BRPI0609885A2 - composição farmacêutica e uso da mesma - Google Patents
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Abstract
COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DA MESMA. A invenção proporciona um oligonucleotídeO com uma seqúência de SEQ ID NO: 1 ou seu homólogo funcional, uma composição compreendendo os mesmos e um método para tratamento de neoplasma de células B através de uso do oligonucleotídeo ou seu homólogo funcional ou da composição compreendendo o oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo induz à apoptose de células B neoplásicas, super-regula CD40 sobre células B neoplásicas e estimula a produção de IL-10 a partir de células B neoplásicas.
Description
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA MESMA
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção proporciona um oligonucleotideocom uma seqüência conforme mostrado em SEQ ID NO: 1 ou seuhomólogo funcional, uma composição compreendendo o mesmo eum método para tratamento de neoplasma de células B usandoo oligonucleotideo através de indução de apoptose decélulas B neoplásicas, super-regulação de CD40 sobrecélulas B neoplásicas e através de estimulação de células Bneoplásicas a produzir IL-10. O oligonucleotideo ou seuhomólogo funcional pode ser usado sozinho ou em combinaçãocom produtos quimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticose radiação para tratar neoplasma de células B.
ANTECEDENTES
Baseado no sistema de classificação WHO (AmericanJournal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121),malignidades linfóides são agrupadas em três classesprincipais: neoplasma de células B, neoplasma de célulasassassinas naturais (NK)/células T e linfomas de Hodgkin.
O neoplasma de células B é ainda dividido em doisgrupos: neoplasma de células B precursoras e neoplasma decélulas B periféricas. Neoplasma de células B precursorasinclui leucemia linfoblástica aguda B precursora (leucemialinfoblástica aguda de células B, B-ALL)/linfornalinfoblástico (LBL). Neoplasma de células B periféricasinclui leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL),linfoma linfocítico pequeno, leucemia pró-linfocitica decélulas B, linfoma linfo plasmacítico/imunocitoma, linfomade células de Mantle, linfoma folicular, linfoma folicularcutâneo, linfoma de células B de zona margina extranodal dotipo MALT, linfoma de células B de zona marginal nodal (+/-células B monocitóides), linfoma de zona marginal esplenica(+/- linfócitos vilosos), leucemia de células pilosas,plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas, linfoma decélulas B grande difuso, linfoma de células B grandemediastinal (timico), linfoma de células B grandeintravascular, linfoma de efusão primário e linfoma deBurkitt.
Leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL) eleucemia linfoblástica/linfocítica aguda de células B (B-ALL) são dois tipos de leucemias de células B. As célulasde B-CLL expressam CD19, CD 5 e CD23 (Nicholas Chiorazzi,M.D. e colaboradores, N Engl J Méd 2005; 352: 804-15). Ascélulas de B-ALL expressam marcadores CD19+CD10+.
Linfoma linfocitico pequeno é um neoplasma de célulasB. A população monoclonal de células B em linfomalinfocitico pequeno expressa CD19, CD 5 e CD23 (CatherineThieblemont e colaboradores, Blood 2004; 103: 2727-2737).
Dependendo do neoplasma de células B diagnosticado,opções de tratamento atuais são quimioterapia, radioterapiae imunoterapia.
CD4 0, expresso sobre a superfície celular delinfócitos B normais e células dendríticas, é um membro dafamília do receptor do fator de necrose de tumor (TNFR).CD4 0L (CD154), expresso sobre linfócitos T, é um membro dafamília do fator de necrose de tumor (Castle BE ecolaboradores, J Immunol 1993; 151: 1777-1788). Interaçãode CD4 0L e CD4 0 promove a proliferação, diferenciação eapresentação de antígeno de linfócitos B, célulasdendríticas e monócitos (Ranheim EA e colaboradores, J ExpMed 1993; 177: 925-935; Yellin MJ e colaboradores, J.Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J e colaboradores,Annu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M. von Bergwelt-BaildonMS e colaboradores, Blood 2002; 99: 3319-3325).
CD40 também expressa sobre células B neoplasicas. Foidemonstrado que intensificação da expressão de CD4 0 promovea apoptose de células B neoplasicas (Peter Chu ecolaboradores, PNAS, 19 de Março de 2002, vol. 99, no: 6,3854-3859; Frank Dicker e colaboradores, BLOOD, 15 de Abrilde 2005, Volume 105, Número 8: 3193-3198).
Experimentos in vitro e in vivo indicaram queestimulação e super-regulação de CD4 0 induziu à inibição decrescimento de células B neoplasicas (Funakoshi ecolaboradores, Blood 83: 2787-2794, 1994; Murphy ecolaboradores, Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A.G.e colaboradores, 1996, Oncogene 13: 2243; Hirano, A. ecolaboradores, 1999, Blood 93: 2999; Tong, A.W. , M. ecolaboradores, 2001, Clin. Câncer Res. 7: 691).
Promoção de expressão de CD4 0 sobre células Bneoplasicas foi reportada como intensificando aantigenicidade de células B neoplasicas e,conseqüentemente, promovendo a geração de linfócitos Tcitotóxicos (CTL) específicos às células. Os CTL podemmatar eficazmente células B neoplasicas (Dilloo D ecolaboradores, Blood 1997, 90: 1927-1933; Kato K ecolaboradores, J. Clin Invést. 1998, 101: 1133-1141; WierdaWG e colaboradores, Blood 2000, 96: 2917-2924; Takahashi Se colaboradores, Hum Gene Ther. 2001, 12: 659-670;Takahashi S e colaboradores, Câncer Gene Ther. 2001; 8:378-387) . Na presença de CD40L, células B de leucemialinfocítica crônica expressando CD4 0 podem ser mortas porlinfócitos T citotóxicos CD4 (Frank Dicker e colaboradores,Blood, 15 de Abril de 2005, Vol 105, Número 8: 3193-3198).Interação de D4 0L e CD4 0 sobre células de linfoma deBurkitt poderia promover a célula a apresentar antígenostumorígenos a CTLs específicos (Khanna, R. e colaboradores,1997, J. Immunol. 159: 5782). Experimentos in vivo e testesclínicos também demonstraram que ativação de CD40 poderiaintensificar a imunogenicidade de células B de leucemialinfocítica crônica (B-CLL) e, conseqüentemente, induzir àgeração de CTLs específicos às células (Kato, K. ecolaboradores, 1998, J. Clin. Invest. 101: 1133; Wierda,W.G. e colaboradores, 2000, Blood 96: 2917).
Juntos, esses dados indicam que intensificação deexpressão de CD4 0 sobre células B neoplásicas podeestimular a imunidade anti-tumor contra neoplasma decélulas B. A imunidade anti-tumor inclui, mas não estálimitada a, o seguinte:
1. promoção de apoptose de células B neoplásicas;
2. inibição do crescimento de células B neoplásicas;
3. intensificação da imunogenicidade de células Bneoplásicas e, portanto, promoção da geração de CTLsespecíficos às células.
Interleucina-10 (IL-10) é uma citocina homodiméricaproduzida por determinadas células T, monócitos, macrófagose algumas células neoplásicas desenvolvidas a partir decélulas B, células T ou células NK (Kitabayashi ecolaboradores, 1995; Masood e colaboradores, 1995; Sjoberge colaboradores, 1996; Beatty e colaboradores, 1997;
Boulland e colaboradores, 1998; Jones e colaboradores,1999). Atividade de IL-10 é mediada por seu receptorespecífico na superfície celular. O receptor expressa sobrecélulas apresentando antígeno, linfócitos e também célulasB de leucemia linfocítica crônica (B-CLL). Descobriu-se quea adição de IL-10 exógeno inibia a proliferação de célulasde B-CLL recentemente isoladas de pacientes (JesperJurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan e colaboradores,Characterization of interleukin-10 receptor expression onB-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89,No. 11 (1 de Junho), 1997: páginas 4146-4152). Também foireportado que IL-10 inibe a proliferação de células de B-CLL e intensifica a apoptose de células de B-CLL (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand e Jacques Banchereau.Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-ChronicLymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 17 9,Janeiro de 1994, 91-99) . Imunoestimulação de propriedadesanti-câncer de IL-lo foi discutida em uma revisão, da qualfoi especulado que superexpressão de IL-10 dentro domicroambiente do tumor pode catalisar rejeição imune docâncer (Simone Mocellin, Francesco M. Marincola e Howard A.Young. Interleukin-10 and the immune response againstcâncer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology, 2005;78: 1043-1051) .
Na presente invenção, nós proporcionamos umoligonucleotídeo e um método para tratamento de neoplasmade células B através de uso do oligonucleotídeo da presenteinvenção. O oligonucleotídeo induz à apoptose de células Bneoplásicas, promove expressão de CD4 0 sobre células Bneoplásicas e estimula as células B neoplásicas a produzirIL-10, todos os quais contribuem para o tratamento de umneoplasma de células B.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Na primeira modalidade, a presente invençãoproporciona um oligonucleotideo com uma seqüência de 5'-TCGCGACGTCGTTCGTTCTC-31 (designada como 01igo-2 ou indicadaSEQ ID NO: 1) ou seu homólogo funcional. O oligonucleotideoou seu homólogo funcional pode ter uma modificação na parteprincipal de fosfato que é uma modificação parcial oucompleta de fosforotioato ou fosforoditioato. Ooligonucleotideo ou seu homólogo funcional pode termodificações químicas ou ter substituições por bases raras.O oligonucleotideo ou seu homólogo funcional pode ser umaparte funcional de qualquer outro oligonucleotideo oufragmento de DNA ou ser clonado em um plasmídeo, vetorbacteriano, vetor viral ou vacina de DNA, respectivamente.O oligonucleotideo com a seqüência de SEQ ID NO: 1 pode sermodificado através de adição de uma ou mais bases (depreferência 1 a 10 bases) a cada uma de suas extremidadesou através de alteração das bases no mesmo. Aqueleshabilitados na técnica podem determinar o uso dooligonucleotideo com a seqüência SEQ ID NO: 1 ou seuhomólogo funcional, ou do fragmento de DNA, fita simples oufita dupla, compreendendo uma ou mais cópias dooligonucleotideo com a seqüência (SEQ ID NO: 1) para obtero objetivo da presente invenção baseado no conhecimento natécnica e no ensinamento da presente invenção.
Na segunda modalidade, a presente invenção proporcionaum método para tratamento de neoplasma de células B usandoo oligonucleotideo ou seu homólogo funcional da presenteinvenção ou a composição compreendendo os mesmos em umindivíduo. O indivíduo é um ser humano ou animal. Oneoplasma de células B inclui, mas não está limitado a,leucemia de células B, linfoma de células B e mieloma.
Na terceira modalidade, a presente invençãoproporciona um método para tratamento de neoplasma decélulas B usando o oligonucleotídeo ou seu homólogofuncional da presente invenção ou a composiçãocompreendendo os mesmos através de indução da apoptose decélulas B neoplásicas.
Na quarta modalidade, a presente invenção proporcionaum método para tratamento de neoplasma de células B usandoo oligonucleotídeo ou seu homólogo funcional da presenteinvenção ou a composição compreendendo os mesmos através desuper-regulação de CD40 sobre células B neoplásicas.
Na quinta modalidade, a presente invenção proporcionaum método para tratamento de neoplasma de células B usandoo oligonucleotídeo ou seu homólogo funcional da presenteinvenção ou a composição compreendendo os mesmos através deestimulação de células B neoplásicas a produzir IL-10.
Em outra modalidade, a presente invenção proporcionauma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo ou seu homólogofuncional da presente invenção sozinho e/ou em um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis. A composição podeser administrada através de administração enteral,parenteral e tópica ou através de inalação.
Em ainda outra modalidade, a presente invençãoproporciona um método para o tratamento de neoplasma decélulas B compreendendo administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz do oligonucleotídeo ou seu homólogofuncional da presente invenção ou da composiçãocompreendendo os mesmos e pelo menos um de agentes anti-neoplasma de células B, incluindo produtosquimioterapêuticos, produtos imunoterapêuticos e os agentesusados em radioterapia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Apoptose de células de B-CLL induzida por01igo-2 (Dosagem)
Células de B-CLL foram cultivadas em meio com soro ABhumano a 10% com ou sem várias quantidades de Oligo-2. Nodia 7, as células foram coradas com TMRE. O número decélulas de B-CLL viáveis foi calculado para o percentual decélulas TMRE-positivas.
Figura 2. O efeito de Oligo-2 sobre a super-regulaçãode CD40 sobre células de B-CLL
As células de B-CLL foram incubadas com ou sem Oligo 2durante 7 dias e, então, coradas com anticorpo FITC-CD40para análise de expressão de CD40 usando citometria defluxo. O nível de expressão foi indicado com o número MFI.
Figura 3. O efeito de Oligo-2 sobre a super-regulaçãode CD40 sobre células de linfoma linfocítico pequeno
As células de linfoma linfocítico pequeno foramincubadas com ou sem Oligo-2. No dia 7, as células foramcoradas com anticorpo FITC-CD40 para análise de expressãode CD4 0 usando citometria de fluxo. O nível de expressãofoi indicado com o número MFI.
Figura 4. Apoptose de células de B-ALL induzida porOligo-2
Células de B-ALL foram incubadas com ou sem Oligo-2.
Nos dias 3, 5 e 7 da incubação, as células foram coradascom TMRE, seguido por análise por citometria de fluxo. 0número de células de B-ALL viáveis foi calculado para opercentual de células TMRE-positivas.
Figura 5. Super-regulação de CD40 sobre células de B-ALL pelo Oligo 2
Células de B-ALL foram cultivadas com ou sem 1 ug/mlde 01igo-2. Nos dias 3, 5 e 7 da cultura, as células foramcoradas com mAb anti-CD4 0 FITC-rotulado para análise deexpressão de CD4 0 usando citometria de fluxo. O nível deexpressão foi indicado com o número MFI.
Figura 6. Produção de interleucina-10 a partir decélulas de B-CLL induzida por Oligo-2
As células de B-CLL foram cultivadas com ou sem Oligo-2 em um meio isento de soro. Os sobrenadantes foramcoletados no ponto de tempo indicado e avaliados comrelação à IL-10 usando um kit ELISA.
Figura 7. O efeito de Oligo-2 sobre a proliferação dePBMCs humanas normais
As PBMCs humanas normais foram cultivadas com Oligo-2,2216 ou 2006 durante 3 6 h e, então, incorporadas com[3H]timidina para determinação da proliferação das células,respectivamente. As cinco amostras de sangue foramanalisadas. A proliferação de células foi expressa como SI.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Na presente invenção, os termos a seguir terão ossignificados abaixo:
Um "oligonucleotídeo" significa múltiplos nucleotídeos(isto é, moléculas compreendendo um açúcar (por exemplo,deoxiribose) ligados a um grupo fosfato e a uma baseorgânica permutável). Existem quatro bases orgânicas,citosina (C) , timina (T) , adenosina (A) e guanina (G) . 0oligonucleotídeo pode ser sintetizado por um sintetizadorautomático de oligonucleotídeo disponível no mercado ou serpreparado a partir de seqüências de ácido nucleicoexistentes usando técnicas conhecidas.
Uma "modificação de parte principal" deoligonucleotídeo significará que um oligonucleotídeo temuma parte principal de fosfato modificada com fosforotioato(isto é, pelo menos um dos pxigênios do fosfato ésubstituído por enxofre) ou outra parte principalmodificada. Uma "modificação química" de oligonucleotídeosignificará que a modificação através de utilização dosgrupos ativos do nucleotídeo ou criação de análogos denucleotídeo. As modificações podem ocorrer durante ou apóssíntese do oligonucleotídeo. Durante a síntese, basesmodificadas (incluindo, mas não limitado a, análogos detimidina) podem ser incorporadas internamente ou sobre aextremidade 5". Após a síntese, a modificação pode serrealizada usando os grupos ativos (via um aminomodificador, via os grupos 3' ou 5' hidroxila ou via ogrupo fosfato).
Um "neoplasma de células B" significará doençasdesenvolvidas a partir da proliferação anormal de célulasda linhagem de linfócitos B. O neoplasma de células B podeser agrupado em leucemia de células B, linfoma de células Be mieloma (plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas) .Leucemia de células B inclui leucemia linfocítica crônicade células B (B-CLL), leucemia linfoblástica aguda B precursora (leucemia linfocítica aguda de células B, B-ALL) , leucemia pró-linfocítica de células B e leucemia decélulas pilosas. Linfoma de células B inclui linfomalinfocitico pequeno, linfoma linfoplasmacítico/imunocitoma, linfoma de células de Mantle,linfoma folicular, linfoma folicular cutâneo, linfoma decélulas B de zona marginal extranodal do tipo MALT, linfomade células B de zona marginal nodal (+/- células Bmonocitóides), linfoma de zona marginal esplênica (+/-linfócitos vilosos), linfoma de células B grande difuso,linfoma de células B grande mediastinal (tímico), linfomade células B grande intravascular, linfoma de efusãoprimário e linfoma de Burkitt.
Um "indivíduo" significará um mamífero incluindo, masnão limitado a, um ser humano, macaco, cão, gato, cavalo,vaca, porco, bezerro, cabra, camundongo e rato. Ooligonucleotídeo da invenção pode ser administrado a umindivíduo com neoplasma de células B.
Um "agente anti-neoplasma de células B" significará umagente usado para tratar neoplasma de células B em umindivíduo. O agente inclui o oligonucleotídeo da presenteinvenção, produtos quimioterapêuticos, produtos
imunoterapêuticos e os agentes usados em radioterapia. 0oligonucleotídeo da invenção pode ser administrado antesde, junto com ou após a administração de um ou mais de outros agentes anti-neoplasma de células B para obterefeito sinergístico no tratamento de um neoplasma decélulas B.
Os "produtos quimioterapêuticos" significará osprodutos quimioterapêuticos que tratam neoplasma de célulasB em combinação com o oligonucleotídeo da invenção. Ooligonucleotídeo da presente invenção pode ser usado com umou mais produtos quimioterapêuticos no tratamento deneoplasma de células B. Os produtos imunoterapêuticosincluem, mas não estão limitados a, agentes de alquilação,tais como ciclofosfamida ou clorambucil, vinca alcalóides(por exemplo, vincristina e vinblastina), procarbazina,metotrexato, prednisona, antraciclina, L-asparaginase,análogos de purina (por exemplo, monofosfato defludarabina, 2-clorodeoxiadenosina e pentostatina),citosina, arabinosida, cisplatina, etoposida e ifosfamida.O oligonucleotídeo da presente invenção também pode serusado com uma ou mais combinações de produtoquimioterapêutico na quimioterapia. As combinações incluem,mas não estão limitadas a, CVP (ciclofosfamida, vincristinae prednisona) , CHOP (CVP e doxorubicina) , C-MOPP(ciclofosfamida, vincristina, prednisona e procarbazina),CAP-BOP (CHOP m ais procarbazina e bleomicina), m-BACOD(CHOP mais metotrexato, bleomicina e leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorubicina,ciclofosfamida, etoposida e leucovorina mais MOPP padrão),ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorubicina, ciclofosfamida,etoposida, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexatoe leucovorina), MACOP-B (metotrexato, doxorubicina,ciclofosfamida, vincristina, dose fixa de prednisona,bleomicina e leucovorina), IMVP-16 (ifosfamida, metotrexatoe etoposida), MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato eetoposida), DHAP (dexametasona, alta dose de citarabina ecisplatina), ESHAP (etoposida, metilpredisolona, HDcitarabina, cisplatina), CEPP(B) (ciclofosfamida,etoposida, procarbazina, prednisona e bleomicina) , CAMP(lomustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona) , CHOPmais bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostarda denitrogênio, arabinosida de citosina e etoposida. MOPP(mecletamina (mostarda de nitrogênio), vincristina(Oncovin), procarbazina e prednisona) , ABVD (por exemplo,adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina), ChIVPP(clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona) , CABS(lomustina, doxorubicina, bleomicina e estreptozocina),MOPP mais ABVD, MOPP mais ABV (doxorubicina, bleomicina evinblastina) ou BCVPP (carmustina, ciclofosfamida,vinblastina, procarbazina e prednisona) e CAP(ciclofosfamida, doxorubicina e prednisona).
Os "produtos imunoterapeuticos" significará osprodutos imunoterapeuticos que tratam neoplasma de célulasB em um combinação com o oligonucleotídeo da invenção. Ooligonucleotídeo da presente invenção pode ser usado com umou mais produtos imunoterapeuticos no tratamento deneoplasma de células B. Os produtos imunoterapeuticosincluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-CD20. Oanticorpo a CD20 inclui imunoglobulinas e seus fragmentosque são especificamente reativos com uma proteína de CD20sobre a superfície de células B neoplásicas. Anticorpos aCD2 0 podem ser anticorpos policlonais e monoclonais,anticorpos quiméricos, anticorpos bi-específicos eanticorpos humanizados. Uma "CD20" ê uma proteína damembrana de células B (Tedder e colaboradores, ImmunologyToday 15: 450-454 (1994)) e é expressa sobre células Bneoplásicas e normais (John C. Byrd e colaboradores, J ClinOncol 2001; 19: 2165-2170; Huhn D e colaboradores, Blood2001, 98: 132601331).Um "veículo farmaceuticamente aceitável" denota um oumais enchedores, diluentes ou substâncias de encapsulaçãosólidas ou líquidas que são adequados para administração dooligonucleotídeo da invenção a um indivíduo. O veículo podeser orgânico, inorgânico, natural ou sintético. O veículoinclui qualquer e todas as soluções, diluentes, solventes,meios de dispersão, lipossoma, emulsões, revestimentos,agentes anti-bacterianos e anti-fúngicos, agentes pararetardo de absorção e qualquer outro veículo adequado paraadministração do oligonucleotídeo da invenção e seu uso ébem conhecido na técnica.
A "quantidade terapeuticamente eficaz" dooligonucleotídeo da invenção se referirá a uma dose usadapara obter um resultado desejado de tratamento de neoplasmade células B em um indivíduo. A dose pode ser determinadaatravés de métodos padrões bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica e pode variar dependendo de fatoresincluindo, mas não limitado a, o tamanho e/ou saúde globaldo indivíduo ou a gravidade da doença. Introdução de umoligonucleotídeo da invenção pode ser realizada como umúnico tratamento ou durante uma série de tratamentos. Dosesindividuais do oligonucleotídeo da invenção para aadministração oscilam de cerca de 1 jag a 100 mg poradministração. Contudo, doses para o tratamento deneoplasma de células B podem ser usadas em uma faixa de 10a 1.000 vezes maior do que as doses descritas acima. Oregime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar oefeito terapêutico ótimo por aqueles habilitados natécnica.
A "via" de administração do oligonucleotídeo dainvenção significará a administração enteral, parenteral etópica ou inalação. O termo "enteral", conforme usado aqui,inclui administração oral, gástrica, intestinal e retal. Otermo "parenteral" inclui administração intravenosa,intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ouvaginal. O termo "tópico" denota a aplicação dooligonucleotídeo externamente à epiderme, à cavidade bucale no ouvido, olho e nariz.
Uma "composição farmacêutica" significará a composiçãocompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz dooligonucleotídeo da invenção com ou sem um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição inclui, mas nãoestá limitada a, soluções aquosas ou salinas, partículas,aerossóis, pelotas, grânulos, pós, tabletes, tabletesrevestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes,emulsões, suspensões, cremes, gotas e outras composiçõesfarmacêuticas adequadas para uso em uma variedade desistemas de distribuição de fármaco. As composições sãoadequadas para uso por injeção, oral, bucal, retal evaginal, inalação e aplicação em depósito. Em todos oscasos, a composição deve ser estéril e estável sob ascondições de fabricação e armazenamento e preservada contraa contaminação microbiana. Para injeção, a composiçãoincluirá soluções ou dispersões aquosas e pós para opreparo extemporâneo de soluções injetáveis ou dispersão.
"Pó" na presente invenção se refere a uma composição quecontém partículas sólidas finamente divididas contendo ooligonucleotídeo da invenção. O pó pode ser formulado comoutros veículos farmaceuticamente aceitos (por exemplo,água, PBS, solução salina e outros tampõesfarmaceuticamente aceitos) antes de uso. As soluções podemser preparadas através de incorporação do oligonucleotídeoem um ou mais solventes apropriados e outros ingredientesrequeridos. Dispersões podem ser preparadas através deincorporação do oligonucleotídeo em um veículo, o qualcontém um meio de dispersão (por exemplo, glicerol,polietileno glicóis líquidos e óleos) e os outrosingredientes requeridos. Para administração oral, acomposição será formulada com veículos ingeríveis paraformar tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos,géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes. Paraadministração bucal, a composição será tabletes oucomprimidos da maneira convencional. Para inalação, acomposição será um spray aerossol de embalagenspressurizadas ou um nebulizador ou um pó seco e pode serselecionada de por aqueles habilitados na técnica. Ooligonucleotídeo também pode ser formulado como composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis para aplicações retais ouvaginais e para aplicação por depósito. O oligonucleotídeoda invenção na composição pode ser usado sozinho ou emcombinação com um ou mais de outros agentes incluindo, masnão limitado a, produtos quimioterapêuticos, produtosimunoterapêuticos e um ligante reconhecido por um receptorou molécula específica da célula alvo. O oligonucleotídeoda invenção em combinação com outro agente pode estar emcomposições distintas e usado com o seguinte: (1) ooligonucleotídeo é misturado com um segundo agente antes deadministração; (2) o oligonucleotídeo e um segundo agentesão administrados a um indivíduo em momentos diferentes;(3) o oligonucleotídeo e um segundo agente sãoadministrados a diferentes locais de um indivíduo. Alémdisso, a composição pode conter plasmídeo, vetores virais,vetores bacterianos e vacinas de ácido nucleico trazendo aseqüência do oligonucleotídeo da invenção.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são ilustrativos e não deverãoser encarados como limitando o escopo da presente invenção.Variações razoáveis, tais como aquela que ocorrem para oescopo da presente invenção.
Exemplo 1. Síntese do oligonucleotídeo
Um oligonucleotídeo com uma seqüência de 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (designado como Oligo-2, SEQ IDNO: 1) foi projetado e sintetizado.
Para analisar as funções do Oligo-2, doisoligonucleotídeos de controle de 2006 com a seqüência 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-31 (SEQ ID NO: 2) e 2216 com aseqüência de 51-gggggacgatcgtcgggggg-31 (SEQ ID NO: 3)também foram sintetizados. Três dos oligonucleotídeos foramsintetizados na Sangon Biotech Company (Shanghai, China) ,testados com relação à endotoxina através de uso do ensaiode lisato de amebócito Limulus (Associates of Cape Cod,Inc) e manipulados em reagentes isentos de pirogenio. 22 06(J Immunol 2000, 164: 1617) é um oligonucleotídeo bemestudado que ativa fortemente células B normais. 2216 (EurJ Immunol 2001; 31: 2154) é outro oligonucleotídeo bemestudado que induz à altas quantidades de interferon dotipo I em células dendríticas plasmacitóides.
Os métodos para síntese do oligonucleotídeo são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e, dentreoutros, síntese em fase sólida é geralmente usada.Especificamente, no processo da síntese, o suporte sólidousado é glóbulo de vidro com poro controlado (CPG) . Esseglóbulo tem uma superfície com orifícios e canais e sãonesses que o nucleotídeo protegido é preso. A síntese deoligonucleotídeo começa com o nucleotídeo mais 31 eprossegue através de uma série de ciclos compostos de cincoetapas que podem ser repetidas até que o nucleotídeo maisseja preso. Essas etapas são desproteção, ativação,acoplamento, revestimento e estabilização.
Etapa 1. Desproteção
O grupo protetor no nucleosídeo protegido preso a umCPG (vidro com poro controlado) é removido através de ácidotricloroacético (TCA), levando a um grupo 51-hidroxilareativo.
Etapa 2. Ativação
Nessa etapa, tetrazola ataca o acoplamento denucleosídeo de fosforamidita, formando um intermediário detetrazolil fosforamidita.
Etapa 3. Acoplamento
O intermediário de tetrazolil fosforamidita reage como grupo hidroxila do recipiente e a ligação 5' a 31 éformado. A tetrazola é reconstituída e o processo continua.
Etapa 4. Revestimento
Nessa etapa, um reagente de acetilação composto deanidrido acético e N-metil imidazola é usado para bloquearum grupo hidroxila reativo sobre sua extremidade mais 5'dos oligonucleotídeos para evitar falha de acoplamento.
Etapa 5. Estabilização
Uma vez que a etapa de revestimento é realizada, aúltima etapa no ciclo é a etapa de oxidação, a qualestabiliza a ligação de fosfato entre a cadeia dooligonucleotídeo em crescimento e a base mais recentementeadicionada. Essa etapa é realizada na presença de iodo comoum oxidante suave em tetrahidrofurano (THF) e água.
Após essa etapa final, o ciclo é repetido para cadanucleotideo na seqüência. Após término da síntese, amolécula de DNA fita simples é purificada através demétodos tais como HAP, PAGE, HPLC, Cl8 e OPC.
Exemplo 2. Apoptose de células de B-CLL humanas induzidapor 01igo-2
1. Preparo de células de B-CLL humana
Amostras de sangue de pacientes com B-CLL não tratada(patologicamente identificada) (The First Hospital, JilinUniversity, China) foram coletadas após obtenção deconsentimento informado por escrito aprovado. Célulasmononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladasatravés de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque (Pharmacia). Células de B-CLL CD5+CF19+CD23+ em PBMCsforam purificadas usando o kit de isolamento de células B(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para > 95%de células CD5+CD19+CD23+ (células de B-CLL). O preparadode células foi realizado sob a orientação da MiltenyiBiotec.
2. Apoptose de células de B-CLL humanas induzida porOligo-2
As células de B-CLL foram incubadas com Oligo 2 ou2006 ou 2216 em uma concentração final de 3 |-ig/ml em meioRPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a IO6células/cavidade em uma lâmina com 48 cavidades. 0 Oligo 2,2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro(HyClone). Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640isento de soro (HyClone)) foi usado como um controle(Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coradas com tetrametil-rodamina etiléster (TMRE)(Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell e colaboradores, TheJournal of Biological Chemistry Vol, 279, No. 23, Edição de4 de Junho, páginas 24152-24162, 2004) durante 10 minutos.
As células de B-CLL positivas para TMRE (viáveis) e TMRE-negativas (apoptóticas) foram determinadas através decitometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O número de célulasde B-CLL viáveis foi calculado multiplicando-se a contagemde células totais pelo percentual de células TMRE-positivasem cada ponto de tempo. O experimento foi repetido com dezamostras de sangue de pacientes com B-CLL e o resultadomédio (n = 10) mostrou que Oligo-2 induziusignificativamente à apoptose de células de B-CLL (Tabela1) e o efeito induzido pelo Oligo-2 é aproximadamente 2vezes mais forte do que aquele induzido pelo 2006. Alémdisso, o efeito da dose de Oligo-2 e 2006 sobre a apoptosedas células de B-CLL também foi observado. 0 resultadomostrou que Oligo-2, em várias dosagens oscilando de 0,1-10lg/ml, obviamente induziu à apoptose de células de B-CLL(Figura 1) . Comparativamente, na dosagem de 1 |ag/ml, oefeito de indução de apoptose do Oligo-2 é aproximadamente3 vezes mais forte do que aquele do 2006. Juntos, essesresultados demonstram que Oligo-2 pode ser usado paratratar B-CLL através de indução da apoptose de células deB-CLL.Tabela 1. Apoptose de células de B-CLL induzida por 01igo-2(cinética)
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Exemplo 3. Super-regulação de CD40 sobre células de B-CLLhumana pelo Oligo-2
1. Preparo de células de B-CLL humana
Células de B-CLL humana foram isoladas de pacientescom B-CLL com o procedimento conforme descrito no Exemplo 2 .
2. Super-regulação de CD40 sobre células de B-CLLhumana pelo Oligo-2
As células de B-CLL foram incubadas com Oligo 2 ou2006 ou 2216 em uma concentração final de 3 jag/ml em meioRPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a IO6células/cavidade em uma lâmina com 48 cavidades. O Oligo 2,2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI 1640 isento de soro(HyClone). Um volume igual do diluído (meio RPMI 1640isento de soro (HyClone) ) foi usado como um controle(Meio).
No dia 7 após a incubação, as células foram contadas ecoradas com anticorpo FITC-CD4 0 (Becton Dickinson)(Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell e colaboradores, TheJournal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Edição de4 de Junho, páginas 24152-24162, 2004) durante 10 minutos.As células de B-CLL coradas com anticorpo CD40 foramdeterminadas através de citometria de fluxo (B.D. FACSAria). O resultado (Figura 2) mostrou que Oligo 2 super-regula significativamente a expressão de CD4 0 sobre célulasde B-CLL, indicando que Oligo-2 pode ser usado para tratarB-CLL através de super-regulação de CD40 sobre as células.A super-regulação de CD4 0 promove a apoptose de células deB-CLL, induz à inibição de crescimento de células de B-CLLe torna as células de B-CLL mais imunogênicas paraestimular a geração de CTLs específicos às células de B-CLL. O experimento foi repetido com pelo menos dez amostrasde sangue de pacientes com B-CLL com resultados similares.
Exemplo 4. A Apoptose de células de linfoma linfocíticopequeno humano induzida por Oligo 2
1. Preparo de células de linfoma linfocítico pequenohumano
As células de linfoma linfocítico pequeno foramisoladas do tecido de biópsia de nódulo linfático depacientes (The First Hospital, Jilin University, China) comlinfoma linfocítico pequeno (patologicamente identificado)após obtenção de consentimento informado por escritoaprovado. O tecido de biópsia foi picado através de lâminasde vidro com superfície grossa para liberar as células em 5ml de meio RPMI 164 0 de soro AB humano a 10% (HyClone) emuma lâmina de cultura de 6 cm. As células liberadas foramfiltradas através de uma malha de aço inoxidável ecoletadas em um tubo cônico de 50 ml contendo 15 ml de meioRPMI 164 0 isento de soro (HyClone) . O tubo foi centrifugadoa 300 x g durante 10 minutos e, então, o sobrenadante foidescartado. Células de linfoma linfocítico pequenoCD5+CD19+CD23+ foram purificadas usando um kit deisolamento de células B (Miltenyi Biotec, BergischGladbach, Alemanha) para > 95% de células CD5+CD19+CD23+(células de linfoma linfocítico pequeno). O preparado decélulas foi realizado sob a orientação da Miltenyi Biotec.
2. Apoptose de células de linfoma linfocítico pequenoinduzida por 01igo-2
As células de linfoma linfocítico pequeno foramincubadas com Oligo 2 ou 2006 ou 2216 em uma concentraçãofinal de 3 ng/ml em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10%(HyClone) a IO6 células/cavidade em uma lâmina com 48cavidades. O Oligo 2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI164 0 isento de soro (HyClone). Um volume igual do diluído(meio RPMI 164 0 isento de soro (HyClone) ) foi usado como umcontrole (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após a incubação, as células foramcontadas e coradas com tetrametil-rodamina etiléster (TMRE)(Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell e colaboradores. THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, Edição de4 de Junho, páginas 24152-24162, 2004) durante 10 minutos.As células de linfoma linfocítico pequeno TMRE-positivas(viáveis) e TMRE-negativas (apoptóticas) foram determinadasatravés de citometria de fluxo (B.D. FACS Ária). O númerode células de linfoma linfócito pequeno viáveis foicalculado multiplicando-se a contagem de células totaispelo percentual de células TMRE-positivas em cada ponto detempo. O experimento foi repetido com cinco amostras dospacientes com linfoma linfocítico pequeno e o resultadomédio (n = 5) mostrou que Oligo-2 induz significativamentea apoptose das células de linfoma linfocítico pequeno(Tabela 2) , indicando que 01igo-2 pode ser usado paratratar linfoma linfocítico pequeno através de indução deapoptose de células de linfoma linfocítico pequeno.
Tabela 2. Apoptose de células de linfoma linfocíticopequeno induzida por 01igo-2
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Exemplo 5. Super-regulação de CD40 de células de linfomalinfocítico pequeno induzida por Oligo-2
1. Preparo de células de linfoma linfocítico pequenohumano
Células de linfoma linfocítico pequeno humano foramisoladas de pacientes de acordo com os procedimentosconforme descrito no Exemplo 4.
2. Super-regulação de CD40 de células de linfomalinfocítico pequeno induzida por Oligo-2
As células de linfoma linfocítico pequeno humano foramincubadas com Oligo 2 ou 2006 ou 2216 em uma concentraçãofinal de 3 ug/ml em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10%(HyClone) a 10s células/cavidade em uma lâmina com 48cavidades. O Oligo 2, 2006 ou 2216 foi diluído em meio RPMI1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual do diluído(meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como umcontrole (Meio).No dia 7 após incubação, as células foram contadas ecoradas com anticorpo FITC-CD4 0 (Becton Dickinson)(Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell e colaboradores, TheJournal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Edição de4 de Junho, páginas 24152-24162, 2004) durante 10 minutos.As células de linfoma linfocítico pequeno coradas comanticorpo CD4 0 foram determinadas através de citometria defluxo (B.D. FACS Aria) . O resultado (Figura 3) mostrou queOligo 2 super-regula significativamente a expressão de CD40sobre células de linfoma linfocítico pequeno, indicando queOligo-2 pode ser usado para tratar linfoma linfocíticopequeno através de super-regulação de CD4 0 sobre ascélulas. A super-regulação de CD40 promove a apoptose decélulas de linfoma linfocítico pequeno, induz à inibição decrescimento de células de linfoma linfocítico pequeno etorna as células de linfoma linfocítico pequeno maisimunogênicas para estimular a geração de CTLs específicosàs células de linfoma linfocítico pequeno. O experimentofoi repetido com pelo menos dez amostras de sangue depacientes com linfoma linfocítico pequeno com resultadossimilares.
Exemplo 6. Apoptose de células de leucemialinfocítica/linfoblãstica aguda de células B humana (B-ALL)induzida por Oligo-2
1. Preparo de células de B-ALL humana
Amostras de sangue de pacientes com B-ALL não tratada(patologicamente identificada) (The First Hospital, JilinUniversity, China) foram coletadas após obtenção deconsentimento informado por escrito aprovado. PBMCs foramisoladas através de centrifugação em gradiente de densidadeFicoll-Paque (Pharmacia). Células de B-ALL CD19+CD10+ emPBMCs foram purificadas usando o kit de isolamento decélulas B (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha)para > 95% de células CD19+CD10+células (células de B-ALL).
O preparado de células foi realizado sob a orientação daMiltenyi Biotec.
2. Apoptose de células de B-ALL humanas induzida por 01igo-2
As células de B-ALL foram incubadas com Oligo 2 ou2216 em uma concentração final de 3 (ag/ml em meio RPMI 1640de soro AB humano a 10% (HyClone) a IO6 células/cavidade emuma lâmina com 48 cavidades. O Oligo 2 ou 2216 foi diluídoem meio RPMI 164 0 isento de soro (HyClone) . Um volume igualdo diluído (meio RPMI 164 0 isento de soro (HyClone) ) foiusado como um controle (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coradas com tetrametil-rodamina etiléster (TMRE)(Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell e colaboradores, TheJournal of Biological Chemistry Vol, 279, No. 23, Edição de4 de Junho, páginas 24152-24162, 2004) durante 10 minutos.As células de B-ALL positivas para TMRE (viáveis) e TMRE-negativas (apoptóticas) foram determinadas através decitometria de fluxo (B.D. FACS Aria). 0 número de célulasde B-ALL viáveis foi calculado multiplicando-se a contagemde células totais pelo percentual de células TMRE-positivasem cada ponto de tempo. O resultado mostrou que Oligo-2induziu significativamente à apoptose de células de B-ALL(Figura 4) , demonstrando que Oligo-2 pode ser usado paratratar B-ALL através de indução da apoptose de células deB-ALL. O experimento foi realizado com dez amostras desangue de pacientes com B-ALL com resultados similares.Exemplo 7. A super-regulação de CD40 sobre células de B-ALLpelo 01igo-2
1. Preparo de células de B-ALL
Células de B-ALL foram isoladas de amostras de sanguede pacientes de acordo com os procedimentos conformedescrito no Exemplo 6.
As células de B-ALL foram incubadas com Oligo 2 ou2216 em uma concentração final de 3 ug/ml em meio RPMI 1640de soro AB humano a 10% (HyClone) a IO6 células/cavidade emuma lâmina com 48 cavidades. O Oligo 2 ou 2216 foi diluídoem meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone). Um volume igualdo diluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) ) foiusado como um controle (Meio).
Nos dias 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coradas com anticorpo FITC-CD40 (BectonDickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell ecolaboradores, The Journal of Biological Chemistry Vol.279, No. 23, Edição de 4 de Junho, páginas 24152-24162,2004) durante 10 minutos. As células de B-ALL coradas comanticorpo CD4 0 foram determinadas através de citometria defluxo (B.D. FACS Aria). O resultado (Figura 5) mostrou queOligo 2 super-regula significativamente a expressão de CD40sobre células de B-ALL, indicando que Oligo-2 pode serusado para tratar B-ALL através de super-regulação de CD40sobre as células. A super-regulação de CD40 promove aapoptose de células de B-ALL, induz à inibição decrescimento de células de B-ALL e torna as células de B-ALLmais imunogênicas para estimular a geração de CTLsespecíficos às células de B-ALL. O experimento foi repetidocom dez amostras de sangue de pacientes com B-ALL comresultados similares.
Exemplo 8. A produção de IL-10 a partir de B-CLL induzidapelo 01igo-2
1. Preparo de células de B-CLL
Células de B-CLL foram isoladas de pacientes com B-CLLde acordo com os procedimentos conforme descrito no Exemplo2.
As células de B-CLL foram cultivadas com Oligo 2 emuma concentração final de 3 ug/ml em meio RPMI 164 0 isentode soro (HyClone) em uma concentração de IO6células/cavidade em uma lâmina com 48 cavidades emtriplicatas. O Oligo 2 foi diluído em meio RPMI 1640 isentode soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI1640 isento de soro (HyClone)) foi usado como um controle(Meio). Os sobrenadantes de cultura foram coletados a 72 hou nos pontos de tempo indicados e avaliados com relação ãIL-10 no sistema Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems).Nossos dados mostraram que disparo com Oligo-2 levou àprodução de um alto nível de IL-10 a partir de células deB-CLL (Figura 6). Um aumento profundo de produção de IL-10foi detectado a 6 h, com um pico a 24 h, e altos níveisrestantes durante as 72 h de cultura. Além disso, nossosdados ainda mostraram que adição de rH-IL-10 exógeno(Schering Corp) em culturas de células de B-CLL induziu àcélulas de B-CLL apoptóticas de uma maneira dose de IL-10-dependente, as quais puderam ser especificamente bloqueadaspelo anticorpo anti-IL-10 (R&D Systems). Essasdescobertas demonstram que Oligo-2 podem ser usados paratratar B-CLL através de indução da produção de IL-10 queprovoca a apoptose de células de B-CLL de uma maneiraautócrina. O experimento foi repetido usando pelo menos dezamostras de pacientes com B-CLL.
Exemplo 9. O efeito de Oligo-2 sobre a proliferação dePBMCs humanas normais
PBMCs humanas foram isoladas de revestimentos dacamada leucocitária de doadores de sangue normais (TheBlood Center of Jilin Province, China) através decentrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque(Pharmacia). A viabilidade das PBMCs era de 95-99% conformedeterminado através de exclusão com azul de tripano.
As PBMCs (6 X 105/cavidade) foram colocadas em lâminascom fundo em U com 96 cavidades (Costar) e cultivadas comou sem o Oligo-2 (6 (ag/ml) em triplicatas durante 36 h,seguido por pulsação com [3H]timidina (New England Nuclear,Boston, MA) durante 16 h. As células foram coletadas sobrefiltros de fibra de vidro e detectadas em um contador decintilação. A proliferação de células foi expressa como SI(índice de estimulação) (a partir de cavidades triplas).
Dados de cinco amostras de sangue normais são mostrados.2006 e 2216 foram usados em controles. Os resultadosmostraram que Oligo-2 pôde estimular as PBMCs a proliferarobviamente (Figura 7) , indicando que Oligo-2, ao invés deinduzir à apoptose, é proliferação-estimulatório para PBMCshumanas normais e não é tóxico para as células cultivadas.
Tendo descrito a invenção em detalhes e através dereferência às modalidades preferidas, será evidente paraaqueles habilitados na técnica que modificações e variaçõessão possíveis sem se desviar do escopo da invenção,conforme definido nas reivindicações em anexo a seguir.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<1I0> ChafigtbtÉn Hu&pu Biotochnology Co. (f/td
<120> COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E US O D A MESMA
<130> IP060010
<I80> 3
<170> Patentln version 3, 1
<210> 1
<2ll> 21
<212> DM
<213> Seqüência Artificial
<40C> 1
tc&tcsacet çgttcgttct c
<210> 2
<2l'i> 24
<212> DS4A
<213> Seqüência Artificial
<40D> 2
tçgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
<23.0> 3
<2ll> 20
<212> Mk
<2l3> Seqüência Artificial
20
Claims (21)
1. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender: (1) um oligonucleotídeo tendo qualquer uma dasseqüências de SEQ ID NO: 1-9 e (2) agente anti-neoplasma decélulas B.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato do referido agente anti-neoplasmade células B ser produtos quimioterapêuticos, produtosimunoterapeuticos ou agentes usados em radioterapia.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos referidos produtosquimioterapêuticos serem selecionados do grupo consistindode: fludarabina, pentostatina, vincristina, ciclofosfamidae prednisona.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos referidos produtosquimioterapêuticos serem selecionados do grupo consistindode: CVP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona) e CHOP(ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona).
5. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos referidos produtosimunoterapeuticos serem um anticorpo anti-CD20.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de a referida radioterapia serradiação externa ou um tratamento com anticorpo radio-rotulado.
7. Uso de uma composição farmacêutica compreendendo umoligonucleotídeo tendo qualquer uma das seqüências de SEQID NO: 1-9 caracterizado pelo fato de ser para fabricaçãode um medicamento para tratamento de neoplasma de células Bem um indivíduo mamífero que precisa de tratamento.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopor compreender indução de apoptose de células Bneoplãsicas.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopor compreender super-regulação de CD4 0 sobre células Bneoplãsicas.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por compreender estimulação de células Bneoplãsicas para produzir IL-10.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato do neoplasma de células B serleucemia de células B, linfoma de células B ou mieloma.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato da leucemia de células B serleucemia linfocítica crônica de células B ou leucemialinfocítica aguda de células B.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato do linfoma de células B ser linfomalinfocítico pequeno.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato do referido indivíduo mamífero serum ser humano.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato da referida composição farmacêuticaser administrada enteralmente, parenteralmente outopicamente ou através de inalação.
16. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo qualquer uma das seqüências de SEQID NO: 1-9 caracterizado pelo fato de ser para fabricaçãode um medicamento para indução de apoptose de células Bneoplásicas.
17. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo qualquer uma das seqüências de SEQID NO: 1-9 caracterizado pelo fato de ser para fabricaçãode um medicamento para intensificação da expressão de CD40sobre células B neoplásicas.
18. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo qualquer uma das seqüências de SEQID NO: 1-9 caracterizado pelo fato de ser para fabricaçãode um medicamento para indução de células B neoplásicas.
19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato das referidas célulasB neoplásicas serem células de leucemia linfocítica crônicade células B (B-CLL).
20. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17,caracterizado pelo fato das referidas células B neoplásicasserem células de leucemia linfocítica aguda de células B(B-ALL).
21. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17,caracterizado pelo fato das referidas células B neoplásicasserem células de linfoma linfocítico pequeno.
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