JP2008521401A - BCR−ABL融合遺伝子のRNAi調節およびその使用方法 - Google Patents
BCR−ABL融合遺伝子のRNAi調節およびその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
この出願は、2004年11月24日出願の米国特許仮出願第60/630878号および2004年12月1日出願の米国特許仮出願第60/632403号に基づく優先権を主張する。これらの仮出願の全内容を本願明細書に援用する。
ファイヤーら、Nature、第391巻、806〜811頁、1998年 ノウェル ピーシー(Nowell PC)ら、1960年、Science、第132巻、1467頁 ローリー ジェイディー(Rowley JD)、1973年、Nature、第243巻、290〜293頁 ウェストブルック シーエー(Westbrook CA)ら、1992年、Blood、第80巻、2983頁 ハイスターカンプ エヌ(Heisterkamp N)ら、1983年、Nature、第306巻、239頁 バーンズ(Barnes)ら、2002年、Acta Haematologica、第108巻、180〜202頁 ファダール(Faderl)ら、2003年、Cancer、第98巻、1337頁 カーズロック(Kurzrock)ら、2003年、Ann.Intern.Med.第138巻、819頁 ロスバーグ(Rothberg)、2003年、Leukemia Res.第27巻、977頁 ウィルダ(Wilda)ら、Oncogene、2002年、第21巻、5716頁 シェル(Scherr)ら、Blood、2003年、第101巻、1566頁 ハイデンライヒ(Heidenreich)ら、Blood、2003年、第101巻、3157頁 ヴォールボルト(Wohlbold)ら、Blood、2003年、第102巻、2236頁 リッター ユー(Ritter U)ら、Oligonucleotides、2003年、第13巻、365頁 リ(Li)ら、Oligonucleotides、2003年、第13巻、401頁 チェン ジェー(Chen J)ら、J.Clin.Invest.2004年、第113巻、1784頁
(1 iRNA薬剤の設計および選択)
(2 候補となるiRNA薬剤の評価)
候補となるiRNA薬剤を、それが標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価することができる。例えば、候補となるiRNA薬剤を用意し、標的遺伝子、例えばBcr−Abl融合遺伝子を内因的に発現するか、あるいはBcr−Abl融合タンパク質をそれから発現することができるコンストラクトでトランスフェクションされていることによって発現する細胞に接触させることができる。上記候補となるiRNA薬剤との接触の前および後の標的遺伝子発現のレベルを、例えばmRNAまたはタンパク質レベルで比較することができる。標的遺伝子から発現されたRNAまたはタンパク質の量が、上記iRNA薬剤と接触した後に低下していると判定された場合、上記iRNA薬剤が標的遺伝子発現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的Bcr−Abl融合RNAまたはBcr−Abl融合タンパク質のレベルは、いかなる望ましい方法でも測定できる。例えば、標的RNAのレベルは、ノーザンブロット解析、逆転写連結ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、またはRNアーゼプロテクションアッセイで測定することができる。タンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット解析または免疫蛍光によって測定することができる。
(iRNA薬剤の安定性試験、修飾、および再試験)
候補となるiRNA薬剤を、そのiRNA薬剤が対象の体内に導入された際などの安定性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することができる。同方法は、修飾、特に切断、例えば対象の体内に存在する成分による切断の影響を受けやすい部位を同定する方法を利用することができる。
(インビボ試験)
Bcr−Abl融合遺伝子発現を阻害できるものとして同定されたiRNA薬剤を、動物モデル(例えばマウスまたはラットなどの哺乳動物)中でのインビボでの機能に関して試験することができる。例えば、上記iRNA薬剤を動物に投与して、その生体内分布、安定性、およびそれがBcr−Abl融合遺伝子発現を阻害する能力または望ましくない細胞増殖を低減する能力に関して評価することができる。
(3 iRNA化学)
ここでは、RNAiを媒介して、Bcr−Abl融合遺伝子の発現を阻害する単離されたiRNA薬剤、例えばdsRNA薬剤について述べる。
(ヌクレアーゼ抵抗性の強化)
iRNA薬剤、例えばBcr−Abl融合体を標的とするiRNA薬剤は、同薬剤が有するヌクレアーゼ抵抗性を強化することができる。
ヌクレアーゼ抵抗性を最大にするために、2’修飾を、1つまたは複数のリン酸リンカー修飾(例えばホスホロチオエート)と併用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、2つ以上の異なった修飾を含有するものである。
(v)L−RNA、2’−5’結合、逆方向結合、a−ヌクレオシド。したがって、他の好ましいNRMには、L−ヌクレオシドおよびL−ヌクレオシドから派生した2量体ヌクレオチド;2’−5’リン酸結合、非リン酸結合、および修飾リン酸結合(例えば、チオリン酸、ホスホラミデート、およびボロノホスフェート);逆方向結合、例えば3’−3’結合または5’−5’結合を有する2量体;糖の1’部位にα結合を有する単量体、例えばα結合を有する本明細書に記載の構造が含まれる。
(テザーリガンド)
薬理学的特性を含めたiRNA薬剤の特性は、リガンド、例えば、テザーリガンドを導入することによって、影響を受け、調整され得る。
(5’−リン酸修飾)
好ましい実施形態では、iRNA薬剤は、5’がリン酸化されているか、または5’プライム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の5’−リン酸修飾には、RISC媒介遺伝子サイレンシングに適合したものが含まれる。適切な修飾には、5’−モノホスファート((HO)2(O)P−O−5’);5’−ジホスファート((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−トリホスファート((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−グアノシンキャップ(7−メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−モノチオホスファート(ホスホロチオエート;(HO)2(S)P−O−5’);5’−モノジチオホスファート(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオラート((HO)2(O)P−S−5’);酸素/硫黄で置換されたモノホスファート、ジホスファートおよびトリホスファートの任意の更なる組み合わせ(例えば、5’−アルファ−チオトリホスファート、5’−ガンマ−チオトリホスファートなど)、5’−ホスホロアミデート((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−、(OH)2(O)P−5’−CH2−)、5’−アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−)、エトキシメチル、など、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−)が含まれる。
(iRNA薬剤の細胞への輸送)
理論に結びつけることは望まないが、コレステロール結合iRNA薬剤とリポタンパク質のある種の成分(例えば、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質)との間の化学的類似性は、iRNA薬剤と血液中のリポタンパク質(例えば、LDL、HDL)との結合および/またはiRNA薬剤とコレステロールに親和性を有する細胞成分、例えば、コレステロール輸送経路の成分との相互作用を引き起こす可能性がある。リポタンパク質ならびにその成分は、細胞によって、様々な能動的および受動的輸送機構によって、例えば、限定はしないが、LDL受容体結合LDLのエンドサイトーシス、酸化された、もしくはその他の修飾をされたLDLのスカベンジャー受容体Aとの相互作用によるエンドサイトーシス、肝臓におけるHDLコレステロールのスカベンジャー受容体B1の媒介による取り込み、ピノサイトーシスまたはABC(ATP結合カセット)輸送タンパク質、例えば、ABC−A1、ABC−G1もしくはABC−G4によるコレステロールの膜通過輸送によって取り込まれ、処理される。したがって、コレステロール結合iRNA薬剤は、このような輸送機構を有する細胞、例えば、肝臓の細胞による取り込みの促進を受けることができた。このように、本発明は、このような成分(例えば、コレステロール)の天然リガンドをiRNA薬剤に結合させるか、またはこの成分(例えば、LDL、HDL)の天然リガンドと関連する、もしくは結合するiRNA薬剤に化学的部分(例えば、コレステロール)を結合させることによって、ある種の細胞表面成分、例えば、受容体を発現する細胞にiRNA薬剤を標的化させる証拠および一般的方法を提供する。
(4 その他の実施形態)
RNA、例えば、iRNA薬剤は、インビボにおいて、例えば、細胞に送達された外来DNA鋳型から細胞内で産生され得る。例えば、このDNA鋳型は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与によって(米国特許第5328470号)、または定位注射によって(例えば、チェン(Chen)ら、Proc.Natl.Acad.Sci、USA、第91巻、3054〜3057頁、1994年)対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達担体が包埋された徐放性マトリックスを含み得る。DNA鋳型は、例えば、2個の転写単位を含むことができ、一方はiRNA薬剤の上鎖を含む転写物を生成し、他方はiRNA薬剤の下鎖を含む転写物を生成する。この鋳型が転写されたとき、iRNA薬剤が生成され、遺伝子サイレンシングを媒介するsiRNA薬剤断片に処理される。
(5 製剤)
本明細書で説明したiRNAは、対象に投与するために製剤化することができる。
(6 Brc−Abl融合発現に関連した障害)
Bcr−Abl融合物を標的とするiRNA薬剤、例えば、本明細書で説明したiRNA薬剤は、対象、例えば、Bcr−Abl融合遺伝子発現に関連した疾患または障害、例えば、望ましくない細胞増殖もしくは癌、またはより具体的には白血病を発症しているヒト又はその危険性のあるヒトを治療するために使用することができる。
(7 治療方法および送達経路)
iRNA薬剤、例えば、Bcr−Abl融合物を標的とするiRNA薬剤を含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、クモ膜下、実質、静脈内、経鼻、経口および眼内送達が含まれる。本発明のiRNA薬剤を投与する好ましい手段は、非経口投与によるものである。
「薬学的に許容される担体」という用語は、その担体が肺に著しく有害な毒性効果を与えず肺に取り込まれることが可能であることを意味する。
一実施形態では、単位用量を1日1回より少ない頻度で、例えば、2日、4日、8日または30日毎に1回より少ない頻度で投与する。他の実施形態では、単位用量は一定頻度(例えば、規則正しい頻度)では投与されない。例えば、単位用量を1回で投与することが可能である。iRNA薬剤が媒介するサイレンシングは、iRNA薬剤組成物を投与した後、数日間維持され得るので、多くの場合、1日1回より少ない頻度で、場合によっては全治量期間中1回のみ組成物を投与することが可能である。
試薬の入手先が本明細書に具体的に挙げられていない場合、このような試薬は、分子生物学用試薬の任意の供給元から、分子生物学での適用に標準的な量/純度で入手することができる。
siRNA合成
1本鎖RNAは、Expedite 8909合成機(アプライドバイオシステムズ、アプレラドイチュランド社(Applied Biosystems、Applera Deutschland GmbH)、[ドイツ国、ダルムシュタット(Darmstadt)所在]および固相担体として微細孔性ガラス(CPG、500Å、グレンリサーチ社(Glen Reserach)、[米国バージニア州スターリング(Starling)所在])を使用して、1μmoleのスケールで固相合成によって作製された。RNAおよび2’−O−メチルヌクレオチドを含有するRNAは、それぞれ対応するホスホラミダイトおよび2’−O−メチルホスホラミダイトを使用して固相合成によって作製された(プロリゴバイオケミ社(Proligo Biochemie GmbH)、[ドイツ国、ハンブルク(Hamburg)所在])。これらの構成単位を、「Current protocols in nucleic acid chemistry」、ボカージュ エス.エル.(Beaucage、S.L.)ら(編)、John Wiley & Sons、Inc.[アメリカ合衆国ニューヨーク]に記載されたような標準的ヌクレオシドホスホラミダイト化学物質を使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル(1%)に溶解したボカージュ試薬(クルアケム社(Chruachem Ltd)[英国グラスゴー(Glasgow)所在])の溶液と置換することによって導入された。他の付随する試薬は、マリンクロットベーカー社(Mallinckrodt Baker)[ドイツ国、グリサイム(Griesheim)所在]から入手した。
核酸配列は、標準的名称、具体的には表2の略語を使用して以下に表した。
切断点変種e14a2に対して陽性の初代患者細胞におけるBCR−ABLの下方制御
新たに診断された、未治療のフィラデルフィア染色体陽性CML慢性患者3人から、CD34陽性細胞を単離した。細胞を採取する前に患者からインフォームドコンセントを得た。単核細胞をフィコールハイパック密度勾配遠心(セロメッド社(Seromed)[ドイツ国、ベルリン所在])によって収集した。CD34陽性細胞は、幹細胞単離キットおよびMACSカラム(ミルテニーバイオテック社(Miltenyi Biotech)[ドイツ国、ベルギッシュグラートバハ(Bergisch Gladbach)所在])を使用して、製造者の指示に従って単離した。細胞純度は、FITC結合抗CD34抗体(ビーディ バイオサイエンスィーズ イムノサイトメトリーシステムズ(BD Biosciences、Immunocytometry Systems)[アメリカ合衆国カリフォルニア州サンホゼ所在])を使用してFACS分析によって調べた。CD34陽性細胞の画分は、96〜99%の範囲であった。
Claims (25)
- 配列番号2、6、12、14、16または20のうちの1つにおける15以上の連続したヌクレオチドの配列との相違が1、2、または3ヌクレオチド以下であるアンチセンス鎖からなるiRNA薬剤。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号2、6、12、14、16または20のうちの1つにおける少なくとも15の連続したヌクレオチドを有する、請求項1に記載のiRNA薬剤。
- 配列番号1、5、11、13、15または19のうちの1つにおける15以上の連続したヌクレオチドの配列との相違が1、2、または3ヌクレオチド以下であるセンス鎖をさらに含む、請求項1または2に記載のiRNA薬剤。
- 配列番号1、5、11、13、15または19のうちの1つにおける15の連続したヌクレオチドの配列を有するセンス鎖をさらに含む、請求項1または2に記載のiRNA薬剤。
- 前記薬剤が薬剤番号3、4、または5のうちの1つである、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- 前記センス鎖が、薬剤番号3、4、または5のセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、薬剤番号3、4、または5のアンチセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドを有する、請求項1に記載のiRNA薬剤。
- 前記iRNA薬剤が、前記薬剤と共にインキュベーションした後の培養ヒト細胞中に存在するBCR−ABL融合タンパク質レベルの量を、前記薬剤と共にインキュベートされていない細胞と比較して有意に低減し、同細胞が、好ましくは32Dp210/e14a2、32Dp210−T315I、32Dp210−H396P、32Dp210/e13a2、32Dp190/e1a2、M07p210/e14a2、K562、MEG−01、またはSUP−B15であるか、あるいは白血病患者から単離されたものである、請求項1乃至6のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- 前記アンチセンスRNA鎖の長さが30ヌクレオチド以下であり、かつiRNA薬剤の2本鎖領域の長さが15から30ヌクレオチド対である、請求項1乃至7のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- 前記iRNA剤に生物試料中での高い安定性を付与する修飾を含んでなる、請求項1乃至8のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- ホスホロチオエートまたは2’修飾ヌクレオチドを含む、請求項9に記載のiRNA薬剤。
- ウリジンが2’修飾ヌクレオチドである、少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−ua−3’)ジヌクレオチド;5’−ウリジンが2’修飾ヌクレオチドである、少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5’−ug−3’)ジヌクレオチド;5’−シチジンが2’修飾ヌクレオチドである、少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−ca−3’)ジヌクレオチド;または5’−ウリジンが2’修飾ヌクレオチドである、少なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−uu−3’)ジヌクレオチドを含む、請求項10に記載のiRNA薬剤。
- 前記2’修飾ヌクレオチドが、2’−デオキシ、2’−デオキシ−2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)、2’−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)、および2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)からなる群から選択された修飾を含む、請求項10または11に記載のiRNA薬剤。
- 1から4個の不対ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部分を含む、請求項1乃至12のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- 前記ヌクレオチド突出部分が、2または3個の不対ヌクレオチドを有する、請求項13に記載のiRNA薬剤。
- 前記ヌクレオチド突出部分が、前記iRNA薬剤のアンチセンス鎖の3’末端にある、請求項13または14に記載のiRNA薬剤。
- リガンドを含む、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のiRNA薬剤。
- 前記リガンドが、iRNA薬剤のセンス鎖の3’末端に結合している、請求項16に記載のiRNA薬剤。
- 請求項1乃至17のいずれか1項に記載のiRNA薬剤と、
薬学的に許容される担体と
からなる医薬組成物。 - 対象の細胞内にあるBCR−ABL RNAの量を低減する方法であって、同細胞を、請求項1乃至18のいずれか1項に記載のiRNA薬剤と接触させることからなる方法。
- 請求項1乃至17のいずれか1項に記載のiRNA薬剤を作製する方法であって、前記方法は前記iRNA薬剤を合成することからなり、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、ヌクレオチド鎖分解に対してiRNA薬剤を安定化させる少なくとも1つの修飾を含む方法。
- 増殖性障害を有するか、同増殖性障害を発症する危険性のあるヒトを治療する方法であって、前記方法は請求項1乃至17のいずれか1項に記載のiRNA薬剤を投与することからなり、好ましくは、前記iRNA薬剤が、薬剤番号1、2、3、4、5または6のiRNA薬剤のセンス鎖配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号1、2、3、4、5または6のiRNA薬剤のアンチセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とからなる方法。
- 前記iRNA薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号3、4または5のセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなり、前記iRNA薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号3、4または5のアンチセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなる、請求項21に記載の方法。
- 前記iRNA薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号3または4のセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなり、前記iRNA薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号3または4のアンチセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなり、前記増殖性障害が慢性骨髄性白血病である、請求項22に記載の方法。
- 前記iRNA薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号5のセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなり、前記iRNA薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号5のアンチセンス配列における少なくとも15の連続したヌクレオチドからなり、前記増殖性障害がPh+急性リンパ芽球性白血病である、請求項22に記載の方法。
- 前記ヒトの細胞または組織内のBCR−ABL RNAレベルを低下させるのに十分な量で、前記iRNA薬剤が投与される、請求項21乃至24のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
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