PT1883411E - Oligonucleótido e composições compreendendo o mesmo para o tratamento de neoplasma de células - Google Patents

Oligonucleótido e composições compreendendo o mesmo para o tratamento de neoplasma de células Download PDF

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Yong-Li Yu
Mu-Sheng Bao
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Description

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DESCRIÇÃO "OLIGONUCLEÓTIDO E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO O MESMO PARA O TRATAMENTO DE NEOPLASMA DE CÉLULAS B"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção proporciona um oligonucleótido com uma sequência conforme mostrado em SEQ ID NO: 1 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, num sujeito mamifero, uma composição compreendendo o mesmo e um método para indução de apoptose de células B neoplásicas, super-regulação de CD40 sobre células B neoplásicas in vitro e indução de células B neoplásicas para produzir IL-10 in vitro. 0 oligonucleótido pode ser usado individualmente ou em combinação com produtos quimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticos e radiação para tratar neoplasma de células B.
ANTECEDENTES
Baseado no sistema de classificação WHO (American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121), as malignidades linfoides são agrupadas em três classes principais: neoplasma de células B, neoplasma de células assassinas naturais (NK)/células T e linfomas de Hodgkin. 0 neoplasma de células B é ainda dividido em dois grupos: neoplasma de células B precursoras e neoplasma de células B periféricas. 0 neoplasma de células B precursoras inclui leucemia linfoblástica aguda B precursora (leucemia linfoblástica aguda de células B, B-ALL)/linfoma linfoblástico (LBL). 0 neoplasma de células B periféricas inclui leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia pró-linfocítica de 2 células B, linfoma linfoplasmacítico/imunocitoma, linfoma de células de Mantle, linfoma folicular, linfoma folicular cutâneo, linfoma de células B de zona margina extranodal do tipo MALT, linfoma de células B de zona marginal nodal (+/-células B monocitoides), linfoma de zona marginal esplénica (+/- linfócitos vilosos), leucemia de células pilosas, plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas, linfoma de células B grande difuso, linfoma de células B grande mediastinal (timico), linfoma de células B grande intravascular, linfoma de efusão primário e linfoma de Burkitt. A leucemia linfocitica crónica de células B (B-CLL) e a leucemia linfoblástica/linfocitica aguda de células B (B-ALL) são dois tipos de leucemias de células B. As células de B-CLL expressam CD19, CD5 e CD23 (Nicholas Chiorazzi, M.D. et al. N Engl J Med 2005;352:804-15). As células de B-ALL expressam marcadores CD19+CD10+. O linfoma linfocitico pequeno é um neoplasma de células B. A população monoclonal de células B em linfoma linfocitico pequeno expressa CD19, CD5 e CD23 (Catherine Thieblemont, et al. Blood. 2004;103: 2727-2737).
Dependendo do neoplasma de células B diagnosticado, opções de tratamento atuais são a quimioterapia, radioterapia e imunoterapia.
O CD40, expresso sobre a superfície celular de linfócitos B normais e células dendríticas, é um membro da família do recetor do fator de necrose de tumor (TNFR). O CD40L (CD154), expresso sobre linfócitos T, é um membro da família do fator de necrose de tumor (Castle BE. et al. J 3
Immunol 1993; 151: 1777-1788). A interação de CD40L e CD40 promove a proliferação, diferenciação e apresentação de antigeno de linfócitos B, células dendriticas e monócitos (Ranheim EA, et al. J Exp Med 1993; 177: 925-935; Yellin MJ, et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Anhu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M. von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325). O CD40 também expressa sobre células B neoplásicas. Foi demonstrado que a intensificação da expressão de CD40 promove a apoptose de células B neoplásicas (Peter Chu. et al. PNAS, março 19, 2002, vol. 99, n° : 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 abril 2005 Volume 105, Número 8: 3193-3198).
Experiências in vitro e in vivo indicaram que a estimulação e super-regulação de CD40 induziu à inibição de crescimento de células B neoplásicas (Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953,1995; Eliopoulos, A. G., et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A., et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al. 2001.Clin. Câncer Res. 7:691). A promoção de expressão de CD40 sobre células B neoplásicas foi reportada como intensificando a antigenicidade de células B neoplásicas e, consequentemente, promovendo a geração de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos às células. Os CTL podem matar eficazmente células B neoplásicas (Dilloo D, et al. Blood. 1997;90:1927-1933; Kato K, et al. J Clin Invest. 1998;101:1133-1141; Wierda WG, et al. Blood. 2000;96:2917-2924; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, et al. Câncer Gene Ther.2001;8:378-387). Na presença de CD40L, as células 4 B de leucemia linfocítica crónica expressando CD40 podem ser mortas por linfócitos T citotóxicos CD4 (Frank Dicker, et al. Blood, 15 abril 2005 Vol 105, Número 8: 3193-3198). A interação de D40L e CD40 sobre células de linfoma de Burkett poderia promover a célula a apresentar antigenos tumorais a CTLs específicos (Khanna, R. et al. 1997. J. Immunol. 159:5782). Experiências in vivo e testes clínicos também demonstraram que a ativação de CD40 poderia intensificar a imunogenicidade de células B de leucemia linfocítica crónica (B-CLL) e, consequentemente, induzir à geração de CTLs específicos às células (Kato, K., et al. 1998.J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W. G., et al. 2000. Blood 96: 2917) .
Juntos, estes dados indicam que a intensificação de expressão de CD40 sobre células B neoplásicas pode estimular a imunidade antitumoral contra neoplasma de células B. A imunidade antitumoral inclui, mas não está limitada ao seguinte: 1. promoção de apoptose de células B neoplásicas; 2. inibição do crescimento de células B neoplásicas; 3. intensificação da imunogenicidade de células B neoplásicas e, portanto, promoção da geração de CTLs específicos às células. A interleucina-10 (IL-10) é uma citocina homodimérica produzida por determinadas células T, monócitos, macrófagos e algumas células neoplásicas desenvolvidas a partir de células B, células T ou células NK (Kitabayashi et al., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997; Boulland et al., 1998; Jones et al., 1999). A atividade de IL-10 é mediada pelo seu recetor específico na superfície celular. O recetor expressa-se sobre células 5 apresentando antígeno, linfócitos e também células B de leucemia linfocítica crónica (B-CLL). Descobriu-se que a adição de IL-10 exógeno inibia a proliferação de células de B-CLL recentemente isoladas de pacientes (Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89, No 11 (1 de junho), 1997: pág. 4146-4152). Também foi reportado que IL-10 inibe a proliferação de células B-CLL e intensifica a apoptose de células B-CLL (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand, e Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179 janeiro 1994 91-99). A imunoestimulação de propriedades anticancerigenas de IL-10 foi discutida numa revisão, da qual foi especulado que a super-expressão de IL-10 dentro do microambiente do tumor pode catalisar rejeição imune do cancro (Simone Mocellin, Francesco M. Marincola e Howard A. Young. Interieukin-10 and the immune response against câncer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78:1043-1051) .
Na presente invenção, nós proporcionamos um oligonucleótido tendo a sequência SEQ ID:1 para utilização no tratamento de neoplasma de células B num sujeito mamífero. O oligonucleótido induz a apoptose de células B neoplásicas, promove a expressão de CD40 em células B neoplásicas e estimula as células B neoplásicas a produzir IL-10.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num primeiro aspeto, a invenção proporciona um oligonucleótido tendo a sequência SEQ ID: 1 para a 6 utilização no tratamento de neoplasma de células B, num sujeito mamífero.
Num outro aspeto, a invenção fornece um oligonucleótido que tem a sequência SEQ ID N0:1 para a utilização no tratamento de neoplasma de células B, o qual está compreendido dentro de uma composição farmacêutica.
Num outro aspeto, a invenção fornece um método de indução de apoptose de células neoplásicas de células B in vitro, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B com uma composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID NO: 1.
Num outro aspeto, a invenção fornece um método para aumentar a expressão de CD40 em células neoplásicas de células B, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B in vitro com uma composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID NO:1.
Num outro aspeto, a invenção fornece um método para induzir as células neoplásicas de células B a produzir IL-10, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B in vitro com uma composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID N0:1.
Num outro aspeto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de neoplasma de células B compreendendo: (1) um oligonucleótido com a sequência SEQ ID N0:1 e (2), um agente anti-neoplasma de células B. 7
Num outro aspeto, a invenção refere-se à utilização de um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID N0:1 para a produção de um medicamento para o tratamento de neoplasma de células B.
Um oligonucleótido com uma sequência de 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (designada como 01igo-2 ou indicada SEQ ID NO: 1) ou seu homólogo funcional é divulgada. 0 oligonucleótido ou seu homólogo funcional pode ter uma modificação na parte principal de fosfato que é uma modificação parcial ou completa de fosforotioato ou fosforoditioato. 0 oligonucleótido ou seu homólogo funcional pode ter modificações químicas ou ter substituições por bases raras. 0 oligonucleótido ou seu homólogo funcional pode ser uma parte funcional de qualquer outro oligonucleótido ou fragmento de ADN ou ser clonado num plasmídeo, vetor bacteriano, vetor virai ou vacina de ADN, respetivamente. 0 oligonucleótido com a sequência de SEQ ID NO: 1 pode ser modificado através de adição de uma ou mais bases (de preferência 1 a 10 bases) a cada uma das suas extremidades ou através de alteração das bases do mesmo. Os peritos na técnica podem determinar o uso do oligonucleótido com a sequência SEQ ID NO: 1 ou seu homólogo funcional, ou do fragmento de ADN, de cadeia simples ou de cadeia dupla, compreendendo uma ou mais cópias do oligonucleótido com a sequência (SEQ ID NO: 1) para obter o objetivo da presente divulgação com base no conhecimento na técnica e no ensinamento da presente invenção.
Um método para o tratamento de neoplasma de células B é também divulgado, usando o oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente invenção ou a composição compreendendo o mesmo num indivíduo. 0 indivíduo é um ser humano ou animal. 0 neoplasma de células B inclui, mas não está limitado a, leucemia de células B, linfoma de células B e mieloma.
Um método para o tratamento de neoplasma de células B usando o oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente divulgação, ou a composição compreendendo os mesmos por indução da apoptose de células neoplásicas de células B é também divulgado.
Um método para o tratamento de neoplasma de células B usando o oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente divulgação, ou a composição compreendendo os mesmos por super-regulação de CD40 em células neoplásicas de células B é também divulgado.
Um método para o tratamento de neoplasma de células B usando o oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente divulgação, ou a composição compreendendo os mesmos por estimulação das células neoplásicas de células B para a produção de IL-10 é também divulgado.
Num outro aspeto, a presente divulgação proporciona uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente invenção, sozinho ou em/com um outro veículo farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser administrada através de administração entérica, parenteral e tópica ou através de inalação.
Um método para o tratamento de neoplasma de células B é também divulgado, compreendendo a administração de uma 9 quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleótido ou seu homólogo funcional da presente divulgação, ou da composição compreendendo os mesmos e pelo menos um de agentes anti-neoplasma de células B, incluindo produtos quimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticos e os agentes usados em radioterapia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Apoptose de células de B-CLL induzida por Oligo-2 (Dosagem) Células de B-CLL foram cultivadas em meio com soro AB humano a 10% com ou sem várias quantidades de Oligo-2. No dia 7, as células foram coradas com TMRE. 0 número de células de B-CLL viáveis foi calculado para a percentagem de células TMRE-positivas.
Figura 2. O efeito de Oligo-2 sobre a super-regulação de CD40 em células B-CLL
As células de B-CLL foram incubadas com ou sem Oligo-2 durante 7 dias e, então, coradas com anticorpo FITC-CD40 para análise de expressão de CD40 usando citometria de fluxo. O nivel de expressão foi indicado com o número MFI.
Figura 3. O efeito de Oligo-2 sobre a super-regulação de CD40 sobre células de linfoma linfocitico pequeno
As células de linfoma linfocitico pequeno foram incubadas com ou sem Oligo-2. No dia 7, as células foram coradas com anticorpo FITC-CD40 para análise de expressão de CD40 usando citometria de fluxo. O nivel de expressão foi indicado com o número MFI. 10
Figura 4. Apoptose de células de B-ALL induzida por Oligo-2 Células de B-ALL foram incubadas com ou sem Oligo-2. Nos dias 3, 5 e 7 da incubação, as células foram coradas com TMRE, seguido por análise por citometria de fluxo. O número de células de B-ALL viáveis foi calculado para a percentagem de células TMRE-positivas.
Figura 5. Super-regulação de CD40 sobre células de B-ALL pelo Oligo-2 Células de B-ALL foram cultivadas com ou sem 1 pg/mL de Oligo-2. Nos dias 3, 5 e 7 da cultura, as células foram coradas com mAb anti-CD40 FITC-rotulado para análise de expressão de CD40 usando citometria de fluxo. O nível de expressão foi indicado com o número MFI.
Figura 6. Produção de interleucina-10 a partir de células de B-CLL induzida por Oligo-2
As células de B-CLL foram cultivadas com ou sem Oligo-2 num meio isento de soro. Os sobrenadantes foram recolhidos no ponto de tempo indicado e avaliados em termos de IL-10 usando um kit ELISA.
Figura 7. O efeito de Oligo-2 sobre a proliferação de PBMCs humanas normais
As PBMCs humanas normais foram cultivadas com Oligo-2, 2216 ou 2006 durante 36 h e, então, incorporadas com [3H]timidina para determinação da proliferação das células, respetivamente. As cinco amostras de sangue foram analisadas. A proliferação de células foi expressa como SI. 11 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
Na presente invenção, os termos a seguir terão os significados abaixo:
Um "oligonucleótido" significa múltiplos nucleótidos (isto é, moléculas compreendendo um açúcar (por exemplo, deoxiribose) ligados a um grupo fosfato e a uma base orgânica permutável). Existem quatro bases orgânicas, citocina (C) , timina (T) , adenina (A) e guanina (G) . 0 oligonucleótido pode ser sintetizado por um sintetizador automático de oligonucleótidos disponível no mercado, ou ser preparado a partir de sequências de ácido nucleico existentes usando técnicas conhecidas.
Uma "modificação de parte principal" de oligonucleótido significará que um oligonucleótido tem uma parte principal de fosfato modificada com fosforotioato (isto é, pelo menos um dos oxigénios do fosfato é substituído por enxofre) ou outra parte principal modificada.
Uma "modificação química" de oligonucleótido significará a modificação através de utilização dos grupos ativos do nucleótido ou criação de análogos de nucleótido. As modificações podem ocorrer durante ou após a síntese do oligonucleótido. Durante a síntese, bases modificadas (incluindo, mas não limitado a, análogos de Timidina) podem ser incorporadas internamente ou sobre a extremidade 5' . Após a síntese, a modificação pode ser realizada usando os grupos ativos (via um amino modificador, via os grupos 3' ou 5' hidroxilo ou via o grupo fosfato). 12
Um "neoplasma de células B" significará doenças desenvolvidas a partir da proliferação anormal de células da linhagem de linfócitos B. 0 neoplasma de células B pode ser agrupado em leucemia de células B, linfoma de células B e mieloma (plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas). A leucemia de células B inclui leucemia linfocitica crónica de células B (B-CLL), leucemia linfoblástica aguda B precursora (leucemia linfocitica aguda de células B, B-ALL) , leucemia pró-linfocitica de células B e leucemia de células pilosas. 0 linfoma de células B inclui linfoma linfocitico pequeno, linfoma linfo plasmacitico/imunocitoma, linfoma de células de Mantle, linfoma folicular, linfoma folicular cutâneo, linfoma de células B de zona marginal extranodal do tipo MALT, linfoma de células B de zona marginal nodal (+/- células B monocitoides), linfoma de zona marginal esplénica (+/-linfócitos vilosos), linfoma de células B grande difuso, linfoma de células B grande mediastinal (timico), linfoma de células B grande intravascular, linfoma de efusão primário e linfoma de Burkitt.
Um "indivíduo" significará um mamífero incluindo, mas não limitado a, um ser humano, macaco, cão, gato, cavalo, vaca, porco, cabra, ovelha, ratinho e rato. o oligonucleótido da invenção pode ser administrado a um indivíduo com neoplasma de células B.
Um "agente anti-neoplasma de células B" significará um agente usado para tratar neoplasma de células B num indivíduo. 0 agente inclui o oligonucleótido da presente invenção, produtos guimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticos e os agentes usados em radioterapia. 0 oligonucleótido da invenção pode ser administrado antes de, 13 em conjunto com, ou após a administração de um ou mais outros agentes anti-neoplasma de células B para se atingir um efeito sinergistico no tratamento de neoplasma de células B.
Os "produtos quimioterapêuticos" significarão os produtos quimioterapêuticos que tratam o neoplasma de células B em combinação com o oligonucleótido da invenção. 0 oligonucleótido da presente invenção pode ser usado com um ou mais produtos quimioterapêuticos no tratamento de neoplasma de células B. Os produtos quimioterapêuticos incluem, mas não estão limitados a, agentes de alquilação, tais como ciclofosfamida ou clorambucil, vinca alcaloides (por exemplo, vincristina e vinblastina), procarbazina, metotrexato, prednisona, antraciclina, L-asparaginase, análogos de purina (por exemplo, monofosfato de fludarabina, 2-clorodeoxiadenosina e pentostatina), citosina, arabinosida, cisplatina, etoposida e ifosfamida. 0 oligonucleótido da presente invenção também pode ser usado com uma ou mais combinações de produto quimioterapêutico na quimioterapia. As combinações incluem, mas não estão limitadas a, CVP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona), CHOP (CVP e doxorubicina), C-MOPP(ciclofosfamida, vincristina, prednisona e procarbazina), CAP-BOP (CHOP mais procarbazina e bleomicina), m-BACOD (CHOP mais metotrexato, bleomicina e leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposida e leucovorina mais MOPP padrão), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposida, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato e leucovorina), MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dose fixa de prednisona, bleomicina e leucovorina), IMVP-16 14 (ifosfamida, metotrexato e etoposida), MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato e etoposida), DHAP (dexametasona, alta dose de citarabina e cisplatina), ESHAP (etoposida, metilpredisolona, HD citarabina, cisplatina) CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposida, procarbazina, prednisona e bleomicina), CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona), CHOP mais bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostarda de azoto, arabinosida de citosina e etoposida. MOPP (mecletamina (mostarda de azoto), vincristina (Oncovin), procarbazina e prednisona), ABVD (por exemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina), CHIVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona), CABS (lomustina, doxorubicina, bleomicina e estreptozocina), MOPP mais ABVD, MOPP mais ABV (doxorubicina, bleomicina e vinblastina) ou BCVPP (carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina e prednisona) e CAP (ciclofosfamida, doxorubicina e prednisona).
Os "produtos imunoterapêuticos" significarão os produtos imunoterapêuticos que tratam o neoplasma de células B em combinação com o oligonucleótido da invenção. 0 oligonucleótido da presente invenção pode ser usado com um ou mais produtos imunoterapêuticos no tratamento de neoplasma de células B. Os produtos imunoterapêuticos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-CD20. 0 anticorpo a CD20 inclui imunoglobulinas e seus fragmentos que são especificamente reativos com uma proteína de CD20 sobre a superfície de células B neoplásicas. Anticorpos CD20 podem ser anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos bi-específicos e anticorpos humanizados. Uma "CD20" é uma proteína da membrana de células B (Tedder et al., Immunology Today 15: 15 450-454 (1994)) e é expressa sobre células B neoplásicas e normais (John C. Byrd, et al. J Clin Oncol 2001; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98: 1326-1331).
Um "veículo farmaceuticamente aceitável" denota um ou mais agentes de enchimento, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidas ou líquidas que são adequados para administração do oligonucleótido da invenção a um indivíduo. O veículo pode ser orgânico, inorgânico, natural ou sintético. O veículo inclui qualquer e todas as soluções, diluentes, solventes, meios de dispersão, lipossoma, emulsões, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardo de absorção e qualquer outro veículo adequado para administração do oligonucleót ido da invenção e seu uso é bem conhecido na técnica. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do oligonucleótido da invenção deverá referir-se a uma dose usada para obter um resultado desejado de tratamento de neoplasma de células B num indivíduo. A dose pode ser determinada através de técnicas padrão bem conhecidas pelos peritos na técnica e pode variar dependendo de fatores incluindo, mas não limitado ao tamanho e/ou saúde global do indivíduo ou a gravidade da doença. A introdução de um oligonucleótido da invenção pode ser realizada como um único tratamento ou durante uma série de tratamentos. As doses individuais do oligonucleótido da invenção para a administração oscilam de cerca de 1 pg a 100 mg por administração. Contudo, as doses para o tratamento de neoplasma de células B podem ser usadas numa faixa de 10 a 1.000 vezes maior do que as doses descritas acima. O regime de dosagem pode ser ajustado para 16 proporcionar o efeito terapêutico ideal pelos peritos na técnica. A "via" de administração do oligonucleótido da invenção significará a administração entérica, parenteral e tópica ou inalação. 0 termo "entérica", conforme aqui usado, inclui a administração oral, gástrica, intestinal e retal, o termo "parenteral" inclui a administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal, ou vaginal. 0 termo "tópico" denota a aplicação do oligonucleótido externamente à epiderme, na cavidade bucal e no ouvido, olho e nariz.
Uma "composição farmacêutica" significará a composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do oligonucleótido da invenção com ou sem um veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição inclui, mas não está limitada a, soluções aquosas ou salinas, partículas, aerossóis, peletes, grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, composições farmacêuticas em gotas e outras composições adequadas para uso numa ampla variedade de sistemas de distribuição de fármacos. As composições são adequadas para uso por injeção, oral, bucal, retal e vaginal, inalação e aplicação em depósito. Em todos os casos, a composição deve ser estéril e estável sob as condições de fabrico e armazenamento e preservada contra a contaminação microbiana. Para injeção, a composição incluirá soluções ou dispersões aquosas e pós para a preparação extemporânea de soluções injetáveis ou dispersão. "Pó" na presente invenção refere-se a uma composição que contém partículas sólidas finamente divididas contendo o oligonucleótido da invenção. 0 pó pode 17 ser formulado com outros veículos farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, água, PBS, solução salina e outros tampões farmaceuticamente aceitáveis) antes da utilização. As soluções podem ser preparadas através de incorporação do oligonucleótido em um ou mais solventes apropriados e outros ingredientes requeridos. As dispersões podem ser preparadas através de incorporação do oligonucleótido num veículo, o qual contém um meio de dispersão (por exemplo, glicerol, polietilenoglicóis líquidos e óleos) e os outros ingredientes necessários. Para administração oral, a composição será formulada com veículos de ingestão para formar comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes. Para administração bucal, a composição será comprimidos ou comprimidos da maneira convencional. Para inalação, a composição será um pulverizador em aerossol de embalagens pressurizadas ou um nebulizador ou um pó seco e pode ser selecionada de por um perito na técnica. 0 oligonucleótido também pode ser formulado como composições farmaceuticamente aceitáveis para aplicações retais ou vaginais e para aplicação por depósito. 0 oligonucleótido da invenção na composição pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes incluindo, mas não limitado a, produtos quimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticos e um ligante reconhecido por um recetor ou molécula específicos da célula alvo. 0 oligonucleótido da invenção em combinação com outro agente pode estar em composições distintas e ser usado com o seguinte: (1) o oligonucleótido é misturado com um segundo agente antes da administração; (2) o oligonucleótido e um segundo agente são administrados a um indivíduo em momentos diferentes; (3) o oligonucleótido e um segundo agente são administrados a diferentes locais de um indivíduo. Além disso, a 18 composição pode conter plasmídeo, vetores bacterianos, vetores virais e vacinas de ácido nucleico suportando a sequência do oligonucleótido da invenção.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são ilustrativos da presente invenção.
Exemplo 1. Síntese do oligonucleótido
Um oligonucleótido com uma sequência 5'- TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (designado como 01igo-2, SEQ ID NO: 1) foi projetado e sintetizado.
Para analisar as funções do 01igo-2, dois oligonucleótidos de controlo de 2006 com a sequência 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO:2) e 2216 com a sequência de 5'-gggggacgatcgtcgggggg-3' (SEQ ID NO: 3) também foram sintetizados. Três dos oligonucleótidos foram sintetizados em Sangon Biotech Company (Xangai, China), testados em termos de endotoxina através de uso do ensaio de lisato de amebócito Limulus (Associates of Cape Cod, Inc) e manipulados em reagentes isentos de pirogénio. O 2006 (J Immunol 2000: 164: 1617) é um oligonucleótido bem estudado que ativa fortemente células B normais. O 2216 (Eur J Immunol 2001; 31: 2154) é outro oligonucleótido bem estudado que induz à altas quantidades de interferão do tipo I em células dendriticas plasmacitoides.
Os métodos para síntese do oligonucleótido são bem conhecidos por peritos na técnica e, entre outros, a síntese em fase sólida é geralmente usada. Especificamente, no processo da síntese, o suporte sólido usado é glóbulo de 19 vidro com poro controlado (CPG). Esse glóbulo tem uma superfície com orifícios e canais e são nesses que o nucleótido protegido é preso. A síntese de oligonucleótido começa com o nucleótido na terminação mais 3' e prossegue através de uma série de ciclos compostos de cinco etapas que podem ser repetidas até que o nucleótido mais 5' seja preso. Essas etapas são desproteção, ativação, acoplamento, revestimento e estabilização.
Etapa 1. Desproteção 0 grupo protetor no nucleosídeo protegido preso a um glóbulo CPG (vidro com poro controlado) é removido através de ácido tricloroacético (TCA), levando a um grupo 5'-hidroxilo reativo.
Etapa 2. Ativação
Nessa etapa, tetrazola ataca o acoplamento de nucleosídeo de fosforamidita, formando um intermediário de tetrazolil fosforamidita.
Etapa 3. Acoplamento 0 intermediário de tetrazolil fosforamidita reage com o grupo hidroxilo do recipiente e a ligação 5' a 3' é formada. A tetrazola é reconstituída e o processo continua.
Etapa 4. Revestimento
Nessa etapa, um reagente de acetilação composto de anidrido acético e N-metil imidazol é usado para bloquear um grupo hidroxilo reativo na sua extremidade mais 5' dos oligonucleótidos para evitar falha de acoplamento. 20
Etapa 5. Estabilização
Uma vez que a etapa de revestimento é realizada, a última etapa no ciclo é a etapa oxidação, que estabiliza a ligação de fosfato entre a cadeia do oligonucleótido em crescimento e a base mais recentemente adicionada. Essa etapa é realizada na presença de iodo como um oxidante suave em tetrahidrofurano (THF) e água.
Após essa etapa final, o ciclo é repetido para cada nucleótido na sequência. Após término da síntese, a molécula de ADN de cadeia simples é purificada através de métodos tais como HAP, PAGE, HPLC, C18 e OPC.
Exemplo 2 Apoptose de células de B-CLL humanas induzida por Oligo-2 1. Preparação de células B-CLL humanas
Amostras de sangue de pacientes com B-CLL não tratados (patologicamente identificados) (The First Hospital, Jilin University, China) foram recolhidas após obtenção de consentimento informado por escrito aprovado. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas através de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque (Pharmacia). Células B-CLL CD5+CD19+CD23+ em PBMCs foram purificadas usando o kit de isolamento de células B (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para > 95% de células CD5+CD19+CD23+ (células de B-CLL). A preparação de células foi realizada sob a orientação da Miltenyi Biotec. 21 2. Apoptose de células de B-CLL humanas induzida por Oligo-2
As células de B-CLL foram incubadas com 01igo-2 ou 2006 ou 2216 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone). Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após incubação, as células foram contadas e coradas com tetrametil rodamina etiléster (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células de B-CLL positivas para TMRE (viáveis) e negativas para TMRE (apoptóticas) foram determinadas através de citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O número de células de B-CLL viáveis foi calculado multiplicando-se a contagem de células totais pela percentagem de células TMRE-positivas em cada ponto de tempo. A experiência foi repetida com dez amostras de sangue de pacientes com B-CLL e o resultado médio (n = 10) mostrou que Oligo-2 induziu significativamente à apoptose de células de B-CLL (Tabela 1) e o efeito induzido pelo Oligo-2 é aproximadamente 2 vezes mais forte do que aquele induzido pelo 2006. Além disso, o efeito da dose de Oligo-2 e 2006 sobre a apoptose das células de B-CLL também foi observado. 0 resultado mostrou que Oligo-2, em várias dosagens oscilando de 0,1-10 pg/mL, obviamente induziu à apoptose de células de B-CLL (Figura 1) . Comparativamente, na dosagem de 1 pg/mL o efeito de indução de apoptose do Oligo-2 é aproximadamente 3 vezes mais forte do que aquele do 2006. Juntos, esses 22 resultados demonstram que 01igo-2 pode ser usado para tratar B-CLL através de indução da apoptose de células de B-CLL.
Tabela 1. Apoptose de células de B-CLL induzida por
Oligo-2 (cinética) Células de B-CLL viáveis (%) (n = 10) Grupo Tempo de incubação (dia) 3 5 7 Meio 82,2 ± 12,2 79,5 ± 9,25 81,3 + 11,0 2216 67,7 ± 18,2 57,7 + 16,7 50,7 ± 13,5 2006 66,5 ± 12,1 44,4 ± 15,0 40,2 ± 10,8 Oligo-2 45,5 ± 9,5 17,6 ± 5,6 14,2 ± 3, 1
Exemplo 3 Super-regulação de CD40 em células de B-CLL humanas por Oligo-2 1. Preparação de células B-CLL humanas Células de B-CLL humanas foram isoladas de pacientes com B-CLL com os procedimentos conforme descritos no Exemplo 2. 2. Super-regulação de CD40 em células de B-CLL humanas por Oligo-2
As células de B-CLL foram incubadas com Oligo-2 ou 2006 ou 2216 a uma concentração final de 3 yg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone). Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio).
No dia 7 após incubação, as células foram contadas e coradas com anticorpo FITC-CD4 0 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of 23
Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células B-CLL coradas com anticorpo CD40 foram determinadas por citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O resultado (Figura 2) mostrou que Oligo-2 super-regula significativamente a expressão de CD40 sobre células de B-CLL, indicando que Oligo-2 pode ser usado para tratar B-CLL através de super-regulação de CD40 sobre as células. A super-regulação de CD40 promove a apoptose de células de B-CLL, induz à inibição de crescimento de células de B-CLL e torna as células de B-CLL mais imunogénicas para estimular a geração de CTLs específicos às células de B-CLL. A experiência foi repetida com pelo menos dez amostras de sangue de pacientes com B-CLL com resultados similares.
Exemplo 4 A Apoptose de células de linfoma linfocitico pequeno humano induzida por Oligo-2 1. Preparação de células de linfoma linfocitico pequeno humano
As células de linfoma linfocitico pequeno foram isoladas do tecido de biopsia de nódulo linfático de pacientes (The First Hospital, Jilin University, China) com linfoma linfocitico pequeno (patologicamente identificado) após obtenção de consentimento informado por escrito aprovado. O tecido de biopsia foi picado através de lâminas de vidro com superfície grossa para libertar as células em 5 mL de meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) numa placa de cultura de 6 cm. As células libertadas foram filtradas através de uma malha de aço inoxidável e recolhidas num tubo cónico de 50 mL contendo 15 mL de meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone). O tubo foi centrifugado a 300 x g durante 10 minutos e, então, o sobrenadante foi descartado. 24 Células CD5+CD19+CD23+ de linfoma linfocítico pequeno foram purificadas usando o kit de isolamento de células B (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para > 95% de células CD5+CD19+CD23+ (células de linfoma linfocítico pequeno). A preparação de células foi realizada sob a orientação da Miltenyi Biotec. 2. Apoptose de células de linfoma linfocítico pequeno induzida por 01igo-2
As células de linfoma linfocítico pequeno foram incubadas com 01igo-2 ou 2006 ou 2216 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após a incubação, as células foram contadas e coradas com tetrametil rodamina etiléster (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células de linfoma linfocítico pequeno positivas para TMRE (viáveis) e negativas para TMRE (apoptóticas) foram determinadas através de citometria de fluxo (B.D. FACS Ária) . O número de células de linfoma linfocítico pequeno viáveis foi calculado multiplicando-se a contagem de células totais pela percentagem de células TMRE-positivas em cada ponto de tempo. A experiência foi repetida com cinco amostras dos pacientes com linfoma linfocítico pequeno e o resultado médio (n = 5) mostrou que Oligo-2 induz significativamente a apoptose das células de linfoma 25 linfocítico pequeno (Tabela 2), indicando que 01igo-2 pode ser usado para tratar linfoma linfocítico pequeno através de indução de apoptose de células de linfoma linfocítico pequeno.
Tabela 2. Apoptose de células de linfoma linfocítico pequeno induzida por 01igo-2 Células de linfoma linfocítico pequeno viáveis (%) n=5 Grupo Tempo de incubação (dia) 3 5 7 Meio 81,2 ± 7,7 78,4 ± 9,1 77,1 ± 13,2 2216 68,5 ± 15,0 58,7 ± 12,3 52,1 ± 10,2 2006 67,6 ± 10,3 45, 3 ± 8,9 41,1 ± 8,2 Oligo-2 60,3 ± 12,2 23, 2 ± 5,6 15,5 ± 6,2
Exemplo 5 Super-regulação de CD40 de células de linfoma linfocítico pequeno induzida por Oligo-2 1. Preparação de células de linfoma linfocítico pequeno humano
As células de linfoma linfocítico pequeno humano foram isoladas de pacientes com os procedimentos conforme descritos no Exemplo 4. 2. Super-regulação de CD40 de células de linfoma linfocítico pequeno induzida por Oligo-2
As células de linfoma linfocítico pequeno foram incubadas com Oligo-2 ou 2006 ou 2216 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. 0 Oligo-2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio). 26
No dia 7 após a incubação, as células foram contadas e coradas com anticorpo FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células de linfoma linfocitico pequeno coradas com anticorpo CD40 foram determinadas por citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O resultado (Figura 3) mostrou que Oligo-2 super-regula significativamente a expressão de CD40 sobre células de linfoma linfocitico pequeno, indicando que Oligo-2 pode ser usado para tratar linfoma linfocitico pequeno através de super-regulação de CD40 sobre as células. A super-regulação de CD40 promove a apoptose de células de linfoma linfocitico pequeno, induz à inibição de crescimento de células de linfoma linfocitico pequeno e torna as células de linfoma linfocitico pequeno mais imunogénicas para estimular a geração de CTLs específicos às células. A experiência foi repetida com cinco amostras com resultados semelhantes.
Exemplo 6. Apoptose de células de leucemia linfocítica/linfoblástica aguda de células B humanas (B-ALL) induzida por Oligo-2 1. Preparação de células B-ALL humanas
Amostras de sangue de pacientes com B-ALL não tratados (patologicamente identificados) (The First Hospital, Jilin University, China) foram recolhidas após obtenção de consentimento informado por escrito aprovado. PBMCs foram isoladas através de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque (Pharmacia). Células B-ALL CD19+CD10+ em PBMCs foram purificadas usando o kit de isolamento de células B (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para > 95% 27 de células CD19+CD10+ (células de B-ALL). A preparação de células foi realizada sob a orientação da Miltenyi Biotec. 2. Apoptose de células de B-ALL induzida por 01iqo-2 As células de B-ALL foram incubadas com 01igo-2 ou 2216 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2, ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após a incubação, as células foram contadas e coradas com tetrametil rodamina etiléster (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et ai. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células de B-ALL positivas para TMRE (viáveis) e negativas para TMRE (apoptóticas) foram determinadas através de citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O número de células de B-ALL viáveis foi calculado multiplicando-se a contagem de células totais pela percentagem de células TMRE-positivas em cada ponto de tempo. O resultado mostrou gue Oligo-2 induziu significativamente à apoptose de células de B-ALL (Figura 4), demonstrando que Oligo-2 pode ser usado para tratar B-ALL através de indução da apoptose de células de B-ALL. A experiência foi repetida com dez amostras de sangue de pacientes com B-ALL com resultados similares. 28
Exemplo 7 Super-regulação de CD40 em células de B-ALL por 01igo-2 1. Preparação de células B-ALL humanas Células de B-ALL humanas foram preparadas a partir de amostras de sangue de pacientes com os procedimentos conforme descritos no Exemplo 6.
As células de B-ALL foram incubadas com 01igo-2 ou 2216 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2, ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) ) foi usado como um controlo (Meio).
Nos dias 3, 5, 7 após a incubação, as células foram contadas e coradas com anticorpo FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23,
Publicação de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) durante 10 minutos. As células B-ALL coradas com anticorpo CD40 foram determinadas por citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O resultado (Figura 5) mostrou que Oligo-2 super-regula significativamente a expressão de CD40 sobre células de B-ALL, indicando que Oligo-2 pode ser usado para tratar B-ALL através de super-regulação de CD40 sobre as células. A super-regulação de CD40 promove a apoptose de células de B-ALL, induz à inibição de crescimento de células de B-ALL e torna as células de B-ALL mais imunogénicas para estimular a geração de CTLs específicos às células de B-ALL. A experiência foi repetida com dez amostras de pacientes com B-ALL com resultados similares. 29
Exemplo 8 A produção de IL-10 a partir de B-CLL induzida por 01igo-2 1. Preparação de células B-CLL humanas Células de B-CLL humanas foram isoladas de pacientes com B-CLL com os procedimentos conforme descritos no Exemplo 2. 2. A produção de IL-10 a partir de B-CLL induzida por 01iqo-2
As células de B-CLL foram cultivadas com 01igo-2 a uma concentração final de 3 pg/mL em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) a 106 células/poço numa placa com 48 poços. O Oligo-2 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controlo (Meio). Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos às 72 h ou nos pontos de tempo indicados e avaliados em termos de IL-10 no sistema Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems). Os nossos dados mostraram que a ignição com Oligo-2 levou à produção de um alto nível de IL-10 a partir de células de B-CLL (Figura 6). Um aumento profundo de produção de IL-10 foi detetado a 6 h, com um pico às 24 h, e altos níveis restantes durante as 72 h de cultura. Além disso, os nossos dados ainda mostraram que a adição de rh-IL-10 exógeno (Schering Corp) em culturas de células de B-CLL induziu células de B-CLL apoptóticas de uma maneira dependente de dose de IL-10, as quais poderiam ser especificamente bloqueadas pelo anticorpo anti-IL-10 (R&D Systems). Estas descobertas demonstram que Oligo-2 pode ser usado para tratar B-CLL através de indução da produção de IL-10 que provoca a apoptose de células de B-CLL de uma maneira autócrina. A experiência foi repetida usando pelo menos dez amostras de pacientes com B-CLL. 30
Exemplo 9 O efeito de Oligo-2 sobre a proliferação de PBMCs humanas normais PBMCs humanas foram isoladas de revestimentos da camada leucocitária de dadores de sangue normais (The Blood Center of Jilin Province, China) através de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Pharmacia). A viabilidade das PBMCs foi de 95-99% conforme determinado através de exclusão com azul de tripano.
As PBMCs (6 X 105/poço) foram colocadas em lâminas com fundo em U com 96 poços (Costar) e cultivadas com ou sem o Oligo-2 (6 pg/mL) em triplicado durante 36 h, seguido por pulsação com [3H]timidina (New England Nuclear, Boston, MA) durante 16 h. As células foram recolhidas sobre filtros de fibra de vidro e detetadas num contador de cintilação. A proliferação de células foi expressa como SI (indice de estimulação) (a partir de poços triplos). Dados de cinco amostras de sangue normais são mostrados. 2006 e 2216 foram usados em controlos. Os resultados mostraram que Oligo-2 pôde estimular as PBMCs a proliferar obviamente (Figura 7), indicando que Oligo-2, ao invés de induzir à apoptose, é estimulador da proliferação para PBMCs humanas normais e não é tóxico para as células cultivadas.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Changchun Huapu Biotechnology Co.,Ltd
<120> Um oligonucleótido ou seu homólogo funcional, uma composição compreendendo o mesmo e um método para o tratamento de neoplasma em células B 31 <130> IP 0 6 0 010 <160> 3 <17 0> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <4 0 0> 1 tcgtcgacgt cgttcgttct c 21 <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <4 0 0> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <4 0 0> 3 gggggacgat cgtcgggggg 20
Lisboa

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um oligonucleótido que tem a sequência SEQ ID NO: 1 para a utilização no tratamento de neoplasma de células B, num sujeito mamífero. 2. 0 oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o oligonucleótido ser para induzir apoptose de células neoplásicas de células B. 3. 0 oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o oligonucleótido ser para a super-regulação de CD40 sobre células neoplásicas de células B. 4. 0 oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o oligonucleótido ser para a estimulação das células neoplásicas de células B para produzir IL -10.
5. O oligonucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referido neoplasma de células B é leucemia de células B, linfoma ou mieloma de células B. 2 6. 0 oligonucleótido de acordo com a reivindicação 5 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com a reivindicação 5, em que a referida leucemia de células B é leucemia linfocitica crónica de células B, ou leucemia linfocitica aguda de células B. 7. 0 oligonucleótido de acordo com a reivindicação 5 para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com a reivindicação 5, em que o referido linfoma das células B é linfoma linfocitico pequeno. 8. 0 oligonucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido indivíduo mamífero é um indivíduo humano. 9. 0 oligonucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento de neoplasma de células B, de acordo com qualquer reivindicação anterior, que se destina à administração por via entérica, parentérica ou tópica ou por inalação.
10. Um oligonucleótido que tem a sequência de SEQ ID N0:1 para a utilização no tratamento de neoplasma de células B, o qual está compreendido dentro de uma composição farmacêutica.
11. Um método de indução de apoptose de células neoplásicas de células B in vitro, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B com uma 3 composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID NO: 1.
12. Um método para aumentar a expressão de CD40 em células neoplásicas de células B, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B in vitro com uma composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID N0:1.
13. Um método para a indução de células neoplásicas de células B para produzir IL-10, compreendendo o contacto das referidas células neoplásicas de células B in vitro, com uma composição compreendendo um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID N0:1. 14. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, em que as referidas células neoplásicas de células B são células de leucemia linfocitica crónica de células B (B-CLL), ou células de leucemia linfocitica aguda de células B (B -ALL), ou células de linfoma linfocitico pequeno.
15. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de neoplasma de células B, compreendendo: (1) um oligonucleótido com a sequência SEQ ID N0:1 e (2) , um agente anti-neoplasma de células B.
16. A composição de acordo com a reivindicação 15, em que o referido agente anti-neoplasma de células B é selecionado a partir de agentes quimioterapêuticos, imunoterapêuticos, ou agentes utilizados em radioterapia. 4
17. A composição de acordo com a reivindicação 16, em que os referidos quimioterapêuticos são selecionados a partir do grupo constituído por: fludarabina, pentosatin, vincristina, ciclofosfamida, prednisona, CVP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona), e CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona).
18. A composição de acordo com a reivindicação 16, em que os referidos imunoterapêuticos são um anticorpo anti-CD20 .
19. A composição de acordo com a reivindicação 16, em que a referida radioterapia é a radiação externa ou um tratamento com o anticorpo radiomarcado.
20. A utilização de um oligonucleótido possuindo a sequência SEQ ID NO:l para a produção de um medicamento para o tratamento de neoplasma de células B.
21. A utilização de acordo com a reivindicação 20, em que o neoplasma de células B é selecionado a partir de leucemia de células B, linfoma ou mieloma das células B. Lisboa,
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2728276A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Index Pharmaceuticals Ab Combination therapies against cancer
CN101643496B (zh) * 2008-08-07 2015-09-09 长春华普生物技术有限公司 一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸
WO2010053433A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Index Pharmaceuticals Ab Increased expression of specific antigens
WO2012084991A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Index Pharmaceuticals Ab Biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system ii
US9157919B2 (en) * 2010-12-21 2015-10-13 Index Pharmaceuticals Ab Method for identifying biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system
CN106893724B (zh) * 2015-12-17 2023-05-02 苏州派动生物技术有限公司 具有抗原增效作用和肿瘤治疗作用的寡核苷酸
WO2021249116A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AP1775A (en) * 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
KR20020091170A (ko) * 2000-03-31 2002-12-05 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 림프종의 치료를 위한 항-사이토카인 항체 또는길항제 및 항-ｃｄ２０의 조합된 사용
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20040009156A1 (en) * 2001-10-12 2004-01-15 Christoph Reinhard Antisense therapy using oligonucleotides that target human kinesin genes for treatment of cancer
ES2528384T3 (es) 2001-12-12 2015-02-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Healt Métodos de utilización de inhibidores del receptor de adenosina para potenciar la respuesta inmunitaria y la inflamación
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
DE10258677A1 (de) 2002-12-13 2004-06-24 Elez, Vera, Dr. Kombinations-antisense-Oligonukleotid-Krebstherapie
CN100486987C (zh) * 2003-03-05 2009-05-13 长春华普生物技术有限公司 抗病毒和抗肿瘤的含CpG单链脱氧寡核苷酸
CN100439386C (zh) 2003-03-05 2008-12-03 长春华普生物技术有限公司 增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸
DE602004031946D1 (de) 2003-07-25 2011-05-05 Changchun Huapu Biotechnology Co Ltd Das künstliche cpg single strand deoxidation-oligonukleotid und dessen antivirale anwendungen
JP4513879B2 (ja) 2008-03-05 2010-07-28 ソニー株式会社 像ぶれ補正装置、レンズ鏡筒装置及びカメラ装置

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