JPH11225771A - 細胞死抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞の死滅に起因する疾患の治療薬の開発に
寄与し得る、細胞死を抑制する活性を有する物質を提供
する 【解決手段】 細胞死を抑制する活性を有する蛋白質Ｐ
ＣＴＦ３５と、それをコードする遺伝子ｐｃｔｆ３５を
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞死を抑制する
活性を有する因子（細胞死抑制因子、以下ＰＣＴＦ３５
とする）と、それをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】神経変性疾患の多くは、神経細胞または
神経細胞間の信号伝達に異変が生じることにより、神経
細胞が死滅し発症するとされている。このような神経変
性疾患の代表例として、パーキンソン病やアルツハイマ
ー病が挙げられる。パーキンソン症は、黒質神経細胞が
変性して神経伝達物質の一つであるドーパミンが産生さ
れなくなり、ドーパミン作動性の神経細胞が死ぬことに
より発症すると言われている。一方、アルツハイマー病
は主に大脳皮質や海馬の神経細胞が死ぬことによって痴
呆症状を呈するとされている。以上に述べた神経細胞死
が関連する疾病に関し、発症原因である神経細胞死を抑
制する、または神経細胞の生育若しくは成長を促す作用
を示す物質等が有効な治療薬となり得ると想定されてお
り、盛んに研究が行われている。最近、プロトオンコジ
ーンであるｂｃｌ２遺伝子（Tsujimoto ら、Science, V
ol.228, p1440-1443, 1985）が細胞死を抑制することが
報告されている（Vaux D.L. ら、Nature, Vol.335, p44
0-442, 1988)。その細胞死を抑制する機能について種々
の機構が提唱されているが、完全には証明されていな
い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】神経性疾患の原因であ
ると考えられる神経細胞死を抑制、または神経細胞の成
長を促進させる蛋白質、並びにそれをコードする遺伝子
を同定すれば、神経細胞死に起因する疾患に有効な治療
薬を提供することができ、またこれに擬似する化合物の
探索を行う上で、きわめて重要な意義を有する。すなわ
ち、神経細胞の死滅を抑制する活性を有する蛋白質は、
それ自体が有効な医薬となり得ると同時に、当該蛋白質
の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を阻害また
は促進する作用を有する物質等を医薬として開発するに
際しても、極めて有用である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｂｃｌ２
遺伝子が細胞死を抑制することに着目し、細胞死の抑制
に関与する蛋白質の誘導発現を想定して、この様な蛋白
質の存在を調べたところ、ｂｃｌ２遺伝子の導入によ
り、細胞死を抑制する活性を有する因子（ＰＣＴＦ３
５）が、形質転換細胞の外に分泌されることを見出し
た。そしてこのＰＣＴＦ３５を精製、単離し、さらに精
製されたＰＣＴＦ３５の部分アミノ酸配列を基に、それ
をコードする遺伝子（以下、ｐｃｔｆ３５とする）をク
ローニングし、本発明を完成した。すなわち本発明は、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、も
しくは配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有する蛋
白質である。更に本発明は、配列番号：１に記載のアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である。更
に本発明は、配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤ
ＮＡ、もしくは配列番号：２のＤＮＡとストリンジェン
トな条件でハイブリダイズし、かつ細胞死の死滅を抑制
する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。更
に本発明は、以下の〜の理化学的性状および生理活
性を有する蛋白性物質であることを特徴とする細胞死抑
制因子である。 プロトオンコジーンであるｂｃ１２遺伝子で形質転換
された褐色細胞種の培養液から得ることができる； 還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量は約３５，
０００である； 細胞の死滅を抑制する活性を有する； Ｎ末端側の１から２２番目のアミノ酸配列が以下のア
ミノ酸配列である； Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｎ末端側の１３８〜１４１番目のアミノ酸配列が以下
のアミノ酸配列である。 Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ

【０００５】本発明者らは、ｂｃｌ２遺伝子の機能解析
のために、これを褐色細胞種であるラットＰＣ１２細胞
に形質導入し、その形質転換細胞（以下、ＰＣ１２／ｂ
ｃｌ２細胞とする）の挙動を詳細に調べた。野生型のＰ
Ｃ１２細胞は、適当な生育可能な培地から血清を取り除
くと細胞死に至る。しかし、ｂｃｌ２遺伝子によって形
質転換されたＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞は、無血清培地に
おいても細胞死に至ることなく生育を続け、逆に突起を
伸展するという挙動を示した。本発明者らはこのＰＣ１
２／ｂｃｌ２細胞の挙動に着目し、当該細胞の外に細胞
の死滅を抑制する活性を有する因子が分泌されている可
能性を想定した。そこで、ＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞を培
養した後の培養上清を調製し、これを無血清培地、すな
わち細胞が死滅に至る環境下におかれた野生型ＰＣ１２
に加えたところ、この野生型ＰＣ１２はＰＣ１２／ｂｃ
ｌ２細胞と同様に生育を続け、なおかつ突起を伸展させ
ることが確認された。このことは、ＰＣ１２／ｂｃｌ２
細胞が、培地中に他のＰＣ１２細胞の死滅を抑制する活
性を有する因子を放出していることを示すものである。

【０００６】本発明者らは、この培地中に存在すると思
われる細胞死を抑制する因子を、６０％アセトニトリル
を展開溶媒とした逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ
−ＨＰＬＣ）、ならびにポリアクリルアミド電気泳動
（ＰＡＧＥ）を用いて精製を試みた。その結果、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおける分子量が３５キロダルトン（ｋｄ）
の蛋白質が回収することができた。この回収蛋白質に細
胞死を抑制する活性があることを確認することにより、
当該蛋白質が目的の細胞死抑制因子、即ちＰＣＴＦ３５
であると判断した。また、本発明者らは、上記方法で精
製されたＰＣＴＦ３５のＮ末端２１残基までのアミノ酸
配列、ならびに、ＰＣＴＦ３５のペプチド鎖をブロムシ
アンで切断して得られる限定分解物のＮ末端アミノ酸配
列をそれぞれ解析した（図９及び図１０）。これらのア
ミノ酸配列を基に推定される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドを合成し、これをプローブとしたポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により、ＰＣ１２
細胞から調製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）か
ら調製したｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＴＦ３５を
コードする遺伝子ｐｃｔｆ５をクローニングすることが
できた。またクローニングされた遺伝子から決定される
ＰＣＴＦ３５のアミノ酸配列から、図９及び図１０に示
したＮ末端アミノ酸配列は、それぞれＰＣＴＦ３５のＮ
末端側の１から２２番目のアミノ酸配列（Ｖａｌ Ｍｅ
ｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｔｈｒ）、Ｎ末端側の１３８〜１４１番目のアミ
ノ酸配列（Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ）に相当す
ることが判明した。

【０００７】遺伝子ｐｃｔｆ３５は、配列番号：２に示
される６９９塩基対（ｂｐ）からなる遺伝子である。ま
た、その塩基配列ならびにＰＣＴＦ３５のＮ末端配列の
解析結果から、本発明のＰＣＴＦ３５は、２３アミノ酸
残基からなるシグナルペプチドによって細胞外に分泌さ
れる、全２３３個のアミノ酸残基からなる分子量２９．
５ｋｄの蛋白質であることが明らかとなった。先のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量の測定によればＰＣＴＦ３５
の分子量は３５ｋｄであることから、ＰＣＴＦ３５は糖
鎖等の何らかの修飾を受けているものと思われる。本発
明のＰＣＴＦ３５が有する細胞死を抑制する活性とは、
細胞に対してＰＣＴＦ３５を添加したときに、ＮＧＦ及
び血清の非存在下にあっても細胞が死滅せずに生育を続
けることを意味する。また、本発明のＰＣＴＦ３５は、
ＰＣ１２細胞に作用させた場合には、細胞死を抑制する
活性と同時に突起の伸展を促す活性を示す。すなわち、
野生型のＰＣ１２細胞は、血清またはＮＧＦ（Nurve Gr
owthFactor；神経細胞増殖因子、Greene L.A., J.Cell.
Biol., Vol.78, p747(1978)）を含む適当な培地におい
ては、生育を続ける（図１）が、この状態の細胞を血清
及びＮＧＦを含まない培地に２５００個／ｃｍ² 程度の
低密度状態にして移すと、やがてＰＣ１２細胞は萎縮し
て全体の９０〜１００％が死滅する（図２）。しかし、
血清及びＮＧＦを除去した培地に無血清培地におけるＰ
Ｃ１２／ｂｃｌ２細胞の培養上清を添加すると、ＮＧＦ
を添加したときと同様にＰＣ１２細胞は生存する（図
３）。

【０００８】この様なＰＣＴＦ３５の細胞死を抑制する
活性は、細胞の生存を観察することで確認ができる。ま
た、より簡便的に測定するには、ＰＣＴＦ３５と同様に
細胞死を抑制する活性を示すＮＧＦの簡易活性測定方法
（佐々木ら、１９９０年日本動物実験代替法学会第４回
大会要旨集、８５頁）に準じ、ＰＣＴＦ３５を細胞に添
加した後の、当該細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）活性の変化を確認することで行うことも可能であ
る。このように、細胞死を抑制する蛋白質であるＰＣＴ
Ｆ３５は、細胞死に起因する疾患に有効な治療薬となり
得るものと考えられる。また、ＰＣＴＦ３５ならびにそ
れをコードする遺伝子ｐｃｔｆ３５は、当該蛋白質の機
能と同様の機能を有する物質、当該機能を阻害または促
進する作用を有する物質等を医薬として開発するに際し
て、極めて有用であり、特に遺伝子ｐｃｔｆ３５は、遺
伝子組み換え技術等を用いてＰＣＴＦ３５を大量生産す
る上で不可欠のものである。本発明においては、配列番
号：１に示したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす
るものであればいずれの遺伝子も本発明の範囲内であ
る。また、本発明においては、配列番号：２に示したＤ
ＮＡ配列の他に、当該ＤＮＡとハイブリダイズし、かつ
細胞死を抑制する活性を有する生理活性蛋白質をコード
するＤＮＡも、本発明の範囲内である。

【０００９】すなわち、遺伝子ｐｃｔｆ３５の全長配列
において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導
入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によ
るＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤ
ＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異
体が遺伝子ｐｃｔｆ３５とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつ細胞死抑制活性を有する生理活
性蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号：２に
示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内
のものである。上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｐｃ
ｔｆ３５のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するも
のであれば許容範囲内である。また、遺伝子ｐｃｔｆ３
５とハイブリダイズする程度としては、通常の条件下
（例えば ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ
（ベーリンガー・マンハイム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１
７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃の
ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハ
イム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブ
リダイズさせ、５０℃の０．５ｘＳＳＣ溶液（０．１％
［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条
件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイ
ゼーションで、遺伝子ｐｃｔｆ３５にハイブリダイズす
る程度であればよい。

【００１０】また、配列番号：１に示したアミノ酸配列
と異なる配列からなる蛋白質であっても、上記のごとく
遺伝子ｐｃｔｆ３５と相同性の高い変異体遺伝子にコー
ドされる蛋白質であって、かつ細胞死抑制活性を有する
生理活性蛋白質であれば、本発明の範囲内のものであ
る。すなわち、本発明のＰＣＴＦ３５のアミノ酸配列の
１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
された変異体であっても、当該変異体が細胞死抑制活性
を有する蛋白質であれば、当該変異体は本発明の範囲内
のものである。

【００１１】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００１２】従って、配列番号：１に示したＰＣＴＦ３
５のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋
白質であっても、その変異がＰＣＴＦ３５の３次元構造
において保存性が高い変異であって、その変異蛋白質が
ＰＣＴＦ３５と同様に細胞死抑制活性を有する生理活性
蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと
言うことができる。変異の程度としては、配列番号：１
に示したアミノ酸配列との相同性が、９０％以上のもの
が許容し得る範囲である。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明であるＰＣＴＦ３５は、上
述のように、ｂｃｌ２遺伝子で形質転換したラットＰＣ
１２細胞を適当な培地を用いて培養させることにより、
培地中に生産させることができる。ｂｃｌ２遺伝子は、
ＰＣ１２細胞および大腸菌、古草菌の双方で複製保持さ
れることのできるシャトルベクター、例えば、ｐｃＤＮ
Ａ３、ｐＡＧＥ１２３等に組み換え、これをリン酸カル
シウム法、エレクトロポレーション法等の一般的な遺伝
子導入法により、ＰＣ１２細胞に導入することができ
る。また、形質転換されたＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞は、
ＲＰＭＩ１６４０培地、ＨＤＭＥＭ培地等の、適当な培
地により培養すればよく、何ら特別な培養方法や手段を
必要としない。

【００１４】本発明であるＰＣＴＦ３５は、同じく本発
明である遺伝子ｐｃｔｆ３５を、一般的な遺伝子組み換
え技術によって組み換え用ベクターに連結して、組み換
え遺伝子ｐｃｔｆ３５を調製し、これを適当な宿主ベク
ター系で発現させることで生産することもできる。適当
なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラ
スミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母
由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバ
クテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィル
ス等の動物ウィルス等が利用できる。組み換えに際して
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。さら
に該遺伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な
発現プロモーターを接続することもできる。使用するプ
ロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよい。例え
ば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、
ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロ
モーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳ
ＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰ
ＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロ
モーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０
由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、
それぞれ使用できる。

【００１５】また本発明のＰＣＴＦ３５は、遺伝子ｐｃ
ｔｆ３５を他の蛋白質（例、グルタチオンＳトランスフ
ェラーゼ、プロテインＡその他）をコードする遺伝子と
連結することにより、いわゆる融合蛋白質として発現さ
せることも可能である。このようにして発現させた融合
型ＰＣＴＦ３５は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビ
ンその他）を用いて切り出すことが可能である。本発明
のＰＣＴＦ３５の発現の際に利用できる宿主としては、
エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母としてはＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌
株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ
Ｃ１２細胞等が利用できる。組み換え型遺伝子ｐｃｔｆ
３５を用いて、上記宿主細胞を形質転換する方法として
は、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等、
用いる宿主細胞に応じて一般に用いられる形質転換方法
を適用することができる。以下、実施例および試験例を
示し、本発明をさらに具体的に説明する。

【００１６】

【実施例】以下に示す実施例における各種操作は、市販
されている実験キットを用いる場合には、キットに添付
されている説明書の記載に従い、またその他特に断らな
い場合は、当業者にとって自体公知の各種操作方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ. ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８９、その他当業者にとって標準的な方法
を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とす
る）により行った。

【００１７】＜実施例１＞ ＰＣＴＦ３５の調製 １）ｂｃｌ２遺伝子のＰＣ１２細胞への導入 理化学研究所から提供された野生型ＰＣ１２（Mah S.P.
ら, J. Neurochem., Vol.63,p.1183-1186,1993）細胞を
用い、ＮＯＢＯＲＵらの方法（J. Neurobio.,Vol.25(1
0),p1227-1234)に従い、以下の操作によりｂｃｌ２遺伝
子を導入した。ＰＣ１２細胞は、ＨＤＭＥＭ培地を入れ
た６穴プレートで２４時間培養後、１．５μｇのヒトｂ
ｃｌ２遺伝子を組み換えた発現ベクターｐＡＧＥ１２３
を加え、リン酸カルシウム法により、マーカー物質Ｇ４
１８（和光純薬）４５０μｇ／ｍＬを含むＨＤＭＥＭ培
地で１４日間培養することにより、遺伝子ｂｃｌ２を含
むｐＡＧＥ１２３によって形質転換したＰＣ１２細胞
（ＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞）を調製した。

【００１８】２）形質転換細胞の培養上清の調製 １）で得られたＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞を、１００ｍｍ
径のシャーレに１０％馬血清、５％牛胎児血清を添加し
たＨＤＭＥＭ培地（ギブコ社）１０ｍＬに加えて、８０
−９０％コンフルエントになるまで前培養した。上記シ
ャーレ培養の３枚分に相当するｂｃｌ２／ＰＣ細胞を、
２４５×２４５×２５ｍｍの培養トレイ（住友ベークラ
イト社製）に用意した前培養と同じ培地５０ｍＬに接種
し、再び９０％コンフルエントになるまで培養した。培
養後の細胞を、血清を含まないＨＤＭＥＭ培地を用いて
トレイ中で３回洗浄したのち、同無血清培地５０ｍＬを
加えて、２日間培養した。この培養後の無血清培地を回
収し、さらに５０ｍＬの同無血清培地を新たに加えて２
日間培養した後の培地も回収した。以上の作業を繰り返
し、培養上清として合計１０００ｍＬを用意した。

【００１９】３）ＰＣＴＦ３５の活性測定 本発明のＰＣＴＦ３５の細胞死抑制活性の測定は、佐々
木らの方法（前述）に準じ、野生型ＰＣ１２細胞にＰＣ
ＴＦ３５を作用させた際の野生型ＰＣ１２細胞中の乳酸
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定する方法、具体
的には以下の操作により測定した。ＰＣＴＦ３５を含む
試料を凍結乾燥させた後にＨＤＭＥＭ培地に溶解させ、
被検試料とした。２４穴プレートの各穴に、約５０００
個の野生型ＰＣ１２細胞を含む２００μＬのＨＤＭＥＭ
培地を用意し、そこに被検試料２００μｌを添加した
後、ＣＯ２細胞培養器内で２４時間培養した。培養後、
各サンプルをエッペンドルフチューブに回収し、３００
０×ｇ５分間で野生型ＰＣ１２細胞を遠沈、回収した。
リン酸緩衝液でｐＨ６．８に調節した生理的食塩水（Ｐ
ＢＳ）で回収したＰＣ１２細胞を洗浄後、０．２％Ｔｗ
ｅｅｎを含むＰＢＳで当該ＰＣ１２細胞を可溶化して溶
出されるＬＤＨ活性を、ＭＴＸ”ＬＤＨ”（極東製薬
製）を用いて測定した。ＰＣＴＦ３５をＮＧＦ１００ｎ
ｇ／ｍＬに換えて同様の操作を行ったときのＰＣ１２細
胞内のＬＤＨ活性をあわせて測定して標準値とし、この
標準値に対する比（％ＮＧＦ）をもって被検試料に含ま
れるＰＣＴＦ３５の細胞死抑制活性とした。

【００２０】４）ＰＣＴＦ３５の精製 ａ）高速液体クロマトグラフ ２）で得た培養上清１０００ｍＬを、撹拌式セル（アミ
コン社製）を用いて、蛋白質の分子量として１０ｋｄ〜
５０ｋｄに相当する分画を５０倍（２０ｍＬ）にまで精
製濃縮した。この濃縮画分について、以下の条件による
逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行
った。 機器；日立製作所（株）製高速液体クロマトグラフ（Ｌ６００９、Ｌ６２９９、 Ｌ４０００、Ｄ２５００） 検出；ＵＶ（２２０ｎｍ） カラム；東ソーＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷＲＰ（７．５ｃｍ長）、室温 展開液；Ａ緩衝液 ０．０５％トリフロロ酢酸 Ｂ緩衝液 ０．０５％トリフロロ酢酸／６０％アセトニトリル 展開条件；展開速度 １ｍＬ／分 ０分〜５０分 Ｂ緩衝液０〜２０％の直線勾配 ５０分〜５６分 Ｂ緩衝液２０〜３５％の直線勾配 ５６分〜６８分 Ｂ緩衝液３５〜４７％の直線勾配 ６８分〜７３分 Ｂ緩衝液４７〜５２％の直線勾配 ７３分〜７８分 Ｂ緩衝液１００％ 回収；１ｍＬ毎に画分して回収

【００２１】各回収画分についてＰＣＴＦ３５の活性を
測定したところ、アセトニトリル２５％前後でカラムか
ら溶出される画分１１が最も高い活性を示した。このク
ロマトグラフの結果を図４に示す。ｂ）ＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ａ）で得た
画分１１を凍結乾燥後、１００μＬの２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した。この溶解後の試料
１６μＬに４μＬの５×サンプリング緩衝液を加え、沸
騰水中で５分間加熱して変性させた試料について、以下
の条件によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、画分１１中に
含まれる蛋白質の分子量を測定した。

【００２２】 濃縮ゲル；０．４５ｍＬ ３０％Ｔ−２．７％Ｃアクリルアミド溶液 ０．７５ｍＬ ０．４％ＳＤＳを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液 （ｐＨ６．８） １．８ｍＬ 精製水 １８μＬ １０％過硫酸アンモニウム溶液 ６．０μＬ ＴＥＭＥＤ 分離ゲル；ミニスラブゲル（１ｍｍ厚） ３ｍＬ ３０％Ｔ−２．７％Ｃアクリルアミド溶液 ０．７５ｍＬ ０．４％ＳＤＳを含む１．５Ｍトリス塩酸緩衝液 （ｐＨ８．８） ３．７５ｍＬ 精製水 ７０μＬ １０％過硫酸アンモニウム １０μＬ ＴＥＭＥＤ 泳動緩衝液；２５ｍＭトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳ 泳動条件；濃縮ゲル ５０Ｖ、分離ゲル１５０Ｖ

【００２３】泳動後のゲルをクーマシーブルー（ＣＢ
Ｂ）で染色して、蛋白質の存在を青色のバンドで確認し
たところ、回収画分中で最も含有量の多い蛋白質は、分
子量３５ｋｄであることが確認された。このＣＢＢ染色
後のゲルを図５に示す。ｃ）ポリアクリルアミド電気泳
動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）ａ）の画分１１につい
て、以下の条件によりＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行っ
た。 濃縮ゲル；１ｍＬ １２．５％Ｔ−２％Ｃアクリルアミド溶液 ０．５ｍＬ ０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８） ２ｍＬ 精製水 ０．５ｍＬ ４％リボフラビン溶液 ３μＬ ＴＥＭＥＤ 分離ゲル；ミニスラブゲル（１ｍｍ厚） ３ｍＬ ３０％Ｔ−２．７％Ｃアクリルアミド溶液 ３ｍＬ １．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８） ６ｍＬ 精製水 ５３．３μＬ ２０％過硫酸アンモニウム ６．７μＬ ＴＥＭＥＤ 泳動緩衝液；２５ｍＭトリス、０．１９２Ｍグリシン 泳動条件；濃縮ゲル ５０Ｖ、分離ゲル１５０Ｖ

【００２４】画分１１を凍結乾燥後、１６μＬの２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した。この溶
解後の試料３２μＬに８μＬの５×サンプリング緩衝液
を加え、泳動用試料を調製した。上記ゲルを２枚調製
し、泳動用資料の１６μＬを各ゲルに載せて電気泳動を
行った。泳動後のゲルの１枚をＣＢＢで染色して蛋白質
の位置を確認した（図６の←１ないし←４）。ＣＢＢ染
色で確認した位置←１ないし←４に相当する部分をもう
１枚のゲルからそれぞれ切り出した。この切り出したゲ
ルを、２００μＬの２０ｍＭトリス緩衝溶液ｐＨ８．０
に２４時間、４℃で浸してゲル中の蛋白質を抽出後、ゲ
ルを遠心分離して上清を回収した。この回収された各上
清を、ＨＤＭＥＭ培地に対して１２時間、４℃で透析し
た後、各試料の細胞死抑制活性を確認した。その結果、
←１に相当する部分のゲルから回収された蛋白質に、当
該活性が認められた。各回収蛋白質の細胞死抑制活性を
図７に示す。

【００２５】さらに、この回収蛋白質を再度ｂ）の方法
に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、３５ｋｄの
蛋白質が確認され（図８）、以上からこの蛋白質がＰＣ
ＴＦ３５であると判断した。 ５）ＰＣＴＦ３５のＮ末端アミノ酸配列の決定 ３）のｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った後の３
５ｋｄに位置するＰＣＴＦ３５を、泳動ゲルからイモビ
ロンＰＳＱ膜（ミリポア社製）に、１０％メタノールを
含む１０ｍＭＣＡＰＳ（ｐＨ１１）緩衝液を用いて、１
８０ｍＡで９０分間の条件で転写させた。転写後の膜を
５０％メタノール／１０％酢酸溶液に５分間浸して固定
化し、Rapid Stain CBB Kit （ナカライ社製）で２０分
間染色した。その後、脱色、乾燥してＰＣＴＦ３５が位
置する部分を切り出し、ヒューレットパッカード社製ア
ミノ酸シーケンサー（ＨＰＧ１００５Ａ）を使用して、
当該機器の操作マニュアルに従い、ＰＳＱ膜上のＰＣＴ
Ｆ３５のＮ末端のアミノ酸配列を分析した。このＮ末端
のアミノ酸配列を図９に示す。

【００２６】６）ＰＣＴＦ３５の部分アミノ酸配列の決
定 ３）のｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った後、Ｐ
ＣＴＦ３５が位置する部分の泳動ゲルを切り出し、当該
ゲルをホモジネートした。これに、２０μｇのブロムシ
アンを含む７０％蟻酸１００μＬを加え、室温で３時間
反応させた後、１５０００×ｇでホモジネートされたゲ
ルを回収した。この回収されたゲルを試料として３）の
ｂ）の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後
のゲルをＣＢＢで染色したところ、約２８ｋｄの相当す
る位置に新たな蛋白質、すなわちブロムシアンによるＰ
ＣＴＦ３５の限定分解物のバンドが確認された。この限
定分解物について５）と同様の操作を加え、そのＮ末端
のアミノ酸配列を分析した。その結果、図１０に示す配
列が確認された。

【００２７】＜実施例２＞ 遺伝子ｐｃｔｆ３５のクロ
ーニング １）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の増幅 実施例１で決定したＰＣＴＦ３５のＮ末端２１残基（図
９）の一部である配列ＱＱＧＫＥＡＴに相当するオリゴ
ＤＮＡ（下記の配列−１）をSENCE PRIMERとして、さら
に、実施例１の６）で得たブロムシアンによるＰＣＴＦ
３５の限定分解物のＮ末端のアミノ酸配列ＹＲＧＲＳＶ
Ｐ（図１０）に相当するオリゴＤＮＡ（下記の配列−
２）をANTISENCE PRIMERとして、それぞれＰＥアプライ
ドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機（ＡＢＩ３８０
Ｂ）を用いて合成した。 配列−１；５’−ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧ
（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＣ
（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＡＣ−３’ 配列−２；５’−ＧＧ（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ
／Ｇ／Ｔ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）Ｃ
（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）
Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）ＴＡ−３’

【００２８】鋳型とする全ＲＮＡは、ISOGEN kit（ニッ
ポンジーン社製）を用い、同kit の説明書の記載に従っ
てＰＣ細胞から抽出した。この全ＲＮＡを鋳型として、
TAKARA RNA PCR kit(AMV) （宝酒造製）を用い、以下の
条件で逆転写反応及びＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行っ
た。 鋳型全ＲＮＡ ５μｌ（１μｇ） １０×ＰＣＲ緩衝液 ５μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−１） ２μｌ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−２） ２μｌ 水 ２９μｌ 逆転写酵素 ０．５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ ２５ｍＭ 塩化マグネシウム ５μｌ 総量 ５０μｌ 上記反応液に対して、９４℃で３０秒間保持後、−２．
５℃／２秒の速度で冷却５５℃まで冷却し、５５℃で３
０秒間保持した後、＋２．５℃／２秒の速度で７２℃に
加温して、７２℃９０秒間反応させる工程を３０回繰り
返して、目的配列を増幅させた。

【００２９】反応終了後、常法に従ってアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）を行い、ゲルをエチジ
ウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して約３９０
ｂｐに相当する位置に増幅ＤＮＡの存在を確認し、この
増幅ＤＮＡのバンドを含むゲルを切り出した。このゲル
をホモジネートした後、３５０μＬのマクサムギルバー
ト緩衝液（０．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１％ＳＤ
Ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム）を
加えて室温で２４時間放置して、ゲルからＤＮＡ断片を
抽出後、１５０００×ｇ、１０分間遠心して上清を回収
した。この回収上清からエタノール沈殿でＤＮＡ断片を
精製した。

【００３０】２）増幅ＤＮＡの塩基配列の決定 １）で精製した増幅ＤＮＡを、塩基配列決定用ベクター
であるpBluescriptII（Stratagene社製）に、ニッポン
ジーン（株）製のLigation Pack を用いて、以下の条件
で１６℃で１８時間反応させて連結し、組み換えベクタ
ーを調製した。 精製増幅ＤＮＡ ４μｌ（２００ｎｇ） pBluescriptII １μｌ（５０ｎｇ） ＢＡＳ １．２５μｌ Hexamine cobalt chloride ０．５μＬ Spermidine ０．５μＬ 水 ０．７５μＬ ＤＮＡLigase ５μｌ

【００３１】組み換えベクターを含む上記反応溶液５μ
Ｌを用いて、ヒートショック法により大腸菌ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体を、アンピシリン（Ａｍ
ｐ）５０μｇ／ｍｌ、５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒ
ｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉ
ｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）４０μｇ／ｍｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓ
ｉｄｅ（ＩＰＴＧ）１００μＭを含有するＬＢ寒天培地
にプレーティングし、３７℃で一晩培養した。プレート
上の白色コロニーを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ
液体培地１０ｍｌに接種して３７℃で一晩培養し、遠心
分離によって菌体を集めた後、組み換えＤＮＡをFlexiP
rep （ファルマシア社製）で精製した。精製された組み
換えＤＮＡの１μｇを定法に従ってアルカリ変性させ、
ThermoSequenase Pre-mix cycle sequencing Kit（アマ
シャム社製）の説明書に従って、ジデオキシ法により増
幅ＤＮＡの塩基配列を決定した。増幅ＤＮＡの長さは、
全３４６ｂｐであった。

【００３２】３）遺伝子ｐｃｔｆ３５の取得 ２）で決定された３４６ｂｐからなる塩基配列を基に、
目的遺伝子全体の取得を以下のＲＡＣＥ（Rapid Amplif
ication of cDNA Ends）法（Frohman M.A., et.al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.85, p8998(1988) ）により
行った。反応用プライマーとして、３’ＲＡＣＥ用に配
列−３を、５’ＲＡＣＥ用に配列−４をそれぞれ合成し
た。 配列−３；５’−ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡ
ＧＡＣＡＣＡＧＧＴＤＡＧＣ−３’ 配列−４；５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧ
ＡＣＧＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣ−３’ １）で得られた全ＲＮＡの１μｇを鋳型としてMarathon
cDNA amplificationkit （クローンテック社製）の説
明書に従い、以下の条件でＰＣＲを行った。 鋳型全ＲＮＡ ５μｌ（１μｇ） １０×ＰＣＲ緩衝液 ５μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−３） ２μｌ １０μＭ オリゴヌクレオチド（配列−４） ２μｌ 水 ３４．５μｌ 逆転写酵素 Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ 総量 ５０μｌ

【００３３】上記反応液に対して、９４℃で３０秒間保
持後、−２．５℃／２秒の速度で７２℃まで冷却後４分
間保持し、＋２．５℃／２秒の速度で再び９４℃に戻す
工程を５回、続いて９４℃で３０秒間保持後、−２．５
℃／２秒の速度で７０℃まで冷却後４分間保持し、＋
２．５℃／２秒の速度で再び９４℃に戻す工程を５回行
った後、さらに９４℃で３０秒間保持後、−２．５℃／
２秒の速度で６８℃まで冷却後４分間保持し、＋２．５
℃／２秒の速度で再び９４℃に戻す工程を３０回繰り返
した。反応終了後、常法に従ってアガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度１％）を行い、ゲルをエチジウムブロマイ
ドで染色した後、紫外光照射して約１６００ｂｐに相当
する位置に増幅ＤＮＡの存在を確認した。この増幅ＤＮ
Ａを含むゲルからの増幅ＤＮＡの精製、ベクターへの組
み込み、シーケンシングの各操作を２）と同様にして行
って、増幅ＤＮＡの全塩基配列の決定を行った。その結
果、増幅ＤＮＡは全１６４５ｂｐからなるＤＮＡであ
り、その中に終止コドンを含む６９９ｂｐのＯＲＦ（Op
en Reading Flame）を有していた。このＯＲＦにコード
されるアミノ酸配列中に、ＰＣＴＦ３５のＮ末端アミノ
酸配列、およびその限定分解物２３ｋｄのＮ末端のアミ
ノ酸配列と部分的に一致する配列が、それぞれ含まれて
いることから、目的である遺伝子ｐｃｔｆ３５がクロー
ニングされたと判断した。この遺伝子ｐｃｔｆ３５を含
む増幅ＤＮＡである１６４５ｂｐの全塩基配列を配列番
号：３に示す。クローニングされた遺伝子から決定され
るアミノ酸配列を配列番号：３に示す。このアミノ酸配
列から、図９に示したＰＣＴＦ３５のＮ末端アミノ酸配
列は、ＰＣＴＦ３５のＮ末端側の１から２２番目のアミ
ノ酸配列：Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒに相当することが
明らかとなった。また図１０に示したＮ末端アミノ酸配
列は、ＰＣＴＦ３５のＮ末端側の１３８〜１４１番目の
アミノ酸配列：Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇに相当
することが明らかとなった。

【００３４】＜実施例３＞ 組み換え遺伝子手法による
ＰＣＴＦ３５の調製 １）組み換え発現ベクターｐＣＴＦ３５の構築とＰＣ１
２細胞の形質転換 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで開環させた組み換
え用ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）１μ
ｇを調製し、これに実施例２の３）で得た遺伝子ｐｃｔ
ｆ３５を含む全長１６４４ｂｐの増幅ＤＮＡ１μｇを加
え、実施例２の２）と同様の操作によって連結、形質転
換と組み換え体ＤＮＡの調製を行い、組み換え発現ベク
ターｐＣＴＦ３５を得た。理化学研究所から提供された
野生型ＰＣ１２細胞をＨＤＭＥＭ培地を入れた６穴プレ
ートで２４時間培養後、１．５μｇの組み換え発現ベク
ターｐＣＴＦ３５を加え、リン酸カルシウム法により、
マーカー物質Ｇ４１８（大日本製薬）４００μｇ／ｍＬ
を含むＨＤＭＥＭ培地で１４日間培養することにより、
該組み換えベクターにより形質転換されたＰＣ１２細胞
（ＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞）を３クローン調製した。同
時にｐｃＤＮＡ３で形質転換されたＰＣ１２細胞（ｍｏ
ｃｋ・ＰＣ１２細胞）も調製した。

【００３５】２）ノーザンハイブリダイゼーション ３クローンのＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞、ｍｏｃｋ／ＰＣ
１２細胞、ならびに野生型ＰＣ１２細胞を、それぞれ１
００ｍｍ径のシャーレに１０％馬血清、５％牛胎児血清
を添加したＨＤＭＥＭ培地（ギブコ社）１０ｍＬに加え
て、８０−９０％コンフルエントになるまで培養した
後、ISOGEN kit（ニッポンジーン社製）ならびにoligot
ex dT30 （日本合成ゴム社製）を用いて各細胞からｍＲ
ＮＡを抽出した。２μｇのｍＲＮＡを定法に従ってアガ
ロースゲル電気泳動で分画後、１０×ＳＳＣ緩衝液を用
いて室温、１８時間でメンブレン（ＮＥＮ社製Gene Scr
eenPlus）に転写し、ノーザンハイブリダイゼーション
を行った。プローブとして、配列表３に示したＤＮＡの
５’末端から１４６２ｂｐのフラグメントを鋳型として
Ramdom Primer DNA LabelingKit （宝酒造社製）を用い
て［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＤＮＡ断片を調製し
た。ハイブリダイゼーションは以下の組成の溶液中で
（濃度は全て終濃度）、６５℃で１６時間行った。 １０％ デキストラン硫酸 １％ ＳＤＳ １Ｍ ＮａＣｌ ２．４×１０５ｃｐｍ／ｍＬ 標識プローブ

【００３６】ハイブリダイゼーション終了後、メンブレ
ンを２×ＳＳＣ緩衝液で室温、５分を２回、次いで１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液で６０℃、３０分を２
回、さらに０．１×ＳＳＣ緩衝液で室温、５分を１回の
条件で０．１％ＳＤＳを用い、５１℃で洗浄した。メン
ブレン洗浄後のシグナルの検出は、−８０℃で２４時
間、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM−ＥＣＬ（アマシャム社製)
フイルムを使用して行った。この結果、ｍｏｃｋＰＣ１
２細胞および野生型ＰＣ１２細胞に比べ、３つのＰＣ１
２／ｐＣＴＦ細胞において、有意な発現が確認された。
このハイブリダイゼーション後の露光結果を図１１に示
す。

【００３７】３）組み換え体ＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞の
生存率の確認 野生型ＰＣ１２細胞を、１００ｍｍ径のシャーレに用意
したＮＧＦ２５０μｇ／ｍＬを含む無血清ＨＤＭＥＭ培
地（ギブコ社）１０ｍＬに対して、５０００個／ｃ
ｍ³ 、１００００個／ｃｍ³ 、２５０００個／ｃｍ³ の
３種類の細胞密度となるよう添加し、２４時間および４
８時間培養した後の生細胞数を、トレパンプル−色素排
除試験（ギブコ社）により計測して、これを１００％と
した。１）で得たＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞、ならびに野
生型ＰＣ１２細胞を、それぞれ１００ｍｍ径のシャーレ
に用意した無血清ＨＤＭＥＭ培地（ギブコ社）１０ｍＬ
に対して、５０００個／ｃｍ³ 、１００００個／ｃ
ｍ³ 、２５０００個／ｃｍ³ の３種類の細胞密度となる
よう添加し、２４時間および４８時間培養した後の生細
胞数をそれぞれ計測し、ＰＣ１２／ｐＣＴＦ３５の細胞
死抑制効果を確認した。その結果、ＰＣ１２／ｐＣＴＦ
細胞は、野生型ＰＣ１２細胞に比べ、より生存細胞数が
多かった（図１２）。また、ＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞を
実施例１と同様に培養して得た上清の濃縮液に細胞死抑
制効果が認められ、またこれを無血清培地中の野生型Ｐ
Ｃ１２細胞に添加したところ、細胞死が抑制されること
が確認された。

【００３８】

【配列表】 出願人氏名：大正製薬株式会社 発明の名称：細胞死抑制因子 整理番号：ＤＡ−０２６２４ 配列の数：３ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：２３３残基 配列の型 ：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Val Met Gly Ser Gly Asp Ser Val Pro Gly Gly Val Cys Trp Leu 5 10 15 Gln Gln Gly Lys Glu Ala Thr Cys Ser Leu Val Leu Lys Thr Gln 20 25 30 Val Ser Arg Glu Glu Cys Cys Ala Ser Gly Asn Ile Asn Thr Ala 35 40 45 Trp Ser Asn Phe Thr His Pro Gly Asn Lys Ile Ser Leu Leu Gly 50 55 60 Phe Leu Gly Leu Val His Cys Leu Pro Cys Lys Asp Ser Cys Asp 65 70 75 Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys Ala Cys Arg Met Leu Gly Gly 80 85 90 Arg Pro His Cys Glu Cys Val Ser Asn Cys Glu Gly Val Pro Ala 95 100 105 Gly Phe Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg Asp Glu 110 115 120 Cys Glu Leu Arg Thr Ala Arg Cys Arg Gly His Pro Asp Leu Arg 125 130 135 Val Met Tyr Arg Gly Arg Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val 140 145 150 Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala 155 160 165 His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Pro Asn 170 175 180 Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser 185 190 195 Ser Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile 200 205 210 Gly Val Arg His Pro Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro 215 220 225 Ala Glu Glu Glu Glu Asn Phe Val 230 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ：６９９塩基 配列の型 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 GTGATGGGCT CGGGGGATTC TGTGCCGGGT GGTGTGTGCT GGCTCCAGCA GGGTAAGGAG 60 GCTACCTGCA GTCTGGTGCT GAAGACACAG GTCAGCCGGG AGGAGTGCTG CGCTTCCGGC 120 AACATCAACA CAGCCTGGTC CAACTTCACC CACCCGGGCA ATAAAATCAG CCTGCTAGGA 180 TTCCTGGGCC TTGTCCACTG CCTACCATGC AAAGATTCTT GCGACGGAGT GGAGTGCGGC 240 CCCGGCAAGG CGTGCCGCAT GTTGGGGGGC CGTCCACACT GCGAGTGCGT GTCCAACTGC 300 GAGGGGGTTC CCGCGGGCTT CCAGGTCTGC GGCTCTGATG GCGCCACCTA CCGGGACGAA 360 TGCGAACTGC GCACCGCGCG CTGTCGAGGA CACCCAGACC TGCGCGTCAT GTACCGCGGC 420 CGCTGCCAAA AGTCCTGCGC TCAGGTAGTG TGCCCGCGCC CCCAGTCGTG CCTTGTGGAT 480 CAGACTGGCA GCGCACACTG CGTGGTGTGT CGCGCTGCAC CCTGCCCAGT ACCTCCCAAC 540 CCTGGCCAAG AACTCTGCGG CAACAACAAC GTTACCTACA TCTCGTCGTG TCACTTGCGC 600 CAGGCCACTT GCTTTCTGGG CCGTTCCATT GGAGTTCGGC ACCCGGGCAT CTGCACAGGT 660 GGCCCCAAAG TACCAGCAGA GGAGGAAGAG AACTTCGTG 699 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ）：３ 配列の長さ：１６４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： CTCGCC ATG CGT CCT GGG GCA CTG TGG CCG CTG CTT TGG GGA GCC 45 Met Arg Pro Gly Ala Leu Trp Pro Leu Leu Trp Gly Ala -23 -20 -15 CTG GTC TGG GCG GTG GGA TCC GTG GGC GCC GTG ATG GGC TCG GGG 90 Leu Val Trp Ala Val Gly Ser Val Gly Ala Val Met Gly Ser Gly -10 -5 -1 1 5 GAT TCT GTG CCG GGT GGT GTG TGC TGG CTC CAG CAG GGT AAG GAG 135 Asp Ser Val Pro Gly Gly Val Cys Trp Leu Gln Gln Gly Lys Glu 10 15 20 GCT ACC TGC AGT CTG GTG CTG AAG ACA CAG GTC AGC CGG GAG GAG 180 Ala Thr Cys Ser Leu Val Leu Lys Thr Gln Val Ser Arg Glu Glu 25 30 35 TGC TGC GCT TCC GGC AAC ATC AAC ACA GCC TGG TCC AAC TTC ACC 225 Cys Cys Ala Ser Gly Asn Ile Asn Thr Ala Trp Ser Asn Phe Thr 40 45 50 CAC CCG GGC AAT AAA ATC AGC CTG CTA GGA TTC CTG GGC CTT GTC 270 His Pro Gly Asn Lys Ile Ser Leu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Val 55 60 65 CAC TGC CTA CCA TGC AAA GAT TCT TGC GAC GGA GTG GAG TGC GGC 315 His Cys Leu Pro Cys Lys Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly 70 75 80 CCC GGC AAG GCG TGC CGC ATG TTG GGG GGC CGT CCA CAC TGC GAG 360 Pro Gly Lys Ala Cys Arg Met Leu Gly Gly Arg Pro His Cys Glu 85 90 95 TGC GTG TCC AAC TGC GAG GGG GTT CCC GCG GGC TTC CAG GTC TGC 405 Cys Val Ser Asn Cys Glu Gly Val Pro Ala Gly Phe Gln Val Cys 100 105 110 GGC TCT GAT GGC GCC ACC TAC CGG GAC GAA TGC GAA CTG CGC ACC 450 Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg Asp Glu Cys Glu Leu Arg Thr 115 120 125 GCG CGC TGT CGA GGA CAC CCA GAC CTG CGC GTC ATG TAC CGC GGC 495 Ala Arg Cys Arg Gly His Pro Asp Leu Arg Val Met Tyr Arg Gly 130 135 140 CGC TGC CAA AAG TCC TGC GCT CAG GTA GTG TGC CCG CGC CCC CAG 540 Arg Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg Pro Gln 145 150 155 TCG TGC CTT GTG GAT CAG ACT GGC AGC GCA CAC TGC GTG GTG TGT 585 Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val Cys 160 165 170 CGC GCT GCA GCC TGC CCA GTA CCT CCC AAC CCT GGC CAA GAA CTC 630 Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Pro Asn Pro Gly Gln Glu Leu 175 180 185 TGC GGC AAC AAC AAC GTT ACC TAC ATC TCG TCG TGT CAC TTG CGC 675 Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu Arg 190 195 200 CAG GCC ACT TGC TTT CTG GGC CGT TCC ATT GGA GTT CGG CAC CCG 720 Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro 205 210 215 GGC ATC TGC ACA GGT GGC CCC AAA GTA CCA GCA GAG GAG GAA GAG 765 Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu 220 225 230 AAC TTC GTG TGG GCTGCAGCCACTGGGCCTGGTATTTAAGGCCGTCCTGATTTTTATTTATTA 828 Asn Phe Val 233 TTACAGAAAA TATTCTAATT TATGTCACAT GGACATTCCC CAAACCTAGC CTGGAACCAC 888 TTGGGGATCC CCTAGGATCC TGAGCACATA TCACAGGAAC TGAAGGAAGA TTTTGTAAGA 948 GTTGGTATAT GCGTCACCGG GTACTGGGAT CCAAGTTAGC ACCCCAGACA CCTGCTGCCC 1008 AGGGAGGGCT GCTTCGTGGA GACCCCCTGA TTTGATCTCC CCACCTGCTT TCTAGGTGGC 1068 GCTATCTCAG GCCACAGCTG ACGGTAGTGT CTCCACCTCA ATTGGTGTTT GCATGTGGCC 1128 GGTCTCAGAC CAGAGCAGGC AGCATCGGGT CAGAGAAACA CTGGGTTCAT TCCTGTTCAG 1188 TCCACTTGGG GTGAGACCTG GTAGAAACAT TGGGTTGTGG CTGACTCGCA AGCCCAGGAG 1248 AACCTGTGGA CACCAGGATT CACTCTAGCA CCAACTGCCC TGTTCCCTGG ACACCCACAT 1308 TAGCTTTTAC CCAGCCCCAC TTGTCACCAA GCACATGCTG TTTTGTCTCA CCCATCACCC 1368 TGACAGCTGC CACTGAAAAT TACCCACCCG TGCCTTCAGG GAAGCCAAAG AGGGGAGTGA 1428 GAGTTCAGTA GGTAGAGTGC TTTCCAAGCA TTCACAACGT CCTGGGCTCT GTCCCCAGCA 1488 CCACATAAAA CAGACATGTT GACTCAGGCC TGTTATCCCA GCACTTGGAA AGTAGAGGAA 1548 AGAGGATCAG GAGTTCGAGT TCATCTTTGG TTACACTGTG AGTTCAAGGC CAGCCTGAGC 1608 TACCTTATCT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1645

【図面の簡単な説明】

【図１】生物の形態を示す写真であって、生育状態の野
生型ＰＣ１２細胞を示す（細胞密度は２５００個／ｃｍ
² ）。

【図２】生物の形態を示す写真であって、野生型ＰＣ１
２細胞（細胞密度は２５００個／ｃｍ² ）を無血清培地
に移行して２４時間経過した後の、死滅状態の野生型Ｐ
Ｃ１２細胞を示す。

【図３】生物の形態を示す写真であって、野生型ＰＣ１
２細胞（細胞密度は２５００個／ｃｍ² ）を、ＰＣ１２
／ｂｃｌ２細胞の培養上清を含む無血清培地に移行して
２４時間経過した後の、野生型ＰＣ１２細胞を示す。

【図４】ＰＣ１２／ｂｃｌ２細胞の培養上清について
の、０．０５％のＴＦＡを含む６０％アセトニトリルを
グラジエント溶媒とした逆相クロマトグラフを示す。縦
軸左とバーグラフは細胞死抑制活性（％ＮＧＦ）と各画
分の活性値を、縦軸右と折線は、溶媒グラジエント（ア
セトニトリル濃度％）を示す。

【図５】電気泳動の結果を示す写真であって、逆相クロ
マトグラフで得た画分１１をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、
銀染色したゲルを示す。

【図６】電気泳動の結果を示す写真であって、逆相クロ
マトグラフで得た画分１１をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥし
た後、ＣＢＢ染色したゲルと、確認された蛋白質の位置
を←１ないし←４で示したものである。

【図７】図６の←１ないし←４に相当する蛋白質の細胞
死抑制活性を示す（縦軸が活性％）。

【図８】電気泳動の結果を示す写真であって、細胞死抑
制活性が確認された図６の←１に相当する蛋白質の、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀染色したゲルの図である。

【図９】アミノ酸シーケンサーで決定されたＰＣＴＦ３
５のＮ末端のアミノ酸配列を示す。図中の？は、未確認
の残基を意味する。

【図１０】アミノ酸シーケンサーで決定された、ＰＣＴ
Ｆ３５の限定分解物である２８ｋｄの蛋白質のＮ末端の
アミノ酸配列を示す。

【図１１】電気泳動の結果を示す写真であって、遺伝子
ｐｃｔｆ３５を含んだ形質転換体から抽出したｍＲＮＡ
に対するノーザンハイブリダイゼションの露光結果を示
す。レーン１から３はＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞の各クロ
ーン、レーン４はＰＣ１２／ｐｃＤＮＡ３細胞、レーン
５は野生型ＰＣ１２細胞である。

【図１２】ＰＣ１２／ｐＣＴＦ細胞の無血清培地におけ
る生存率を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
   質； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有する蛋
   白質。
2. 【請求項２】 配列番号：１に記載のアミノ酸配列から
   なる蛋白質をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）からなる遺伝
   子； （ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ； （ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
   でハイブリダイズし、かつ細胞死を抑制する活性を有す
   る蛋白質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 以下の〜の理化学的性状および生理
   活性を有する蛋白性物質であることを特徴とする細胞死
   抑制因子： プロトオンコジーンであるｂｃ１２遺伝子で形質転換
   された褐色細胞種の培養液から得ることができる； 還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量は約３５，
   ０００である； 細胞の死滅を抑制する活性を有する； Ｎ末端側の１から２２番目のアミノ酸配列が以下のア
   ミノ酸配列である； Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｎ末端側の１３８〜１４１番目のアミノ酸配列が以下
   のアミノ酸配列である。 Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ