KR20080007655A - 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체, 이들을함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체, 이들을함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SEQ ID NO:1-9의 서열을 가진 9개의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체(functional homologues) 또는 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한 조성물 및 상기 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체 또는 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한 조성물을 사용하여 B림프구 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발하며, B림프구 신생세포 상에서 CD40의 조절을 향상하고 B림프구 신생세포에서 IL-10의 생성을 촉진(자극)한다.
올리고뉴클레오티드, B림프구, 세포사멸(에이포토시스), 신생 세포, 기능상동체, 신생물.

Description

올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체, 이들을 함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법{OLIGONUCLEOTIDES OR THEIR FUNCTIONAL HOMOLOGUES, A COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND A METHOD OF TREATING B CELL NEOPLASM}
본 발명은 SEQ ID NO:1 ~ 9에서 나타낸 서열(Sequences)을 가진 9개의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체(functional homologues), 이들을 함유한 조성물 및 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 B림프구(B cell)의 신생세포(neoplastic cells)의 세포사멸(에이포토시스)(apoptosis)를 유발하고, B리프구 신생세포 상에서 CD40의 조절을 향상(up-regulating)하며, 그 B림프구의 신생세포를 자극하여 IL-10을 생성함으로써 B림프구 신생물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체는 개별적으로 또는 함께 사용하거나, 또는 화학요법제, 면역요법제 및 방사선(radiation) 요법제와의 조합으로 사용하여 B림프구 신생물을 치료할 수 있다.
세계보건기구 시스템(WHO system)(참고문헌 : American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121)에 의해 림프계 악성(lymphoid malignancies)은 다음 3가지 주분류, 즉 B림프구 신생물(B-cell neoplasm), T림프구(T-cell)/내튜럴 킬러림프구[natural killer (NK)-cell] 신생물 및 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas)으로 구분하였다.
상기 B림프구 신생물은 다음 2가지 그룹(group)으로 더 분리한다:
전구 B림프구 신생물(precursor B-cell neoplasm) 및 말초 B림프구 신생물(peripheral B-cell neoplasm), 전구 B림프구 신생물에는 전구 B림프구-급성림프 모구성 백혈병(precureor B-acute lymphoblastic leukemia)(B-cell acute lymphoblastic leukema: B-ALL)/림프모구성 림프종(lymphoblastic lymphoma:LBL)을 포함한다.
말초 B림프구 신생물에는 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia)(B-CLL), 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), B림프구 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 림프 형질 세포 림프종/면역 세포종(immunocytoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 여포 림프종(follocular lymphoma), 피부 여포 림프종(cutaneous follicular lymphoma), MALT 타입(type)의 결절성 외연변층 B림프구 림프종(extranodal marginal zone B-cell lymphoma), 결정성 연변층 B림프구 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma)(+/- 단구상 B림프구), 비장성 연변층 림프종(splenic marginal zone lymphoma)(+/- 융모상 림프구(villous lymphoma)), 유모상 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 형질세포종(plasmacytoma)/형질세포성 골수종(plasma cell myeloma), 미만성 대 B림프구 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 종격(흉선) 대 B림프구 림프종(mediastinal(thymic) large B cell lymphoma), 맥관내 대 B림프 구 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 1차 확연 림프종(primary effusion lymphoma) 및 버킷트 림프종(Burkitt's lymphoma)을 포함한다.
B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)과 B림프구 급성 림프 모구성/림프구성 백혈병(B-ALL)은 2가지 타입의 B림프구 백혈병이다.
상기 B-CLL 세포는 CD19, CD5 및 CD23을 발현한다(참고문헌 : Nicholas Chiorazzi, M.D., 등, N Engl J. Med. 2005;352:804-15).
상기 B-ALL 세포는 CD19 및 CD10 표지(markers)를 발현한다.
소 림프구성 림프종(Small lymphocytic lymphoma)은 B림프구 신생물이다. 그 소 림프구성 리프종 세포는 CD19, CD5 및 CD23(참고문헌 : Catherine Thieblemont, 등, Blood. 2004;103:2727-2737)을 발현한다.
진단한 B림프구 신생물에 따라, 현행 치료선택에는 화학요법, 방사선요법 및 면역요법이 있다.
정상 B림프구의 세포표면과 수지상 세포(dentritic cells) 상에서 발현된 CD40은 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor)(TNFR) 계통군(family) 중 하나의 멤버이다. T림프구 상에서 발현된 CD40L(CD154)은 종양 과사 인자 계통군 중 하나의 멤버이다(참고문헌 : Castle BE 등, J. Immunol. 1993; 151: 1777-1788).
CD40L과 CD40의 상호작용은 B림프구, 수지상 세포 및 단핵세포(monocytes)의 증식, 분화(differentiation) 및 항원제시(antigen presentation)를 촉진한다(참고문헌 : Ranheim EA, 등, J. Exp. Med. 1993; 177:925-935; Yellin M.J. 등, J. Immunol. 1994; 153:666-674; Banchereau J. 등, Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS. 등, Blood 2002; 99: 3319-3325).
또, CD40은 B림프구 신생 세포(B cell neoplastic cells) 상에서 발현한다.
상기 CD40 발현의 증강(enhancing)으로 B림프구 신생 세포의 세포사멸(에이포토시스)(apoptosis)을 촉진하는 것을 입증하였다(참고문헌:Peter Chu 등, PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker 등, BLOOD, 15 April 2005; Volume 105, Number 8: 3193-3198).
생체외(실험관내) 및 생체내 실험에서는 CD40의 자극 및 조절향상이 B림프구 신생 세포의 성장억제를 유발하였음을 나타내었다(참고문헌:Funakoshi 등, Blood 83: 2787-2794, 1994; Murphy 등, Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A. G., 등, 1996, Oncogene 13:2243; Hirano, A, 등, 1999, Blood 93:2999; Tong, A. W., M 등, 2001, Clin. Cancer Res. 7:691).
B림프구 신생 세포 상에서 CD40의 발현 촉진은 B림프구 신생 세포의 항원성을 증강하여, 결과적으로 그 신생 세포에 특이성 있는 세포장해 T림프구(cytotoxic T lymphocyte : CTL)의 생성을 촉진하는 것으로 보고 되었다.
상기 CTL(세포장해 T림프구)은 B림프구 신생 세포를 효과적으로 킬링(killing)할 수 있다(참고문헌:Dilloo D, 등, Blood. 1997;90:1927-1933; Kato K, 등, J. Clin Invest. 1998;101:1133-1141; Wierda WG, 등, Blood, 2000;96:2917-2924; Takahashi S, 등, Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, 등, Cancer Gene Ther. 2001;8:378-387).
CD40L의 존재하에서, B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포(B cell chronic lymphocytic leukemia cells)를 발현하는 CD40은 CD4 세포장해 T림프구에 의해 킬링(killing)할 수 있다(참고문헌: Frank Dicker 등, Blood, 15 April 2005 Vol. 105, Num. 8: 3193-3198).
버켓트 림프종(Burkett'slymphoma) 세포 상에서 D40L과 CD40의 상호작용은 그 세포를 촉진하여 특정 CTL에 종양항원(turmor antigens)을 제공할 수 있다(참고문헌:Khanna R. 등, 1997. J. Immunol. 159:5782).
상체내 실험과 임상실험에서도 CD40의 활성화가 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포의 면역원성(immungenicity)을 증강시킬 수 있어, 결과적으로 이들 세포에 특이성이 있는 CTL의 생성을 유발할 수 있다는 것을 나타내었다(참고문헌:Kato, K. 등, 1998.J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W. G. 등, 2000. Blood 96:2917).
동시에, 이들 데이터에서는 B림프구 신생 세포(B cell neoplastic cells) 상에서 CD40 발현의 증강이 B림프구 신생물에 대하여 항종양 면역(anti-tumor immunity)을 촉진할 수 있다는 것을 나타내었다.
항종양 면역은 다음 특성을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다:
1. B림프구 신생 세포의 세포사멸(에이포토시스) 촉진;
2. B림프구 신생 세포의 성장 억제;
3. B림프구 신생 세포의 면역원성을 증강, 따라서 상기 세포에 특이성 있는 CTL의 생성 촉진.
인터류킨(interleukin)-10(IL-10)은 어느 T림프구 세포(T cell cells), 단핵세포, 마크로파아지와, B림프구 세포, T림프구 세포 또는 NK림프구 세포에서 발생된 신생 세포 일부에 의해 생성된 호모다이머 사이토 카인(homodimer cytokine)이다(참고문헌:Kitabayashi 등, 1995; Masood 등, 1995; Sjoberg 등, 1996; Beatty 등, 1997; Boulland 등, 1998; Jones 등, 1999).
IL-10 활성은 항원 제시 세포(antigen-presenting cells), 림프구(lymphocytes) 및 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포 상에서 발현된 그 특성 세포 표면 수용체에 의해 매개 된다.
외인성 IL-10의 추가가 환자로부터 새로 분리한 B-CLL 세포의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다(참고문헌:Jesper Juriander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan 등, B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포 상에서 인터류킨-10 수용체 발현의 성상, Blood, Vol. 89, No 11(June 1), 1997: pp 4146-4152).
또 IL-10은 B-CLL 세포의 증식을 억제하여 B-CLL 세포의 세포사멸(에이포토시스)(apoptosis)을 증강하는 것으로 보고하였다(Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand 및 Jacques Banchereau; 인터류킨 10은 B-만성 림프구성 백혈병 세포의 세포사멸(Apoptotic cell death)을 유발한다; J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99).
IL-10의 면역자극 항암 성상(immunostimulating anticancer properties)은 종양 미세환경(tumor microenvironment)에서 IL-10의 과잉발현(over-expression)이 암면역 거절(cancer immune rejection)을 촉진할 수 있는 것으로 추정하는 논문집 에서 토의 되었다(참고문헌: Simone Mocellin, Francesco M. Marincola 및 Howard A. Young; Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint, Journal of Leukocyte Biology, 2005; 78-1043-1051).
(발명의 요지)
첫째 예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9에서 각각 나타낸 서열을 가진 올리고(Oligo) 1, 올리고 3, 올리고 4, 올리고 5, 올리고 6, 올리고 7, 올리고 8, 올리고 9, 올리고 10으로 지정한 9개의 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides)와 이들의 기능상동체(functional homologues)를 제공한다.
상기 올리고뉴틀레이티드 또는 이들의 기능상동체는 하나의 포스페이트 골격 수식(phosphate backbone modification), 즉 부분 또는 완전 포스포로티오에이트(phosphoro thioate) 또는 포스포로디티오에이트 수식(phosphorodithioate modification)을 가질 수 있다.
그 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체는 화학수식(chemical modifications)을 가질 수 있거나, 또는 미량염기(rare bases)와의 치환을 가질 수 있다.
그 올리고뉴클레이티드 또는 이들의 기능상동체는 어느 다른 DNA 프라그멘트의 기능부분(functional parts)이거나 또는 플라스미드(plasmid), 세균성 백터(bacterial vector), 바이러스성 백터(viral vector) 또는 DNA 백신에 각각 클로닝(cloning)할 수 있다.
상기 SEQ ID NO:1-9의 서열을 가진 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 염기 (바람직하게는 1~10개의 염기)를 이들 올리고뉴클레오티드의 각각의 단부에 부가하거나 또는 하나 이상의 염기를 이들의 올리고뉴클레오티드 내에서 변화시켜 수식할 수 있다.
이 기술분야의 통상의 기술자들은 SEQ ID NO:1-9의 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체를 개별적으로 또는 함께 사용하거나, 또는 서열(SEQ ID NO:1-9)을 각각 가진 올리고뉴클레오티드를 함유한 DNA 프라그멘트를 사용하여 이 분야에서 잘 알려진 기술지식과 본 발명의 교시를 기초로 하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있다는 것을 결정할 수 있다.
둘째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들 기능상동체를 개별적으로 또는 함께 사용하거나, 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체 함유 조성물을 피검자에 사용하여 B림프구 신생물(B cell neoplasm)의 치료방법을 제공한다.
상기 피검자는 인간 또는 동물이다. 상기 B림프구 신생물에는 B림프구 백혈병, B림프구 림프종(lymphoma) 및 골수종(myeloma)을 포함한다.
셋째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체를 개별적으로 또는 함께 사용하거나 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체 함유 조성물을 사용하여 B림프구 신생 세포의 세포사멸(에이포토시스)(apoptosis)을 유발하는 B림프구 신생물의 치료방법을 제공한다.
넷째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체를 개별적으로 또는 함께 사용하거나, 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기 능상동체를 함유한 조성물을 사용하여 B림프구 신생 세포 상에서 CD40의 조절 향상을 하는 B림프구 신생물의 치료방법을 제공한다.
다섯째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체를 사용하거나, 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체 함유 조성물을 사용하여 B림프구 신생 세포를 자극함으로써 IL-10을 생성하는 B림프구 신생물의 처리방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체의 치료 유효량 또는 의약적으로 허용할 수 있는 1종 이상의 캐리어(carrier)와 함께 함유한 조성물을 제공한다.
그 조성물은 소화관내 투여, 비경구 투여 및 국소 투여를 통해, 또는 흡입에 의해 투여한다.
하나의 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체를 개별적으로 또는 함께 치료 유효량으로 투여하거나, 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체를 함유하거나 화학요법제, 면역요법제를 포함하는 항 B림프구 신생물 약제와 방사선치료제 중 최소 하나와 함께 함유하는 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 B림프구 신생물의 치료방법을 제공한다.
정의
본 발명에서 다음 용어는 아래의 의미를 가진다:
"올리고뉴클레오티드"(oligonucleotide)는 다중 뉴클레오티드)(즉, 하나의 포스페이트기와 하나의 치환할 수 있는 유기 염기에 결합된 하나의 당(suger)(즉, 디옥시리보스)으로 이루어진 분자)를 의미한다.
4개의 유기 염기 사이토신(C), 티민(T), 아데닌(A) 및 구아닌(G)이 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 시중에서 입수할 수 있는 자동화 올리고뉴클레오티드 신세사이저(synthesizer)에 의해 합성하거나, 또는 공지기술을 사용하여 현행 핵산서열에서 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 "골격수식"("backbone modification")은 하나의 올리고뉴클레오티드가 하나의 포스포로티오에이트 수식 포스페이트 골격(즉, 그 포스페이트의 산소들 중 최소 하나가 황에 의해 치환 됨) 또는 다른 수식 골격을 가진 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드 "화학수식"(chemical modification)은 상기 뉴클레오티드의 활성기의 사용 또는 뉴클레오티드 유사체 형성에 의한 수식을 의미한다.
상기 수식은 올리고뉴클레오티드의 합성 중 또는 합성 후에 발생할 수 있다.
그 합성 중에, 수식 염기(modified bases)(티미딘 유사체를 포함하나 한정되는 것은 아니다.)는 내부결합(incorporated internally)할 수 있거나 또는 5' 단부 상에 결합할 수 있다.
그 합성 후에, 그 수식은 활성기[아미노 수식인자(amino modifier)를 통해, 3' 또는 5' 히드록시기를 통하여, 또는 포스페이트기를 통해]를 사용하여 실시할 수 있다.
"B 림프구 신생물"(B cell neoplasm)은 B 림프구 연결 세포 중 비정상 증식에서 발생한 질병(diseases)을 의미한다.
그 B림프구 신생물은 B림프구 백혈병, B림프구 림프종 및 골수종(myeloma)(형질 세포종/형질 세포성 골수종)으로 구분할 수 있다.
B림프구 백혈병에는 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL), 전구 B림프구-급성 림프모구성 백혈병(precursor B-acute lymphoblastic leukemia)(B림프구 급성 림프구성 백혈병, B-ALL), B림프구 전 림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia) 및 유모상 세포성 백혈병(hairy cell leukemia)을 포함한다.
B림프구 림프종에는 소 림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma), 림프 형질 세포성 림프종(lympho plasmacytic lymphoma)/면역 세포종(immunocytoma), 외투 세포 림프종(Mantle cell lymphoma), 여포 림프종(Follicular lymphoma), 피부여포 림프종(cutaneous follicular lymphoma), MALT 타입의 결절 외변층 B림프구 림프종(extranodal marginal zone B-cell lymphoma of MALT type), 결절 연변층 B림프구 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma)(+/- 단구상 B림프구:monocytoid B-cells), 비장성 연변층 림프종(splenic marginal zone lymphoma)(+/- 융모상 림프구:villous lymphocytes), 미만성 대 B림프구 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 맥관내 대 B림프구 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 1차 확연 림프종(primary effusion lymphoma) 및 버킷트 림프종(Burkitt's lymphoma)을 포함한다.
"피검자"(subject)는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말(horse), 소(cow), 돼지, 염소, 양, 마우스(mouse) 및 랫(rat)을 포함하나 한정되지 않은 하나의 포유동물(mammal)을 말한다.
본 발명의 올리고뉴클레이티드는 B림프구 신생물을 가진 피검자에 투여할 수 있다.
"항 B림프구 신생물 약제"(anti-B cell neoplasm agent)는 피검자의 B림프구 신생물을 치료하는데 사용되는 하나의 약제(agent)를 의미한다.
그 약제(agent)에는 본 발명의 올리고뉴클레이티드, 화학요법제, 면역요법제 및 방사선 치료제를 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레이티드는 하나 이상의 다른 항 B림프구 신생물 약제의 투여 전, 투여와 함께, 또는 투여 후에 투여하여 B림프구 신생물의 치료에 상승 효과를 얻을 수 있다.
"화학요법제"(chemotherapeutics)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 배합하여 B림프구 신생물을 치료하는 화학요법제를 말한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생물의 치료에서 1종 이상의 화학요법제와 함께 사용할 수 있다.
상기 화학요법제에는 시클로포스파미드 또는 클로람부실(chlorambucil), 빈카 알카로이드(vinca alkaloids)(즉, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트(methotrexate), 프리드니손(prednisone), 안트라시클린, L-아스파라기나제, 퓨린유사제(purine analogs)(즉, 플루다라빈 모노포스페이트, 2-클로로디옥시아데노신 및 펜토스타틴), 시토신, 아라비노사이드(arabinoside), 시스플라틴, 에토포사이드 및 이포스파미드(ifosfamide) 등 알킬화제(alkylating agents)를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
또, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학요법제에서 1종 이상의 화학요법제 배합물과 함께 사용할 수 있다.
그 배합물에는 CVP(시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프리드니손), CHOP(CVP 및 독소루비신), C-MOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프리드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP(CHOP+프로카르바진 및 블레오마이신), m-BACOD(CHOP+메토트렉세이트, 블레오마이신 및 류코보린), ProMACE-MOPP(프리드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포사이드 및 류코보린 + 표준(standard) MOPP, ProMACE-CytaBOM(프리드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포사이드, 사이타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 류코보린), MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 일정용량의 프리드니손(fixed dose prednisone), 블레오마이신 및 류코보린), MVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), MIME(메틸-개그(methyl-gag), 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), DHAP(덱사메타손, 고용량의 사이타라빈 및 시스플라틴), ESHAP(에토포사이드, 메틸프리디솔론, HD사이타라빈, 시스플라틴), CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포사이드, 프로카르바진, 프리드니손 및 블레오마이신), CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 사이타라빈 및 프리드니손), CHOP+블레오마이신, 메토트렉세이트, 프로카르바진, 나이트로젠 머스타드(nitrogen mustard), 사이토신 아라비노사이드 및 에토포사이드, MOPP(메클리타민(나이트로젠 머스타드), 빈크리스틴(온코빈:Oncovin), 프로카르바진 및 프리드니손), ABVD(즉, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChIVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프리드니손), CABS(로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP+ABVD, MOPP+ABV(독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 또는 BCVPP(카르무스틴, 사이클로포스파미드, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프리드니손) 및 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 및 프리드니손)을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
"면역요법제"(immunotherapeutics)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 배합하여 B림프구 신생물을 치료하는 면역요법제를 의미한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생물의 치료에서 1종 이상의 면역요법제와 함께 사용할 수 있다.
상기 면역요법젱는 항 CD20 항체(anti-CD20 antibodies)를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
상기 항 CD20 항체에는 B림프구 신생 세포의 세포표면 상에서 CD20 단백질과 특이하게 반응성이 있는 면역글로불린(immunoglobulins) 및 그 프라그멘트(fragments)를 포함한다.
CD20 항체는 다클론항체(polyclonal antibody) 및 단클론항체, 키메라항체, 이중 특이성 항체(bi-specific antibody) 및 인체항체(humanized antibody)로 할 수 있다.
"CD20"은 B림프구막 단백질(B-cell membrane protein)이며(참고문헌: Tedder 등, Immunology Today 15: 450-454(1994)), 정상(normal) 세포와 B림프구 신생 세포 상에서 발현한다(참고문헌: John C. Byrd 등, J. Clin, Oncol. 2001; 19:2165-2170; Huhn D, 등,Blood 2001, 98: 1326-1331).
"의약적으로 허용할 수 있는 캐리어"(pharmacetuically acceptable carrier)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 피검자의 투여에 적합한 1종 이상의 고상 또는 액상 필러(filler), 희석제(diluents) 또는 피포물질(encapsulating substances)을 의미한다.
그 캐리어는 유기, 무기, 천연 또는 합성 캐리어로 할 수 있다.
그 캐리어에는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 투여에 적합한 모든 용액, 희석제, 용제, 분산 배양액, 리포솜(liposome), 에멀젼, 코팅, 항균 및 항진균제, 동장(isotonic) 및 흡수 지연제와 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 투여에 적합한 어느 다른 캐리어를 포함하며, 이들의 사용은 이 기술에서 공지되었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 "치료 유효량"은 피검자에서 B림프구 신생물을 치료하는 소정의 결과를 얻는데 사용된 용량(dose)을 말한다.
그 용량은 그 기술분야의 기술자에 의해 공지된 표준기술에 의해 측정할 수 있으며, 그 피검자의 체형 또는/및 전체 건강상태 또는 질병의 중증도(severity)(질병의 정도)를 포함하나 한정되지 않은 여러 가지 인자(factors)에 따라 변경할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 도입은 단일치료 또는 일련의 치료에 걸쳐 실시할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 피검자 투여용량은 1회 투여당 약 1㎍ ~ 100㎎의 범위를 가진다.
그러나, B림프구 신생물의 치료용량은 위에서 설명한 용량보다 10 ~ 1,000배 더 높은 용량 범위에서 사용할 수 있다.
그 용량 처방(dosage regimen)은 조정하여 이 기술분야의 기술자에 의해 최적의 치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 "루트(route)는 소화관내(enteral)투여, 비경구투여 및 국소투여 또는 흡입(inhalation)을 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "소화관내"에는 구강(oral)투여, 위내(gastric)투여, 장내(intestinal)투여 및 직장내(rectal)투여를 포함한다.
용어 "비경구"(parenteral)에는 정맥내투여, 복강내투여, 근육내투여, 피하투여, 직장내 및 질내(vaginal)투여를 포함한다.
용어 "국소"(topical)는 표피, 협면와동(buccal cavity) 및 귀(ear), 눈(eye) 및 코(nose)의 외부에 상기 올리고뉴클레오티드의 사용을 의미한다.
"의약 조성물"(pharmaceytical composition)은 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드를 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어와 함께 함유한 조성물 또는 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한 조성물을 의미한다.
그 조성물에는 수용액 또는 식염용액, 파티클(particles), 에어로졸(aerosols), 펠릿(pellets), 그래늄(granules), 분말(powders), 정제(tablets), 코팅정제, (마이클로)캡슐,좌약, 시럽, 에멀젼(emulsions), 현탁액, 크림, 점적제(drops) 및 여러 가지의 약물투여기(drug delivery systems)의 사용에 적합한 다른 의약 조성물을 포함한다.
그 조성물은 주사, 구강, 협면(buccal), 직장 및 질내사용(vaginal use), 흡입 및 데포(depot) 사용에 적합하다.
모든 경우, 그 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균성 및 안전성을 가질 필요가 있으며 그 미생물(균) 오염을 방지하여 보존할 필요가 있다.
주사용으로, 그 조성물에는 주사용액 또는 분산액의 즉석 조제용으로 수용액 또는 분산액 및 분말을 포함한다.
이 발명에서 "분말"(powder)은 상기 올리고뉴클레오티드를 미분산성 고체입자 함유 조성물을 말한다.
그 분말은 사용 전에 의약적으로 허용되는 다른 캐리어(즉, 물, PBS, 식염수 및 다른 의약적으로 허용되는 버퍼)와 제제할 수 있다.
그 용액은 1종 이상의 적합한 용제와 다른 필요한 성분 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 배합하여 조제할 수 있다.
분산액은 상기 올리고뉴클레오티드를 분산 매질(dispersion medium)(즉, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌글리콜 및 오일)과 다른 필요한 성분을 포함하는 비히클(vehicle)에 배합하여 조제할 수 있다.
경구투여용으로, 상기 조성물은 가식(식용) 캐리어(edible carriers)와 제제하여 정제, 환제, 당제(dragees), 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 형성한다.
구강투여용으로, 상기 조성물은 통상의 방법으로 하여 정제(tablets 또는 lozenges)로 할 수 있다.
흡입(inhalation)용으로, 상기 조성물은 가압팩(packs) 또는 분무기(nebulizer)에 의한 에어로졸 스프레이(aerosol spray) 또는 건조분말로 하며 이 기술분야의 기술자에 의해 선택할 수 있다.
또, 상기 올리고뉴클레오티드는 직장내 또는 질내 사용 또는 데포(depot) 사용에 쓰이는 의약적으로 허용할 수 있는 조성물로서 제제할 수 있다.
그 조성물 중에서 상기 올리고뉴클레오티드는 단독으로 사용하거나, 화학요법제, 면역요법제 및 특정 수용체 또는 표적세포의 분자에 의해 인식된 리간드를 포함하나 한정되지 않은 1종 이상의 다른 약제(agents)와 배합하여 사용할 수 있다.
또 다른 약제와 배합한 상기 올리고뉴클레오티드는 각각의 조성물로 하여 다음과 같이 사용할 수 있다:
(1) 상기 올리고뉴클레오티드는 투여 전 하나의 제 2약제(second agent)와 혼합한다;
(2) 상기 올리고뉴클레오티드와 하나의 제 2약제를 피검자에 시간을 달리하여 투여한다;
(3) 상기 올리고뉴클레오티드와 하나의 제 2약제를 피검자의 다른 부위에 투여한다.
또, 그 조성물은 플라스미드, 세균벡터, 바이러스벡터와 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 서열을 가진 핵산 백신을 함유할 수 있다.
도 1은 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절 향상에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸다.
상기 B-CLL 세포는 7일간 올리고뉴클레오티드와 함께 배양하거나 그 올리고뉴클레오티드 없이 배양한 다음, 유동세포 계측법(flow cytometry)을 사용하여 CD40 발현분석을 위하여 FITC-CD40 항체로 염색하였다.
그 발현 레벨은 MFI 넘버(number)로 표시하였다.
도 2는 소 림프구성 림프종 세포(small lymphocytic lymphoma cells) 상에서 CD40의 조절 향상에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸다.
상기 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 사용하지 않고 상기 소 림프구성 림프종 세포를 배양하였다.
배양 7일에, 유동세포 계측법(flow cytometry)을 사용하여 CD40 발현 분석을 위하여 상기 세포를 FITC-CD40 항체로 염색하였다.
그 발현 레벨은 MFI 넘버(number)로 표시하였다.
도 3은 정상 인간 PBMC의 증식에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸다.
정상 인간 PBMC는 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하거나 사용하지 않고 배 양한 다음, 세포의 증식을 측정하기 위하여 [3H] 티미딘으로 배합하였다.
세포의 증식은 cpm으로 표시하였다.
다음에 실시예를 설명하나, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이 분야의 기술자에 의해 합리적으로 발생하는 변형 등 여러 가지의 합리적인 변형은 여기서 본 발명의 범위 내에서 벗어남이 없이 실시할 수 있다.
실시예 1 : 상기 올리고뉴클레오티드의 합성
본 발명자들은 다음 서열과 명칭을 가진 올리고뉴클레오티드(oligonucleitides)를 지정하여 합성하였다:
Figure 112007086575596-PCT00001
상기 Oligo들의 기능을 분석하기 위하여, 서열 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'를 가진 2006과 서열 5'-gggggacgatcgtcggggg-3'을 가진 2216의 2개의 대조 올리고뉴클레오티드(control oliginucleitudes)를 또 합성하였다.
그 올리고뉴클레오티드 모두는 상곤 바이오테그 컴파티(Sangon Biotech Company)(중국, 상하이)에서 합성하여 리뮬루스 아메바성세포 용해물 아세이(Limulus amebocyte lysate assay)를 사용하여 엔도톡신(endotoxin)(내독소)에 대하여 테스트 하였으며(Associates of Cape Cod, Inc), 발열인자 없는 시약(pyrogen-free reagents) 중에서 조작(manipulation) 하였다.
상기 올리고뉴클레오티드 2006(참고문헌: J. Immunol. 2000; 164: 1617)은 정상 B림프구 세포를 강하게 활성화하여 충분하게 실험한 올리고뉴클레오티드이다.
상기 올리고뉴클레오티드 2216(참고문헌: Eur. J. Immunol. 2001; 31:2154)은 형질세포 형상의 수지상 세포(plamacytoid dendritic cells)에서 높은 양의 타입 1 인터페론(interferon)을 유발하는 또 다른 올리고뉴클레오티드로서 충분하게 실험을 한 것이다.
그 올리고뉴클레오티드의 합성방법은 이 기술분야의 기술자에 의해 널리 공지되었으며, 기타방법 중에서 고상 합성법(solid-phase synthesis)이 일반적으로 사용되었다.
특히, 상기 고상 합성법의 프로세스에서 고상 지지체는 조절소공글라스(controlled pore glass : CPG) 비이드(bead)가 사용되었다.
이 비이드(bead)는 구멍(holes)과 채널(channels)을 가진 하나의 표면을 가지며, 이들의 구멍과 채널 내에는 보호(protected) 뉴클레오티드가 부착되어 있다.
그 올리고뉴클레오티드 합성은 상기 3'-최상(most) 뉴클레오티드에서 개시하여 상기 5'-최상 뉴클레오티드가 결합될 때까지 반복되는 5개 스텝으로 이루어진 일연의 사이클(cycles)을 통하여 처리한다.
이들의 스텝에는 다음의 탈보호 작용(deprotection), 활성화 작용(activation), 커플링 작용(coupling)(동반작용), 캐핑 작용(capping) 및 안정화 작용(stabilization)이 있다.
스텝 1 : 탈보호 작용(deprotection)
CPG(controlled pore glass) 비이드(bead)에 부착된 보호 뉴클레오사이드에서의 보호기가 반응성 5'-히드록시기를 이탈하는 트리클로로아세트산(TCA)에 의해 제거된다.
스텝 2 : 활성화 작용(activation)
이 스텝에서, 테트라졸이 테트라졸릴 포스포르아미다이트 중간체를 형성하는 커플링 작용 포스포르아미다이트 뉴클레오사이드를 공격한다.
스텝 3 : 커플링 작용(coupling)
테트라졸릴 포스포르아미다이트 중간체가 그 수용체의 히드록시기와 작용하여 5' ~ 3' 결합이 형성된다.
그 테트라졸은 재구성되고, 그 프로세스는 연속한다.
스텝 4 : 캐핑작용(capping)
이 스텝에서, 아세트산 무수물과 N-메틸이미다졸로 이루어진 아세틸화 시약을 사용하여 커플링 작용 장애(cuopling failure)를 회피하기 위해 그 올리고뉴클레오티드의 5'-최단부(most end) 상에서 반응성 히드록시기를 블로킹(blocking)한다.
스텝 5 : 안정화 작용(stabilization)
일단 상기 캐핑 작용 스텝이 완료될 경우, 이 사이클에서의 최종 스텝은 산화작용(oxidation)으로, 이 산화작용은 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬과 방금 전에 부가한 염기(most recently added base) 사이의 포스페이트 결합을 안정화한다.
이 스텝은 테트라히드로푸란(THF)과 물 중에서 온화한 산화제로서 요오드(iodine)의 존재하에 실시한다.
이 최종 스텝 다음에 이 사이클은 상기 서열의 각각의 뉴클레오티드에 대하여 반복한다.
상기 합성이 완료된 후에 단일가닥(single stranded) DNA 분자를 HAP, PAGE, HPLC, C18 및 OPC 등의 방법에 의해 정제한다.
실시예 2 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleitudes)에 의해 유발된 인간 B-CLL 세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
치료하지 않은 B-CLL(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제 1병원)의 혈액샘플을 혈액 채취 허가서를 발급받은 후에 채취하였다.
말초혈 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells : PBMCs)는 Ficoll-Paque(Pharmacia)의 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 분리하였다.
상기 PBMC에서 CD5 + CD19 + CD23 + B-CLL 세포는 B림프구 분리 킷 트(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 CD5 + CD19 + CD23 + 세포(B-CLL 세포) > 95%으로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자 Miltenyi Biotec의 지침서에 의해 실시하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 인간 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
상기 B-CLL 세포는 48-웰플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 최종 농도 3㎍/ml에서 각각 Oligo1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216으로 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 희석하였다.
얻어진 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지, HyClone)의 동일 용량을 대조 희석액(control)(배지:Medium)으로 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들의 세포를 카운팅(counting)하고 10분간 테트라메틸-로드아민-에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)로 염색(staining)하였다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
TMRE 양성(+)(생존가능) 및 TMRE 음성(-)(세포사멸:apoptotic) B-CLL 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)에 의해 계측하였다.
생존가능 B-CLL 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점(time point)에서 TMRE-양성(+) 세포 %로 곱하여 계산하였다.
B-CLL 환자에서 채취한 10종의 혈액샘플로 동일하게 실험을 반복하여 실시하였다.
평균하여 그 결과(n=10)에서는 상기 올리고뉴클레오티드가 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 현저하게 유발하였음을 나타내었다(다음 표 1 참조).
올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 B-CLL 세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)
생존가능한 B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포(%) (n=10)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
Oligo 1 55.7 27.7 19
Oligo 3 85.5 37.3 31.6
Oligo 4 60.1 38.8 27.5
Oligo 5 58.1 38.1 23.2
Oligo 6 52.3 34.9 31.7
Oligo 7 59.6 38.4 30.2
Oligo 8 51.1 34.2 29.6
Oligo 9 52.8 37.9 24.3
Oligo 10 54.6 35.4 28.3
배지(대조) 82.2 79.5 81.3
2006 66.5 44.4 40.2
2216 67.7 57.7 50.7
실시예 3 : 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의한 인간 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절 향상
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
실시예 2에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 B-CLL 환자에서 인간 B-CLL 세포를 분리하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 B-CLL 세포 상에서의 CD40의 상향 조절(up-regulation)
상기 B-CLL 세포는 48-웰플레이트(well plate)의 106 cells/well 에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 최종 농도 3㎍에서 각각 Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7, Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 또는 2216과 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HuClone) 중에서 상기 올리고뉴클레오티드를 희석하였다.
그 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지:HyClone)의 동일 용량을 대조(배지)로 사용하였다.
배양 7일 후에, 10분간 세포(cells)를 카운팅(counting)하여 FITC-CD40 항체로 염색하였다(Becton ickinson)(Molecular Probes Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
B-CLL 세포를 염색한 상기 CD40 항체를 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
그 결과(도 1)에서는 상기 올리고뉴클레오티드가 B-CLL 세포 상에서 CD40의 발현 조절을 현저하게 향상한다는 것을 나타내었으며, 그 올리고뉴클레오티드를 사용하여 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절향상을 통해 B-CLL 환자를 치료할 수 있다는 것을 나타내었다.
CD40의 조절향상은 B-CLL 세포의 세포사멸(에이포토시스)을 촉진하여, B-CLL 세포의 성장 저지(growth inhibition)를 유발하고 그 B-CLL 세포를 더 면역원성(immunogenic)이 있도록 하여 B-CLL 세포에 특이성 있는 CTL의 발생을 촉진(자극)한다.
B-CLL 환자로부터 채취한 최소 10개의 혈액샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 4 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucletides)에 의해 유발된 인간 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸(에이포토시스)
1. 인간 소림프구성 림프종 세포의 조제
환자의 혈액 채취 허가 통지서를 취득한 다음, 소림프구성 림프종(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제 1병원)로부터 림프절(lymph node)의 생검조직(biopsy tissue)에서 소림프 구성 림프종 세포를 분리하였다.
그 생검조직을 거친 표면의 글라스 슬리이드(glass slides)에 의해 민싱(mincing)하여 6㎝ 배양 플레이트내 5㎖의 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 이들 세포(cells)를 방출하였다.
그 방출된 세포는 스테인리스 스틸제 메시를 통하여 여과하고 15ml의 혈청 없는 RPMI 1640 배지를 포함하는 50㎖용 삼각 튜브 내에 수집(collection)하였다.
그 삼각튜브를 10분간 300×g에서 원심분리한 다음, 상증액을 폐기하였다.
CD5 + CD19 +CD23 + 소림프구성 림프종 세포는 B림프구 분리키트(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 CD5 + CD19 + CD23 + 세포(소림프구성 림프종 세포) > 95%으로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자(Miltenyi Biotec)의 지침서에 따라 실시하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드(olignucleotides)에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포의 에이포토시스(세포사멸)
48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 최종 농도 3㎍/ml에서 각각 Oligo 1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216과 함께 상기 소림프구성 림프종 세포를 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 상기 올리고뉴클레오티드(olignucleotides)를 희석하였다.
대조(control)(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 PEMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들 세포를 10분간 카운팅(counting)하고 테트라메틸-로드아민 에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)로 염색하였다.
상기 TMRE-양성(+)(생존가능) 및 TMRE-음성(-)(세포사멸) 소림프구성 림프종 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D FACS Aria)에 의해 측정하였다.
생존가능 소림프구성 림프종 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점에서 상기 TMRE-양성 세포 %와 곱하여 계산하였다.
소림프구성 림프종 환자로부터 얻은 5개 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하였다. 평균하여 그 결과(n=5)에서는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleo tides)가 그 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸을 현저하게 유발한다는 것을 나타내었으며(다음 표 2), 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 사용하여 그 세포(cells)의 세포사멸을 유발함으로써 소림프구성 림프종을 치료할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포(small lymphocytic lymphoma cells)의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)
생존가능한 소림프구성 림프종 세포(%) (n=5)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
Oligo 1 53.5 26.7 18
Oligo 3 83.9 38.4 29.1
Oligo 4 61.1 36.9 29.7
Oligo 5 57.2 37.4 21.3
Oligo 6 56.2 36.1 32.1
Oligo 7 60.5 40.3 31.1
Oligo 8 50.2 37.4 30.2
Oligo 9 54.2 39.7 25.4
Oligo 10 56.5 37.6 29.3
배지(대조) 81.2 78.4 77.1
2006 67.6 45.3 41.1
2216 68.5 58.7 52.1
실시예 5 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포 상에서 CD40의 조절 향상
1. 인간 소림프구성 림프종 세포의 조제
실시예 4에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 환자로부터 인간 소림프구성 림프종 세포를 분리하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포 상에서 CD40의 조절 향상
상기 소림프구성 림프종 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 3㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo 1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216과 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 상기 올리고뉴클레오티드를 희석하였다.
대조(control)(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 7일 후에, 이들 세포(cells)를 10분간 카운팅(counting)하고 FITC-CD40 항체(Becton ickinson)(Molecular Prober Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
상기 CD40 항체로 염색한 소림프구성 림프종 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
그 결과(도 2)에서는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)가 소림프 구성 림프종 세포 상에서 CD40의 발현 조절을 현저하게 향상한다는 것을 나타내었으며, 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포(cells) 상에서 CD40의 조절 향상에 의해 소림프구성 림프종을 치료할 수 있다는 것을 나타내었다.
CD40의 조절 향상은 소림프구성 림프종 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 촉진하여, 소림프구성 림프종 세포의 성장 억제를 유발하며, 소림프구성 림프종 세포가 더 면역원성이 있도록 하여 소림프구성 림프종 세포에 특이성 있는 CTL의 발생을 촉진한다.
5개의 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 6 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 인간 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
1. 인간 B-ALL 세포의 조제
환자 혈액 채취 허가 통지서를 얻은 다음에, 치료하지 않은 B-ALL(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제일병원)로부터 혈액샘픔을 채취하였다. PBMC는 Ficoll-Paque (Pharmacia) 밀도구배 원심분리에 의해 분리하였다.
PBMC 에서의 CD19 + CD10 + B-ALL 세포는 B림프구 분리킷트(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany)를 사용하여 CD19 + CD10 + 세포(B-ALL 세포) > 95%로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자(Miltenyi Biotec)의 지침서에 따라 실시하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucletoides)에 의해 유발된 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
상기 B-ALL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 3㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo 1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216과 함께 배양하였다.
상기 올리고뉴클레오티드는 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 희석하였다.
대조(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들의 세포(cells)를 10분간 카운팅(counting) 하고 테트라메틸-로드아민 에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)로 염색하엿다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
상기 TMRE-양성(+)(생존가능) 및 TMRE-음성(-)(세포사멸) B-ALL 세포를 유동세포 계측법(B.D FACS Aria)에 의해 측정하였다.
생존가능 B-ALL 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점에서 TMRE-양성(+) 세포 %와 곱하여 계산하였다.
B-ALL 환자로부터 채취한 10개의 혈액샘플을 사용하여 실험을 동일하게 반복하였으며, 평균으로 하여 얻은 결과(n=10)에서는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)가 B-ALL 세포(다음 표 3)의 에이포토시스(세포사멸)을 현저하게 유발하였다는 것을 나타내었으며, 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucl eotides)를 사용하여 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)을 유발함으로써 B-ALL을 치료할 수 있다는 것을 나타내었다.
상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
생존가능 B-ALL 세포(%) (n=10)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
Oligo 1 66.9 60.1 59.5
Oligo 3 67.9 64.1 65
Oligo 4 69.2 66.2 65.7
Oligo 5 70.6 68.2 67
Oligo 6 66.4 61 60.3
Oligo 7 75.9 70.1 69.2
Oligo 8 80.1 74.9 72.3
Oligo 9 67.2 63.1 62.9
Oligo 10 72.6 68.1 65.3
배지(대조) 91.5 92.7 93.1
2006 94.9 95 93.5
2216 62.9 58.4 59
실시예 7 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의한 B-ALL 세포 상에서 CD40의 조절 향상
1. 인간 B-ALL 세포의 조제
인간 B-ALL 세포는 실시예 6에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 환자의 혈액샘플을 조제하였다.
상기 B-ALL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 3㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo 1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216과 함께 배양하거나, 이들의 올리고뉴클레오티드 없이 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 희석하였다.
동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone)을 대조(배지)로서 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 그 세포(cells)를 10분간 카운팅하고 FITC-CD40 항체(Becton ickinson)(Molecular Probes Inc)로 염색하였다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
CD40 항체로 염색한 소림프구성 림프종 세포는 유동세포 계측법(flow cytomerty)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
10개의 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하였으며, 평균적으로 얻은 그 결과(표 4)에서는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)가 B-ALL 세포에서 CD40의 발현을 현저하게 조절하여 향상한다는 것을 나타내었으며, 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 사용하여 그 세포(cells)에서 CD40의 조절을 향상함으로써 B-ALL을 치료할 수 있다.
CD40의 조절 향상은 B-ALL 세포(cells)의 에이포토시스(세포사멸)을 촉진하여 B-ALL 세포(cells)의 성장억제를 유발하며 그 B-ALL 세포가 더 면역원성이 있도록 하여 B-ALL 세포(cells)에 특이성 있는 CTL의 발생을 촉진(자극)한다.
상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 B-ALL 세포(cells) 상에 CD40의 조절 향상
B림프구 급성 림프구성 백혈병 세포(MFI) 상에서 CD40 발현 (n=10)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
oligo 1 33.6 33.9 34.2
oligo 3 29.9 29.1 30.2
oligo 4 30.1 29.9 31.6
oligo 5 25.3 26.6 26.9
oligo 6 32.9 32.8 33.1
oligo 7 27.8 28.1 29.2
oligo 8 15.9 17.2 17.8
oligo 9 28.2 28.1 29.2
oligo 10 26.9 27.4 27.8
배지(대조) 7.2 7.9 8.5
2006 9.9 9.5 10.6
2216 33.7 33.8 34.1
실시예 8 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 B-CLL에서 IL-10의 생성
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
인간 B-CLL 세포는 실시예 2에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 B-CLL 환자에서 분리하였다.
2. 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 B-CLL에서 IL-10의 생성
상기 B-CLL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate) 내 106 cells/well에서 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중 3㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo 1, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, Oligo10, 2006 또는 2216과 함께 또는 각각의 이들 올리고뉴클레오티드 없이 3반복 배양하였다.
상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)는 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 희석하였다.
동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 대조(Medium)로서 사용하였다.
배양 상증액은 24시간 또는 표시시간에 수집하여 Fluorokine MAP 면역 배열구조(immunoarray) 시스템(R&D Systems)에서 IL-10에 대하여 평가하였다.
본 발명에 의한 데이터에서는 상기 올리고뉴클레오티드와의 개시(triggering)가 B-CLL 세포에서 IL-10의 레벨이 높은 생성을 유발한다는 것을 나타내었다(다음 표 5).
또, 본 발명의 데이터에서는 B-CLL 세포 배양액에 외인성 rh-IL-10(Schering Corp)의 첨가가 항 IL-10항체(R&D Systems)에 의해 특이성 있게 블로킹 될 수 있는 IL-10의 용량 의존성 방법으로 하여 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 유발하였다는 것을 추가로 나타내었다.
이들의 실험결과에서는 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 자기분비(autocrine) 방식으로 B-CLL 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발하는 IL-10의 생성을 유발함으로써 B-CLL을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
B-CLL 환자에서 얻은 최소 10개의 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)에 의해 유발된 B-CLL 세포에서 인터류킨(IL)-10 생성
B-CLL 세포에 의한 IL-10 생성
그룹 pg/ml
Oiogo 1 800
Oiogo 3 621
Oiogo 4 469
Oiogo 5 523
Oiogo 6 112
Oiogo 7 576
Oiogo 8 502 Oiogo 9 455
Oiogo 10 752
대조(배지) 01.2
실시예 9 : 인간 정상(human normal) PBMC의 증식에 대한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)의 효과
인간 PBMC는 Ficoll-Hypaque의 밀도구배 원심분리법(Pharmacia)에 의해 정상 헌혈자(중국, 지린성 혈액센터)의 버피코트(buffy coat)에서 분리하였다.
그 PBMC의 생존율(viability)은 트리판 블루 엑스클루젼(trypan blue exclusion)에 의해 측정한 바와 같이 95 ~ 99% 이었다.
PBMC(6×105/웰(well)를 96-웰 U형상 저부형성 플레이트(U-bottomed plates)(Costar)내에 도포(plated)하여 6㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7, Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 또는 2216과 함께 또는 이들의 올리고뉴클레오티드 없이 36시간 동안 3반복으로 배양하였다.
그 다음, 이어서 16시간 동안 [3H] 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA, us)으로 표지하였다(pulsing).
그 셀(cells)을 글라스파이버필터 상에서 수집하고, 신필레이션 카운터(scintillation counter : 섬광계수기) 내에서 검출하였다.
그 세포증식은 cpm(분당 카운트수)(3중 웰(triplet wells)에서)으로 나타내었다.
5개의 정상 혈액샘플에서의 데이터를 나타내었다.
2006 및 2216은 대비(controls)로 사용하였다.
그 결과에서는 상기 올리고뉴클레오티드가 PBMC를 자극(촉진)하여 증식할 수 있다는 것을 확실하게 나타내었으며(도 3), 상기 올리고뉴클레오티드가 세포사멸(에이포토시스)의 유발 대신 정상 인간 PBMC에 대하여 증식-자극성(proliferation-stimulatory)이 있으며, 배양세포에 대하여 비독성인 것을 나타내었다.
본 발명은 바람직한 실시예에 따라 구체적으로 설명한 바 있으나, 다음의 첨부된 청구범위에서 한정한 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 변경 및 변형이 가능하다는 것은 이 기술분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
<110> CHANGCHUN BIOTECHNOLOGY CO., Ltd <120> Oligonucleotides or their functional homologues, a composition comprising the same and a method of treating B cell neoplasm <130> IP060011 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 1 tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 2 tcggcacgcg acgtgctggc cgtcgtttcc 30 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 3 tcgtcgtcgt cgttgtcgtt gggg 24 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 4 tcgttgccgt cgg 13 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 5 tcgtcgggtg cgacgtcgca gggggg 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 6 tcgtcgggtg cgatcgcagg gggg 24 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 7 tcgtcgggtg catcgatgca gggggg 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 8 tcgtcgggtg cgacgtcgca 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 9 tcggggacga tcgtcggggg g 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 10 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 11 gggggacgat cgtcgggggg 20

Claims (26)

  1. SEQ ID NO:1-9로 나타낸 서열(sequences)을 가진 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides) 또는 이들의 기능상동체(functional homologues).
  2. 제 1항의 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides)의 하나의 개별 올리고뉴클레오티드 1 ~ 5개 복제(copies)로 이루어진 DNA 프라그멘트(fragment) 및 그 기능상동체.
  3. 하나의 기능부분(functional portion)으로서 청구항 1의 올리고뉴클레오티드중 개별(individual) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 DNA 프라그멘트(fragment) 및 그 기능상동체.
  4. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체에 있어서,
    서열 SEQ ID NO:1-9를 가진 올리고뉴클레오티드가 1 ~ 10개의 염기에 의해 인접(flanking)될 수 있음을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프 라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  5. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체에 있어서,
    포스페이트 골격수식(phosphate backbone modification)을 가질 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  6. 제 5항에 있어서,
    포스페이트 골격수식은 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 수식인 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  7. 제 6항에 있어서,
    포스포로에이트 또는 포스포로디티오에이트 수식은 부분(partial) 또는 완전(complets) 수식인 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  8. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    이들의 염기는 화학수식을 할 수 있거나, 미량염기(rare bases)로 변화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  9. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    합성(synthetic) 또는 분리(isolated) 할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  10. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체로 이루어진 하나의 벡터(vector).
  11. 제 10항에 있어서,
    벡터는 하나의 세균벡터(bacterial vector), 하나의 플라스미드. 하나의 바이러스벡터(viral vector) 또는 하나의 DNA 백신인 것을 특징으로 하는 상기 벡터.
  12. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체를 함유한 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체는 각각 또는 함께 사용되거나, 또는 최소 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어와 함께 사용되거나, 또는 최소 1종의 다른 항 B림프구 생싱물 약제와 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    항 B림프구 신생물 약제가 화학요법제, 면역요법제 또는 방사선 치료제인 것을 특징을 하는 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 면역요법제는 항 CD20 항체에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 방사선 치료는 외부 방사선 치료 또는 방사능 표지항체 치료인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 피검자(subject)의 B림프구 신생물의 치료방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    B림프구 신생물은 B림프구 백혈병, B림프구 림프종 또는 골수종인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    B림프구 백혈병은 B림프구 만성 림프구성 백혈병 또는 B림프구 급성 림프구성 백혈병을 포함하나 한정되지 않으며, B림프구 림프종은 소 림프구성 림프종을 포함하나 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    피검자는 인간 또는 동물인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  21. 제 17항에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 소화관내 투여, 비경구투여 또는 국소투여 또는 흡입투여 하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  22. B림프구 신생세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)를 유발하는 방법에 있어서,
    제1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 B림프구 신생세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)를 유발하는 방법.
  23. 인간 B림프구 신생세포 상에서 CD40의 발현을 증진(enhancing)하는 방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간 B림프구 신생세포 상에서 CD40의 발현을 증진하는 방법.
  24. B림프구 신생세포(B cell neoplastic cells)를 유발하여 IL-10을 생성하는 방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides) 또는 DNA 프라그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 B림프구 신생세포를 유발하여 IL-10을 생성하는 방법.
  25. 제 22항 내지 제 23항 중 어느 한 한에 있어서,
    B림프구 신생세포가 B림프구 백별형 세포, B림프구 림프종 세포 또는 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    B림프구 백혈병 세포는 B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포 또는 B림프구 급성 림프구성 백혈병 세포를 포함하나 한정되지 않으며, B림프구 림프종 세포는 소 림프구성 림프종 세포를 포함하나 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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