖にわたって全体的に配列決定した。 共通配列であるＴｙｃＤＮＡ（配列番号２２）のコード化配列と同一の配列を 得た。ＴｙｃＤＮＡのコード化配列と、実施例１で得たＴｘｃＤＮＡのコード化 配列との相同性は、ヌクレオチドの８４％の同一性である。 ＴｙｃＤＮＡのコード化領域は、推定アミノ酸配列の配列番号２３を有するＴ ｙタンパク質をコードしている。このタンパク質配列は、４１．８kDという算定 分子量を有する３６４個のアミノ酸を含む。 Ｔｙなるタンパク質と、実施例１で得たＴｘなるタンパク質との配列の相同性 は、アミノ酸の７５％の同一性である。 ＴｙのｃＤＮＡ（配列番号２２）のコード化領域をベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａ ｍｐ中に含む大腸菌ＸＬ−１ブルーの標本（ＴｙｃＤＮＡ／ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ ｐ、30/6/95）を、Ｉ−１０６８なる番号の下に１９９５年７月５日付でＣＮＣ Ｍに寄託した。 実施例４：タンパク質Ｔｙの生物学的活性 Ａ−アポトーシスの誘発 タンパク質Ｔｙがアポトーシスを誘発できる能力を、実施例２に示した操作方 法に従って試験したが、それには、ｐｃＤＬ−ＴＹと名付けたＴｙｃＤＮＡ（配 列番号２２）のコード化領域を含むベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６で核酸移入 し、ＴｘｃＤＮＡのサブクローニングについて実施例２に記載の条件に従ってそ の調製を実施した、Ｃｏｓ−１細胞を用いた。 この細胞の形態学的性状を、２３時間および４３時間の温置後に観察し、単離 したＤＮＡの観察を、４３時間の温置後に実施した。 ＴｘまたはＩＣＥｐ４５のコード化領域を含むベクターで核酸移入した細胞と 比較して得られた結果は、タンパク質Ｔｘについて実施例２の図７および図８に 示したのと同一である。 これらの結果は、タンパク質Ｔｙは、タンパク質Ｔｘと同じくアポトーシスの 誘発に関与していることを示している。 Ｂ−タンパク質Ｔｙのプロテアーゼ活性 タンパク質Ｔｙが分子間方式で自己切断できる能力を、タンパク質Ｔｘによる ＩＣＥの前駆体の切断について実施例２に記載したのと同様な条件下で、真核細 胞での同時トランスフェクション系で試験したが、それは、ＴｙｃＤＮＡ（配列 番号２２）のコード化領域を含むベクターと、修飾されたタンパク質Ｔｙをコー ドしているＤＮＡを含むベクターとをＣｏｓ−１細胞に同時に導入することを用 い、そのそれぞれのＤＮＡは、実施例２に記載した発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α２９６およびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに、それぞれ挿入した。 タンパク質Ｔｙを二重に修飾した、すなわち、一方では第２４５位Ｃｙｓのコ ドンを、「重複」ＰＣＲ法によってセリンのコドンへと突然変異させ、他方では 、配列番号２３の第６８〜３６４残基に相当するＴｙフラグメントのＮ末端に、 エピトープタグ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）を導入した。 下記のプライマーの対： （ａ）一方では、Ｔｙのコード化配列から選び、制限部位のＢａｍＨＩ、次いで 、タグのＴ７をコードしているヌクレオチド配列を付加することによって合成し た、 および、第１７位にＣからＧへの突然変異を有するＴｙ（相補鎖）のコード化配 列から選んだ、 （ｂ）他方では、第２０位にＧからＣへの突然変異を有するＴｙのコード化配列 から選んだ、 および上記のＴｙ５Ａ１（配列番号２６）、 を用い、下記の増幅条件：９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、１分；３０サ イクル；Ventポリメラーゼ（Biolabs 社）を用いてＴＹｃＤＮＡのテンプレート を増幅した。得られた２種類の増幅生成物を結合し、それぞれプライマーＴ７Ｔ ｙおよびＴｙ５Ａ１、ならびに上記の条件を用いたＰＣＲによって増幅した。 増幅生成物を制限酵素のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、同じ制 限酵素で前もって消化しておいたベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローニング した。得られたプラスミドをｐＴ７ＴＹΔ６７Ｃ２４５Ｓと呼ぶ。得られた配列 は、ＤＮＡ配列決定によって全体的に確認した。 ＴｙｃＤＮＡ（配列番号２２）をサブクローニングした発現ベクターｐｃＤＬ −ＳＲα２９６はプラスミドｐｃＤＬ−ＴＹと呼び、上記のとおり調製した。 Ｃｏｓ−１細胞を、ベクターｐＴ７ＴＹΔ６７Ｃ２４５Ｓで核酸移入するか、 またはこのプラスミドとプラスミドｐｃＤＬ−ＴＹとで同時核酸移入し、次いで 、実施例２に記載の操作条件に従って、２３時間または４３時間培養し、溶解し 、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動、およびマウス抗Ｔ７モノクローナル抗 体を用いるウエスタンブロットによって分析したが、マウス抗免疫グロブリンヤ ギ抗体は、アルカリ性ホスファターゼに代えてセイヨウワサビのペルオキシダー ゼと複合させた。次いで、膜に結合した抗体を、オートラジオグラフィーを用い たＥＣＬウエスタン検出システム（Amersham社）で呈示した。 同時トランスフェクションを、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６のみ、および ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐで同じようにして実施し、細胞を２３時間培養し た。 図９に示したとおり、突然変異させたタンパク質Ｔｙを、核酸移入したＣｏｓ 細胞で単独で発現させたとき、Ｔ７Ｔｙ形態（見かけＭＷは約３０kD）が検出で きた（列Ｅ）。より低いＭＷの帯域の不在は、突然変異させたタンパク質Ｔｙが 自己切断できないことを示す。この細胞を、Ｔｙを含むベクターと同時核酸移入 したときは（列ＦおよびＧ）、主要な帯域の出現が、タンパク質Ｔｙによって突 然変異させたタンパク質Ｔｙの切断生成物に相当する、２０kDの見かけＭＷに認 められる。 これらの結果は、タンパク質Ｔｙが、一方では、核酸移入されたＣｏｓ細胞で 発現され、他方では、プロテアーゼ活性を有すること、および、特に分子間の方 式で自己切断できることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＳ 9/64 ＡＡＭ //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ラランヌ，ジャンルイ フランス国 エフ94120 フォントネスー ボワ，リュ マクシミリアン ロベスピエ ール，39 (72)発明者 リビングストン，デイビッド ジェイ. アメリカ合衆国 02160 マサチューセッ ツ，ニュートン，マディソン アベニュー 20 (72)発明者 スー，マイケル エス．エス. アメリカ合衆国 02159 マサチューセッ ツ，ニュートン，ドナ ロード 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロテアーゼ活性を有するヒトポリペプチドをコードし、配列番号１： の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列。 ２．アポトーシスを誘発できる能力を有するヒトポリペプチドをコードし、配列 番号１： の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列。 ３．プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発できるヒトポリペプチド をコードし、配列番号１： の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列。 ４．プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発できるヒトポリペプチド をコードし、配列番号１の配列のヌクレオチド第４２番に始まり、ヌクレオチド 第１，１７２番で終る配列を有するＤＮＡ配列、ならびにそれとハイブリッド形 成し、同じ機能を有するＤＮＡ配列。 ５．配列番号１の配列のヌクレオチド第４２番に始まり、ヌクレオチド第１，１ ７２番で終る配列を有する請求項４記載のＤＮＡ配列。 ６．プロテアーゼ活性を有し、アポトーシスを誘発でき、そして配列番号２： の配列のアミノ酸配列を有するヒトポリペプチド、ならびに該配列の対立遺伝子 および類似体。 ７．配列番号２の配列のアミノ酸配列を有し、タンパク質Ｔｘと称される請求項 ６記載のポリペプチド。 ８．プロテアーゼ活性を有し、アポトーシスを誘発できるヒトポリペプチドであ って、宿主細胞での、配列番号２の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ の発現によって得られるようなヒトポリペプチド。 ９．真核宿主細胞での発現によって得られるような請求項８記載のポリペプチド 。 １０．そのプロテアーゼ活性が、ＩＬ−１βの転換酵素の成熟能力に対応する請 求項６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １１．請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。 １２．請求項１１記載のベクターで形質転換させた宿主細胞。 １３．配列番号２の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡによって形質転 換させた宿主細胞でのタンパク質Ｔｘの発現を含む方法。 １４．宿主細胞が真核細胞である請求項１３記載の方法。 １５．請求項６〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドに対して仕向けた抗 体。 １６．医薬としての請求項６〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １７．請求項１６記載の医薬を活性成分として含有する製剤組成物。 １８．ＩＬ−１βの生産を変調するための請求項１７記載の製剤組成物。 １９．アポトーシスを変調するための請求項１７記載の製剤組成物。 ２０．配列番号１の配列のヌクレオチド第４２番に始まり、ヌクレオチド第１， １７２番で終るＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、同じ機能を有する請求項４記 載のＤＮＡ配列。 ２１．プロテアーゼ活性を有し、かつアポトーシスを誘発できるポリペプチドを コードし、配列番号２２の配列のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列。 ２２．ヌクレオチド第１０４番に始まり、ヌクレオチド第１１９５番に終わる、 配列番号２２の配列の請求項２２記載のＤＮＡ配列。 ２３．プロテアーゼ活性を有し、アポトーシスを誘発でき、配列番号２３のアミ ノ酸配列を有し、そしてタンパク質Ｔｙと称されるヒトポリペプチド。 ２４．配列番号２３の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの、宿主細胞 での発現によって得られる限りでのヒトポリペプチド。 ２５．配列番号２３の配列のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡによって形質 転換された宿主細胞での、タンパク質Ｔｙの発現を含む方法。