ES2273337T3 - Secuencias de adn codificantes de proteinas humanas tx y ty emparentadas con la enzima de conversion de la interleuquina -1-beta. - Google Patents

Secuencias de adn codificantes de proteinas humanas tx y ty emparentadas con la enzima de conversion de la interleuquina -1-beta. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS HUMANOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE PROTEASA Y CAPAZ DE INDUCIR LA APOPTOSIS, EMPARENTADOS CON LA ENZIMA DE CONVERSION DE LA INTERLEUQUINA-1BETA.

Description

Secuencias de ADN codificantes de proteínas humanas Tx y Ty emparentadas con la enzima de conversión de la interleuquina-1beta.
La presente invención se refiere a una secuencia de ADN codificante de una nueva proteína humana Tx emparentada con la enzima de conversión de la interleuquina-1beta, la proteína Tx, su procedimiento de producción, las composiciones farmacéuticas que la contienen y sus aplicaciones como medicamentos.
La interleuquina-1beta (IL-1\beta) es una citoquina pro-inflamatoria implicada en la patogenia de múltiples enfermedades inflamatorias agudas o crónicas tal como la poliartritis reumatoide, las enfermedades inflamatorias de intestinos o el choque séptico (Dinarello et al., 1992, Immunological Reviews, 127, 119-146).
Los monocitos y los macrófagos humanos sintetizan la IL-1\beta en forma de un precursor inactivo de 31kDa (pIL-1\beta). El pIL-1\beta no posee secuencia señal convencional y no puede ser secretado eficazmente por la célula más que después de un corte entre el ácido aspártico 116 y la alanina 117. Este corte, que genera la forma IL-1\beta activa de 17kDa, es efectuado por una enzima específica denominada enzima que convierte interleuquina-1beta (ICE por sus iniciales en inglés) (Thornberry et al., 1992, Nature, 356, 768-774; Cerretti et al., 1992, Science, 256, 97-100). Esta enzima ha sido caracterizada en hombre y en ratón (Nett et al., 1992, Journal of Immunology, 149, 3254-3259; Molineaux et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1809-1813). Esta es una cisteína proteasa única que no presenta homología con las otras tiol-proteasas conocidas. Posee igualmente una especificidad particular para ciertos enlaces peptídicos Asp-X de la pIL-1\beta.
La enzima ICE está compuesta por dos sub-unidades de 20kDa (p20) y 10kDa (p10) cuya asociación es necesaria en la actividad enzimática. Estas sub-unidades provienen de la ruptura proteolítica de una forma pro-enzima de 45kDa (p45). La enzima ICE ella misma es capaz de romper su precursor p45 o la forma p30 de 30 kDa, que no posee los 119 aminoácidos de la parte N-terminal de la pro-enzima, en forma p20 más p10 activa. La secuencia completa de p45 ha sido caracterizada por su ADNc así como la secuencia de aminoácidos (Thornberry et al. ya citado). La caracterización del gen de la ICE humano ha sido descrita (Cerretti et al., 1994, Genomics, 20, 468-473).
Trabajos recientes han puesto en evidencia un rol posible de la ICE en la regulación de la muerte celular programada o apoptosis (Yuan et al., 1993, Cell, 75, 641-652). En efecto, la ICE presenta una homología de 28% con Ced-3, una proteína de C. elegans implicada en la apoptosis, y la sobreexpresión de la ICE murina en fibroblastos de rata desencadena la apoptosis (Miura et al., 1993, Cell, 75,653-660). Además, la expresión de la proteína crmA, una serpina viral inhibidora de la ICE, en neuronas ganglionarias de pollo transfectadas protege estas células de la muerte por apoptosis inducida por la supresión del factor de crecimiento (nerve growth factor) (Gagliardini et al., 1994, Science, 263, 826-828). Estas observaciones sugieren que la ICE u homólogas de esta proteína podrían estar implicadas en la regulación de la muerte celular programada observada principalmente en las enfermedades neuronales degenerativas tal como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson así como las isquemias cerebrales (Barinaga, M, Science, 259, 762, 1993).
La evidencia de nuevas proteínas emparentadas con la ICE que juegan un papel bien en la maduración de la IL-1\beta bien en la apoptosis puede contribuir al desarrollo de nuevos agentes terapéuticos o diagnósticos en situaciones en las que están implicadas la IL-1\beta o la apoptosis.
Una proteína similar a la enzima que convierte IL-1beta (ICE) está codificada por el gen Nedd2 de ratón (Kumar et al., Genes & Dev. 8:1613-1626, 1994).
Se han descrito cisteína-proteasas de la misma familia después la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente (Munday et al., J.Biol.Chem 270;15870-15876, número del 30 junio 1995).
La presente invención se refiere una nueva proteína humana Tx que presenta una homología de 52% aproximadamente con el precursor humano p45 de la ICE y que no permite la maduración del precursor de la IL-1\beta en citoquina activa. La proteína Tx posee dos funciones inesperadas: por una parte, es una proteasa y es capaz principalmente de romper el precursor p30 de la ICE en sub-unidades p10 y p20 y por otra parte, es capaz de inducir la apoptosis en células, por ejemplo en células Cos transfectadas.
Estas propiedades biológicas permiten prever la utilización de la proteína Tx en el tratamiento de situaciones patológicas que responden a la IL-1\beta o en las que interviene la apoptosis.
La presente invención se refiere también a una nueva proteína humana Ty que presenta una homología superior a 70% con la proteína Tx. La proteína Ty es capaz de inducir la apoptosis en células, por ejemplo células Cos transfectadas. La proteína Ty es una proteasa que es capaz de autoromperse de manera intermolecular.
La presente invención tiene por objetivo por lo tanto una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y que tiene la secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 1:
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así como una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que tiene la capacidad de inducir la apoptosis y que tiene la secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 1 anterior.
La invención tiene por objetivo particularmente una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene la secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 1 anterior.
La secuencia de ADN anterior que codifica una proteína que tiene 377 aminoácidos es una secuencia de ADNc que puede obtenerse por amplificación mediante PCR, a partir de ARN de monocitos activados por el LPS o de polinucleares o de placenta humanos, gracias a oligonucleótidos derivados de la secuencia de la ICE y de la secuencia de genes homólogos previamente identificados, según condiciones operatorias de la que se da una descripción detallada más adelante.
La evidencia de la actividad proteasa así como la de la capacidad para inducir la apoptosis se ilustran más adelante en la parte experimental.
La patente describe principalmente una secuencia de ADN que codifica un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis que tiene la secuencia que comienza en el nucleótido 42 y que termina en el nucleótido 1172 de la secuencia SEQ ID Nº 1 así como las secuencias de ADN que hibridan con esta y que tiene las misma función.
Por secuencias que hibridan, se incluyen las secuencias de ADN que hibridan bajo las condiciones de fuerte estringencia y que codifican un polipéptido que tiene la misma actividad. Las condiciones de estringencia comprenden por ejemplo una hibridación a 65ºC, durante 18 horas en una solución 5X SSPE; 10X Denhardt; 100 \mug/ml DNAss; 1% SDS seguida de 3 lavados durante 5 minutos con 2X SSC; 0,05% SDS, luego 3 lavados durante 15 minutos a 65ºC en 1X SSC; 0,1% SDS, según Maniatis et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
El conocimiento de la secuencia SEQ ID Nº 1 permite reproducir la presente invención por ejemplo mediante métodos conocidos de síntesis química o por cribado de un banco genómico o de un banco de ADNc con ayuda de sondas de oligonucleótidos de síntesis mediante las técnicas conocidas de hibridación.
La invención se refiere también a un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 2
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así como los alelos y los análogos de esta secuencia.
Por alelos y análogos, se incluyen las secuencias modificadas por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos aunque estos productos conserven la misma función.
La invención tiene por objetivo especialmente el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 2 y designada proteína Tx.
Uno de los aspectos de la invención se refiere igualmente a un polipéptido según la invención tal como se ha obtenido por la expresión en una célula huésped de un ADN codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 2.
Cuando el polipéptido de la invención se obtiene por expresión en una célula huésped, esta se realiza según los métodos conocidos de ingeniería genética y de cultivo celular.
La expresión puede realizarse en una célula procariota, por ejemplo E. coli o en una célula eucariota, por ejemplo una célula Cos que contiene la secuencia de ADN codificante del polipéptido de la invención precedida de una secuencia promotora conveniente.
La invención se refiere principalmente a un polipéptido según la invención tal como se ha obtenido por la expresión en una célula huésped eucariota.
La invención se refiere más especialmente a un polipéptido según la invención cuya actividad proteasa corresponde a la capacidad de madurar la enzima de conversión de la IL-1beta. Un ejemplo de determinación de esta actividad proteasa particular se describe más adelante.
La invención tiene también por objetivo un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis así como una célula huésped transformada por un vector anterior.
Los vectores de expresión son vectores conocidos que permiten la expresión de la proteína bajo el control de un promotor conveniente. Para las células procariotas, el promotor puede ser por ejemplo el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac, el promotor \beta-lactamasa o el promotor PL. Para las células de levadura, el promotor puede ser por ejemplo el promotor PGK o el promotor AD. Para las células de mamíferos, el promotor puede ser por ejemplo el promotor SV40 o los promotores de adenovirus. Vectores de tipo Baculovirus pueden utilizarse también para la expresión en células de insectos.
Las células huésped son por ejemplo células procariotas o de células eucariotas. Las células procariotas son por ejemplo E. coli, Bacillus o Streptomices. Las células huésped eucariotas comprenden levaduras así como células de organismos superiores, por ejemplo células de mamíferos o de células de insectos. Las células de mamíferos son por ejemplo fibroblastos tales como células CHO o BHK de hámster y de células Cos de mono. Las células de insectos son por ejemplo células SF9.
La invención se refiere a un procedimiento que comprende la expresión de la proteína Tx en una célula huésped transformada por un ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 2 y principalmente un procedimiento en el que la célula huésped es una célula eucariota.
La patente describe también anticuerpos dirigidos contra el polipéptido según la invención.
Los anticuerpos policlonales o monoclonales de la invención pueden prepararse según los métodos conocidos y pueden utilizarse por ejemplo para la valoración de la proteína Tx, por ejemplo en un ensayo ELISA y como agentes de diagnóstico.
La nueva proteína Tx de la invención tiene propiedades biológicas remarcables, en particular una actividad proteasa, principalmente la capacidad para madurar la enzima de conversión de la IL-1beta así como la capacidad para inducir la apoptosis, como muestran los resultados dados más adelante.
Estas propiedades biológicas hacen la proteína Tx de la invención utilizable por ejemplo en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en la cicatrización de llagas o en la reducción de efectos secundarios de los tratamientos por irradiación en los que la Il-1\beta está implicada o por ejemplo en el campo de cánceres y de la infección en las que interviene la apoptosis.
La presente invención tiene por lo tanto por objetivo, a título de medicamento, el polipéptido según la invención.
La invención se extiende a las composiciones farmacéuticas que contienen como principio activo un medicamento definido anteriormente y se refiere particularmente a las composiciones farmacéuticas para modular la producción de IL-1 beta o para modular la apoptosis.
El principio activo puede incorporarse a excipientes usuales para la preparación de composiciones farmacéuticas anteriores. Las composiciones pueden administrarse por vía parenteral, oral o local.
Los polipéptidos de la invención también permiten proyectar nuevos agentes terapéuticos constituidos por inhibidores de estos polipéptidos y su utilización como medicamento, por ejemplo en el tratamiento de la inflamación asociada a enfermedades autoinmunes, el choque séptico o las enfermedades neurodegenerativas.
La invención se refiere también a una secuencia de ADN hibridante con la secuencia de ADN que comienza en el nucleótido 42 y que se termina en el nucleótido 1172 de la secuencia SEQ ID Nº 1 y que tiene la misma función.
La hibridación se obtiene por ejemplo en un tampón 5xSSC, 10xDenhardt, 100 microg/ml ADN de esperma de salmón, 1% SDS durante una noche a 65ºC. Los lavados se efectúan a continuación por ejemplo en un tampón 1xSSC, 0,1% SDS, dos veces 30 mn a 60ºC.
La invención se refiere particularmente a la secuencia de ADN codificante de un polipéptido que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene la secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 22 y más particularmente la secuencia que comienza en el nucleótido 104 y que se termina en el nucleótido 1195 de la secuencia SEQ ID Nº 22.
La secuencia de ADN SEQ ID Nº 22 anterior, que codifica una proteína que tiene 364 aminoácidos, es una secuencia de ADNc que puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante PCR, a partir de ADNc de rata o de placenta humana, gracias a oligonucleótidos derivados de la secuencia ADNc Tx (SEQ ID Nº 1). Un ejemplo detallado de preparación se da más adelante en la parte experimental. El conocimiento de la secuencia SEQ ID Nº 22 permite reproducir la presente invención por ejemplo mediante métodos conocidos de síntesis química o de cribado de bancos genómicos o de bancos de ADNc con ayuda de sondas de oligonucleótidos de síntesis mediante las técnicas de hibridación.
La invención tiene igualmente por objetivo un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23 y designada proteína Ty.
Uno de los aspectos de la invención se refiere igualmente a un polipéptido según la invención tal como se ha obtenido por la expresión en una célula huésped de un ADN codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23.
La invención se refiere también a las células huésped, los vectores de expresión que permiten obtener la expresión de la proteína Ty y cuyos ejemplos se han indicados anteriormente para la expresión de la proteína Tx.
La invención se refiere también a un procedimiento que comprende la expresión de la proteína Ty en una célula huésped transformada por un ADN codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23.
La invención se refiere también a los anticuerpos policlonales o los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Ty.
La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que encierran la proteína Ty a título de medicamento.
Las figuras anexas ilustran ciertos aspectos de la invención:
La figura 1 representa la detección de secuencias homólogas a la ICE mediante Southern Blot en el ADN genómico humano derivado de PBMC digerido por las enzimas de restricción BglII (línea A); PstI (línea B); HindIII (línea C); BamHl (línea D). La detección se hace por hibridación con una sonda ICE exón 6 marcada con ^{32}P.
La figura 2 representa la secuencia nucleotídida del exón 6 del gen T2 (SEQ ID Nº 5).
La figura 3 representa la secuencia nucleotídida del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID Nº 2).
La figura 4 representa la detección de ARNm Tx por Northern Blot en los tejidos de la rata (línea A); del timo (línea B); de la próstata (línea C); de testículo (línea D); de ovario (línea E); del intestino delgado (línea F); de colon (línea G); de leucocitos periféricos (línea H). La detección se hace por hibridación con una sonda Tx exón 6'' marcada con ^{32}P.
La figura 5 representa la secreción de la IL-1\beta madura en las células Cos-1 que contienen constitutivamente el pIL-1\beta y transfectadas con el vector pcDL-SR\alpha296 que contiene ICE p45 (línea 2) o Tx (línea 3), el vector pcDL-SR\alpha296 solo (línea 4), el vector pcDNAI/Amp solo (línea 5), el vector pcDNAI/Amp que contiene Tx (línea 6) o ICE p30 (línea 7) comparativamente con un cultivo control sin ADN (línea 1). La IL-1\beta madura se mide en pg/ml de líquido sobrenadante celular por ELISA (A: incubación 16 horas; B : incubación 24 horas;
La figura 6 representa la ruptura del precursor ICE p30 en células Cos-1 transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 solo (línea A) o que contiene el mutante marcado T7-ICEp30C285S (línea B) o cotransfectadas con el vector pcDL-SR\alpha296 que contiene el mutante T7-ICEp30C285S y el vector que contiene ICE p30 (línea C) o ICE p45 (línea D) o Tx (línea E). La detección se hace por Western Blot con el anticuerpo anti-T7 con un control que corresponde a una transfección por el vector pcDL-SR\alpha296 que contiene Tx solo (línea F).
La figura 7 representa la inducción de la apoptosis por la proteína Tx en células Cos-1 transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 solo (7B) o que contiene Tx (7C) o ICE p45 (7D) comparativamente con un cultivo control sin ADN (7A) después de un cultivo de 22 horas (crecimiento x 400).
La figura 8 representa el ADN de las células Cos-1 transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 que contiene ICE p45 (línea B) o Tx (línea C) o por el vector solo (línea D) comparativamente con un cultivo control sin ADN (línea A). La detección se hace por coloración con BET después de migración sobre un gel de agarosa con marcadores de tamaño ADN de fago lambda digerido por HindIII (Ml) y ADN de fago \PhiX174 digerido por HindIII
(M2).
La figura 9 representa la ruptura de la proteína Ty mutada (T7TY\Delta67C245S) sin células Cos-1, bien transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 solo (línea B) o el vector pcDNAI/Amp solo (línea C) o el vector pT7TY\Delta67C245S (línea E), bien co-transfectadas por el vector pT7TY y el vector pT7TY\Delta67C245S (línea F; 23 horas y línea G; 43 horas). La detección se hace por Western Blot comparativamente con un cultivo control sin ADN (línea A) y marcadores de pesos moleculares (línea D; no detectables).
Los ejemplos siguientes ilustran la invención, sin limitarla.
Ejemplo 1 Identificación de la secuencia Tx A - Evidencia de genes homólogos a ICE humano
Se han identificado genes homólogos a ICE mediante Southern Blot al utilizar una sonda de ADN que corresponde al exón 6 del gen de ICE.
a) Preparación de la sonda ICE exón 6
Se han descrito los límites del exón 6 de ICE humano así como la organización intrón/exón completa del gen ICE humano (Cerretti et al. ya citado). El exón 6 (235 pb) corresponde a los nucleótidos 635 a 868 de la secuencia ADNc p45 de la ICE descrita (Thornberry et al. ya citado).
La sonda ICE exón 6 se preparó por amplificación por PCR con los oligonucleótidos siguientes:
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que se eligieron al utilizar los datos publicados (Thornberry et al. ya citado), sintetizados y utilizados para amplificar por RT-PCR el ARN que proviene de monocitos sanguíneos humanos, extraído y purificado con ayuda de un kit RNA™ (Bioprobe), al utilizar las condiciones de amplificación siguientes: enzima Biotaq (BioProbe); 30 ciclos (94ºC, 1 mn; 60ºC, 1 C 72ºC, lmn); Aparato PCR: Perkin-Elmer (GeneAmp PCRSystem 9600).
El ADN exón 6 obtenido se purificó por centrifugación sobre columna Spin X (Costar) y se marcó con ^{32}P mediante la técnica de cebado aleatorio ("random priming") por medio de un kit oligolabelling (Pharmacia Biotech).
b) Hibridación con ADN genómico: Southern Blot
La sonda ICE exón 6 radiomarcada obtenida se utilizó como sonda de hibridación sobre un ADN genómico humano.
El ADN genómico humano se preparó a partir de células mononucléicas de sangre periférica (PBMC) con el kit TurboGen (Invitrogen) luego se cortó respectivamente con las enzimas de restricción BglII, PstI, HindIII o BamHI (Boehringer Mannheim), se migró sobre un gel de agarosa 0,9% en 1x TAE, se transfirió sobre una membrana de nylon GeneScreen Plus (NEN Dupont) luego se hibridó con la sonda ICE exón 6.
Las condiciones de hibridación son las descritas por Maniatis et al. (ya citado) realizadas en 5x SSPE, 10x Denhart, 100 \mug/ml DNAss, 1% SDS, una noche a 65ºC seguido de lavados realizados sucesivamente en 2x SSC, 0,05% SDS, 30 mn a temperatura ambiente luego 1x SSC, 0,1% SDS, 30 mn a 65ºC, lo que corresponde a una fuerte estringencia. El tampón de lavado se preparó a partir de soluciones almacenadas siguientes
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20x SSC: solución acuosa de cloruro de sodio 3M, citrato de sodio 0,3 M
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10% SDS: solución acuosa de dodecil-sulfato de sodio, Después de lavar, la membrana se expuso con una película Hyperfilm-MP (Amersham).
Como lo muestra la figura 1, para cada una de las enzimas de restricción se observaron tres a cuatro bandas diferentes que correspondían a fragmentos de ADN de tamaño diferente que aparentemente, para algunos de ellos, correspondían a genes fuertemente homólogos a la ICE pero diferentes de este último ya que un gen único no puede dar más que uno o como máximo dos bandas distintas durante una hibridación con una sonda correspondiente a un solo exón.
B - Clonage de genes homólogos a la ICE a) Clonage de secuencias genómicas homólogas a la ICE
Para identificar los diferentes fragmentos de ADN obtenidos anteriormente, los fragmentos del ADN genómico humano extraído de células mononucléicas de sangre periférica (PBMC) luego digerido por la enzima HindIII (Boehringer Mannheim) se prepararon por electroforesis preparativa en gel de agarosa 1,5%, 1x TAE, según las condiciones descritas por Maniatis et al. (ya citado). El gel se cortó en 20 fracciones en la zona correspondiente a pesos moleculares inferiores a 2,3kb luego se efectuó una amplificación por PCR sobre el ADN eluido de cada una de las fracciones con ayuda de oligonucleótidos ICE 6.5 (SEQ ID Nº 3) e ICE 6.3 (SEQ ID Nº 4) descritos anteriormente, al utilizar las condiciones de amplificación siguientes: 94ºC, 1 mn; 55ºC, 1 mn; 72ºC, 1 mn; 30 ciclos; polimerasa BioTaq.
Entre las 20 fracciones anteriores, se retuvieron ocho fracciones que dieron la mejor amplificación por PCR. El material amplificado se clonó gracias a la enzima T4-DNA ligasa en el vector pCRII según las instrucciones del proveedor con el kit TA Cloning (Invitrogen) y secuencia mediante la técnica de Sanger con la enzima Sequenasa al utilizar el material de electroforesis Macrophor (Pharmacia System). Las secuencias determinadas se analizaron por medio de programas informáticos GCG (Devereux et al. Nucleic Acids Research 12, 387-395 (1984)).
Entre las secuencias nucleotídida obtenidas, identificamos una secuencia denominada T2 que presentaba 92% de identidad en nucleótidos con la secuencia del exón 6 de ICE.
La secuencia nucleotídida T2 presentaba una fase de lectura abierta sobre el conjunto del exón 6 (SEQ ID Nº 5) representado en la figura 2, que conducía a buscar a identificar ARN mensajeros que codifican una proteína T2 y a clonar el ADNc correspondiente a T2.
b) Clonage de ADNc homólogo a la ICE
Los ARN totales se extrajeron y purificaron con ayuda de un kit RNA™ (Bioprobe) a partir, bien de monocitos activados por LPS durante 18 horas, bien de placenta, bien de polinucleares aislados de sangre periférica. Cada ADNc correspondiente se sintetizó con ayuda de un oligonucleótido poli-dT y de la enzima transcriptasa reversa al utilizar el Kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer) según las instrucciones del proveedor luego se amplificó por PCR al utilizar los dos oligonucleótidos siguientes:
7
elegido en la secuencia codificante del exón 6 de T2, de manera a amplificar específicamente una secuencia de tipo T2 pero no una secuencia ICE, y
8
elegido en el extremo 3' de la región codificante del ADNc de ICE (hebra complementaria).
Se obtuvo aproximadamente un fragmento de 600 pares de bases respectivamente a partir de cada una de las 3 preparaciones de ARN al utilizar las condiciones de amplificación siguientes: 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 30 s; 30 ciclos con el Kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer). Se clonó el fragmento al utilizar el kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenció como se ha indicado anteriormente. La secuencia nucleotídica así determinada no corresponde a un ADNc T2 esperado sino a un nuevo ADNc que hemos denominado Tx.
C - Identificación del ADNc Tx a) Determinación de la secuencia consensus del ADNc Tx
Las secuencias nucleotídicas de los extremos 5' y 3' del ADNc de Tx se obtuvieron mediante la técnica PCR anclada a partir de un ADNc de placenta.
El extremo 5' del ADNc de Tx se amplificó utilizando el kit 5'-Race-Ready cDNA (Human Quick-Clone cDNA) (Clontech) y los oligonucleótidos de amplificación siguientes:
9
El extremo 3' del ADNc Tx se amplificó al utilizar el kit 3' RACE System (Gibco-BRL), y los oligonucleótidos de amplificación siguientes:
10
Estos dos pares de iniciadores respectivos se definieron a partir de la secuencia parcial de Tx obtenida anteriormente.
Los fragmentos de amplificación obtenidos se clonaron luego al utilizar el kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenciaron como se ha indicado anteriormente.
Las secuencias nucleotídicas se confirmaron gracias a la utilización de oligonucleótidos TxA (SEQ ID Nº 10) y TxB (SEQ ID Nº 11) anteriores y los oligonucleótidos siguientes:
11
que se eligieron en la secuencia codificante de Tx (hebra codificante o hebra complementaria).
La compilación del conjunto de las secuencias obtenidas da la secuencia nucleotídica consensus del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) representada en la figura 3. La secuencia así determinada comprende 1291 nucleótidos que terminan por una secuencia de poliadenilación. Presenta una fase de lectura abierta que comienza por una metionina iniciadora en el nucleótido 42 y que termina por un codón de terminación en el nucleótido 1172. Resulta una fase de lectura abierta de 1131 nucleótidos codificante de una proteína de 377 aminoácidos.
b - Clonage de la región codificante del ADNc Tx
La región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) se amplificó por RT-PCR a partir de ARN total bien de monocitos, bien de polinucleares o bien de placenta al utilizar los oligonucleótidos siguientes:
100
Estos iniciadores de amplificación se eligieron según la secuencia consensus ADNc Tx determinada precedentemente (o la hebra complementaria) y sintetizados al añadir sitios de clonage respectivamente BamHl y Nco1 para el oligonucleótido TxP5 y Xba1 y Xhol para el oligonucleótido TxP3.
El producto amplificado obtenido que tenía una longitud de aproximadamente 1150 pares de bases fue digerido por las enzimas BamHl y Xbal (Boehringer Mannheim) y clonó, al utilizar el kit de ligación Amersham, en el vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) previamente digerido por las mismas enzimas de restricción BamH1 y Xba1. El producto clonado fue enteramente secuenciado sobre las dos hebras, por medio de los oligonucleótidos TxA, TxB, TxC, TxD, Tx1, Tx2, Tx3, Tx4, Tx5 y Tx6 anteriores.
Para cada ARN de partida utilizado, la secuencia nucleotídica obtenida fue idéntica a la secuencia codificante de la secuencia consensus ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) anterior. No se observó por lo tanto diferencia a partir de diferentes tejidos utilizados que provenían de individuos diferentes.
La región codificante del ADNc Tx codificó la proteína Tx cuya la secuencia deducida en aminoácidos (SEQ ID Nº 2) se muestra en la figura 3. La secuencia de la proteína Tx comprende 377 aminoácidos que tienen un peso molecular calculado de 43,26 kDa.
La homología de la secuencia de la proteína Tx con el precursor ICE p45 es como máximo de 52% de identidad en aminoácidos al introducir discontinuidades en la alineación de las secuencias.
Una muestra de E. coli XL-1 azul que contenía la región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) en el vector pcDNAI/Amp (cDNA Tx/pcDNAI 13/07/94) se depositó en la CNCM el 29 julio 1994 bajo el número I-1462.
c - Expresión del ARNm de Tx en diferentes tejidos humanos
Se ha estudiado la expresión del ARNm codificante de la proteína Tx en ocho tejidos diferentes por Northern Blot al utilizar una sonda de ADN correspondiente a la parte de Tx que se alinea con el exón 6 de la ICE ("Tx exón 6"). Esta sonda corresponde a los nucleótidos 595 a 811 de la secuencia SEQ ID Nº 1.
La sonda "Tx exón 6" se preparó al amplificar esta secuencia a partir del plásmido que contenía el ADNc Tx al utilizar como iniciadores los oligonucleótidos T2.A (SEQ ID Nº 6) y TxC (SEQ ID Nº 12) anteriores.
Esta sonda se marcó con ^{32}P mediante el método de cebado aleatorio "random priming" con el kit Oligolabelling (Pharmacia BioTech) luego se utilizó para detectar por hibridación ARNm Tx sobre una membrana que contenía 2 \mug de ARN poliA+ respectivamente de diferentes tejidos humanos sobre una membrana Multiple Tissue Northern Blot II (Clontech) según las condiciones de hibridación dadas por el proveedor.
Como lo muestra la figura 4, se detectó una señal de ARNm en la mayoría de los tejidos ensayados con intensidades variables. Los leucocitos de la sangre periférica (H) dan la señal más fuerte. La rata (A), el intestino delgado (F), el timo (B) y el ovario (E) dan señales intermedias. La próstata (C) y el colon (G) dan una señal muy débil y finalmente no se detectó ninguna señal en el ARNm de testículo (D).
El ARNm que codifica la proteína Tx se expresa por lo tanto en numerosos tejidos y más particularmente en las células sanguíneas.
Ejemplo 2 Estudio de la función de la proteína Tx A - Ruptura de la pre-IL-1\beta
La capacidad de la proteína Tx para romper eventualmente el precursor de IL-1\beta humaine se ensayó en un sistema de transfección en células eucariotas con uno u otro de los vectores de expresión pcDNAI/Amp y pcDL-SR\alpha296.
La región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) se clonó primero en los sitios BamHl y Xbal del vector de expresión eucariota pcDNAI/Amp (Invitrogen). Después de digestión con las enzimas BamHl y Xbal, se aisló un inserto de 1150 pares de bases aproximadamente y luego se purificó. Los sitios de restricción de los extremos se rellenaron con ayuda de la T4 DNA Polimerasa (Boehringer Mannheim). El ADNc obtenido se subclonó con ayuda de un kit de ligación (Amersham) en el vector pcDL-SR\alpha296 (Takebe et al., Molecular and Cellular Biology, Vol 8, 466, 1988) abierto por la enzima Xbal luego cuyos extremos se rellenaron con la T4 DNA Polimerasa. Después de purificación al utilizar el kit plasmid maxi (QIAGEN), se obtuvieron preparaciones de ADN plasmídico Tx en los dos vectores.
Las células eucariotas utilizadas para la transfección son una línea celular Cos-1 que expresa constitutivamente la pIL-1\beta y que se ha obtenido por transfección de un plásmido que contenía el gen de la pIL-1\beta humana. La síntesis de pIL-1\beta se mantuvo en esta línea al cultivar las células en presencia de 0,5 mg/ml de sulfato de G-418 en el medio de cultivo DMEM, SVF 10%, glutamina, P/S, piruvato, HEPES.
Se incubaron 3x10^{6} células Cos-1 a 37ºC en atmósfera húmeda a 5% de CO_{2} en la cajas Petri y se transfectaron con 15 \mug de ADN plasmídico previamente mezclado con 200 \mul de DEAE-Dextran y diluido con 4 ml de PBS antes de ser añadido a las cajas. Después de incubación de las células a 37ºC durante 30 minutos y adición de 8 ml de una solución de cloroquina 80 \muM en DMEM sin suero, las células se incubaron durante 2,5 horas. La solución sobrenadante se aspiró luego y las células se trataron durante dos minutos con DMSO a 10% en DMEM sin suero. Después de lavar con el medio sin suero, se añadieron 10 ml de medio de cultivo completo anterior. Después de incubación, el líquido sobrenadante de las células transfectadas se recogió a diferentes tiempos comprendidos entre 16 y 45
horas.
El IL-1\beta maduro presente en los líquidos sobrenadantes se midió mediante un ensayo ELISA IL1-\beta (R&D Systems) que permitió la detección específica del IL-1\beta maduro.
La transfección se realizó con la región codificante del ADNc Tx insertado en uno u otro de los dos vectores anteriores en comparación con transfecciones que comprenden respectivamente la región codificante del ADNc de ICE p45 o de ICE p30 así como una transfección testigo con el vector solo correspondiente que no contenía plásmido.
Como lo muestra el testigo 5, la transfección del ADNc de la ICE p45 (columna 2) o p30 (columna 7) confirió a las células la capacidad de secretar IL-1\beta maduro. Por el contrario, cuando el ADNc Tx es transfectado en las mismas condiciones (columnas 3 y 6), no se observó IL-1\beta secretada como para las transfecciones controles (columnas 1, 4, 5). Se obtuvieron resultados similares con los dos vectores de expresión cualquiera que fuera el tiempo de incubación (16 h: fig. 5A; 24 h: fig. 5B; 29 h y hasta 44 h) después de la transfección.
La proteína Tx no posee la propiedad de convertasa del IL-1\beta.
B - Actividad proteasa de la proteína Tx: ruptura del precursor 30 kDa de ICE
La capacidad de la proteína Tx para romper eventualmente el precursor 30 kDa de la ICE (ICE p30) se ensayó en un sistema de co-transfección en células eucariotas al introducir simultáneamente en células Cos-l un vecteur que contenía la región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) y un vector que contenía un ADN codificante de una proteína ICE modificada, insertándose cada ADN respectivamente en el vector de expresión pcDL-SR\alpha296 anterior.
La proteína ICE se modificó doblemente: Por una parte, para permitir una detección específica de la proteína ICE en presencia de la proteína Tx, se fusionó un pequeño péptido T7 en el extremo N terminal de la proteína ICE p30. La proteína así marcada o sus productos de maduración se detecta mediante Western Blotting con un anticuerpo monoclonal específico del péptido T7 (Tsai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 8864, 1992). Por otra parte para expresar la enzima en una forma incapaz de inducir su propia maduración, se utilizó un mutante de la ICE p30, cuya cisteína Cys 285 del sitio activo se reemplazó por una serina (Wilson, K.P. et al. Nature, 370, 28 July 1994, 270-275). Esta enzima es entonces inactiva e incapaz de inducir su propia maduración o de romper la pIL-1\beta. El mutante se preparó por mutagénesis con ayuda de oligonucleótidos apropiados y del kit de mutagénesis Transformer™ site-directed mutagénesis kit (Clontech). La secuencia obtenida se verificó enteramente. Se obtuvo así la ICE p30 marcada y mutada designada T7-ICEp30C285S.
Las células Cos-1 se transfectaron bien por el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía T7-ICEp30C285S, bien por el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía Tx o co-transfectaron por los dos vectores, siguiendo las condiciones operatorias anteriores. Después de 22 horas de cultivo, las células se recogieron, se lavaron y se lisaron en un tampón NaCl 10mM, Hepes 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaF 50-mM, Triton X-100 0,2%, leupeptina 1 \mug/ml, aprotinina 20 u/\mul y PMSF 1 mM. El lisado celular se centrifugó a 400 g y 4ºC luego el líquido sobrenadante se sometió a una electroforesis sobre un gel con 16% de poliacrilamida en SDS-PAGE. Las proteínas del gel se transfirieron luego sobre una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-T7 (Novagen) durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavó luego se incubó 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo de cabra anti-immunoglobulina de ratón conjugado a la fosfatasa alcalina. Los anticuerpos fijados a la membrana se revelaron luego por el sustrato de la fosfatasa alcalina (Promega).
Se realizaron co-transfecciones de la misma manera con el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía T7-ICEp30C285S y el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía bien ICE p30, bien ICE p45 en lugar de Tx.
Como lo muestra la figura 6, cuando la proteína ICE p30 mutada (T7-ICEp30C285S) se expresó sola en las células Cos transfectadas, la forma T7-p30 de la enzima (PM aparente 35 kDa) puede detectarse (línea B).
La ausencia de banda correspondiente a la forma p20 mostró que la enzima mutada es incapaz de romperse. Cuando las células se co-transfectaron con el vector que contenía la enzima ICE p30 (línea C) o p45 (línea D), se observó una banda a un PM aparente de 26 kDa correspondiente al producto de ruptura T7-p20 por la enzima activa. Cuando las células se co-transfectaron con el vector que contenía Tx (línea E), se observó igualmente la aparición de una banda mayoritaria con un PM aparente de 26 kDa acompañado de dos bandas menores a aproximadamente 31 kDa y 28 kDa. Las diferentes bandas correspondían a los productos de ruptura de la forma p30 de la ICE por la proteína Tx expresada en las células.
Estos resultados mostraron que la proteína Tx, se expresa por una parte en las células Cos tranfectadas, por otra parte posee una actividad proteasa. Además, la proteína Tx es capaz de romper el precursor 30 kDa de la ICE y puede así contribuir a la maduración in vivo de la pro-enzima de la ICE y a la generación de la enzima en forma
activa.
C - Inducción de la apoptosis por la proteína Tx
La capacidad de la proteína Tx a inducir la apoptosis se ensayó por transfección en células Cos y por examen morfológico de las células cultivadas.
Se ha descrito la transfección de la ICE en diferentes tipos celulares que conllevan la muerte de estas células por apoptosis (Miura et al. ya citado).
Se realizó la transfección de células Cos-1 por el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía la región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) así como la transfección con el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía ICE p45 como se ha descrito anteriormente. La morfología de las células se observó después de una incubación de 22 horas.
Como muestra la figura 7, se observó la aparición de células redondas que se desprendían del soporte y cuyo aspecto morfológico es característico de células en apoptosis en los cultivos de células Cos transfectadas con el ADNc de la ICE (7D). El mismo cambio de morfología se observó en los cultivos de células Cos transfectadas con el ADNc Tx (7C).
Se obtuvieron resultados morfológicos idénticos cuando se utilizó el vector pcDNAI/Amp anterior para expresar ICE y Tx en las células Cos-1 transfectadas.
Estos resultados se han confirmado por la observación del ADN aislado a partir de células Cos-1 transfectadas e incubadas 40 horas después de la transfección. El ADN de las células se preparó con el kit microTurboGen (Invitrogen), migrado sobre gel de agarosa 1,5% y se coloreó con BET.
Como muestra la figura 8, el ADN de las células transfectadas por ICE p45 (línea B) y por Tx (línea C) presenta el aspecto característico "en escalera" de células en apoptosis.
Células transfectadas sin ADN (7A y 8A) o con el vector que no contenía ADNc (7B y 8D) no presenta ni la morfología ni el ADN de células en apoptosis.
Estos resultados muestran que la proteína Tx está implicada en la inducción de la apoptosis.
Ejemplo 3 Identificación de la secuencia Ty A - Clonage de genes homólogos a Tx
El ADN genómico humano extraído de células mononucleares de sangre periférica fue digerido por el enzima Hind III (Boehringer Mannheim), luego los fragmentos se separaron por electroforesis preparativa en gel de agarosa 1%, TAE 1x, según las condiciones descritas por Maniatis et al., ya citado. El gel se cortó en 24 fracciones en la zona de los pozos de depósito que correspondía a pesos moleculares superiores a 1,9kb luego se efectuó una amplificación por PCR sobre el ADN eluido de cada una de las fracciones con ayuda de oligonucleótidos T2A (SEQ ID Nº 6) e TxC (SEQ ID Nº 12) ya descritos y al utilizar las condiciones de amplificación siguientes: 94ºC, 30 sec; 55ºC, 30 sec; 72ºC, 1 mn; 30 ciclos; polimerasa BioTaq (BioProbe).
Entre las 24 fracciones anteriores, se retuvieron 10 fracciones que dieron la mejor amplificación por PCR. El material amplificado se purificó sobre gel de agarosa y se clonó en el vector pCRII con el kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenció por la técnica de Sanger con la enzima Sequenasa (Version 2.0 DNA Sequencing Kit) al utilizar el sistema de electroforesis Macrophor (Pharmacia System). Las secuencias determinadas se analizaron por medio de programas informáticos GCG como se indica en el ejemplo 1.
Hemos identificado una secuencia nucleotídica denominada Ty que presenta 94,9% de identidad en nucleótidos con la secuencia ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) y que conduce a buscar a clonar el ADNc correspondiente a Ty.
B - Clonage e identificación del ADNc Ty a) Determinación de la secuencia consensus del ADNc Ty
Las secuencias nucleotídicas de los extremos 5' y 3' del ADNc de Ty se obtuvieron respectivamente a partir de ADNc de rata y de placenta humana mediante la técnica PCR anclada.
El extremo 3' del ADNc de Ty se amplificó al utilizar el kit 3' RACE System (Gibco-BRL), y los oligonucleótidos de amplificación siguientes:
13
Estos dos iniciadores se definieron a partir de la secuencia parcial del exón 6 de la secuencia Ty obtenida anteriormente.6 Los fragmentos amplificados se purificaron sobre gel de agarosa, se clonaron en el vector pCRII y se secuenciaron como se ha indicado anteriormente. La compilación de las secuencias obtenidas ha permitido definir la parte 3' de la región codificante del ADNc Ty así como la región 3' no codificante.
El extremo 5' del ADNc de Ty se amplificó al utilizar el kit Human Spleen 5'-RACE-Ready cDNA (Clontech) y los oligonucleótidos de amplificación siguientes:
15
Estos dos iniciadores se definieron a partir de la secuencia de la región 3' del ADNc Ty obtenida anteriormente al añadir sitios de restricción Xbal y Xhol para Ty5A1. Los fragmentos de amplificación se clonaron luego al utilizar el kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenciaron como se ha indicado anteriormente.
Las secuencias nucleotídicas se confirmaron al utilizar oligonucleótidos Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) y Ty 3.1 (SEQ ID Nº 25) anteriores y los oligonucleótidos siguientes:
17
Estos oligonucleótidos se eligieron en la secuencia codificante de Ty (hebra codificante o hebra complementaria).
La compilación del conjunto de las secuencias obtenidas da la secuencia nucleotídica consensus del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22).
b - Clonage de la región codificante del ADNc Ty
La región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) fue amplificada por PCR a partir del ADNc de rata o de placenta humano al utilizar los kits correspondientes 5'-RACE-Ready cDNA (Clontech), el oligonucleótido Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) anterior y el oligonucleótido siguiente:
19
Estos iniciadores de amplificación se eligieron según la secuencia consensus del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) determinada anterior al añadir el sitio de clonage BamHl para TyP5.
El producto amplificado y purificado sobre gel de agarosa que tenía una longitud de aproximadamente 1100 pares de bases fue digerido por las enzimas de restricción BamHl y Xba1 luego se clonó en el vector pcDNAI/Amp como se ha descrito en el ejemplo 1 y se secuenció como se ha indicado anteriormente. El producto clonado se secuenció enteramente sobre las dos hebras con ayuda de los oligonucleótidos SEQ ID Nº 28 a SEQ ID Nº 38 definidos anteriormente.
Se obtuvo una secuencia idéntica a la secuencia codificante de la secuencia consensus ADNc Ty (SEQ ID Nº 22). La homología de la secuencia codificante del ADNc Ty con la secuencia codificante del ADNc Tx obtenido en el ejemplo 1 es de 84% de identidad en nucleótidos.
La región codificante del ADNc Ty codifica la proteína Ty teniendo la secuencia deducida en aminoácidos SEQ ID Nº 23. La secuencia de la proteína comprende 364 aminoácidos que tienen un peso molecular calculado de
41,8 kDa.
La homología de secuencia de la proteína Ty con la proteína Tx obtenida en el ejemplo 1 es de 75% de identidad en aminoácidos.
Una muestra de E. coli XL-1 azul que contiene la región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) en el vector pcDNAI/Amp (cDNA Ty/pcDNAI /Amp 30/6/95) se depositó en la CNCM el 5 julio 1995 bajo el nºI-1068.
Ejemplo 4 Actividades biológicas de la proteína Ty A - Inducción de la apoptosis
La capacidad de la proteína Ty para inducir la apoptosis se ensayó según el modo operatorio indicado en el ejemplo 2, con ayuda de células Cos-1 transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía la región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) denominado pcDL-TY, y cuya preparación se realizó siguiendo las condiciones descritas en el ejemplo 2 para el sub-clonage del ADNc Tx.
La morfología de las células se observó después de la incubación de 23 horas y de 43 horas y la observación del ADN aislado se efectuó después de incubación de 43 horas.
Los resultados, obtenidos comparativamente con células transfectadas por el vector que contenía la región codificante de Tx o de ICE p45, son idénticas a los mostrados para la proteína Tx en la figura 7 y en la figura 8 del ejemplo 2.
Estos resultados muestran que la proteína Ty como la proteína Tx está implicada en la inducción de la apoptosis.
B - Actividad proteasa de la proteína Ty
La capacidad de la proteína Ty para autoromperse de manera intermolecular se ensayó en un sistema de co-transfección en las células eucariotas, en condiciones análogas a las descritas para la ruptura del precursor de la ICE para la proteína Tx del ejemplo 2, al introducir simultáneamente en células Cos-1 un vector que contenía la región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) y un vector que contenía un ADN codificante de una proteína Ty modificada, estando cada ADN insertado respectivamente en el vector de expresión pcDL-SR\alpha296 y en el vector pcDNAI/Amp descritos en el ejemplo 2.
La proteína Ty se modificó doblemente, por una parte el codón Cys 245 fue mutado en un codón Serina por el método de PCR "cavalgante", por otra parte el epítope tag T7 (MASMTGGQQMG) se introdujo en el extremo N-terminal del fragmento de Ty correspondiente a los residuos 68 a 364 de la secuencia SEQ ID Nº 23.
Los pares de iniciadores siguientes se utilizaron para amplificar la matriz ADNc Ty:
a) por una parte,
T7TY:
CGCGGATCCACCATGGCTTCTATGACAGGAGGTCAACAAATGGGACAAAAGAT
CACCAGTG TAAAACC (SEQ ID Nº 40) 
\newpage
elegida en la secuencia codificante de Ty y sintetizada al añadir un sitio de restricción BamH1 seguido de la secuencia nucleotídica codificante del tag T7 y
TYC245SR:
ATGTTTTTCACCTCTGGAGGCCTGGACAATGATGAC (SEQ ID Nº 41)
elegida en la secuencia codificante de Ty (hebra complementaria) con una mutación C -> G en posición 17,
b) por otra parte,
TYC245S:
GTCATCATTGTCCAGGCCTCCAGAGGTGAAAAACAT (SEQ ID Nº 42)
elegida en la secuencia codificante de Ty con una mutación
G -> C en posición 20 y
Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) anterior,
y al utilizar las condiciones de amplificación siguientes: 94ºC, 1 mn; 60ºC, 1 C 72ºC, 1 mn; 30 ciclos; polimerasa Vent (Biolabs).
Los dos productos de amplificación obtenidos respectivamente se combinaron y amplificaron por PCR al utilizar los iniciadores T7Ty y Ty5Al y las condiciones anteriores.
El producto de amplificación fue digerido con las enzimas de restricción BamHl y Xbal luego clonado en el vector pcDNAI/Amp digerido previamente por las mismas enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pT7TY\Delta67C245S. La secuencia obtenida se verificó enteramente por secuenciación de ADN.
El vector de expresión pcDL-SR\alpha296 en el que se sub-clonó la secuencia de ADNC Ty (SEQ ID Nº 22), denominado plásmido pcDL-TY, se preparó como se ha indicado anteriormente.
Las células Cos-1 fueron transfectadas por el vector pT7TY\Delta67C245S, bien co-transfectadas con este plásmido y el plásmido pcDL-TY luego cultivadas durante 23 horas o 43 horas, lisadas y analizadas por electroforesis sobre gel de poliacrilamida y Western blot al utilizar el anticuerpo monoclonal anti-T7 de ratón, según las condiciones operatorias descritas en el ejemplo 2, pero en las que el anticuerpo de cabra anti-inmunoglobina de ratón está conjugado con la peroxidasa de rábano en vez de fosfatasa alcalina. Los anticuerpos ligados a la membrana se revelaron luego con el sistema de detección Western ECL (Amersham) mediante autoradiografía.
Se realizaron co-transfecciones de la misma manera con el vector pcDL-SR\alpha296 solo y el vector pcDNAI/Amp solo y las células se cultivaron durante 23 horas.
Como muestra la figura 9, cuando la proteína Ty mutada se expresa sola en las células Cos transfectadas, se puede detectar la forma T7Ty (PM aparente aproximadamente 30 kDa) (línea E). La ausencia de banda de PM inferior muestra que la proteína Ty mutada es incapaz de autoromperse. Cuando las células fueron co-transfectadas con el vector que contiene Ty (líneas F y G), se observó la aparición de una banda mayoritaria con un PM aparente de 20 kDa correspondiente al producto de ruptura de la proteína Ty mutada por la proteína Ty.
Estos resultados muestran que la proteína Ty por una parte se expresa en las células Cos transfectadas, por otra parte posee una actividad proteasa y que en particular es capaz de romperse de manera intermolecular.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
DEPOSITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: ROUSSEL UCLAF
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 102, Route de Noisy
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ROMAINVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 93230
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 49.91.49.91
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 49.91.46.10
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de ADN codificante de una proteína humana Tx emparentada con la enzima de conversión de la interleuquina-1beta, proteína Tx, procedimiento de producción, composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) + Correcciones bajo WORDPERFECT 5.1 para SEQ ID NO 22 (ix)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE LA SOLICITUD: FR 9409567
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPOSITO: 02-AGOSTO-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:42..1172
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
20
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 377 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cm
Bull, Herbert G. 
\hskip4.7cm
Calaycay, Jimmy R. 
\hskip4.7cm
Chapman, Kevin T. 
\hskip4.7cm
Howard, Andrew D. 
\hskip4.7cm
Kostura, Matthew J. 
\hskip4.7cm
Miller, Douglas K. 
\hskip4.7cm
Molineaux, Susan M. 
\hskip4.7cm
Weidner, Jeffrey R. 
\hskip4.7cm
Aunins, John 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodimérica para interleuquina-1beta que procesa en monocitos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.500000\baselineskip
(K)
RESIDUOS PERTINENTES EN LA SEQ ID NO: 3: DEL 1 HASTA 20
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACATGACTAC AGAGCTGGAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..20)
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cm
Bull, Herbert G. 
\hskip4.7cm
Calaycay, Jimmy R. 
\hskip4.7cm
Chapman, Kevin T. 
\hskip4.7cm
Howard, Andrew D. 
\hskip4.7cm
Kostura, Matthew J. 
\hskip4.7cm
Miller, Douglas K. 
\hskip4.7cm
Molineaux, Susan M. 
\hskip4.7cm
Weidner, Jeffrey R. 
\hskip4.7cm
Aunins, John 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodiméricas para interleuquina-1beta que procesa en monocitos-1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCACGGCA GGCCTGGATG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 235 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 5 DE 8 A 30"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACAGAGCT GGAGGCATTT GCT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..24)
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cm
Bull, Herbert G. 
\hskip4.7cm
Calaycay, Jimmy R. 
\hskip4.7cm
Chapman, Kevin T. 
\hskip4.7cm
Howard, Andrew D. 
\hskip4.7cm
Kostura, Matthew J. 
\hskip4.7cm
Miller, Douglas K. 
\hskip4.7cm
Molineaux, Susan M. 
\hskip4.7cm
Weidner, Jeffrey R. 
\hskip4.7cm
Aunins, John 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodiméricas para interleuquina-1beta que procesa en monocitos-1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAATGTCCT GGGAAGAGGT AGAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..21)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 753 A 773"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..21)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 829 A 849"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTGACCCA CAGTTCCCCA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 695 A 711"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACTGTGCAT GATGAGA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 905 A 913"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:11..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 915 A 923"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGATGCTGTG TACAAGACC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 795 A 811"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTGGACAA TGATGAC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 995 A 1011"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGATGAAGAT AGAGCCC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 204 A 220"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGTCATGG CAGACTC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/noa= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 249 A 265"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTTGAAGAA GCATTTG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARATERISTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CODIGOmisc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 330 A 346"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGAGTCAG GAGAATC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 375 A 391"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTCTCAGGA ATTCTTC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 503 A 519"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTGACTTT GACATCA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 587 A 603"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTGACTC CATATCC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:13..33
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 42 A 62"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA CCATGGCAGA AGGCAACCAC AGA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (19..39)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 1155 A 1175"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTCTAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1310 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:104..1195
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 364 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 685 A 703"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGTCTCAT GGCATCCTA 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 712 A 731"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCGGAACT GCGCATAAAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (16..35)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 1229 A 1248"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTCTAGAC TCGAGGTGCT CTTTGATGTT GACAG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..20)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 939 A 958"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCTCCTCG TGGATCTTGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 124 A 139"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGATGTTCTT CATGGT 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 290 A 306"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCTCAATA TGGACCA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 472 A 488"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGGCTCTC ATCATAT 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 634 A 651"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTTGCTGCC AGACCAGA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 833 A 851"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTGCAGAG GTGAAAAAC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 1020 A 1038"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTCCATCTT CATTACGGA 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 1094 A 1110"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTTCTGTA CCTTCCG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..16)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 715 A 730"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTATGCGCA GTTCCG 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..18)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 521 A 538"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCATAGTGA GCCCCATT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 385 A 401"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCACGAGG ACAAAGT 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 237 A 253"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGCAAAGAG TCTACCA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:10..33
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 101 A 124"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA AGATGTTGGA ATACCTGGGC AAA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:46..68
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 305 A 327"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA CCATGGCTTC TATGACAGGA GGTCAACAAA TGGGACAAAA GATCACCAGT 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAAAACC 
\hfill
68 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (1..16)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 838 A 853"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:complemento (18..36)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 818 A 836"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGTTTTTCA CCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 818 A 836"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO:21..36
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 838 A 853"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCATCATTG TCCAGGCCTC CAGAGGTGAA AAACAT 
\hfill
36

Claims (12)

1. Secuencia de ADN codificante de un polipéptido que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que consiste en la secuencia nucelotídica de la secuencia SEQ ID Nº 22.
2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, que comienza en el nucleótido 104 y se termina en el nucleótido 1195 de la secuencia SEQ ID Nº 22.
3. Polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que consiste en la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23 y designada proteína Ty.
4. Procedimiento que comprende la expresión de la proteína Ty en una célula huésped transformada por un ADN codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23.
5. ADN que consiste en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1.
6. Composición farmacéutica que encierra a título de medicamento el polipéptido según la reivindicación 3.
7. A título de medicamento el polipéptido según la reivindicación 3.
8. Composición farmacéutica que encierra como principio activo un medicamento según la reivindicación 7.
9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, para modular la producción de IL-1beta.
10. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para modular la apoptosis.
11. Utilización del polipéptido según la reivindicación 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
12. Utilización del polipéptido según la reivindicación 3, o del polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 para la fabricación de un medicamento para la cicatrización de llagas.
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