JPH06508622A

JPH06508622A - ｂｃｒ−ａｂ１アンチセンスオリゴヌクレオチドによる白血球増殖の選択的抑制

Info

Publication number: JPH06508622A
Application number: JP5501069A
Authority: JP
Inventors: カラブレッタ，ブルーノ; ゲヴィルツ，アラン　エム
Original assignee: テンプル　ユニバーシティ−オブ　ザ　コモンウェルス　システム　オブ　ハイヤーエデュケーション
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 1992-06-15
Publication date: 1994-09-29
Also published as: EP0590090A4; US5652222A; CA2103377A1; EP0590090A1; WO1992022303A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｂｃｒ−ａｂ＋アンチセンスオリゴヌクレオチドによる白血球増殖の選択的抑制発明の技術分野本発明は、ｍＲＮＡに対し相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその治療用途に関するものである。

特に本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に対し相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにフィラデルフィア染色体の転位（１口ｎ５ｌｏｃａｌｉｏｎ　）を特徴とする白血病の処置におけるその使用に関するものである。

政府認可の説明ここに記載する発明は、部分的にナショナル・インスチチュート・オン・ヘルス認可ＣＡ４６７８２号およびＣＡ３６８９６号により支援された。

発明の背景しばしば慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）と呼ばれる慢性骨髄性白血病は特定の染色体異常（すなわちフィラデルフィアもしくはＰｈ１染色体）に関連する最初の腫瘍形成病であった。分子レベルにて、最も顕著な特徴は染色体９の長アームから染色体２２における破断点（ｂ＋ｅａｋｐｏｉ遺伝子を生成する。破断は染色体９（バンド９　ｑ　３４）の長アームの末端近く、および染色体２２（バンド２２ｑ１１）の上半分で生ずる。

一般にｃ−ａｂｌプロトオンコジーンはチロシンキナーゼ活性を有するＪ白質をコードする。この活性は、ｂｃｒ−ａｂｌハイブリッド遺伝子を有する細胞で増大する。染色体２２における破断点に位置する遺伝子は、ＣＭＬにおける染色体２２の破断が染色体２２における遺伝子の極めて小さい５．８キロベース（ｋ　ｂ）断片（破断点クラスター領域）で生するため、ｂｃｒと呼ばれる。

説明の目的で、ＢＣＲは破断点クラスター領域を包含す遺伝子は約１３０ｋｂの比較的大きい遺伝子である。

ｃ−−ａｂｌ遺伝子のクローン化は、これが少なくとも２３０ｋｂにわたり、少なくとも１１個のエクソンを有することを示した。２種の異なる第１エクソン、すなわちエクソン１ａおよびエクソン１ｂが存在し、これらは共通の接合アクセプタ部位（すなわちエクソン２）に接合される。エクソン１ａは１９ｋｂであって、エクソン２に対し近位である。エクソン１ａよりも若干率さいエクソン１ｂは２００ｋｂより大であって、エクソン２に対し近位である。この配置の結果、少なくとも２種の主たるｃ−ａｂｌメツセージがその５′領域で相違して転写される［シュチヘルマン等、セル、第４７巻、第２７７頁（１９８６）；パーナート等、モ１ノキュラ・セル・バイオロジー、第７巻、第３２３１頁（１９８７）；フエインシュタイン等、オンコジーン、第４巻、第１４７７〜１４８１頁（１９８９）］。エクソン１ｂを使用すればｍＲＮＡは７．０ｋｂとなる。エクソン１ａを使用すればｍＲＮＡは６．Ｏｋｂとなる。各エクソン１ａおよび１ｂの前には転写プロモータが存在する。

６−ｋｂのｃ−ａｂ１転写物はエクソン１８〜１１で構成される。７−ｋｂ転写物はエクソン１ｂで始まり、２００ｋｂの間隔を越えてエクソン２に達し、オクソン１ａを省いてエクソン２〜１１に合体する。かくして両ｃ−ａｂｌメツセージは、（−２１ｂｌｘクソン２から開始する３′エクソンの共通群を有する。その結果、メッセージは、Ｎ−末端を除き殆どのアミノ酸配列を共有する２種の蛋白質をコードする。コード化は第１エクソンで始まるので、エクソン選択が蛋白質生成を決定する。

ターキャンプ等、ネイチャー、第３１５巻、第７５８頁のキメラｍＲＮＡをもたらす。次いで、このキメラメッセーンは、チロシンキナーゼ活性を増大した大型のキメ力等、セル、第３７巻、第１０３５頁（１９８４）；クレッツアー等、パイロロジー、第１４０巻、第２３０頁（１９８５）；コノプカ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第１８１０頁（１９８５）］、２１０ｋＤａの蛋白質は１４５ｋＤａの正常なヒトａｂｌ蛋白質よりも極めて大であり、極めて高いチロシンキナーゼ活性を有する。

ソン２との間で生ずる［シュチベルマン等、セル、第４７巻、第２７７〜２８４頁（１９８６）コ。これら２種の接合部は、それぞれｒＬ−６Ｊ　（もしくはｒｂ　２　ａ　２Ｊ）およびｒＫ−２８Ｊ　（もしくはｒｂ３ａ２Ｊ）接合部エクソン３によりコードされる２５アミノ酸を含み、他方はこれらアミノ酸を欠如する。これら接合部の一方もしくは両者はＰｈ１−陽性ＣＭＬ患者で検出される［シュチベルマン等、ブラッド、第６９巻、第９７１頁（１９８６）］。

急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）患者の大部分は、その白血病細胞にｐｈ　染色体を有する。ｐｈ　陽性ＡＬＬは一般に、Ｐｈ１−陰性型のＡＬＬよりも化学療法処置に対し反応性が低いと思われる。これは特にｐｈ’　−陽性ＡＬＬを有する子供に見られる。

ＡＬＬに罹患したＰｈ１−陽性患者の約半分は２種のチャー、第３３０巻、第３８６〜３８８頁（１９８７）参照］。

１つを有する。ＣＭＬ患者の約半数がｂ２ａ２接合部を有するのに対し、他の半数はｂ３ａ２接合部を特徴とする。ＡＬＬ患者は約５０％がｂｌａ２．２５％がｂ２ａッド化によるＰＣＲ反応生成物の分析を用いて、３種の分子欠陥を区別するため、改善されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が提案されている［カワサキ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第５６９８〜５７０２頁（１９８８）］。臨床的に、ＣＭＬは常に慢性状態から芽球発症（ｂ＋ａｌｌ　ｃｒＨ口）まで進行する。慢性状態のＣＭＬにおいては、骨髄および末梢血液における成熟および未成熟の骨髄要素の増加が最大の特徴である［ケフラー等、三ニー・イングランド・ジャーナル・メジス、第３０４巻、第２０１頁（１９８１）］。動態試験が示すところでは、これら異常細胞は正常細胞よりも迅速には増殖もしくは成熟しない。寧ろ、ＣＭＬにおける過大な顆粒球造血作用の基礎となる欠陥が骨髄および末梢血液における骨髄プロゲニタ細胞プールの拡大に存在すると思われる［同上］。しかしながら、末端分化細胞の発生は、造血作用の過程が成る程度正常な特徴を保持することを示す。

これに対し、芽球形質転換の間に白血病細胞は「芽球」表現型を有する顕著な程度の分化抑制を示す［ローゼンタール等、アメリカン・ジャーナル・メジスン、第６３巻、第５４２頁（１９７７）］。芽球形質転換もしくは「芽球発症」の開始は、用いうる治療上の選択を制限する。

病気のない期間、したがって生存率は一般に短い。典型的には、これは約４ケ月以内である。

ＣＭＬ慢性状態の最も早期の処置は、たとえばブスルファンのようなアルキル化剤およびたとえばヒドロキシ尿素のようなりＮＡ合成の抑制剤による化学療法である。

両薬剤はＣＭＬの過度の顆粒球増血作用の抑制に有用であるが、その作用は特異的でない。何故なら、これらは正常細胞および白血病細胞の両者における核酸合成を抑制するからである。この標準的な処置対策により平均生存率は約４７ケ月となるが、治療を受けない患者よりも顕著に長くこれら患者が生存するという証明は殆どない［ベルゲスヒール、「慢性顆粒球白血病」、フェアバンクス編、カレント・ヘマトロジー、第２巻、ウィリー出版、ニューヨーク、第１〜２６頁（１９８３）］。牌膵臓射、膵臓削出および強度の化学療法により白血病クローンを除去する試みはＣＭＬ患者の１／３にてｐｈ’　−染色体陽性の徹者を一時的に抑制することも観察されているが、病気の経過を変化させなかった［クニングハム等、プラト、第５３巻、第３７５頁（１９７５）］。白血病患者は常に再発して、最終的に芽球発症および死亡に至る。

たとえばブスルファンおよびヒドロキシ尿素のような化学療法剤は、正常細胞および白血病細胞の両者にて核酸合成を抑制するので特異的でない。さらに、これらが病気の自然経過を変化させ或いは遅延させるのに有効であるかどうかは議論の的である。

極く最近、インターフェロンがＣＭＬ慢性期における治療手段に加えられた。α −インターフェロン（毎日３〜９百万単位の筋肉内投与）は、慢性期ＣＭＬ患者の約３／４にて血球数の正常化をもたらす。ヒドロキシ尿素およびブスルファンで処置された患者とは異なり、α−インターフェロン処置された患者の１／３以上がＰｈ１−染色体含有移行期の低下を示し、処置患者の約１５％が５％未満のＰｈ’−陽性細胞を有する。α−インターフェロンを用いる実験は、最初に１９８５年に用いられて以来制限されている。ヒドロキシ尿素もしくはブスルファンで処置された患者よりもインターフェロン処置された患者にて予後が良好であるという確証はまだ存在しない。さらに、α−インターフェロンは発熱、食欲不振、筋肉痛および骨癌、抑−症およびしばしば免疫血小板減少症を包含する数種の副作用を示す。α−インターフェロンの他の欠点は、ヒドロキシ尿素もしくはブスルファンと対比して投与が一層複雑なことである（筋肉内注射対経口摂取）。

α−インターフェロンは白血病クローンの成長に対し優先的に作用するが、その効果はｐｈ’　−白血病細胞の持続および正常な増血細胞増殖の抑制により示されるように非特異性である。

化学療法およびα−インターフェロン処置に加え、ＣＭ　Ｌのための一層強力な治療は同一組織適合性の兄弟または組織適合上無関係なトナーへの許容性を有する患者における慢性期の際の骨髄移植を含む。骨髄移植は典型的には、徹底的な化学療法および全身照射を行ってｐｈｌ−陽性白血病細胞を死滅させた後に行われる。一般に骨髄移植後の患者の４５〜７０％にて長期生存率もありうるが、２０〜４０％は移植後の死亡を伴う。慢性期の病気の過程で早期に行えば、骨髄移植は特に成功する。

慢性期の際に移植した患者の約４０％は５年間を越えて［ベルゲスヒール、ジャーナルーキャンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー、第１１６巻、第１０４〜１０５頁（１９９０）］。「促進」もしくは「急性」期間における移植は成功率が低い。この種の患者の１０％未満しか白血病なしに５年間を越えて生存しな（１［同上］端細胞にて分化する白血病クローンの能力を順次喪失することを特徴とする。

ＣＭＬ患者、特に促進期における患者では、自家骨髄輸液の使用が増大している。自家骨髄輸液を作成するには骨髄細胞を罹患患者から集め、化学剤ｌこよって白血病細胞を「浄化」し、次いで徹底的な化学療法もしくは全身照射後の患者に戻す。

「芽球発症」の際は治療は殆ど無効であり、病気は最大３〜６ケ月以内で致命的となる。たとえばα−インターフェロンおよび自家骨髄輸液のような処置も有望であるが、これらは非特異性である。必要とされることは、カラチオロ等、サイエンス、第２４５巻、第１１００７〜１１１０頁（１９８９）は、ｃ−ａｂｌの第２エクソンの１８ヌクレオチドに対し相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＴＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２７）を用０るＰｈ１−陽性細胞ラインに５６２の抑制につき開示して０る。Ｋ５６２ラインの細胞はｂ２ａ２接合部を有する。

上記アンチセンスオリゴマーはｂｃｒ−ａｂｌ蛋白質レベルを低下させるのに有効であることも示されたが、このオリゴマーは同様に未転位ａｂｌからのメツセージに対しハイブリダイズするのでｂｃｒ−ａｂｌに対し特異スを感染させたマウスはＣＭＬ−類似の症候群を発生することが示された［ディリー等、サイエンス、第２４７巻、第８２４〜８３０頁（１９９０）；ハイスラーキャンプ等、ネイチャー、第３４４巻、第２５１〜２５３頁（１９９０）］。しかしながら、トランスジェニック動物にてＣＭＬ類似症状を開始させる人工的ｂｃｒ−ａｂ１作成物を用いるこの種の試験は、ｂｃｒ−ａｂ１発現か病気状態の維持に必要であるかどうか或いはｂｃｒ−ａｂ１発現の抑制が病気状態に作用を及ぼしうるかどうかを示さない。

発明の要点Ｐｈ’　−陽性白血病の処置方法が提供される。ハイブリッドｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子から転写されたＲＮＡを、Ｐｈ１−陽性白血病罹患の個人から分離された細胞より抽出する。ｂｃｒ−ａｂ１転位接合部を包囲するｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物の領域のヌクレオチド配列を決定する。次いでｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する約１３量体〜約２６量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを写物部分を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的配列に対しハイブリダイズすることができる。有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを罹患した個人またはそれから集められた細胞に投与する。

好ましくはオリゴヌクレオチドは１５量体〜２１量体であり、すなわち１５〜２１個のヌクレオチドを有するオリゴマーである。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは１５量体〜１８量体である。好ましくは、オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドである。好適具体例によれば、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなっている。

典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これがハイブリダイズするｂａｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列に対し２個以上のヌクレオチドミスマツチを持たない。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的配列は完全に相補的であり、すなわちミスマツチは存在しない。

数のａｂｌ−由来のヌクレオチドとｂｃｒ−由来のヌクレオチドとで構成される。

１つの処置方法は、Ｐｈ１−白血病罹患した個人から吸引された骨髄細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、このように処理された細胞を罹患した個人の人体に戻すことからなっている。

さらに本発明はＰｈ１−陽性白血病を処置するための医薬組成物をも提供し、この組成物は医薬キャリヤとヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する約１３量体〜約２６量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドとからなり、のオリゴヌクレオチドは標的配列にハイブリダイズすることができる。

本明細書に使用する場合、特記しない限り「オリゴヌクレオチド」と言う用語はりボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴリボヌクレオチド）とデオキシリボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴデオキシリボヌクレオチド、ここでは「オリゴデオキシヌクレオチド」とも称する）との両者を包含する。オリゴデオキシヌクレオチドが好適である。

ここで用いる場合、特記しない限り「オリゴヌクレオチド」と言う用語は「ポリヌクレオチド」と称するのに充分な大きさを有するオリゴマーをも包含する。

「オリゴヌクレオチド」および「オリゴデオキシヌクレオチド」と言う用語は、一般的な生物学上重要なヌクレオチド、すなわちヌクレオチド・アデニン（ｒＡＪ）、デオキシアデニン（ｒｄＡＪ）、グアニン（ｒＧＪ　）、デオキシグアニン（「ｄＧ」）、シトシン（ｒｃＪ　’）、デオキシシトシン（ｒｄｃＪ）　、チミン（ｒＴＪ　）およびウラシル（ｒＵＪ　）のオリゴマーおよびポリマーだけでなく、他のヌクレオチドを含有しうるｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうるオリゴマーおよびポリマーをも包含する。同様に、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴデオキシヌクレオチド」と言う用語は、１個もしくはそれ以上のプリンもしくはピリミジン部分、糖部分またはヌクレオチド間結合が化学改変されたオリゴマーおよびポリマーをも包含する。「オリゴヌクレオチド」と言う用語はしたがって、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の改変により「オリゴヌクレオシド」と称してもよいオリゴマーを包含すると理解される。

この種の改変オリゴヌクレオチドは、たとえば下記するアルキルホスホネートオリゴヌクレオシドを包含する。

「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」と言う用語は、ヌクレオチド間結合の１個もしくはそれ以上が式％式％のホスホロチオエート基であるオリゴヌクレオチドを意味し、これは未改変オリゴヌクレオチドの特徴である式％式％のホスホジエステル基とは異なる。

「アルキルホスホネートオリゴヌクレオシド」と言う用語はヌクレオチド間結合の１個もしくはそれ以上が式％式％［式中、Ｒはアルキル基、好ましくはメチルもしくはエチルである］のアルキルホスホネート基であるオリゴヌクレオチドを意味する。

ヌクレオチド配列に沿った方向に関して用いるｔ下流」と言う用語は５’−３’ 方向を意味する。同様に、「上流」と言う用語は３′→５′方向を意味する。特記しない限り本明細書で用いるヌクレオチド配列は５′→３′方向にて左側から右方向に記載する。

ｒｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物」という用語はヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の任意のｍＲＮＡ転写物を意味し、たとえばｂｃｒエクソン２とｃ−ａｂｌ−エクソン２との間の転位によって生ずるハイブリッド遺伝子（ｒｂ２ａ２Ｊ）　、ｂｃｒ−エクソン３と（−３１）ｌ−エクソン２との間の転位によって生ずるハイブリッド化遺ブリッド遺伝子（ｒｂ　１　ａ　２Ｊ　）のような全ゆる種類の第１図は、芽球発症における５人のＣＭＬ患者の群から１）られたｂｃｒ−ａｂｌ接合部に関するｃ　ＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１）を示す。矢印合により形成されたＬ−６型接合部の配列である。

第２Ａ、２Ｂおよび２０図は、未処理（第２Ａ図）。

第１図の標的配列に対し相補的であるが４個のヌクレオチドミスマツチを有する１Ｂ量体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２）によりインビトロで処理（第２Ｂ図）；または同じ標的配列に対し完全に相補的な１Ｂ量体のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）で処理（第２Ｃ図）である芽球発症患者細胞を有する１０日間ＣＭＬ細胞培養物の写真である。

第３図は、芽球発症における２人のＣＭＬ患者から得られたｂｃｒ−ａｂｌ接合部に関するｃＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４）を示す。矢印はｂｃｒ−ａｂｌ破断点を示し、枠は破断点接合部に対応すＬエエクソン３とｃ −ａｂｌ−エクソン２との融合により形成されたに一２８型ｂｃｒ−ａｂｌ接合部の配列である。

第４Ａ、４Ｂおよび４０図は第２Ａ、２Ｂおよび２０図と同様であって、第３図に示したｂｃｒ−ａｂｌ　Ｋ−２８型接合部を発現する芽球発症における患者からの細胞を含む１０日間ＣＭＬ細胞培養物からなっている。

これら細胞は未処理（第４Ａ図）；第３図の標的配列に対し相補的であるが２個のヌクレオチドミスマツチを有する１Ｂ量体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５）によりインビトロ処理（第４Ｂ図）；または同し標的配列に対し完全に相補的な１８量体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）により処理（第４Ｃ図）である。

第５図は、Ｐｈ１−陽性細胞ラインの細胞から得られたｂｃｒ−ａｂｌ接合部に関するｃＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）を示す。矢印はｂｃｒ−ａｂｌ破断点を示し、枠は破断点接合部に対応する１８−ヌクレオチド標的配列を示す。ｂｃｒ−由来の配列部分は破断点の上流に位置する。接合部はｂｃｒエクソン１とｃ−ａｂｌエクソン２との融合により形成される。

第６図は、同じＰｈ１−陽性ＡＬＬ細胞ラインからの培養物における白血病細胞の細胞数プロ・ソトである。細胞は未処理（−ｌ−）；第５図の標的配列に対し相補的であるが２個のヌクレオチドミスマツチを有する１日間体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　８）によりインビトロ処理（−ム一）；または同じ標的配列に対し完全に相補的な１日間体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）で処理（−〇−）である。

第７図は、培養にて対数増殖するＰｈ１−陽性白血病細胞ラインＢＶ１７３の細胞数プロットである（１×１０　細胞／　ｍ　Ｉ　）。細胞は未処置（−ロー）；２３量体ｂ２ａ２センスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドでインビトロ処理（−〇−１ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　３４、最終濃度３．ｃｚＭ）；または２Ｃ量体ｂ２ａ２アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９、最終濃度ニー八−１１，５μｍニー・−１３ＢＭ）によりインビトロ処理である。

第８図は、１０６ＢＶ１７３細胞を注射してから７日間（＋７）および２１日間（＋２１）の後に注射した５ＣＩＤ？ウスの各組織におけるｂｃｒ−ａｂｌ　ｂ２ａ２およびβ−アクチンｍＲＮＡ転写物の存在もしくは不存在を示す。

第９図は第８図と同様であって、マウスの組織（ＰＢＬ＝末梢血液白血球、５ＰＬ−膵臓、ＢＭＣ＝骨髄細胞）におけるｂｃｒ−ａｂｌ　ｂ２ａ２およびβ−アクチンｍＲＮＡ転写物の存在もしくは不存在を示す。マウスには、さらに１０６ＢＶ１７３細胞を注射してから７日間（＋７）もしくは２１日間（＋２１）の後に開始してそれぞれ連続９日間につき１ｍｇのｂ２ａ２センス（「Ｓ」、配列ＩＤ　ＮＯ：３４）またはアンチセンス（ｒａｓＪ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを静脈内接種した。比較マウス（「Ｃ」）には希釈剤のみを接種した。

第１０Ａ〜ＩＯＣ図は、同じ未処理（第１０Ａ図）、センス処理（第１．　ＯＢ図、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４）およびアンチセンス処理（第１０Ｃ図、ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　２９）のマウスの骨髄細胞懸濁物から得られたクロノジェニック分析の結果を示す。細胞（１０５）を塗抹して１２日間にわたり成長させ、次いて倒立顕微鏡で走査した。

第１１Ａおよび１１Ｂ図は、同じセンス処理およびアンチセンス処理のマウスにおける肝臓の写真である。多数の明確な白血病結節がセンス処理マウスからの肝臓に見られ（第１１Ａ図）、アンチセンス処理マウスからの肝臓では見られない（第１１Ｂ図）。

第１２図は同じ比較（−ロー）、センス処理（−〇−１Ｂ　Ｖ　ｉ　７３細胞注射の７日間後の処理；−Ｘ−１ＢＶＩ７３細胞注射の２１日後の処理；−△−１ＢＶ１７３細胞注射の２１日後の処理）；並びにアンチセンス処理（−■−１ＢＶ１７３細胞注射の７日間後の処理；−△−１ＢＶ１７３細胞注射の２１日後の処理）マウスの生存率のグラフである。

発明の詳細な説明本発明者等は、Ｐｈ１−陽性白血病における白血病状態の維持にハイブリッドｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の発現が必要であることを突き止めた。白血病細胞の増殖は、互ｃｒ−ａｂ１転位接合部に対応するｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物の領域にて標的配列に特異的にハイブリダイズする治療的「アンチセンス」オリゴヌクレオチドの投与によって効果的に抑制することができる。治療的オリゴヌクレオチドは、標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有するよう選択される。芽球発症における患ｎからの白血病細胞でさえ抑制することができる。これは、病気が急性段階まで進行した時点で追加的な転位を含む各種の遺伝子変化がｂｃｒ −ａｂ１転位の他に生ずるので驚異的である。

ｂｃｒ−ａｂ＋接合部のヌクレオチド配列には相当な個々の変化が存在する。少なくとも３種の主たる転位が現在知られている（ｂ２ａ２、ｂ３ａ２およびｂｌａ２）。効果的なアンチセンス処理は、個々の患者のｂｃｒ二ａｂｌ接合部における標的配列と相補的アンチセンスオリゴヌクレオチドとの密接なミスマツチを必要とする。

したがって本発明は、個々の患者のｂｃｒ−ａｂｌ接合部の特定ヌクレオチド配列に対し相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置方法を提供する。この種のオリゴヌクレオチドはＩ＼イブリ・ソド九−陽性白血病の治療的処置方法となる。慣用の化学療法は正常細胞および白血病細胞の両者にて核酸合成を抑制するが、ハイブリッＦｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子を発現する白血病細胞のみが影響を受ける。したがって、本発明によるオリゴマーを投与する際の適する量の選択は、慣用の化学療法の場合よりも臨界的でない。

ｂｃｒ−ａｂｌ破断点接合部を包囲するヌクレオチド配列における不均一性のため、療法は先ず最初に個々の患者の接合部を配列決定し、次いて好ましくはこの特定接合部に対し完全に相補的であるオリゴヌクレオチドを投与することを含む。このようにして、ｂｃｒ−ａｂｌ転写物に対し完全にハイブリダイズする傾向、およびｂ（ｒ−ａｂ１転位の阻止が最大化される。Ｐｈ１−陽性細胞増殖の実質的抑制が得られる。

治療的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定ｂｃｒ−ａｂｌ破断点接合部を含むｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ転写物における標的配列に対しハイブリダイズするよう作成される。さらにアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１３オリゴヌクレオチド以下のａｂｌ−由来の転写物部分を含む標的配列に対し相補的となるよう選択される。ｒａｂｌ−由来部分」という用語は、染色体転位にてｂｃｒコード化配列配列転位されるａｂｌコード化配列配列写から生じてＰｈ１−染色体の形成をもたらすｂｃｒ−ａｂｌ　ＲＮＡ転写物の部分を意味する。

同様に、ｂｃｒ−ａｂ１転写物の「ｂＣｒ−由来部分」という用語は、ｃ−ａｂｌに隣接するｂｃｒコード化配９すの転写から生ずる部分を意味する。

ｃ−ａｂｌ遺伝子は正常細胞で発現されて、正常な増血作用を調整する重要な役割を演する。したがって上記したように、ヒトｃ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物に対し相補的でありかつハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドは骨髄増血を抑制するが、赤血球増血しない濃度にて抑制する。ｃ−ａｂｌ　ｍＲＮＡに対しハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドはしたがって骨髄由来細胞の異常増殖を特徴とする障害を処置するのに有用であるが、これは本発明の主たる目的でない。寧ろ、本発明の目的は、未転位ｃ−ａｂｌ配列−ａｂｌ接合部に対し特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを処理して罹患患者に投与することである。したがって本発明は、約１３ヌクレオチド以下のｃ−ａｂｌ−由来のｂｃｒ−ａｂ１転写物部分に対しハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレー由来部分まで１３ヌクレオチド以下だけ延びるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも正常な非白血病増血性細胞の未転位Ｃ−ａｂｌメツセージに対し最小程度しか交差ハイブリダイズしない。このようにしてＰｈ１−白血病細胞の増殖は、正常な増血作用に対し悪影響なしに抑制される。

他方、未転位ｂＣｒ遺伝子からの転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの若干大きい程度の非特異的ハイブリダイズを許容することができる。何故なら、ｂｃｒ遺伝子の発現は現在では正常な増血作用に重要でするので回避すべきである。

リボヌクレオチドの特異的ハイブリッド化を確保するには、オリゴヌクレオチドが約６〜約１３ａｂｌ　−由来ヌクレオチドを含む配列を有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの残部が標的配列のｂｃｒ−由来ヌクレオチドに対し相補的であることが好適である。特に好ましくは、はぼ同数のヌクレオチドを転位破断点に整列する両側に有する）標的ｍＲＮＡ配列に対し相補的である。したがって、ｂ２ａ２接合部に対し相補的な最も好適である１鼾のアンチセンスオリゴヌクレオチドは次の偶数の１４〜２６億体を包含する。

破断点社１応に、次の偶数の１４〜２６量体はそれぞれｂ３ａ２接合部破断点 ↓ およびｂｌａ２接合部：破断点 ↓ に対し相補的である最も好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の治療法における最初の工程は、処置すべき患者がハイブリッドｂｃｒ− ａｂｌ遺伝子を有すると確認することである。これは、患者のＲＮＡもしくはｃＤＮＡをたとえば米国特許第４，６８１，８４０号および第４．８７４．８５３号（参考のため、その全開示をこころ。全ＲＮＡは上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つもしくはそれ以上で検査することができる。最後に、Ｐｈ１−陽性白血病の分子的診断は、たとえばカワサキ等によりプロシーディング−ナショナル・アカデミ−Φサイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第５６９８〜５７０２頁（１９８８）　（参考のため、ここに引用する）に開示された方法のような逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用い特徴的なｍＲＮＡ配列を拡大させると共に検出して達成することができる。

決定のため患者の末梢血液および／または骨髄から得られる。これら細胞は、たとえば非里核細胞を除去するフィコール・ハイパツク遠心分離のような方法によって濃縮することがてきる。ｂｃｒ−ａｂｌハイブリッド遺伝子に対応するヌクレオチド配列を持ったＲＮＡを逆転写、したがって全ｍＲＮＡを、たとえばモレキュラ・クローニング　ラボラトリ−・マニュアル（第２版、１９８９）、Ｊ、サムプルツク等編、第７．９〜７．１１頁（参考のため、ここに引用する）に記載された方法のような周知の抽出法にしたがいＰｈ１−陽性濃縮細胞から分離する。特に、たとえばチョムジンスキー等によりアナリチカル・バイオケミストリー、第１６２巻、第１５６〜１５９頁（１９８７）　（参考のため、ここに引用する）により記載された酸グアニジウムチオシアネートーフェノール−クロロホルム抽出法のような単一工程のＲはＲ”ｌ”ＰＣＲによりクローン化させる。したがって、ｂｃｒエクソン２およびａｂｌエクソン２に対し特異的な合成プライマーをＲＴ−ＰＣＲ技術で用いて、ｂ２ａ−を用いて、ｂ３ａ２接合部を拡大させる。この種の合成プライマーは、ｂ２ａ２およびｂ３ａ２破断点接合部につき公表された配列に基づいて作成することができる［ンユチヘルマン等、セル、第４７巻、第２７７〜２８６頁（１９８６）、参考のためここに引用、並びにフエインンユタイン等、ネイチャー、第３３０巻、第３８６〜３８８頁（１９８７）、参考のためここに引用］。

増大工程の後、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を直接に配列決定することができる。或いは、生成物をさらに適するヘクター、たとえばブリースクリプトＳＫ（Ｍ１３−）ヘクター［ストラタジーンークローニング・システムス、う・ヨラ、ＣＡコでのクローン化によって拡大させることもでき、これはモレキュラ・クローニング、第１２０頁およびショート等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１６巻、第７５８３頁（１９８８）に記載されている。クローン化されたポリメラーゼ連鎖反応生成物のｂｃｒ−ａｂｌ破断点に関する適切な領域の配列決定を次いでたとえばモレキュラ・クローニング、第１３章（参照のため、ここに引用する）に記載されたような慣用の配列決定法にしたがって行う。

個々の患者の適切なりｃｒ−ａｂｌ破断点に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、次いで上記で得られた配列情報に基づいて作成する。一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｂｃｒ−ａｂｌメツセージの標的配列に対し完全に相補的な配列を有する。

しかしながら特に大型オリゴマーにおいては、絶対的な相補性は必要でない。特記しない限り、ここで「標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列」と言う説明は、必ずしも転写物に対し１００％の相補性を有する配列を意味しない。一般に、ｂｃｒ−ａｂｌメツセージの標的領域と共に安定なデユープレックスを形成するのに充分な相補性を有する任意のオリゴヌクレオチドが適している。

安定なデユープレックス形成は、ハイブリッドダイズするオリゴヌクレオチドの配列および長さ、並びにメツセージの標的領域に対する相補性の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズするオリゴマーが大きいほど、より多数のミスマツチを許容することができる。２個以上のミスマツチは恐らく約１８〜２１ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴマーにつき許容しえない。当業者は、任意所定のアンチセンスオリゴマーとｂｃｒ−ａｂｌメツセージ標的配列との間で許容しうるミスマツチの程度を融点に基づいて容易に決定することができ、したがって得られるデユープレックスの安定性を容易に決定することができる。所定塩基対組成のデユープレックスに関する融点は、たとえばモレキュラ・クローニング：ラボラトリ−・マニュアル［第２版（１９８９）　、Ｊ、サムプルツク等編コのような標準文献から決定することができる。長さ１８〜２１ヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドにおいては、２個以下のミスマツチが好適である。１７もしくはそれ以下のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは好ましくは標的配列に対し完全に相補的である。特に好ましくは、本発明により投与されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの寸法とは無関係に標的配列に対し１００％の相補性を有する。

約１３ヌクレオチドより短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ配列に対するハイブリッド化の特異性が低く、酵素切断によって容易に破壊することができ、さらに酵素切断によって不安定化される。したがって、１２もしくはそれ以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは本発明の実施に推奨されない。約２６ヌクレオチドより長い配列は、標的細胞による吸収が減少するためｂｃｒ−ａｂｌ翻訳の抑制にて若干効果が低い。さらに、オリゴマーが大きくなる程、未転位ｂｃｒ配列もしくは未転位ｃ−ａｂｌ配列のいずれかに対する非特異的ハイブリッド化に関する機会が大となる。したがって、本発明は約１３〜約２６ヌクレオチド、好ましくは約１５〜約２１ヌクレオチド、特に好ましくは約１５〜約１８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いる。

本発明の実施に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意公知の化学的オリゴヌクレオチド合成法によって合成することができる。この種の方法は、たとえばウィンナツカ−１「遺伝子からクローンまで：遺伝子工学の序論Ｊ、ＶＣＨフエアラークゲゼルシャントｍ。

ｂ、Ｈ，（アイベルガラフッ・トランスレーション、１９８７］に記載されている。最も有利には、オリゴヌクレオチドは任意市販の自動化核酸合成装置を用いて作成される。この種の１つの装置、すなわちアプライド・バイオシステムス社［フォスター・シティ−１ＣＡ］の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置はβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用いる。

使用するオリゴヌクレオチドは未改変のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体を示すことができる。すなわち、本発明に用途を有するｂｃｒ−ａｂ１ｍＲＮＡ標的配列に対しハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドは生物学上重要な天然ヌクレオチド、すなわちＡ、ｄＡ、ＧＳｄＧＳＣ，ｄＣ，ＴおよびＵのオリゴマーだけでなく、安定性および／または脂質溶解性の改善につき改変されたオリゴヌクレオチド種類をも包含する。たとえば、向上した脂質溶解性および／またはヌクレアーゼ切断に対する耐性はヌクレオチド間ホスホジエステル結合における燐酸の酸素の代りにアルキル基もしくはアルコキシ基を用いてアルキルホスホネートオリゴヌクレオシドまたはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを生成させることにより得られることが知られている。たとえばこれらの非イオン型オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ加水分解に対する増大した耐性および／または増大した細胞吸収を特徴とすると共に相補的核酸配列との安定な複合体を形成する能力を保持する。特にアルキルホスホネートはヌクレアーゼ切断に対し安定であると共に脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオシドの製造については米国特許第４，４６９，８６３号に開示されており、メチルホスホネートが特に好適である。

メチルホスホネートオリゴマーは、溶液中および不溶性ポリマー支持体上の両者にて各種の方法で作成することができる［アグローワルおよびリフチナ、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第６巻、第３００９〜３０２４頁（１９７９）；ミラー等、バイオケミストリー、第１８巻、第５１３４〜５１４２頁（１９７９）、ミラー等、ジャーナル・バイオロジカルｅケミストリー、第２５５巻、第９６５９〜９６６５頁（１９８０）；ミラー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻、第５１８９〜５２０４頁（１９８３）、ミラー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻、第６２２５〜６２４２頁（１９８３）；ミラー等、バイオケミストリー、第２５巻、第５０９２〜５０９７頁（１９８６）；エンゲルスおよびジャガー、アンゲバンテ・ヘミ−・サブルメント、第９１２頁（１９８２）；シンハ等、テトラヘドロン・レタース、第２４巻、第８７７〜８８０頁（１９８３）；ドルマン等、テトラヘドロン、第４０巻、第９５〜１０２頁（１９８４）；ジャガーおよびエンゲルス、テトラヘドロン・レタース、第２５巻、第１４３７〜１４４０頁（１９８４）；ノープル等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１２巻、第３３８７〜３４０４頁（１９８４）；キャラハン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第１６１７〜１６２１頁（１９８６）；コシオルキエウィソツ等、ケミ力・スフリプタ、第２６巻、第２５１〜２６０頁（１９８６）　アグローワルおよびグツドチャイルド、テトラヘドロン・レタース、第３８巻、第３５３９〜３５４２頁（１９８７）　：レスニコウスキー等、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第５５３５〜５５３８頁（１，９８７）；サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ。

第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）］。

メチルホスホネートオリゴヌクレオシドの最も効率的な製造方法は、オリゴデオキシリボヌクレオチドを作成するために使用されるメトキシもしくはβ−シアノエチルホスホルアミダイト試薬と同様である５′−〇−ジメトキシトリチルデオキシヌクレオシド−３′　−〇−ジイソプロピルメチルホスホルアミダイト中間体の使用を含む。メチルホスホネートオリゴマーは、自動化ＤＮＡ合成装置を用い調節気孔のガラスポリマー支持体にて作成することができる［サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）］。

ここに記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成するのに適するヌクレオチド同族体は、限定はしないが米国特許第４，４６９，８６３号に開示されたエチルもしくはメチルホスホレート同族体、並びにラプランシ二等によりヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、第９０８１頁（１９８６）およびステック等によりジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０６巻、第６０７７頁（１９８４）に記載されたホスホロチオエート改変オリゴデオキシヌクレオチドを包含する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一般的合成法はスタイン等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１６巻、第３２０９〜３２２１頁（１９８８）により改変されて、これら化合物をホスホルアミダイド法により自動合成装置で容易に合成しうるようにした。

さらに、ヌクレアーゼ切断に対する耐性も、５′末端と３′末端との両者におけるヌクレオチド間結合をダブル等の方法［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１８巻、第４７５１〜４７５７頁（１９９０）］に従いホスホルアミダイトで改変して達成することができる。

ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合に硫黄と酸素との置換を有する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、デユープレックス形成のための効果的ハイブリッド化の性質と実質的なヌクレアーゼ耐性とを兼備すると共に、帯電したホスフェート同族体の水溶性を保持する。帯電は、リセプタを介する細胞吸収の性質を付与すると思われるしロース等、プロシーディングφナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８６巻、第３４７４〜３４７８頁（１９８９）］。

ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはラプランシエ等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、第９０８１頁（１９８６）およびステック等、／ヤーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０６巻、第６０７７頁（１９８４）に記載されている。

ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一般的合成法はスタイン等［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１６巻、第３２０９〜３２２１頁（１９８８）］により改変されて、これら化合物をホスホルアミダイト手法により自動合成装置で容易に合成しうるようにした。

さらに、オリゴリボヌクレオチド同族体の製造における最近の進歩は、上記目的で他の試薬、たとえば２′−〇−メチルリボヌクレオチド［イノラブ等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第６１３１頁（１９８７）］および複合ＲＮＡ−ＤＮＡ同族体であるキメラオリゴヌクレオチド［イノラブ等、ＦＥＢＳリタース、第２１５巻、第３２７頁（１９８７）］をも使用しうろことを意味する。

アンチセンスオリゴリボヌクレオチドもしくはオリゴレアーゼによる酵素攻撃に対し遊離オリゴリボヌクレオヂドはオリゴデオキシリボヌクレオチドよりも感受性が大である。したがって、本発明の実施にはオリゴデオキーＲＮＡハイブリッ、ドデュープレックスがＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を特異的に攻撃するＲＮアーゼＨの基質であるため、オリゴデオキシリボヌクレオチドが好適である。デユープ１ノツクスのｍＲＮＡストランドの分解は、他のｂｃｒ−ａｂ１メツセージに対するハイブリッド化のためのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドストランドを放出する。

ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適する医薬組成物として患者に投与することができる。

或いは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは患者から集めた細胞に対し生体外で投与することもできる。したが細胞により汚染された患者の骨髄をインビトロ清浄するため骨髄清浄剤として用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同族もしくは自家骨髄移植における清浄剤として有用であると思われる。

骨髄の清浄方法によれば、骨髄をドナーの腸骨から標準操作の室内法によって集める。ドナーからその骨髄を吸引する方法は当業界で周知されている。ドナーから骨髄を吸引するだめの装置および方法の例は米国特許第４゜４８１．９４６号および第４，４８６，１８８号（参考のため、ここに引用する）に開示されている。ドナー（自家移植）または他の個人（同族移植）のいずれかである受給者が体重１ｋｇ当り約４×１０８〜８×１０８の処理骨髄を受けうるよう充分な骨髄を抜取る。これは一般に約７５０〜約１．０００　ｍ　ｌの骨髄の吸引を必要とする。吸引された骨髄を、「バフィコート」調製物として当業者に知られた単細胞懸濁物が得られるまで濾過する。この白血球の懸濁物を適するキャリヤにてアンチセンスオリゴヌクレオチドで有利には約８ｍｇ／ｍ＋の濃度にて処理する。

或いは白血球懸濁物を、清浄を行うまで当業者に知られた標準法により液体窒素に貯蔵することもできる。清浄された骨髄を使用するまで液体窒素中に凍結貯蔵することができる。骨髄および生物学的物質の凍結方法はたとえば米国特許第４，１０７，９３７号および第４，１１７．’８８１号（参考のため、ここに引用する）に開示されている。

アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するだめの骨髄の他の製造方法を用いることもてき、これら方法は上記バフィコート調製物よりもずっと精製された増血細胞の調製物をもたらす。

１種もしくはそれ以上の増血成長因子を吸引骨髄またはバフィーコート調製物に添加して増血腫瘍の成長を刺激し、これによりｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性に対する感受性を増大させることができる。この種の増血成長因子はたとえばＩ　Ｌ−３および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）を包含する。これら成長因子のヒト組換体も有利に用いられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した後、移すべき細胞を自己血漿もしくは緩衝液で洗浄して、組込まれないオリゴマーを除去する。次いで洗浄した細胞を患者に注入する。生体内使用のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドをたとえば適する液体ベヒクルもしくは賦形薬のような医薬キャリヤおよび適宜の補助添加剤と組合せることができる。液体ベヒクルおよび賦形薬は慣用のものであって市販入手できる。その例は蒸留水、生理食塩水、デキストロースの水溶液などである。生体内使用には、ｂｃｒ−ａｂ、ｌアンチセンスオリゴヌクレオチドを好ましくは非経口的、特に好ましくは静脈内で投与する。ベヒクルはそれに応じて設計される。さらにこの種の化合物は末梢血液から白血球を分離し、これらをアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、次いで処理された細胞をドナーの末梢血液に戻して生体外で投与することもできる。生体外の技術は、インターロイキン−２活性リンパ球での癌患者の処置に用いられており、当業者に周知されている。

慣用のキャリヤと共に投与する他、アンチセンスオリゴヌクレオチドは各種の特殊なオリゴヌクレオチド供給技術によって投与することもできる。たとえば、オリゴヌクレオチドを治療投与のためリポソーム内にカプセル化することもできる。オリゴヌクレオチドはその溶解度に応し水層または脂質層の両者に存在させることができ、一般にリポソーム懸濁物と称する。疎水層は、一般に限定はしないが、たとえばレシチンおよびスフィンゴミエリ／のような燐脂質、たとえばコレステロールのようなステロイド、たとえばジアセチルホスフェート、ステアリルアミンもしくはホスファチジン酸のようなイオン型表面活性剤および／または疎水性の他の物質を包含する。

オリゴヌクレオチドはユニラメラリポソーム中へのカプセル化に成功している。

再編成されたセンダイウィルスエンベロブを用いてＲＮＡおよびＤＮＡを細胞に供給することに成功している［アラド等、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ、第８５９巻、第８８〜９４頁（１９８６）］。

さらに、アンチセンスオリゴマーはポリ（Ｌ−リジン）結合体としても供給されている。この種の結合体はレメトワ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第６４８〜６５２頁（１９８７）に記載されている。

たとえば骨髄浄化におけるような生体外の抗腫瘍用途には、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｐｈ１−陽性細胞を死滅させると共に正常な増血細胞の生存性を維持するのに有効な量で投与することができる。この量は特定患者の腫瘍の程度、用いる特定のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドに対する腫瘍の相対的感受性および他の因子に応して変化する。１０５細胞当り約１０〜２００μｇ　／　ｍ　ｌの濃度、好ましくは１０５細胞当り約４０〜１５０ μｇ／ｍｌの濃度を用いることができる。同量もしくはより少量のオリゴヌクレオチドの追加投与が処置を最適化するのに有利である。

たとえば、骨髄容積１ｍｌ当り２Ｘ１０７細胞を含有する骨髄の清浄には、骨髄１ｍｌ当り約２〜４０ｍｇのアンチセンスの量、好ましくは約８〜２４ｍｇ／ｍｌが効果的に用いられる。それより多量もしくは少量のオリゴヌクレオチドも用いることができる。

生体内の使用には、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドを、上記のインビトロ濃度にほぼ等しい細胞外濃度をもたらすのに充分な量で投与することができる。この量は腫瘍の程度、用いる特定オリゴヌクレオチドおよび他の因子に応じて変化することができる。実際の投与量は患者の体格および体重（処置の性質は予防もしくは治療のいずれてあってもよい）、患者の年齢、健康状態および性別、投与ルートおよび曲の因子を考慮することができる。当業者は適する投与量および投与方式を特定の状況に合わせて容易に決定することができる。

１０の投与量は１日当り約０．１〜ｉ、０００ｍｇのオリゴヌクレオチド、好ましくは約１日当り約１０〜約１゜０００ｍｇの範囲とすることができる。それより多量もしくは少量のオリゴヌクレオチドも所要に応して投与することができる。

上記生体内の試験に基つき、処置の経過は有利には推奨した１日のオリゴヌクレオチドの投与量を約６日間〜約２６日間、より好ましくは約９〜約１２日間にわたり注入することからなっている。当業者は、各場合に最適量を容易に決定することができる。

成人の場合、体重１ｋｇ当り毎日約５０ｍｇのオリゴヌクレオチドの投与量か、１〜１０μ〜１の有効な・細胞外濃度を得るのに充分であると思われる。

本発明は、腫瘍細胞に対し成長増進を付与する遺伝子の発現を特異的に抑制することに基づく白血病の処置方法を提供する。すなわち本発明は、これら細胞を選択的に除去する機会を与える。これに対し、大抵の癌装置は酵素経路を封鎖し或いは細胞表現型とは無関係にＤＮＡとランダムに相互作用させることに基づいている。したがって、特定薬剤による正常細胞と対比した腫瘍細胞のに対するこの薬剤の特定作用でなく、正常細胞と癌細胞との間の代謝過程（たとえば成長速度）の差を利用する。

以下、限定しないが実施例により本発明を一層詳細に説明する。

実施例１〜６はインビトロの試験を含ミ、ｐｈ’−白血病細胞増殖の抑制と正常骨髄プロゲニタの増殖許容とを破断点接合部に対し相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドにより同時に示す。これら実験は腫瘍細胞の遺伝子標的による選択的死滅の可能性を示す。

実施例７〜１２においては、白血病増大の生体内モデル［カメルーライド等、サイエンス、第２４６巻、第１５９７頁（１９８９）；セサノ等、ブラッド、第７７巻、第２４６３頁（１９９１）；ディック、キャンサー・セル、第３巻、第３９頁（１９９１）］を用いて、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが白血病細胞増殖をインビボにて効果的に抑制することを示す。重傷合併免疫不全（ＳＣＩＤ）のマウスに白血病細胞を注射して、人間における病気と近似した病気過程を発生させた。ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスで処置したマウスは病気から保護された。各器官におけるアンチセンスオリゴマーの細胞関連の蓄積は４〜６０μＭに達し、これは白血病細胞の増殖を抑制するのに充分である（第７図参照）。この範囲におけるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの細胞外濃度は、健康なヒトドナーの骨髄から得られたコロニー形成細胞にっきインビトロでは無毒であり、ＣＭＬ芽球発症患者からの一次白血病細胞の増殖を極めて効率的に抑制した［データ示さ白血病細胞を芽球発症における５人のＣＭＬ患者の後部腸骨稜における骨髄から得た。これら細胞をイソコープ改変デュルヘッコ培地（ＩＭＤＭ）で１・２に希釈して細胞懸濁物を作成した。フィラデルフィア染色体陽性の芽球細胞をフィコール・ハイパツク密度勾配沈降により分離して非単核細胞を除去した。かくして、骨髄細胞懸濁物を２・１の比にてヒストパック密度勾配（シグマ・ケミカル・カンパニー社、セントルイス、ＭＯ）に静かに載せ、次いで１５００ｒｐｍにて１８℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後に、界面層に残る細胞をパッスールピペットで集め、ｌ　ＭＤＭにより１１０００ｒｐにて４０℃で１−０分間洗浄した。

Ｂ、破断点配列決定メチルセルロース半固体培地に塗抹した細胞を７〜１１日間にわたり培養した後に培地から回収した。全ＲＮへをコムチンスキー等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１６２巻、第１５６〜１５９頁（１９８７）の方法により分離した。特に過大細胞増殖した１人の患者から分離されたＲＮＡ　（６，１〜５　ｔｔ　ｇ）を、ｃ−ａｂＴ−ＰＣＲプライマＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴ　ＧＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）と３７℃にて３０分間にわたりアニールさせた。３′プライマーのアニールの後、ＲＮＡを５００単位のモロニー・種ネズミ白血病ウィルス逆転写酵素で３７℃にて１時間転写させた。反応を停止させ、混合物を１×テルムス・アクな２２ヌクレオチドオリゴマーＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＡＴ　ＣＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１ｇ／′μｌの最終濃度まで添加してｃＤＮＡ断片を拡大させた。５５℃でアニールし、７２℃ で合成し、さらに９５°Ｃて変性させて、６０サイクルのＰＣＲをパーキン・エルマー−サーマル・サイクラ−で行なった。ｂ２ａ２接合部に対応する拡大生成物を次いで２％アガロースゲルで分離した。ｂｃｒ−ａｂｌ断片を含有するバンドを切除し、ジーン・クリーン（登録商標）キット［バイオ１０１、インコーポレーション社］を用いて標準技術により清浄し、ＳＭＡ　Ｉ切断により線状化させたブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン・クローニング・システムス社）にて盲端結合によりクローン化させた。数種の個すのクローンを、次いで製造業者により推奨される配列決定法に従いセクエナーセ２０酵素（米国バイオケミカル・コーポレーション社、クリープランターにおけるクローン化部位に整列する特定プライマーとセクエナーゼ（登録商標）反応緩衝剤の存在下に１５分間にわたり３７℃でアニールさせた。プライマーアニールした断片を室温にてセクエナーゼ（登録商標）２゜０酵素と共に室温で培養し、α−５３５ｄＳＴと共に３７℃で培養した。次いて標識された雛型−プライマー複合体をＡ、ＴＳＣおよびＧヌクレオチドを含有する試験管（チューブ１本当り１種のヌクレオチド）に移し、３７℃にて５〜３０分間培養した。次いて各試料を予め作成したアクリルアミ］・ゲルに充填し、約１０時間にわたり流した。配列決定用ケルを乾燥し　フィルムをＯ／Ｎに露出した。数種の個々のクローンの配列分析は、ｂｃｒ− ａｂｌ接合部が第１図に示したｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：］、）を有することを確認した。図面における矢印はｂｃｒ−ａｂｌ破断点接合部を示し、枠は接合部に対応する１８ヌクレオチドを示し、これはアンチセンスオリゴマーのハイブリッド化に好適な標的配列を形成する。接合部はンユチヘルマン等、セル、第４７巻、第２７７頁（１９８６）により報告されたＬ−６型破断点に正確に対応し、ここてｂｃｒエクソン２はｃ−ａｂ１エクソン２に融合する。

接合部の１８−ヌクレオチド標的配列に対し特異的な合成】８量体ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を用い芽球発症ＣＭＬ　ＲＮＡから得られたＲＴ−ＰＣＲ拡大生成物のハイブリッする９ヌクレオチドに対し相補的なこの「アンチセンス」オリゴマーを、モデル３８０　Ｂ　ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムス・インコーポレーション社、フォスター・シティ、ＣＡ）を用いて合成した。クローン化した破断点の配列決定分析は、４種の場合のそれぞれにて接合部が第１図に示した配列と同一であることを芽球細胞（０，５Ｘ１０５細胞）をインターロイキン−３（ＩＬ−３，２０Ｕ／ｍｌ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ、５ｎｇ／ｍｌ）の存在下に０．４ｍｌの液体懸濁培養物（２％ヒトＢ血清を含むイソコープ改変デュルベッコ培地）に入れて、細胞コロニー形成を刺激した。標的配列に対し完全に相補的であるＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣ’ＴＴＣＣＴＴＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）オリゴマーの他に、ミスマンスオリゴマーＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴＡＴも作成された（ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：２）。ＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ８Ｆ処理した培養物には培養の開始時点で４０ｕｇ／ｍｌ　（Ｌμｇ／ｍ１＝ｏ、３５ｕＭ）（Ｄオリゴヌクレオチドを接種し、１８時間後に２０μｇ　／　ｍ　ｌを接種した。比較培養物は未処理のままにした。培養物にオリゴヌクレオチドを第２回目に添加してから４時間の後、細胞をＩＬ−３（２０Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−Ｃ８Ｆ（５Ｂｇ／ｍｌ）を含有する２反復のメチルセルロース皿に直接シーディングした。半固体培養物に入れた細胞をさらに１０日間にわたり成長させた。次いでプレートを倒立顕微鏡で走査し、コロニーおよびクラスターの・１ − 全数を計数した。成る場合にはＰｈ　陽性芽球細胞を増血成長因子の不存在下に培養し、これら条件下でコロニーは成長因子の存在下におけるよりも少数かつ小型であった。未処理細胞およびミスマツチオリゴマーに露出した細胞は多数の芽球細胞のコロニーを形成しくそれぞれ第２Ａおよび２Ｂ図）、これに対しすっと少数の細胞を含む極めて少数のコロニーがｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で形成された（第２Ｃ図）。５人のＬ−６型接合患者からの芽球細胞から得られたコロニー形成の抑制は、反復実験にて６０〜９０％の範囲であった（第１表参照）。これに対し、正常プロゲニタから形成されたコロニーの個数は合成オリゴマーの存在下でも不存在下でも実質的に同一であった（示さず）。

１　４５０±６４　１１２±１８　７５２　３２４±　１８　６２±８　８２３　４８０±８８　５０±１２　９０４　２１２±１５　８０±８　６０５　３８０±１６　７０±８　８２第２の一般的種類の接合部を有するＣＭＬ芽球発症患者を確認するため、芽球発症におけるＣＭＬ患者の細胞から得られた全ＲＮＡを合成プライマーで逆転写させた。

３′プライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）はＣ−見ｂｌエクソン２の２２ヌクレオチドに対し相補的であった。５′プライマーはｂｃｒエクソン３の２２ヌクレオチドに対し相補的な２２量体ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）であった。このＲＮＡを実施例１によるポリメラーゼ連鎖反応により拡大させた。拡大生成物を、次いてｂ３ａ２接合部に対し相補的である合成１８ｍ体オリゴヌクレオチドＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴ　ＴＧＡＡＣＴＣＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）にハイブリダイズさせた。２人の患者にて破断点をクローン化させた後、数種のクローンの配列分析により、第・３図に示したに一２８破断点に正確に対応するｂ３ａ２接合部を確認した（ＳＥＱ　ＩＤ実施例１の培養条件およびオリゴマー処理条件を用い、オチドとを含有するが２つのミスマツチを有するｂ３ａ２接合部に対し部分的に相補的な１８ヌクレオチド合成オリゴマーＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴ　ＴＧＡＡＣＴＣＴ（、ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：５）（第４Ｂ図）；または同しｂｃｒ−ａｂｌ接合部に対し完全に相補的な１８ヌクレオチド合成オリゴマーＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴ　ＴＧＡＡＣＴＣＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）（第４Ｃ図）に露出させた。

Ｋ−２８破断点を有する上記２人の患者において、標準ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴ７−（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６）によるコロニー形成の抑制は２反復の実験にて第２表に示したように６０〜７０％の範囲であった。

第２表１　２７８±２８　１０２±１４　６５２　１８２±１８　６８±１２　６３に一２８型破断点を有する同じ患者からの細胞を、同様にＬ−６型接合部に対し相補的なアンチセンスオリゴマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）に露出させた。コロニー形成の顕著な低下（２，５〜５％抑制）は、未処理細胞と比較して、このオリゴマーでは観察されず、Ｋ−２８接合部に対し完全に相補的な１８量体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ンで処理された細胞に対する観測された効果の特異性を示した（第以下の実験は、正常な増血プロゲニタ細胞を完全に影アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を示す。

正常な骨髄単核細胞（ＭＮＣ）を同意した志願者から吸引により得ると共に、多数の研究者により従来報告されたように増血プロゲニタにつき濃縮した［ザメクニッり等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー−サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第４１４３〜４１４７頁（１９８６）、カラチオロ等、ジャーナル・クリニカル、インベスチゲーション、第８５巻、第５５〜６１頁（１９９０）］。要するに、骨髄細胞をフィコール・ハイバック密度勾配沈降にかけ、次いでそれぞれプラスチックペトリ皿への付着およびニューラミネダーゼ処理されたヒツジ赤血球でのロゼッチングにより付着性モノサイト・マクロファージおよびＴ− リンパ球を除去した。

フィラデルフィア染色体陽性の芽球細胞をフィコール・ハイパツク密度勾配沈降により芽球発症におけるＣＭＬ患者から分離した（Ｌ−６型接合部）。形態学的分析は、細胞の９５％以上が芽球であることを示した。残余の非芽球細胞は小リンパ球の形態学的外観を有した。２５゜０００ＭＮＣおよび２５．ＯＯＯＣＭＬ芽球細胞を合し、ｂｃｒ−ａｂｌ破断点特異性アンチセンスオリゴマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）（４０μｇ／ｍｌ、Ｏ時点；２０μｇ／ｍｌ、１８時間後）と共に或いは４ヌクレオチドミスマツチのｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）（４０μｇ／ｍｌ、０時点；２０μｇ　／　ｍ　ｌ、１８時間後）と共に培養し、或いは未処理で残した。オリゴヌクレオチドを培養物に第２回目に添加してから４時間の後、細胞をＩＬ−３（２０Ｕ／ｍ＋）とＧＭ−Ｃ８Ｆ　（５ｎｇ／ｍｌ）とを含有する２反復のメチルセルロース皿にシーディングし、さらに１２日間にわたり増殖させた。培養期間の終了後、コロニーを計数した。

１２日間にわたり培養した後、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴマーに露出したＣＭＬ芽球発症細胞から生じたコロニーの個数（白血病コロニー形成単位、ｒＣＦＵ−ＬＪ　）は、ミスマツチｂｃｒ−ａｂｌオリゴマーの存在下で生じた個数よりもずっと少ないことが明かであった。このデータを下表３に示し、ここで数値は２反復の比較培養物（オリゴヌクレオチドを添加せず）および２反復実験培養物の２回の別々の実験からの平均上標準偏差を示す。コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）由来のコロニーは５０個もしくはそれ以上の細胞凝集体で構成されるのに対し、ＣＦＵ−ＧＭ−由来のクラスタは４〜４０個の細胞の凝集体として規定された。これらはプロケニタから得られた正常な増血性コロニーであって、顆粒球およびマクロファージ系列に沿って分化する能力を有する。これに対し、正常なプロゲニタから形成されるコロニーの個数は合成オリゴマーの存在下でも不存在下でもほぼ同じであった。

第３表オリゴヌクレオチド　ＣＦＵ−ＧＭ　ＣＦＵ−Ｌ＊比較　２６３±１０　８０６ ±７０（オリゴマー添加せず）４ヌクレオチド　２６５±６　７８６±２３ミスマツチを持たない　２５３±３５　１８０±１４アンチセンス第３表（続き）オリゴヌクレオチド　ＣＦＵ−ＧＭ＋ＣＦＵ−Ｌ＊＊比較　９７８±２４（オリゴマー添加せず）４ヌクレオチド　９００±４６ミスマノチを持たない　４５０±４２アンチセンス＊ＣＦＵ−Ｌ＝ＣＭＬ芽球発症細胞から形成された＊＊ＣＦＵ−ＧＭ＋ＣＦＵ− Ｌ＝正常骨髄プロゲニタとＣＭＬ芽球発症細胞との１＝１混合物から形成されたコロニー。

形成されたコロニーをメチルセルロース板から除去して、残留コロニーか正常細胞もしくは白血病細胞のいずれて構成されるかを決定した。プレートから除去した残留コロニーからの細胞を分離し、ジームサ（Ｇｉｅｍｓり　染色により形態学的に同定した。ＣＭＬ芽球発症細胞から生ずるコロニーでは芽球細胞のみが確認された。ミスマツチ（４ヌクレオチド置換）ｂｃｒ−ａｂｌオリゴマーに露出した正常ＭＮＣおよびＣＭＬ芽球発症細胞の１−１混合物では予想通り分離細胞は不均一であって、芽球細胞と各種の分化要素とで構成された。標準ｂｃｒ−ａｂ１アンチセンスオリゴマー（ミスマツチなし）に露出された正常ＭＮＣおよびＣＭＬ芽球発症細胞の１−１混合物では分離細胞は主として分化要素で構成され、したかって正常プロゲニタの維持および白血病芽球細胞の選択的除去を示唆した。

実施例４残留細胞のｂｃｒ−ａｂ１発現の分析フィラデルフィア染色体芽球細胞の除去を明確に証明するため、実施例３からの残留細胞をｂＣｒ−ａｂ１転写物の発現につき評価した。何故なら、この転写物のレベルは生存する白血病細胞の個数を反映するからである。

この目的で全ＲＮＡを実施例３からのコロニーの保存物から分離し、ｂｃｒ−ａｂ１転写物のレベルを評価した。

さらにβ２−マイクログロブリン転写物のレベルをも比較として測定した。β２ −マイクログロブリン遺伝子は細胞サイクルとは独立して発現される。

第２４１巻、第７０８〜７１２頁（１９８８）］により記載されたように特定プライマおよびＴａｑポリメラーゼの存在下で拡大させた。拡大生成物を２％アガロースゲルで分離してニトロセルロースフィルタに移し、これを合成４ｏ−ヌクレオチドｃ−ａｂｌ断片および４０−ヌクレオチドβ２−マイクログロブリン断片とハイブリダイズさせ、次いで［γ−Ｐ３２］−八ＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで標識した。ｃ−ａｂｌプローブは第１図の拡大された２５７ヌクレオチド配列を認識し、千ド配列を識別する［同上、サッグス等、ブロン−ディ胞集団より生ずるコロニーから分離されたＲＮＡでは、ｂｃｒ−ａｂ１転写物が検出されながった。これに対し、比較として用いたβ２−マイクログロブリンの発現はアンチセンス処理されたコロニーで明瞭に検出され、これする。

このデータは、天然の病気の意味で、Ｐｈ１−陽性白血病表現型に関連する異常な成長を維持するには機能的ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子が必要であることを示す。合成オリゴマーは正常プロゲニタの成長に影響を与えな（Ｘので、白血病増大は白血病表現型の維持を含む腫瘍特異性遺伝子変化の存在に基づき選択的に抑制することができる。

れた後に、白血病細胞の増殖を選択的に抑制することができる。

ｂ　１　ａ　２接合部を発現するＰｈ１−陽性ＡＬＬ細胞の増殖は、実施例５によるアンチセンスオリゴヌクレＡ−千１・て抑制された。

ＲＮＡをＰｈ１−陽性ＡＬＬ患者より得られた細胞ラインＡＬＬ−１から分離した［エリクソン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第１８０７〜１８１１頁（１９８６）］。

破断点接合部のクローン化および配列決定を実施例口こｃｒ−エクソン１に対し相補的な２２ヌクレオチドオリゴマーＣＡＡＣＡＧＴＣＣＴ　ＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）を使用すると共に３′プライマとしてｃ−ａｂｌエクソン２に対し相補的な２２ヌクレオチドオリゴマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）を使用した。１８量体の破断点配列ＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡ　ＡＧＣＣＣＴＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１４）は、フエインシュタイン等、ネイチャー、第３３０巻、第３８６〜３８８頁（１９８７）の公表された配列を確５００μｌにおけるｐｈ’−陽性細胞（１〜２×１０４細胞）を（ｉ）オリゴマーの不存在下、い１）ｂｌａ２　ｂｃｒ−ａｂｌ破断点接合部に対し相補的であるが２つのヌクレオチドミスマツチを有する】８量体アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）の存在下、または（ｉ　ｉ　ｉ）同じ接合部に対し完全に相補的な１８量体アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）の存在下で培養した。培養物を０時点にて５０μｇのオリゴマー、並びに２４時間および４８時間にて２５μｇ／ｍｌのオリゴマーに露出した。細胞を毎日計数した。その結果を第６図に示し、ここで（−ＩＩ−）は比較培養物（オリゴマーなし）を示し、（−ム一）は２−ミスマツチオリボマーを添加した培養物を示し、さらに（−０−）は完全に相捕的なアンチセンスオリゴマーを添加した培養物を示す。アンチセンスオリゴマーで処理した培養物は比較培養物およびミスマツチ処理の培養物に比べ白血球細胞数における顕著な減少を達成した。

チオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用フィラデルフィア染色体−隅性白血病細胞ラインＢＶ１７３［ペゴラロ等、ジャーナル・ナショナル・キャンブー・インスチチュート、第７０巻、第４４７頁（１９８３）］の核型分析は、分析した２０種の移行期のそれぞれで唯一の染色体異常として９：２２転位を示した。

↓接合部の拡大に続きｂ　２　／　ａ　２もしくはｂ３／ａ２接合部に特異的な１８量体に対するハイブリッド化は、これら細胞におけるｂ　２　／　ａ　２破断点を確認した（データ示さず）。

ｂ　２　／　ａ　２アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドに対するＢＶ１７３細胞の感受性を評価した。ホスホルチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを、慣用のホスホルアミダイトモノマーを用いてアプライド・バイオシステムス・モデル３８０Ｂ型もしくは３９ＯＺ型自動化合成装置のいずれかで、沃素−水一ピリミジンの代りにテトラエチルチウラン（もしくは均等な硫黄−ドナー試薬）を用いる業者推奨の手順にしたがって作成し、各サイクルでは正常な酸化に続くキャップ配列決定と逆相製造用クロマトグラフィーと脱トリチル化とを逆転させ、さらにそのナトリウム塩として最終生成物を得、これらは全て従来公表された方法にしたがった［シンおよびステック、［オリゴヌクレオチドおよび同族体：実用手段」、Ｆ、エックスタイン編、（オックスフォード大学プレス、オックスフォード、１９９１）、第８７〜１０８頁；シンおよびガイブー、「抗癌剤デザイン」、第６巻、第５３９頁（１９９１）；ブーおよびヒルジエンパイン、テトラヘドロン・レタース、第３２巻、第３００５〜３００８頁（１９９１）］。

ＢＶ１７３細胞をホスホロチオエートｂ　２　／　ａ　２アンチセンス２６量体ＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴ　ＡＴＴＧＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９）もしくはホスホロチオエートセンス配列ＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧ　ＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡ　ＧＣＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４）またはｂ３／ａ２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）もしくはｂｌ／ａ２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３）ホスホロチオエートアンチセン２６量体の存在下で培養した。ｂ　２　／　ａ　２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのみがＢＶ１７３細胞の増殖を抑制しく第７図）、さらに反復実験にて１．５μＭ（第７図、−△−）および３．０μＭ（第７図、−・−）のそれぞれの濃度でアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用い９日間の培養後に抑制率は９７．６％および１００％であった。

センスオリゴマーＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４は、未処理比較細胞（第７図、−口 −）と対比して抑制を示さなかった（第７図、−〇−）。

ＢＶ１７３細胞を注射した５ＣＩＤマウスを、次の実験にしたがいｂ２ａ２ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにより病気から保護した。ＢＶ１７３細胞によるマウスの注射は、ヒト白血病患者に近似した病気を誘発する。

Ａ、致死ＢＶ１７３細胞投与量の決定５ＣＩＤマウスにおけるＢＶ１７３細胞の致死量を決定するため、１０３〜１０７細胞を尾静脈に注射し、注射後の種々の時点で生存率を監視した。１０．１０６、１０５もしくは１０４個のＢＶ１７３細胞を注射したマウスは８〜１０週間、９〜１２週間、１３〜１５週間もしくは１４〜２２週間後に、それぞれ白血病細胞増殖により死亡し、これは検死によって確認された。肺臓重量は注射しなかった５ＣＩＤマウスよりも約４０倍大であったのに対し、肝臓および腎臓は多数の転移を有し、注射しなかったマウスと比べて１０倍だけ増大した。１０３Ｂ■ １７３細胞を注射したマウスは移植の３５週間後にもまだ生存し、白血病は検出されなかった。この試験から、１０６個の細胞が致死量と解釈された。

Ｂ、白血病状態の分析ネズミ組織における浸潤性ヒト白血病細胞の個数を決定しうる３種の異なる分析により、病気の進行経過を監視した。

第１の分析は、ｃＡＬＬ抗原（ＣＡＬＬＡ）−陽性細胞の免疫蛍光分析で構成した。正常でないネズミ増血細胞を除く全てのＢＶ１７３細胞はこの抗原を発現する（分析感度＝　１０　’）。単一の細胞懸濁物を白血病５ＣＩＤマウスの末梢血液、膵臓および骨髄細胞からリンパ球−Ｍ濃度勾配での遠心分離によりフロー血球数分析のため作成した［カダーレイン・ラボラドリース・リミテッド社、オンタリオ、カナダコ。細胞（１×１０５）を、ヒトＣＤ１０抗原に対するＦＩＴＣ−結合マウス抗−ＣＡＬＬＡモノクローナル抗体（ベクトンーンキンソン免疫血球計算システム、サンジョース、ＣＡ）で処理した。

処理の後、細胞を洗浄し、エピマウス・プロフィル・アナライザ（クールタ・エレクトロニック社）を用いてフロー血球計算により分析した。各種類の細胞につき、２種の陰性比較を用いた：すなわちＦＩＴＣ−結合抗一〇ＡＬＬＡで処理した健全５ＣＩＤマウスの同じ器官からの細胞、およびＢＶ１７３もしくはネズミ細胞と反応しない抗−ヒトＣＤ３モノクローナル抗体で処理した白血病５ＣＩＤマウスからの細胞懸濁物。

白血病の第２の分析は半固体培地におけるクロノジェニック分析で構成した。ＢＶ１７３細胞はヒト成長因子の不存在下で２５〜３５％のクローン化効率にてコロニーを形成したのに対し、ネズミ細胞はコロニーを形成しない（分析感度＝１０３）。５匹の健全５ＣＩＤマウスの１２枚のプレートから得られたデータは、ネズミ細胞からの僅か数個のコロニーが塗抹後の７〜９日間まで増大し、次いで死滅し始め、１２日間の培養後に生存細胞のコロニーは存在しなかったことを示した。これに対し、ＢＶ１７３細胞は多数の急速に増大するコロニーを形成した。ＢＶ１７３細胞の存在がネズミプロゲニタの成長を可能にする可能性を除外するため、混合実験を行った。

正常ネズミ細胞とＢＶ１７３細胞との混合物から１２日ＰＣＲ分析は、これらコロニー（１０個のコロニーを分析）の１００％がｂｃ　ｒ−ａｂ　ｌ　（ｂ２／ａ２）転写物の発現により示されるように白血病であることを示した（データ示さず）。

第３の分析では、白血病の程度を連鎖ＲＴ−ＰＣＲにより評価して骨髄細胞、牌細胞、末梢血液白血球、肝臓、肺および脳組織から分離された全ＲＮＡにおけるｂ２／８２転写物の発現（分析感度＝１０’）を監視した。注射したＢＶＩ　７３細胞の個数に応じ、注射してから３週間後および６週間後にネズミ組織にてクロノジェニック分析およびＲＴ−ＰＣＲにより種々の個数の白血病細胞が検出された。白血病５ＣＩＤマウスの死亡が予想される数日前に、約８０％、６５％および１０％のｃＡＬＬＡ−陽性細胞が骨髄細胞、牌細胞および末梢血液白血球でそれぞれ検出された。ＲＴ−ＰＣＲは肺および脳にてＢＶ１７３細胞を示した。

Ｃ，ｂ２ａ２アンチセンス処理ＢＶ１７２細胞のｂｃｒ−ａｂｌ接合部を標的とする合成ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが５ＣＩＤマウスにおける病気経過を改変するかどうかを決定した。５ＣＩＤマウスに１０６ＢＶ１７３細胞を注射した。次いで、マウスに１　ｍ　ｇのセンス（ＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧ　ＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡ　ＧＣＧ、５ＥＱＩＤ　ＮＯ：３４）もしくはアンチセンス（ＣＧｃＴＧＡＡＧＧＧ　ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴ　ＡＴＴＧＡＴ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９）ｂ２／ａ２　ｂｃｒ−ａｂｌホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（パイロジエン・レブン＜ｌＥｕ／ｍｇ；イソコウブ改変デュルベッコ培地における０、２ｍｌ、５〜１０秒）を連続９日間のそれぞれにつき１０６ＢＶ１７３細胞を導入してから７日間もしくは２１日間後に開始して静脈内接種した。比較マウスには希釈剤（イソコウブ改変デュルベッコ培地）のみを接種した。これらの時点は、人間における異なる病気段階に近似する。

Ｄ、アンチセンス処理の結果Ｓ　ＣＩ　Ｄマウスに１０６ＢＶＬ７３細胞を注射してから７日間後（→−７）および２１日間後（＋２１）に、単一細胞懸濁物を各種の組織から作成した。Ｏ，１，７ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）で緩衝した０、８３％Ｎ８４Ｃ１にて赤血球を溶解させた後、全ＲＮＡを記載されたように抽出し［チョムチンスキーおよびサッチ、アナリチカル・バイオケミストリー、第１６２巻、第１５６頁（１９８７）］、次いで懸濁物を２つの等しい部分に分けた。ｂｃｒ−ａｂｌおよびβ−アクチン転写物を逆転写させると共に、スジリック等、サイエンス、第２５３巻、第５６２頁（１９９１）により記載されたように特定プライマーおよびＴａｑポリメラーゼで拡大させた。拡大生成物を２％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースフィルタに移し、次いて［γ−Ｐ”２］−ＡＴｌ）およびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識された合ブはｂｃｒ−ａｂｌ接合部を有する拡大２５７−ｂｐ配列を識別し、β−アクチンプローブは５′および３′　β −アクチンプライマー内に含まれる２０９−ｂｐ断片を識別する［トクナガ等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、第２８２９頁（１９８６）］。

未処理およびｂｃｒ’−ａｂｌオリゴデオキシヌクレオチド処理の白血病５ＣＩＤマウスの骨髄細胞懸濁物からのクロノジェニック分析を次のように行った。１ｏ５細胞を２反復で、２．５ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＨＣＣ−４２３０培地［テリー・フィックス・ラボラドリース社、バンク−バー、カナダ］にて３５Ｘ１０ｍｍの組織培養皿［ヌンク・インコーポレーション社、゛ナパービル、ＩＬ］に塗抹し、１２日間にわたり増殖させた。これらプレートを倒立顕微鏡で走査し、全コロニー数を測定した。結果を第９図に示す（Ｃ，未処理マウス；Ｓ１センス処理マウス、ＡＳ、アンチセンス処理マウス）クロノジェニック分析は僅か数個のコロニー（６，０±４．２）が骨髄細胞懸濁物から生じたことを示し、免疫蛍光試験は白血病の存在につき陰性であった。１ｏ６ＢＶ１７３細胞を注射してから２１日間の後、ＲＴ−ＰＣＲは骨髄、肺臓、末梢血液、肝臓および肺にて白血病細胞の存在を示したが、脳では示さなかった（第８図、レーン±２１）。極めて高い白血病コロニー数（３５３゜０±５２．３）が骨髄から発生すると共に、僅か（４゜０±１．４）が肺臓から発生した。骨髄細胞の少なくとも６，０±１．４％がｃＡＬＬＡ−陽性であった。したがって、白血病細胞の注射の７日間後に゛おける５ＣＩＤマウスの処理は人間における「最小残留症状」の臨床状態に近似するのに対し、１０６白血病細胞の注射の２１日間後におけるこの種の処置は「完全病気症状」に近似する。

１０６ＢＶ１７３細胞を注射してから７日間後に始めて９日間にわたりホスホロチオエートオリコ゛デオキシヌクレオチドで処理すると共に最後の処理の１２日間（白血病発病の４週間）後に殺したマウスの末梢血液、膵臓、骨髄、肝臓、肺および脳から分離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は未処理およびセンス処理のマウスにて脳以外の分析組織のそれぞれにてｂｃｒ−ａｂ１転写物を示したが、アンチセンス処理のマウスでは示さなかった（図示せず）。骨髄細胞懸濁物のクロノジエニ・ツク分析は未処理およびセンス処理のマウスにて多数の白血病コロニーを示しくそわぞれ３５３±５２および３８０±２５）、ただしｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの注射後には示さず、これはＲＴ− ＰＣＲのデータと完全に一致した。ＣＡＬＬＡ十細胞が子細胞よびセンス処理動物の骨髄で検出された。ｂｃｒ−ａｂｌホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる最後の処理の２６日間後（白血病発生の６週間）１こ殺したマウスにおいて、肉眼検査は肺臓増大に加え未処理およびセンス処理マウスの肝臓および腎臓にて明確な白血病結節の存在を示したが、アンチセンス処理マウスでは示さなかった（図示せず）。末梢血液白血球、膵臓、骨髄、肝臓、肺および脳から分離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析はアンチセンス処理マウスの組織にてｂｃｒこれらは未処理およびセンス処理マウスからの各組織にて容易に検出された（第９図、レーン＋７）。同様に、骨髄および膵臓の細胞懸濁物のクロノジェニック分析は未処理（第９図）およびセンス処理（第１０８図）　（７）試試料では示さなかった。センス処理されたマウスの末梢血液白血球からは数個のコロニーが得られたが、アンチセンス処理マウスの試料からは検出しうるコロニーが発生しなかった。ＣＡＬＬＡ十細胞が子細胞センス処理マウスの組織で検出されたのに対し、この種の細胞はセンス処理マウスの骨髄（１６，８±１．８％）、膵臓（４゜１±０．２％）および末梢血液（１，９±０．２％）で容易に検出された。

１０６ＢＶ１７３細胞の注射の２１日間後に開始してｂｃｒ−ａｂｌホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで処理しく１ｍｇ／マウス１匹／１日、連続９日間）かつ最後の処理の１２日間後（白血病移植の６週間後）に分析したマウスにて、肺臓腫瘍および肝臓における白血病転移が比較およびセンス処理のマウスにて検出されたが、アンチセンス処理マウスでは検出されなかった。ｂｃｒ −ａｂ１転写物が未処理およびセンス処理のマウスで末梢血液単核細胞、膵臓細胞、骨髄細胞、肝臓、肺および脳からの全ＲＮＡで検出されたが、アンチセンス処理マウスでは検出されなかった（図示せず）。

骨髄細胞懸濁物からのクロノジェニック分析は未処理（５７５，５±８３．８）およびセンス処理（６６８゜５±５９．１）のマウスにて多数の白血病コロニーを示したが、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの注射後には検出されなかった。同様に、膵臓および末梢血液単核細胞懸濁物のクロノジェニック分析は未処理マウスにて８０．５±１２．０および１１゜０±８．５個のコロニー、センス処理マウスでは１１６゜０±２９．７および１４．５±４．９、並びにアンチセンス処理のマウスでは０のコロニーをそれぞれ示した。

比較動物およびセンス処理動物のフロー血球数分析はＣＡＬＬＡ十細胞を子細胞それぞれ１７．７±１．８および１０．０±０．５％）、膵臓（それぞれ１．９ ±０゜１および１．９±０．８％）、並びに末梢血液（それぞれ１．０±０．１および０．９±０．１％）にて示した。

しかしながら、ＣＡＬＬＡ十細胞は子細胞センス処理の後には検出されなかった。処理してから２６日間後のマウスの肉眼検査を完了しく白血病発生の８週間後）、これは肝臓における多数の転移（第１１Ａ図）、腎臓における僅かな転移、およびセンス処理マウスにおける肺臓腫瘍を示したが、アンチセンス処理動物では示さなかった（第１１Ｂ図）。ｂｃｒ−ａｂ１転写物は、ＲＴ−ＰＣＲ生成物（センス処理マウスにおけるよりも少ない）を拡大させた膵臓を除き、各分析組織にてアンチセンスに検出できた（第９図、レーン＋２１）。クロノジェニック分析はＲＴ−ＰＣＲデータと一致し、白血病コロニーを骨髄（８３９，５±４１．７）、膵臓（５４８，５゜±１２８．０）および末梢血液（５１，０±４１．７）にてセンス処理マウスで検出したが、アンチセンス処理の後には検出できなかった。ＣＡＬＬＡ十細胞は子細胞処理の後に骨髄（２３，９±５．０％）、膵臓（９，９±１．８％）および末梢血液（２，０±０．３％）にて容易に検出された。これに対し、これら細胞はアンチセンス処理マウスでは検出されなかった。

Ｃ９要約：致死率要約して、データは１０６ＢＶ１７３細胞が注射され、次いで７日間後もしくは２１日間後にｂｃｒ−ａｂｌアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにより静脈内処理された５ＣＩＤマウス（１ｍｇ／マウス１匹、連続９日間）がそれぞれ白血病細胞の注射の４２日問および５６日間後に病気を持たないのに対し、未処理およびセンス処理のマウスが肉眼的、顕微鏡的および分子的な活性白血病経過の証拠を有することを示す。

３群のマウスにおけるこれらの相違は、その致死率に反ス（全部で１０匹のマウスにつき、それぞれ＋７日もしくは＋２１日から出発した３匹の未処理および５匹のセンス処理）は全て１０６ＢＶ１７３白血病細胞の静脈内注射の１０〜１３週間後に白血病拡散（検死により確認）で死んたのに対し、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンス処理マウス（全部で１２匹のマウスにつき、＋７日もしくは＋２１日のそれぞれから出発してアンチセンス処理６匹）は白血病細胞の注射の１６週間後に生存した（第１２図）（Ｃ，比較；Ｓ１センス処理、ＡＳ、アンチセンス処理）。したがって、ｂｃｒ−ａｂｌアンチセンス処理は生存を長期化させ、致命的病気経過における治療に成功することを証明した。

１０６ＢＶ１７３細胞を注射してがら７日間後、ＲＴ−ＰＣＲはマウスの骨髄、膵臓および末梢血液から得られた細胞懸濁物においてのみ白血病細胞を示した（第８図、レーン＋７）。

合成法、製造法および分析法に関し引用した引例を全て参考のため、ここに引用する。

本発明はその思想および本質的特徴がら逸脱することなく他の態様で実施することも可能であり、したがって本発明の範囲については上記説明だけでなく請求の範囲を参照すべきである。

【刀ＡどＬ入玉（１）一般的情報：（ｉ）出願人：カラプレツタ、ブルーノゲヴイルッ、アラン　エム（ｉ　ｉ）発明の名称：　ｂａｒ−ａｂｌアンチセンスオリゴヌクレオチドによる白血球増殖の選択的抑制（ｉ　Ｌ　ｉ）配列の数＝３４（ｉ　ｖ）通信宛先：（Ａ）宛先：テンプル　ユニバージティー　−オン　ザ　コモンウエルス　システム　オンハイヤー　エデュケーション（Ｂ）街名＝４０６　ユニバージティー　サービスビルディング（］市名：フィラデルフィア（Ｄ）州名：ペンシルバニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：　１９１２２（ｖ）コンピュータ解読フオーム：（Ａ）メディア種類：ディスケット、３．５０インチ、７２０Ｋｂ（Ｂ）＝７ンビユータ：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）作動シスチムニＭＳ−Ｄｏｓ（Ｄ）ソフトウエアー二ワードパーフェクト５．　１（ｖｉ）出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類・（νｉｉ）先行出願データ。

（Ａ）出願番号：０７／７１８．３０２号（Ｂ）出願日。１９９１年６月１８日（ｖｉｉｉ）代理人の情報：（Δ）氏名：モナコ、ダニエル　エイ（Ｂ）登録番号：ａｏ、４８０（Ｃ）参照番号：６０５６−１２０　ＰＣ１（ｉｘ）電信情報：（Ａ）電話　（２１５）５６８−８３８３（Ｂ）テレファックス。

（２１，５）５６８−５５４９（Ｃ）テレックス：なしく２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（ｉ）配列特性（Ａ　）長さ　２５７ヌクレオチド（１３）種類　核酸（Ｃ）鎖型、一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＡＴ　ＣＭＴＡＡＧＧＡＡ　ＧＭＧＣＣＣＴＴＣ４０ＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴ　ＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧ　８０ＴＧＡＡＧＣＣＧＣＴ　ＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴ　ＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡ　ＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴ　１２０ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧ　ＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴ　１６０八ＴＧＡＴＴＴＴＧＴ　ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡ　ＧＡＴＭＣＡＣＴＣＴＭＧＣＡＴＡＡＣ２００ＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡ　ＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧ　ＴＣＴＴＡＧＧＣＴＡ　ＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴ　２４０ＧＧＧＧＭＴＧＧＴ　ＧＴＧＡＡＧＣ２５７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報・（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴＡＴ　１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報−（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型・一本鎖（Ｄ）トポロジー・線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＧＡＡＧＧＧＣＴ’ｒＣＴＴＣＣＴＴＡＴ　１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４の情報・−（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２６６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５の情報：（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ・１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（Ｘｌ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴ　ＴＧＡＡＣＴＣＴ　１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ　１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型・一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋６：ＧＭＧＧＧＣＴＴＴ　ＴＧＭＣＴＣＴ　１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア（７）情報。

（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝８０ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・７・ＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴ　ＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧ　８０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情報：（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ：１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型・一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：ＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣ１８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型：二本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明・ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９：ＧＭＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＣ１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の情報：（＋）配列特性。

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（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２２ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トボロジー：不適切（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧ　２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝２２ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型二一本膜（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：ＣＭＣＡＧＴＣＣＴ　ＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧ　ＣＡ　２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘ　ｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡ　ＡＧＣＣＣＴＴＣ１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１４ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴ　ＣＣＴＴ　１４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６の情報・（ｉ）配列特性（Ａ）長さ　１６ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型　−末鎖（Ｄ）トポロジー　線状（Ｘｌ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６：ＡＡＧＧＧＣＴ’ｒＣＴ　ＴＣＣＴｒＡ　１６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７の情報：（ｉ）配列特性（Ａ）長さ、２０ヌクレオチド（Ｂ）種類　核酸（Ｃ）鏡型　−末鎖（Ｄ）トポロジー、線状（ｘｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：ＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴ　ＣＴｒＣＣＴＴＡＴＴ　２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝２２ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：ＣＴＧＭＧＧＧＣＴ　ＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴ　ＴＧ　２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９の情報：（＋）配列特性：（Ａ）長さ＝１４ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９：ＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧ　ＡＡＣＴ　１４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０（７）情報：（＋）配列特性：（Ａ）長さ：１６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、線状（ｘｉ）配列説明・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０：ＭＧＧＧＣＴＴ？ｒ　ＧＭＣＴＣ１６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２１の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型　−末鎖（Ｄ）トポロジー　線状（ｘｉ）配列説明・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：ＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴ　ＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧ　２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２の情報：（１）配列特性：（Ａ）長さ　２２ヌクレオチド（Ｂ）種類、核酸（Ｃ）鏡型・−末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２・ＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴ　ＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴ　ＧＣ２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３の情報：（ｉ）配列特性− （Ａ）長さ　ｌ　４ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２３：ＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧ　ＣＧＴＣ１４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１６ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型・−末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（Ｘ　ｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４：ＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴ　ＧＣＧＴＣＴ　１６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５：ＴＧＡＡＧＧＧＣ’Ｉ’ｒ　ＣＴＧＣＧＴＣＴＣＣ２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６の情報。

（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ＝２２ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６：ＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴ　ＴＣＴＧＣＧＴＣＴＣＣＡ　２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７の情報：（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ：１８ヌクレオチド（Ｂ）種類　核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７：ＴＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣ１８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８の情報。

（＋）配列特性：（Ａ）長さ、２４ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型・−重鎖（Ｄ）トポロジー、線状（ｘｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８：ＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡ　ＴＴＧＡ　２４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９の情報：（＋）配列特性：（Ａ）長さ二２６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９：ＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧ　ＣＴＴＣ？］”ＣＣＴｒ　ＡＴＴＧＡＴ　２６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝２４ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０：ＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧＭＣＴＣＴＧＣＴ　２４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１の情報：（ｉ）配列特性；（Ａ）長さ、２６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型コー末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ二３１：ＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧ　ＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴ　ＣＴＧＣ’Ｉ’ｒ　２６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、線状（ｘ　ｉ）配列説明　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２：ＧＣＴＧＭＧＧＧＣＴｒＣＴＧＣＧＴＣＴ　ＣＣＡＴ　２４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３３の情報・（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋３３：ＣＧＣＴＧＭＧＧに　ＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧ　２６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４の情報：（１）配列特性（Ａ）長さ・２３ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型コ一本鎮（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４：ＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧ　ＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡ　ＧＣＧ　２３ＦＩＧ、　ＩＴＧＡＡＧＣＣＱＣＴ　ＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴ　ＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡ　ＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴ　１２０ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧ　ＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴ　１６０ＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴ　ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡ　ＧＡＴＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＣ２００ＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡ　ＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧ　ＴＣＴＴＡＧＧＣＴＡ　ＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴ　２４０ＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴ　ＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴ　ＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣ１２０ＣＴＴＣＴＣＧＣＴＧ　ＧＡＣＣＣＡＧＴＧＡ　ＡＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧ　１６０ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡ　ＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧ　ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＧ　ＡＴＡＡＣＡＣＴＣＴ　２００ＡＡＧＣ入ＴＡＡＣＴ　ＡＡＡＧＧＴＧＡＡ入　入ＧＣＴＣＣ，ＧＧＧＴ　ＣＴＴＡＧＧＣＴＡＴ　２４０ＡＡＴＣＡＣＡＡＴＧ　ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧ　ＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴ　ＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧ　８０日　数＋７　＋２１ＦＩＧ、８＋７　＋２１ＦＩＧ、９七′ス　アンチセンス％市す王フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　ゲヴイルツ、アラン　エムアメリカ合衆国　ペンシルバニア　１９１３０フイラデルフイア　ノース　トウニンティフォース　ストリート８３７

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ハイブリッドｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子から転写されたＲＮＡをｐＨｌ− 陽性白血病罹患した患者より分離された細胞から抽出し；（ｂ）ｂｃｒ−ａｂｌ転座接合部を包囲するｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物の領域のヌクレオチド配列を決定し；（ｃ）ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ転写物の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する約１３量体〜約２６量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、前記標的配列はｂｃｒ−ａｂｌ転座接合部を含むと共に転写物のａｂｌ−由来部分の約１３個以下のヌクレオチドを含み、前記アンチセンスオリグヌクレオチドは前記標的配列にハイブリダイズすることができ；（ｄ）有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを罹患した個人またはそこから集めた細胞に投与することを特徴とするｐＨｌ−陽性白血病の処置方法。
２．アンチセンスオリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第１項に記載の方法。
３．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第２項に記載の方法。
４．オリゴヌクレオチドが１５量体〜２１量体である請求の範囲第２項に記載の方法。
５．オリゴヌクレオチドが１５量体〜１８量体である請求の範囲第４項に記載の方法。
６．アンチセンスオリゴヌクレオチドがｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列に対し１個以下のヌクレオチドミスマッチを有する請求の範囲第２項に記載の方法。
７．アンチセンスオリゴヌクレオチドとｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列とが完全に相補的である請求の範囲第６項に記載の方法。
８．アンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリダイスするｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列が約６〜約１３個のａｂｌ−由来のヌクレオチドからなり、前記標的配列の残部がｂｃｒ−由来のヌクレオチドからなる請求の範囲第２項に記載の方法。
９．ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列がほぼ同数のａｂｌ−由来のヌクレオチドとｂｃｒ−由来のヌクレオチドとからなる請求の範囲第８項に記載の方法。
１０．ｐＨｌ−白血病罹患した個人から吸引した骨髄細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理すると共に、処理された細胞を罹患した個人の人体に戻すことからなる請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８または９項に記載の方法。
１１．ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子がｂｃｒエクンン２とｃ−ａｂｌエクンン２との間で転移によって形成される請求の範囲第１項に記載の方法。
１２．アンチセンスオリゴヌクレオチドをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択する請求の範囲第１０項に記載の方法。
１３．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３を有する請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなる請求の範囲第１２項に記載の方法。
１５．ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子がｂｃｒエクソン３とｃ−ａｂｌエクソン２との間で転座によって形成される請求の範囲第１項に記載の方法。
１６．アンチセンスオリゴヌクレオチドをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択する請求の範囲第１５項に記載の方法。
１７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６を有する請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第１６項に記載の方法。
１９．ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子がｂｃｒエクンン１とｃ−ａｂｌエクンン２との間で転座によって形成される請求の範囲第１項に記載の方法。
２０．アンチセンスオリゴヌクレオチドをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択する請求の範囲第１９項に記載の方法。
２１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：９を有する請求の範囲第２０項に記載の方法。
２２．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第２０項に記載の方法。
２３．試薬キャリアとヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する約１３量体〜約２６量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドとからなり、前記標的配列がｂｃｒ−ａｂｌ転座接合部を含むと共に転写物におけるａｂｌ−由来部分の約１３個以下のヌクレオチドとを含み、前記オリゴヌクレオチドが前記標的配列に対しハイブリダイズしうることを特徴とする医薬組成物。
２４．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第２３項に記載の方法。
２５．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第２４項に記載の組成物。
２６．オリゴヌクレオチドが１５量体〜２１量体である請求の範囲第２４項に記載の組成物。
２７．オリゴヌクレオチドが１５量体〜１８量体である請求の範囲第２６項に記載の組成物。
２８．オリゴヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡ標的配列に対し１個以下のヌクレオチドミスマッチを有する請求の範囲第２４項に記載の組成物。
２９．アンチセンスオリゴヌクレオチドと、ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列とが完全に相補的である請求の範囲第２８項に記載の組成物。
３０．オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列が約６〜約１２個のｃ−ａｂｌ−由来のヌクレオチドからなり、前記標的配列の残部がｂｃｒ−由来のヌクレオチドからなる請求の範囲第２４項に記載の組成物。
３１．ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ標的配列がほぼ同数のａｂｌ−由来のヌクレオチドとｂｃｒ−由来のヌクレオチドとからなる請求の範囲第３０項に記載の組成物。
３２．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｂｃｒエクンン２とｃ−ａｂｌエクンン２との間で転座により形成されたヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対し相補的である請求の範囲第２４項に記載の組成物。
３３．アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択される請求の範囲第２７項に記載の組成物。
３４．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３を有する請求の範囲第３３項に記載の組成物。
３５．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第３３項に記載の組成物。
３６．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｂｃｒエクンン３とｃ−ａｂｌエクンン２との間で転座により形成されたヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対し相補的である請求の範囲第２４項に記載の組成物。
３７．アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択される請求の範囲第３６項に記載の組成物。
３８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６を有する請求の範囲第３７項に記載の組成物。
３９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｂｃｒエクンン１とｃ−ａｂｌエクンン２との間で転座により形成されたヒトｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対し相補的である請求の範囲第２４項に記載の組成物。
４０．アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３よりなるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの群から選択される請求の範囲第３９項に記載の組成物。
４１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：９を有する請求の範囲第４０項に記載の組成物。
４２．アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第４０項に記載の組成物。