JP2000050879A

JP2000050879A - 新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質

Info

Publication number: JP2000050879A
Application number: JP10227734A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Takayama; 喜好高山; Makoto Yoshimoto; 真吉本
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2000-02-22
Also published as: WO2000009687A1; AU5196599A

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト単球由来の、炎症調節活性を有する新規
蛋白質ＧＭＰ３０と、それをコードする遺伝子ｇｍｐ３
０を提供する。【解決手段】ヒト単球由来のｃＤＮＡライブラリーか
らのクローニングによって、炎症調節活性を有する新規
蛋白質ＧＭＰ３０をコードする遺伝子ｇｍｐ３０が得ら
れる。該蛋白質は、炎症調節活性を有していることか
ら、抗炎症剤等の開発に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、炎症調節活性を有する
単球由来の新規蛋白質ＧＭＰ３０、該蛋白質をコードす
る遺伝子ｇｍｐ３０に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】単球（monocyte）は造血幹細胞由来の単
核食細胞であり、外来の微生物等を単球細胞内に取り込
んで、単球内に多数存在するライソソームの作用により
融解するなど、感染からの生体防御に重要な役割を果た
している。

【０００３】また、単球は外来刺激等により炎症反応を
起こしている細胞に向かって、血中から血管基底膜を貫
通して遊走する性質を有し、その過程で最終的には単球
はマクロファージへと分化していくことが知られてい
る。また、炎症反応を起こしている細胞から発現される
インターフェロンにより、単球やマクロファージが活性
化されることも知られている。特に外来刺激による炎症
反応は、Ｔ細胞やＢ細胞等の免疫系細胞の働きによって
制御されていることから、単球またはマクロファージ
は、炎症局所で免疫系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞等）との何
らかの相互作用を介して炎症を制御する機能を有すると
想定される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、免疫系細胞と
の相互作用を介した炎症制御機能に関して、特に如何な
る分子を介して炎症反応を制御しているかは、未だに未
解明な点が多い。そのため、この炎症反応を制御する分
子を明らかにすることにより、かかる生体分子を直接的
に医薬として使用し、又は間接的に医薬化合物の探索に
供することが可能となると推察される。

【０００５】本発明は、この様な分子を同定し、医薬等
または医薬等の開発に利用することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは炎症制御に
関与する因子の同定を目的とし、ヒト単球で高発現して
いる遺伝子の中から、所望の蛋白質を把握するべく鋭意
研究の結果、新規蛋白質ＧＭＰ３０の存在と、それをコ
ードする遺伝子ｇｍｐ３０の単離に成功し、本発明を完
成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ炎症調節機能を有する蛋白質に関するものであ
る。さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２に記載のＤＮ
Ａからなる遺伝子、または、（ｄ）配列番号：２のＤＮ
Ａとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ
炎症調節機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡからな
る遺伝子に関するものである。

【０００８】本発明であるＧＭＰ３０は、配列番号１に
示すように全２６６アミノ酸残基からなる分子量３０．
３キロダルトン（ｋｄ）の蛋白質である。

【０００９】また、もう一つの本発明であるｇｍｐ３０
は、配列番号２に示すように８０１塩基対（ｂｐ）から
なる遺伝子である。

【００１０】

【発明の実施の形態】遺伝子ｇｍｐ３０は、ヒト単球由
来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含んだｃＤ
ＮＡ断片として単離することができる。本発明者らが使
用したｃＤＮＡライブラリーは、健常男性末梢血単球か
ら一般的な方法に従って抽出したｍＲＮＡを基に調製し
たものであるが、クローンテック社から市販されている
ヒト末梢血単球のｍＲＮＡを元にしても同様にｃＤＮＡ
を調製することができる。

【００１１】ヒト単球で高発現している遺伝子を識別す
る方法として、大久保らの方法（Okubo et al.,Nature
Genet.,2, p173, 1992）による、遺伝子の発現頻度を解
析する方法を用いることができる。具体的には、以下の
手順による。

【００１２】ヒト単球由来のｍＲＮＡを鋳型とし、適当
な制限酵素で開環させたベクタープラスミドの一端にオ
リゴｄＴを結合させたものをプライマーとしてｃＤＮＡ
合成を行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断する。当該ベクターはｄａｍメチラーゼ陽性の
大腸菌を宿主として調製されたため、ＭｂｏＩの認識配
列である「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化されている。
従ってＭｂｏＩは、新たに合成されたｃＤＮＡ部分のみ
を切断する。当該ベクターは、オリゴｄＴを結合させた
末端とは反対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部位を１ヶ
所だけ有しているので、本酵素は当該ベクターを１ヶ所
切断し、さらに新たに合成されたｃＤＮＡ部分にもしＢ
ａｍＨＩ認識配列が存在すれば、その部位も切断する。
ＢａｍＨＩとＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列からな
る、同一の付着端を生ぜしめるため、両酵素で切断した
後、ＤＮＡリガーゼを作用させれば、プラスミドを閉環
することができる。このようにして調製したプラスミド
を用いて、大腸菌を形質転換することで３’末端ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した。従って当該ライブラリー
は、各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その５’側
部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現する部位
までの領域を含んでいる。当該３’末端ｃＤＮＡライブ
ラリーから無作為に適当個数の組換え体を選択し、各組
換え体中のｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定する。この
ようにして決定された特定配列を有するｃＤＮＡ断片
が、無作為に選択された組み換え体の中から幾つ確認さ
れるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現遺伝子を
識別することができる。

【００１３】上記の高発現遺伝子を識別する方法では、
無作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が
適当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体
を処理すればよい。

【００１４】本発明者らは上記方法を実施し、１１７４
個の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決定
し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとしての
出現頻度が５／１１７４であったｃＤＮＡ断片を、ヒト
単球で高発現している遺伝子のＤＮＡ断片の候補として
選別した。

【００１５】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。

【００１６】クローンテック社から市販されているヒト
末梢血単球ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記３’
断片内の配列を有する適当な長さのオリゴヌクレオチド
とベクター中の配列を有する同程度の長さのオリゴヌク
レオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして
ＰＣＲを行った。その結果、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片
を増幅することができた。この際、ヒト単球から抽出し
たｍＲＮＡを鋳型とし、クローンテック社またはギブコ
社の５’ＲＡＣＥキットを用いることによっても行うこ
とができる。さらにこれはまた、上記３’断片をプロー
ブとして、上記ヒト末梢血単球ｃＤＮＡライブラリー
を、コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハ
イブリダイゼーションで、スクリーニングすることによ
っても行うことができる。

【００１７】上記方法によって増幅したｃＤＮＡ断片
は、ベクターpTBlue Vector（Novagen社）に組み込み、
大腸菌にトランスフェクトすることにより、該クローン
から当該ｃＤＮＡを含む断片を環状プラスミドとして切
り出して全塩基配列を決定した。この際、組換えＤＮ
Ａを独立に２クローン取得して、それぞれのｃＤＮＡ断
片の塩基配列を決定することにより、配列の確認を行っ
た。この配列中に一つの蛋白質翻訳領域（Open Reading
Flame、ＯＲＦ）を見いだし、この遺伝子をｇｍｐ３
０、該遺伝子にコードされる蛋白質をＧＭＰ３０と命名
した。

【００１８】遺伝子ｇｍｐ３０は、適当な宿主ベクター
系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組み換
え遺伝子とすることができる。適当なベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵ
Ｂ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来のプラスミド
（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージ
やレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィル
ス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成Ｄ
ＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンを付加することも可能である。さらに該遺伝子を発現
させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーター
を接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて適
宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合に
は、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチル
ス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主
が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞
である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィ
ルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。

【００１９】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＧＭＰ３０は、適当なプロテ
アーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すこと
が可能である。

【００２０】遺伝子ｇｍｐ３０の発現の際に利用できる
宿主としては、エシェリヒア属菌であるEscherichia co
liの各種菌株、バチルス属菌であるBacillus subtilis
の各種菌株、酵母としてはSaccharomyces cerevisiaeの
各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細
胞等が利用できる。上記組み換えベクターを用いて宿主
細胞を形質転換する方法としては、各宿主細胞に対して
一般に用いられる形質転換方法が適用できる。

【００２１】尚、本発明においては、配列番号２に示し
た塩基配列の他に、該配列とハイブリダイズしかつ炎症
調節機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡも、本発明
の範囲内である。

【００２２】すなわち、遺伝子ｇｍｐ３０の全長配列に
おいて、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導
入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によ
るＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤ
ＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異
体が遺伝子ｇｍｐ３０とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ炎症調節機能を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡであれば、配列番号２に示したＤＮＡ配
列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。

【００２３】上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｇｍｐ
３０のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するもので
あれば許容範囲内である。また、遺伝子ｇｍｐ３０とハ
イブリダイズする程度としては、通常の条件下（例えば
DIG DNA Labeling kit、ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1175033）でプローブをラベルした場合に、３２
℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1603558）中でハイブリダイズさせ、５０℃の
０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含
む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．
１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム
である）でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子
ｇｍｐ３０にハイブリダイズする程度であればよい。

【００２４】また、上記のごとく遺伝子ｇｍｐ３０と相
同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であっ
て、炎症調節機能を有する蛋白質もまた、本発明の範囲
内のものである。

【００２５】すなわち、新規蛋白質ＧＭＰ３０のアミノ
酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加された変異体であっても、該変異体が炎症調節
機能を有する蛋白質であれば、該変異体は本発明の範囲
内のものである。

【００２６】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００２７】従って、配列番号１に示した新規蛋白質Ｇ
ＭＰ３０のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による
変異蛋白質であっても、その変異がＧＭＰ３０蛋白質の
３次元構造において保存性が高い変異であって、その変
異蛋白質がＧＭＰ３０と同様に炎症調節機能を有する蛋
白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言
うことができる。変異の程度としては、配列番号１に示
したアミノ酸配列との相同性が、９０％以上のものが許
容し得る範囲である。

【００２８】

【発明の効果】ＧＭＰ３０が炎症調節機能を有している
ことから、遺伝子ｇｍｐ３０の発現異常やＧＭＰ３０の
活性発現異常は、炎症の亢進や鎮静に影響を与えるもの
と推測される。そのため、当該遺伝子の発現を調節する
物質やＧＭＰ３０の機能を調節する物質は、抗炎症剤と
して期待され得るものであり、遺伝子ｇｍｐ３０や蛋白
質ＧＭＰ３０は、この様な生理活性物質の探索に利用す
ることができる。例えば、遺伝子ｇｍｐ３０の転写発現
系中に被験物質を同時に存在させ、遺伝子ｇｍｐ３０の
発現量をＰＣＲ等の適当な方法で検出することにより、
被験物質の遺伝子発現に与える影響を調べることができ
る。

【００２９】

【実施例】以下実施例を挙げて詳述する。尚、以下特に
断らない限り、実施例で示す各種実験方法、例えば組み
換え体ｃＤＮＡの抽出やｃＤＮＡの塩基配列の決定等
は、いずれも当業者にとって自体公知の各種方法（Mole
cular Cloning、2nd.ed.,ColdSpring Harbor Lab.Press、
1989、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技
術解説書等に記載の方法）により行った。

【００３０】＜１．遺伝子ｇｍｐ３０のクローニング＞１）遺伝子の部分配列の決定ヒト男性健常単球由来のｍＲＮＡを鋳型として、大久保
らの方法（Okubo et al.Nature Genet.,1992、2、p173）
に従い、３’末端ｃＤＮＡライブラリーを作成した。当
該ライブラリーから無作為に１１７４個の組換え体を選
択し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。配列決定に
はＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM377）と同社製
反応キットを用いた。１１７４個の組み換え体中の各Ｄ
ＮＡ断片の発現頻度を解析した結果、下記の配列（配列
−１）を有する遺伝子の発現頻度が５／１１７４であっ
た。

【００３１】配列−１ 5'GATCACCTGGGTTTCTTTATTTATCGACTGTGTCATGACAAGGAAACTTACAAACTGCAA CGCAAAGAAACTATTAAAGGTATTCAGAAACGTGAAGCCAGCAATTGTTTCGCAATTCGG CATTTTGAAAACAAATTTGCCGTGGAAACTTTAATTTGTTCTTGAACAGTCAAGAAAAAC ATTATTGAGGAAAATTAATATCACAGCATAACCCCACCCTTTACATTTTGTGCAGTGATT ATTTTTTAAAGTCTTCTTTCATGTAAGTAGCAAACAGGGCTTTACTATCTTTTCATCTCA TTAATTCAATTAAAACCATTACCTTAAAATTTTTTTCTTTCGAAGTGTGGTGTCTTTTAT ATTTGAATTAGTAACTGTATGAAGTCATAGATAATAGTACATGTCACCTTAGGTAGTAGG AAGAATTACAATTTCTTTAAATCATTTATCTGGGATTTTTATGTTTTATTAGCATTTTCA AGAAGACGGATTATCTAGAGAATAATCATATATATGCATACGTAAAAAT 3' ２）配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニング配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方
法により行った。まず、配列−１の一部分と逆相補鎖と
なるオリゴヌクレオチド（配列−２）、ならびにラムダ
ファージクローニングベクター（λｇｔ１１）のｃＤＮ
Ａ挿入部位近傍の配列を有するオリゴヌクレオチド（配
列−３）を、ＤＮＡ合成機（ABI社製380B）で合成し
た。

【００３２】配列−２ 5'-GAAAAGATAGTAAAGCCCTGTTTGC-3' 配列−３ 5'-GCTGAATATCGACGGTTTCCATATGG-3' λｇｔ１１をクローニングベクターとする、Human Mono
cyte c DNA library（クロンテックラボラトリーズ社
製)を鋳型とし、配列−２のオリゴヌクレオチドと配列
−３のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタ
カラLA PCR Kit Ver.2とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ
（いずれも宝酒造製）を用いて、以下のＰＣＲ操作を行
った。

【００３３】 cDNA library(≧10⁸pfu/ml) 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−２ 2μl 10μM 配列−３ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００３４】上記方法により、配列−１を有するＤＮＡ
断片（約１．１ｋｂ）を特異的に増幅させた。

【００３５】３）塩基配列決定用ベクターへのサブクロ
ーニング２）で増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度１％）で分画した。ゲルをエチジウムブロマ
イドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドを
含むゲルを切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断
片の抽出と精製は、GENECLEAN II Kit（バイオ１０１
社製）を用いて行った。

【００３６】この抽出精製したＤＮＡ断片を、塩基配列
決定用ベクターpT7blue（Novagen社製）にサブクローニ
ングした。Ligation溶液はタカラDNA Ligation Kit Ve
r.2（宝酒造製）を用い、以下の組成で１６℃で１．５
時間反応させた。

【００３７】抽出精製したＤＮＡ断片 1μl(50ng) pT7blue 1μl(10ng) 水 3μl Ligation溶液 5μl 総量 10μl 上記反応後の溶液を用いて、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）
５０μｇ／ｍｌ、5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside４０μｇ／ｍｌ、Isopropyl-β-D-Thio-Galac
topyranoside１００μＭを含有するＬＢ寒天培地にプレ
ーティングし、３７℃で一晩培養した。

【００３８】上記プレートに出現したコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた
後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit（キアゲン社
製）で組換えＤＮＡを精製した。

【００３９】４）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定塩基配列決定にはＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM
377）を用い、ダイターミネーター法を用いた。決定さ
れた塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、
プライマーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定し
た。当該クローンのｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号３
に示す。当該塩基配列が配列−２及び配列−１のうち配
列−２の上流領域を含んでいたことから、目的とする遺
伝子ｇｍｐ３０がクローニングされたことを確認した。

【００４０】当該ｃＤＮＡは２６６残基より成る蛋白質
（ＧＭＰ３０）をコードするＯＲＦを含んでいる（配列
番号３）。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基
の上流域に同じreading frameで終止コドンが出現した
ことから、当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列は配列番号３に示したものが唯一のものである
ことが確認された。

【００４１】＜２．動物細胞内での遺伝子ｇｍｐ３０の
発現＞１）動物細胞発現用ベクターの構築配列番号３の蛋白質の開始コドンより上流の配列を有す
るオリゴヌクレオチド（配列−４）と、終止コドンより
下流の一部分の逆相補鎖の配列を有するオリゴヌクレオ
チド（配列−５）をＤＮＡ合成機（ABI社製380B）で合
成した。

【００４２】配列−４ 5'-TATCTGCAGAATTCAGGATCCCTACC-3' 配列−５ 5'-TCAATAATGTTTTTCTTGACTGTTCAAG-3' ＜１．遺伝子ｇｍｐ３０のクローニング＞で単離した配
列番号３を含む組み換えｃＤＮＡを鋳型とし、配列−４
と配列−５のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、タ
カラLA PCR Kit Ver.2とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ
（いずれも宝酒造製）を用いて、以下のＰＣＲ操作を行
った。

【００４３】 cDNA 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−４ 2μl 10μM 配列−５ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。上記方法によりＤＮＡ断片
（約１．０ｋｂ）を特異的に増幅させた。

【００４４】増幅されたＤＮＡ断片（１．０ｋｂ）を、
ゲル濃度１％のアガロースゲル電気泳動で分画し、ゲル
をエチジウムブロマイドで染色した後、紫外線照射して
目的とするバンドを含むゲルを切り出した。アガロース
ゲルからのＤＮＡ断片の抽出と精製は、GENECLEAN II K
it（バイオ１０１社製）を用いて行った。

【００４５】この抽出精製したＤＮＡ断片を、動物細胞
発現用ベクターpTARGET（プロメガ社製）にサブクロー
ニングした。Ligation溶液はタカラDNA Ligation Kit V
er.2（宝酒造製）を用い、以下の組成で１６℃で１．５
時間反応させた。

【００４６】抽出精製したＤＮＡ断片 1μl(50ng) pTARGET 1μl(10ng) 水 3μl Ligation溶液 5μl 総量 10μl 上記反応後の溶液を用いて、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）
５０μｇ／ｍｌ、5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside４０μｇ／ｍｌ、Isopropyl-β-D-Thio-Galac
topyranoside１００μＭを含有するＬＢ寒天培地にプレ
ーティングし、３７℃で一晩培養した。

【００４７】上記プレートに出現したコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた
後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit（キアゲン社
製）で組換えＤＮＡを精製し、pTARGET-gmp30を得た。
この組み換えプラスミドは、挿入断片の上流にＣＭＶプ
ロモーターを有しており、当該組み換えプラスミドを適
当な動物細胞に導入すれば、ｇｍｐ３０を発現させるこ
とができる。

【００４８】２）ＣＨＯｋ１細胞への組み換えベクター
の導入ＣＨＯｋ１細胞を宿主とし、直径６０ｍｍのプラスチッ
クシャーレをコラーゲンコートしたものに、１０％牛胎
児血清（大日本製薬）、５０ユニット／ｍｌペニシリ
ン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むHamF-12
培地（ギブコ社製、以下増殖培地とする）を使用して、
３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。

【００４９】細胞密度が５０％になった時点で、pTARGE
T-gmp30を含むLIPOFECTAMINE試薬（ギブコ社製）を、細
胞上に重層して６時間培養した後、増殖培地に置換して
４８時間培養した。トリプシンで細胞を分散した後、細
胞懸濁液を直径６０ｍｍのプラスチックシャーレに分注
してさらに２４時間培養した。

【００５０】培地を除いた後、G418試薬（ギブコ社製、
終濃度５００μｇ／ｍＬ）を含有する増殖培地に置換し
た後、増殖培地を３日毎に交換してして２週間培養し
た。細胞のコロニーが肉眼で確認できるようになった時
点で、ステンレスカップを用いてコロニーを３個単離し
た。対照として用いるためにＣＨＯｋ１細胞にpTARGET
ベクター（プロメガ社製）のみを上記と同様にして導入
し、安定な形質転換体を単離した。

【００５１】３）形質転換体中の遺伝子発現の確認単離した各形質転換体を、６穴のプレートでG418添加培
地（終濃度５００μｇ／ｍＬ）で培養し、細胞密度が８
０％コンフルエントになった時点で培地を除去し、ＰＢ
Ｓを添加して洗浄後、Trizol（ギブコ社製）を用いて細
胞からそれぞれ全ＲＮＡを精製した。２μｇの全ＲＮＡ
を鋳型に、Superscript逆転写酵素（ギブコ社製）を用
いてｃＤＮＡを合成した。さらにこのｃＤＮＡを鋳型に
して、実施例２−１）と同じオリゴヌクレオチド（配列
２、３）を用いてＰＣＲ反応を実施した。

【００５２】 cDNA 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−２ 2μl 10μM 配列−３ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００５３】反応物を１％アガロースゲル電気泳動で分
画し、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外線照射
して目的とするバンドが増幅されているか調べた。

【００５４】その結果、pTARGET-gmp30を導入したＣＨ
Ｏｋ１細胞でのみ、目的のバンドが増幅され、コントロ
ールベクターを導入したＣＨＯｋ１細胞では、増幅は確
認できなかった。

【００５５】＜３．インターフェロンγ刺激による遺伝
子ｇｍｐ３０の発現応答＞健常男性より単離した単球１
００００００個を、１０％非動化ウシ胎児血清（大日本
製薬）５０ユニット／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬ
ストレプトマイシンを含むRMPI1640培地中で、最終濃度
１０００ユニット／ｍＬとなるようにインターフェロン
γ（ＩＦＮ−γ）を添加して、さらに２４時間培養し
た。コントロールとしてＩＦＮ−γを含まない培地で単
球を調製した。

【００５６】培養後、培地を除去し、ＰＢＳを添加し洗
浄後、Trizol（ギブコ社製）を用いて細胞からそれぞれ
全ＲＮＡを精製した。２μｇの全ＲＮＡを鋳型に、Supe
rscript逆転写酵素（ギブコ社製）を用いてｃＤＮＡを
合成した。さらにこのｃＤＮＡを鋳型にして、配列−２
と配列−３を用いてＰＣＲ反応を実施した。

【００５７】 cDNA 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−２ 2μl 10μM 配列−３ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００５８】反応物を１％アガロースゲル電気泳動で分
画し、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外線照射
して目的とするバンドが増幅されているか調べた。

【００５９】その結果、ＩＦＮ−γで刺激した単球にお
いて、遺伝子ｇｍｐ３０が有意に高発現している事が確
認できた。

【００６０】

【配列表】配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１配列の長さ：２６６残基配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu Ala Gln Lys Glu Ala 5 10 15 Lys Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu Ala Leu Ile Ile Pro 20 25 30 Pro Asp Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp Pro Asp Asp Val Val 35 40 45 Pro Val Gly Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp Cys Met Cys Phe Gly 50 55 60 Leu Ala Phe Met Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Gly Ala Tyr Leu 65 70 75 Tyr Lys Tyr Phe Ala Leu Gln Pro Asp Asp Val Tyr Tyr Cys Gly 80 85 90 Ile Lys Tyr Ile Lys Asp Asp Val Ile Leu Asn Glu Pro Ser Ala 95 100 105 Asp Ala Pro Ala Ala Leu Tyr Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys 110 115 120 Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu Phe Ile Ser Val Pro Val Pro 125 130 135 Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn 140 145 150 Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr 155 160 165 Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu 170 175 180 Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln 185 190 195 Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu 200 205 210 Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp 215 220 225 Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Gln Arg Arg Glu Thr Ile Lys Gly Ile 230 235 240 Gln Lys Arg Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu 245 250 255 Asn Lys Phe Ala Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser 260 265 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２配列の長さ：８０１塩基配列の型：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：核酸配列 10 20 30 40 50 60 ATGGTGAAGG TGACGTTCAA CTCCGCTCTG GCCCAGAAGG AGGCCAAGAA GGACGAGCCC 60 AAGAGCGGCG AGGAGGCGCT CATCATCCCC CCCGACGCCG TCGCGGTGGA CTGCAAGGAC 120 CCAGATGATG TGGTACCAGT TGGCCAAAGA AGAGCCTGGT GTTGGTGCAT GTGCTTTGGA 180 CTAGCATTTA TGCTTGCAGG TGTTATTCTA GGAGGAGCAT ACTTGTACAA ATATTTTGCA 240 CTTCAACCAG ATGACGTGTA CTACTGTGGA ATAAAGTACA TCAAAGATGA TGTCATCTTA 300 AATGAGCCCT CTGCAGATGC CCCAGCTGCT CTCTACCAGA CAATTGAAGA AAATATTAAA 360 ATCTTTGAAG AAGAAGAAGT TGAATTTATC AGTGTGCCTG TCCCAGAGTT TGCAGATAGT 420 GATCCTGCCA ACATTGTTCA TGACTTTAAC AAGAAACTTA CAGCCTATTT AGATCTTAAC 480 CTGGATAAGT GCTATGTGAT CCCTCTGAAC ACTTCCATTG TTATGCCACC CAGAAACCTA 540 CTGGAGTTAC TTATTAACAT CAAGGCTGGA ACCTATTTGC CTCAGTCCTA TCTGATTCAT 600 GAGCACATGG TTATTACTGA TCGCATTGAA AACATTGATC ACCTGGGTTT CTTTATTTAT 660 CGACTGTGTC ATGACAAGGA AACTTACAAA CTGCAACGCA GAGAAACTAT TAAAGGTATT 720 CAGAAACGTG AAGCCAGCAA TTGTTTCGCA ATTCGGCATT TTGAAAACAA ATTTGCCGTG 780 GAAACTTTAA TTTGTTCTTG A 801 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３配列の長さ：１１２５塩基配列の型：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：核酸配列 10 20 30 40 50 60 GCGGCCGCCA GTGTGATGGA TATCTGCAGA ATTCAGGATC CCTACCGCAG TAGCCGCCTC 60 TGCCGCCGCG GAGCTTCCCG AACCTCTTCA GCCGCCCGGA GCCGCTCCCG GAGCCCGGCC 120 GTAGAGGCTG CAATCGCAGC CGGGAGCCCG CAGCCCGCGC CCCGAGCCCG CCGCCGCCCT 180 TCGAGGGCGC CCCAGGCCGC GCC ATG GTG AAG GTG ACG TTC AAC TCC GCT CTG 233 Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu GCC CAG AAG GAG GCC AAG AAG GAC GAG CCC AAG AGC GGC GAG GAG 278 Ala Gln Lys Glu Ala Lys Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu GCG CTC ATC ATC CCC CCC GAC GCC GTC GCG GTG GAC TGC AAG GAC 323 Ala Leu Ile Ile Pro Pro Asp Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp CCA GAT GAT GTG GTA CCA GTT GGC CAA AGA AGA GCC TGG TGT TGG 368 Pro Asp Asp Val Val Pro Val Gly Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp TGC ATG TGC TTT GGA CTA GCA TTT ATG CTT GCA GGT GTT ATT CTA 413 Cys Met Cys Phe Gly Leu Ala Phe Met Leu Ala Gly Val Ile Leu GGA GGA GCA TAC TTG TAC AAA TAT TTT GCA CTT CAA CCA GAT GAC 458 Gly Gly Ala Tyr Leu Tyr Lys Tyr Phe Ala Leu Gln Pro Asp Asp GTG TAC TAC TGT GGA ATA AAG TAC ATC AAA GAT GAT GTC ATC TTA 503 Val Tyr Tyr Cys Gly Ile Lys Tyr Ile Lys Asp Asp Val Ile Leu AAT GAG CCC TCT GCA GAT GCC CCA GCT GCT CTC TAC CAG ACA ATT 548 Asn Glu Pro Ser Ala Asp Ala Pro Ala Ala Leu Tyr Gln Thr Ile GAA GAA AAT ATT AAA ATC TTT GAA GAA GAA GAA GTT GAA TTT ATC 593 Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu Phe Ile AGT GTG CCT GTC CCA GAG TTT GCA GAT AGT GAT CCT GCC AAC ATT 638 Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile GTT CAT GAC TTT AAC AAG AAA CTT ACA GCC TAT TTA GAT CTT AAC 683 Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn CTG GAT AAG TGC TAT GTG ATC CCT CTG AAC ACT TCC ATT GTT ATG 728 Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met CCA CCC AGA AAC CTA CTG GAG TTA CTT ATT AAC ATC AAG GCT GGA 773 Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly ACC TAT TTG CCT CAG TCC TAT CTG ATT CAT GAG CAC ATG GTT ATT 818 Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile ACT GAT CGC ATT GAA AAC ATT GAT CAC CTG GGT TTC TTT ATT TAT 863 Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr CGA CTG TGT CAT GAC AAG GAA ACT TAC AAA CTG CAA CGC AGA GAA 908 Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Gln Arg Arg Glu ACT ATT AAA GGT ATT CAG AAA CGT GAA GCC AGC AAT TGT TTC GCA 953 Thr Ile Lys Gly Ile Gln Lys Arg Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala ATT CGG CAT TTT GAA AAC AAA TTT GCC GTG GAA ACT TTA ATT TGT 998 Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala Val Glu Thr Leu Ile Cys TCT TGA ACAGTC AAGAAAAACA TTATTGAGGA AAATTAATAT CACAGCATAA 1049 Ser CCCCACCCTT TACATTTTCC TGAATTCCAG CACACTGGCG GCCGTTACTA GTGGATCCGA 1109 GCTCGGTACC AAGCTT １
１２５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 EA04 FA01 GA11 GA18 HA01 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA07 BA01 BA08 BA22 CA26 CA53 DC50 NA14 ZB112 4H045 AA10 BA10 CA42 EA22 FA74 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ炎症調節活性を有する蛋白質。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつ炎症調節活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ。