KR20080011426A - 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체, 이것을함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법 - Google Patents

하나의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체, 이것을함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SEQ ID NO:1의 서열을 가진 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체(functional homologues) 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체를 함유한 조성물 및 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 또는 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한 조성물을 사용하여 B림프구 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발하며, B림프구 신생세포 상에서 CD40의 조절을 향상하고 B림프구 신생세포에서 IL-10의 생성을 촉진한다.
올리고뉴클레오티드, 기능상동체, 신생물, B림프구, 신생세포, 세포사멸(에이포토시스).

Description

하나의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체, 이것을 함유한 조성물 및 비림프구 신생물의 치료방법{AN OLIGONUCLEOTIDE OR ITS FUNCTIONAL HOMOLOGUE, A COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND A METHOD FOR TREATING B CELL NEOPLASM}
본 발명은 SEQ ID NO:1로 나타낸 하나의 서열(Sequences)을 가진 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체(functional homologue), 이것을 함유한 조성물 및 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 B림프구(B cell)의 신생세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발하여, B림프구 신생세포 상에서 CD40의 조절을 향상하고(up-regulating)하며, B림프구의 신생세포를 자극하여 IL-10을 생성함으로써 B림프구 신생물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체는 단독으로 또는 화학요법제, 면역요법제 및 방사선(radiation) 치료제와의 조합으로 사용하여 B림프구 신생물을 치료할 수 있다.
세계보건기구 시스템(WHO system)(참고문헌 : American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121)에 의해 림프계 악성(lymphoid malignancies)은 다음 3가지 주분류, 즉 B림프구 신생물(B-cell neoplasm), T림프구(T-cell)/내튜럴킬러림프구[natural killer (NK)-cell] 신생물 및 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas)으로 구분하였다.
상기 B림프구 신생물은 다음 2가지 그룹(group)으로 더 분리한다:
전구 B림프구 신생물(precursor B-cell neoplasm) 및 말초 B림프구 신생물(peripheral B-cell neoplasm). 전구 B림프구 신생물에는 전구 B림프구-급성림프 모구성 백혈병(precureor B-acute lymphoblastic leukemia)(B-cell acute lymphoblastic leukema: B-ALL)/림프모구성 림프종(lymphoblastic lymphoma:LBL)을 포함한다.
말초 B림프구 신생물에는 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia)(B-CLL), 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), B림프구 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 림프 형질 세포 림프종/면역 세포종(immunocytoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 여포 림프종(follocular lymphoma), 피부 여포 림프종(cutaneous follicular lymphoma), MALT 타입(type)의 결절성 외연변층 B림프구 림프종(extranodal marginal zone B-cell lymphoma), 결절성 연변층 B림프구 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma)(+/- 단구상 B림프구), 비장성 연변층 림프종(splenic marginal zone lymphoma)(+/- 융모상 림프구(villous lymphoma)), 유모상 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 형질세포종(plasmacytoma)/형질세포성 골수종(plasma cell myeloma), 미만성 대 B림프구 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 종격(흉선) 대 B림프구 림프종(mediastinal(thymic) large B cell lymphoma), 맥관내 대 B림프구 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 1차 확연 림프종(primary effusion lymphoma) 및 버킷트 림프종(Burkitt's lymphoma)을 포함한다.
B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)과 B림프구 급성 림프 모구성/림프구성 백혈병(B-ALL)은 2가지 타입의 B림프구 백혈병이다.
상기 B-CLL 세포는 CD19, CD5 및 CD23을 발현한다(참고문헌 : Nicholas Chiorazzi, M.D., 등, N Engl J. Med. 2005;352:804-15).
상기 B-ALL 세포는 CD19 + CD10 + 표지(markers)를 발현한다.
소 림프구성 림프종(Small lymphocytic lymphoma)은 B림프구 신생물이다. 그 소 림프구성 림프종에서 B림프구의 단클론 집단은 CD19, CD5 및 CD23(참고문헌 : Catherine Thieblemont, 등, Blood. 2004;103:2727-2737)을 발현한다.
진단한 B림프구 신생물에 따라, 현행 치료선택에는 화학요법, 방사선요법 및 면역요법이 있다.
정상 B림프구의 세포표면과 수지상 세포(dentritic cells) 상에서 발현된 CD40은 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor)(TNFR) 계통군(family) 중 하나의 멤버이다. T림프구 상에서 발현된 CD40L(CD154)은 종양 과사 인자 계통군 중 하나의 멤버이다(참고문헌 : Castle BE 등, J. Immunol. 1993; 151: 1777-1788).
CD40L과 CD40의 상호작용은 B림프구, 수지상 세포 및 단핵세포(monocytes)의 증식, 분화(differentiation) 및 항원제시(antigen presentation)를 촉진한다(참고문헌 : Ranheim EA, 등, J. Exp. Med. 1993; 177:925-935; Yellin M.J. 등, J. Immunol. 1994; 153:666-674; Banchereau J. 등, Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS. 등, Blood 2002; 99: 3319-3325).
또, CD40은 B림프구 신생 세포(B cell neoplastic cells) 상에서 발현한다.
상기 CD40 발현의 증강(enhancing)으로 B림프구 신생 세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 입증하였다(참고문헌:Peter Chu 등, PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker 등, BLOOD, 15 April 2005; Volume 105, Number 8: 3193-3198).
생체외(실험관내) 및 생체내 실험에서는 CD40의 자극 및 조절향상이 B림프구 신생 세포의 성장억제를 유발하였음을 나타내었다(참고문헌:Funakoshi 등, Blood 83: 2787-2794, 1994; Murphy 등, Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A. G., 등, 1996, Oncogene 13:2243; Hirano, A, 등, 1999, Blood 93:2999; Tong, A. W., M 등, 2001, Clin. Cancer Res. 7:691).
B림프구 신생 세포 상에서 CD40의 발현 촉진은 B림프구 신생 세포의 항원성을 증강하여, 결과적으로 그 신생 세포에 특이성 있는 세포장해 T림프구(cytotoxic T lymphocyte : CTL)의 생성을 촉진하는 것으로 보고 되었다.
상기 CTL(세포장해 T림프구)은 B림프구 신생 세포를 효과적으로 킬링(killing)할 수 있다(참고문헌:Dilloo D 등, Blood. 1997;90:1927-1933; Kato K, 등, J. Clin Invest. 1998;101:1133-1141; Wierda WG, 등, Blood, 2000;96:2917-2924; Takahashi S, 등, Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, 등, Cancer Gene Ther. 2001;8:378-387).
CD40L의 존재하에서, B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포(B cell chronic lymphocytic leukemia cells)를 발현하는 CD40은 CD4 세포장해 T림프구에 의해 킬링(killing)할 수 있다(참고문헌: Frank Dicker 등, Blood, 15 April 2005 Vol. 105, Num. 8: 3193-3198).
버켓트 림프종(Burkett'slymphoma) 세포 상에서 D40L과 CD40의 상호작용은 그 세포를 촉진하여 특정 CTL에 종양항원(turmor antigens)을 제공할 수 있다(참고문헌:Khanna R. 등, 1997. J. Immunol. 159:5782).
상체내 실험과 임상실험에서도 CD40의 활성화가 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포의 면역원성(immungenicity)을 증강시킬 수 있어, 결과적으로 이들 세포에 특이성이 있는 CTL의 생성을 유발할 수 있다는 것을 나타내었다(참고문헌:Kato, K. 등, 1998.J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W. G. 등, 2000. Blood 96:2917).
동시에, 이들 데이터에서는 B림프구 신생 세포(B cell neoplastic cells) 상에서 CD40 발현의 증강이 B림프구 신생물에 대하여 항종양 면역(anti-tumor immunity)을 촉진할 수 있다는 것을 나타내었다.
항종양 면역은 다음 특성을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다:
1. B림프구 신생 세포의 세포사멸(에이포토시스) 촉진;
2. B림프구 신생 세포의 성장 억제;
3. B림프구 신생 세포의 면역원성을 증강, 따라서 상기 세포에 특이성 있는 CTL의 생성 촉진.
인터류킨(interleukin)-10(IL-10)은 어느 T림프구 세포(T cell cells), 단핵 세포, 마크로파아지와, B림프구 세포, T림프구 세포 또는 NK림프구 세포에서 발생된 신생 세포 일부에 의해 생성된 호모다이머 사이토 카인(homodimer cytokine)이다(참고문헌:Kitabayashi 등, 1995; Masood 등, 1995; Sjoberg 등, 1996; Beatty 등, 1997; Boulland 등, 1998; Jones 등, 1999).
IL-10 활성은 항원 제시 세포(antigen-presenting cells), 림프구(lymphocytes) 및 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포 상에서 발현된 그 특성 세포 표면 수용체에 의해 매개 된다.
그 수용체는 항원 제시 세포(antigen-presenting cells), 림프구(lymphocytes) 및 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포 상에서 발현한다.
외인성 IL-10의 추가가 환자로부터 새로 분리한 B-CLL 세포의 증식을 억제하였다는 것을 확인하였다(참고문헌:Jesper Juriander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan 등, B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포 상에서 인터류킨-10 수용체 발현의 성상, Blood, Vol. 89, No 11(June 1), 1997: pp 4146-4152).
IL-10은 또 B-CLL 세포의 증식을 억제하여 B-CLL 세포의 세포사멸(apoptosis)을 증강하는 것으로 보고하였다(Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand 및 Jacques Banchereau). 또, 인터류킨 10은 B-만성 림프구성 백혈병 세포의 세포사멸(Apoptotic cell death)을 유발한다; J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99).
IL-10의 면역자극 항암 성상(immunostimulating anticancer properties)은 종양 미세환경(tumor microenvironment)에서 IL-10의 과잉발현(over-expression)이 암면역 거절(cancer immune rejection)을 촉진할 수 있는 것으로 추정하는 논문집에서 토의 되었다(참고문헌: Simone Mocellin, Francesco M. Marincola 및 Howard A. Young; Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint, Journal of Leukocyte Biology, 2005; 78-1043-1051).
본 발명에서, 본 발명자들은 하나의 올리고뉴클레오티드 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 사용하여 B림프구 신생물의 치료방법을 제공한다.
그 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생 세포의 세포사멸을 유발하여 B림프구 신생 세포 상에서 CD40 발현을 촉진하며 B림프구 신생 세포를 자극하여 IL-10을 생성하며, 모두 B림프구 신생물의 치료에 기여한다.
(발명의 요지)
첫째 예에서, 본 발명은 하나의 서열 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3'(Oligo-2로 지정하거나 SEQ ID NO:1로 나타냄)를 가진 하나의 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides) 및 그 기능상동체(functional homologue)를 제공한다.
상기 올리고뉴클레이티드 또는 그 기능상동체는 하나의 포스페이트 골격 수식(phosphate backbone modification), 즉 부분 또는 완전 포스포로티오에이트(phosphoro thioate) 또는 포스포로디티오에이트 수식(phosphorodithioate modification)을 가질 수 있다.
그 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체는 화학수식(chemical modifications)을 가질 수 있거나, 또는 미량염기(rare bases)와의 치환을 가질 수 있다.
그 올리고뉴클레이티드 또는 그 기능상동체는 어느 다른 올리고뉴클레오티드 또는 어느 다른 DNA 프라그멘트의 하나의 기능부분(functional part)이거나, 또는 하나의 플라스미드(plasmid), 세균성 백터(bacterial vector), 바이러스성 백터(viral vector) 또는 DNA 백신에 각각 클로닝(cloning)할 수 있다.
상기 SEQ ID NO:1의 서열을 가진 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 염기(바람직하게는 1~10개의 염기)를 각각의 그 단부에 부가하거나 또는 염기들을 그 올리고뉴클레오티드 내에서 변화시켜 수식할 수 있다.
이 기술분야의 통상의 기술자들은 SEQ ID NO:1의 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 서열(SEQ ID NO:1)을 가진 그 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 복제(copy)로 이루어진 단 가닥 또는 두 가닥 DNA 프라그멘트를 사용하여 이 분야에서 잘 알려진 기술지식과 본 발명의 교시를 기초로 한 본 발명의 목적을 달성할 수 있다는 것을 결정할 수 있다.
둘째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체 함유 조성물을 피검자에 사용하여 B림프구 신생물(B cell neoplasm)의 치료방법을 제공한다.
상기 피검자는 인간 또는 동물이다. 상기 B림프구 신생물에는 B림프구 백혈병, B림프구 림프종(lymphoma) 및 골수종(myeloma)을 포함한다.
셋째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 함유 조성물을 사용하여 B림프 구 신생 세포의 세포사멸(에이포토시스)(apoptosis)를 유발하여 B림프구 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.
넷째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체를 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체를 함유한 조성물을 사용하여 B림프구 신생 세포 상에서 CD40의 조절을 향상하여 B림프구 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.
다섯째 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체 함유 조성물을 사용하여 B림프구 신생 세포를 자극함으로써 IL-10을 생성하여 B림프구 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 단독의 치료 유효량 또는 의약적으로 허용할 수 있는 1종 이상의 캐리어(carrier)와 함께 함유한 조성물을 제공한다.
그 조성물은 소화관내 투여, 비경구 투여 및 국소 투여, 또는 흡입 투여를 할 수 있다.
하나의 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그 기능상동체 또는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기능상동체와 화학요법제, 면역요법제 및 방사선 치료제를 포함하여 항 B림프구 신생물 처리 약제 중 최소 하나를 함유하는 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 B림프구 신생물의 치료방법을 제공한다.
정의
본 발명에서 다음 용어는 아래의 의미를 가진다:
"올리고뉴클레오티드"(oligonucleotide)는 다중 뉴클레오티드)(즉, 하나의 포스페이트기와 하나의 치환할 수 있는 유기 염기에 결합된 하나의 당(suger)(즉, 디옥시리보스)으로 이루어진 분자)를 의미한다.
4개의 유기 염기 사이토신(C), 티민(T), 아데닌(A) 및 구아닌(G)이 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 시중에서 입수할 수 있는 자동화 올리고뉴클레오티드 신세사이저(synthesizer)에 의해 합성하거나, 또는 공지기술을 사용하여 현행 핵산서열에서 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 "골격수식"("backbone modification")은 하나의 올리고뉴클레오티드가 하나의 포스포로티오에이트 수식 포스페이트 골격(즉, 그 포스페이트의 산소들 중 최소 하나가 황에 의해 치환 됨) 또는 다른 수식 골격을 가진 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드의 "화학수식"(chemical modification)은 상기 뉴클레오티드의 활성기의 사용 또는 뉴클레오티드 유사체 형성에 의한 수식을 의미한다.
상기 수식은 그 올리고뉴클레오티드의 합성 중 또는 합성 후에 발생할 수 있다.
그 합성 중에, 수식 염기(modified bases)(티미딘 유사체를 포함하나 한정되는 것은 아니다.)는 내부결합(incorporated internally)할 수 있거나 또는 5' 단부 상에 결합할 수 있다.
그 합성 후에, 그 수식은 활성기[아미노 수식인자(amino modifier)를 통해, 3' 또는 5' 히드록시기를 통하여, 또는 포스페이트기를 통해]를 사용하여 실시할 수 있다.
"B 림프구 신생물"(B cell neoplasm)은 B 림프구 연결 세포 중 비정상 증식에서 발생한 질병(diseases)을 의미한다.
그 B림프구 신생물은 B림프구 백혈병, B림프구 림프종 및 골수종(myeloma)(형질 세포종/형질 세포성 골수종)으로 구분할 수 있다.
B림프구 백혈병에는 B림프구 만성 림프구성 백혈병(B-CLL), 전구 B림프구-급성 림프모구성 백혈병(precursor B-acute lymphoblastic leukemia)(B림프구 급성 림프구성 백혈병, B-ALL), B림프구 전 림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia) 및 유모상 세포성 백혈병(hairy cell leukemia)을 포함한다.
B림프구 림프종에는 소 림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma), 림프 형질 세포성 림프종(lympho plasmacytic lymphoma)/면역 세포종(immunocytoma), 외투 세포 림프종(Mantle cell lymphoma), 여포 림프종(Follicular lymphoma), 피부여포 림프종(cutaneous follicular lymphoma), MALT 타입의 결절 외변층 B림프구 림프종(extranodal marginal zone B-cell lymphoma of MALT type), 결절 연변층 B림프구 림프종(nodal marginal zone B-cell lymphoma)(+/- 단구상 B림프구:monocytoid B-cells), 비장성 연변층 림프종(splenic marginal zone lymphoma)(+/- 융모상 림프구:villous lymphocytes), 미만성 대 B림프구 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 맥관내 대 B림프구 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 1차 확연 림프종(primary effusion lymphoma) 및 버킷트 림프종(Burkitt's lymphoma)을 포함한다.
"피검자"(subject)는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말(horse), 소(cow), 돼지, 염소, 양, 마우스(mouse) 및 랫(rat)을 포함하나 한정되지 않은 하나의 포유동물(mammal)을 말한다.
본 발명의 올리고뉴클레이티드는 B림프구 신생물을 가진 피검자에 투여할 수 있다.
"항 B림프구 신생물 약제"(anti-B cell neoplasm agent)는 피검자의 B림프구 신생물을 치료하는데 사용되는 하나의 약제(agent)를 의미한다.
그 약제(agent)에는 본 발명의 올리고뉴클레이티드, 화학요법제, 면역요법제 및 방사선 치료제를 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레이티드는 하나 이상의 다른 항 B림프구 신생물 약제의 투여 전, 투여와 함께, 또는 투여 후에 투여하여 B림프구 신생물의 치료에 상승 효과를 얻을 수 있다.
"화학요법제"(chemotherapeutics)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 배합하여 B림프구 신생물을 치료하는 화학요법제를 말한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생물의 치료에서 1종 이상의 화학요법제와 함께 사용할 수 있다.
상기 화학요법제에는 시클로포스파미드 또는 클로람부실(chlorambucil), 빈카 알카로이드(vinca alkaloids)(즉, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트(methotrexate), 프리드니손(prednisone), 안트라시클린, L-아스파라기나제, 퓨린유사제(purine analogs)(즉, 플루다라빈 모노포스페이트, 2-클로로디옥시아데노신 및 펜토스타틴), 시토신, 아라비노사이드(arabinoside), 시스플라틴, 에토포사이드 및 이포스파미드(ifosfamide) 등 알킬화제(alkylating agents)를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
또, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학요법제에서 1종 이상의 화학요법제 배합물과 함께 사용할 수 있다.
그 배합물에는 CVP(시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프리드니손), CHOP(CVP 및 독소루비신), C-MOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프리드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP(CHOP+프로카르바진 및 블레오마이신), m-BACOD(CHOP+메토트렉세이트, 블레오마이신 및 류코보린), ProMACE-MOPP(프리드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포사이드 및 류코보린 + 표준(standard) MOPP, ProMACE-CytaBOM(프리드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포사이드, 사이타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 류코보린), MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 일정용량의 프리드니손(fixed dose prednisone), 블레오마이신 및 류코보린), MVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), MIME(메틸-개그(methyl-gag), 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), DHAP(덱사메타손, 고용량의 사이타라빈 및 시스플라틴), ESHAP(에토포사이드, 메틸프리디솔론, HD사이타라빈, 시스플라틴), CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포사이드, 프로카르바진, 프리드니손 및 블레오마이신), CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 사이타라빈 및 프리드니손), CHOP+블레오마이신, 메토트렉세이트, 프로카르바진, 나이트로젠 머스타드(nitrogen mustard), 사이토신 아라비노사이드 및 에토포사이드, MOPP(메클리타민(나이트로젠 머스타드), 빈크리스틴(온코빈:Oncovin), 프로카르바진 및 프리드니손), ABVD(즉, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChIVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프리드니손), CABS(로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP+ABVD, MOPP+ABV(독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 또는 BCVPP(카르무스틴, 사이클로포스파미드, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프리드니손) 및 CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 및 프리드니손)을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
"면역요법제"(immunotherapeutics)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 배합하여 B림프구 신생물을 치료하는 면역요법제를 의미한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 B림프구 신생물의 치료에서 1종 이상의 면역요법제와 함께 사용할 수 있다.
상기 면역요법젱는 항 CD20 항체(anti-CD20 antibodies)를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
상기 항 CD20 항체에는 B림프구 신생 세포의 세포표면 상에서 CD20 단백질과 특이하게 반응성이 있는 면역글로불린(immunoglobulins) 및 그 프라그멘트(fragments)를 포함한다.
CD20 항체는 다클론항체(polyclonal antibody) 및 단클론항체, 키메라항체, 이중 특이성 항체(bi-specific antibody) 및 인체항체(humanized antibody)로 할 수 있다.
"CD20"은 B림프구막 단백질(B-cell membrane protein)이며(참고문헌: Tedder 등, Immunology Today 15: 450-454(1994)), 정상(normal) 세포와 B림프구 신생 세포 상에서 발현한다(참고문헌: John C. Byrd 등, J. Clin, Oncol. 2001; 19:2165-2170; Huhn D, 등,Blood 2001, 98: 1326-1331).
"의약적으로 허용할 수 있는 캐리어"(pharmaceutically acceptable carrier)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 피검자의 투여에 적합한 1종 이상의 고상 또는 액상 필러(filler), 희석제(diluents) 또는 피포물질(encapsulating substances)을 의미한다.
그 캐리어는 유기, 무기, 천연 또는 합성 캐리어로 할 수 있다.
그 캐리어에는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 투여에 적합한 모든 용액, 희석제, 용제, 분산 배양액, 리포솜(liposome), 에멀젼, 코팅, 항균 및 항진균제, 동장(isotonic) 및 흡수 지연제와 어느 다른 캐리어를 포함하며, 이들의 사용은 이 기술에서 주지되었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 "치료 유효량"은 피검자에서 B림프구 신생물의 소정의 치료 결과를 얻는데 사용된 용량(dose)을 말한다.
그 용량은 그 기술분야의 기술자에 의해 주지된 표준기술에 의해 측정할 수 있으며, 그 피검자의 체형 또는/및 전체 건강상태 또는 질병의 중증도(severity)(질병의 정도)를 포함하나 한정되지 않은 여러 가지의 인자(factors)에 따라 변경할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 도입은 단일치료 또는 일련의 연속 치료로 실시할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 피검자 투여용량은 1회 투여당 약 1㎍ ~ 100㎎의 범위를 가진다.
그러나, B림프구 신생물의 치료용량은 위에서 설명한 용량보다 10 ~ 1,000배 더 높은 용량 범위에서 사용할 수 있다.
그 용량 처방(dosage regimen)은 조정하여 이 기술분야의 기술자에 의해 최적의 치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 "루트(route)는 소화관내(enteral)투여, 비경구투여 및 국소투여 또는 흡입(inhalation)을 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "소화관내"에는 구강(oral)투여, 위내(gastric)투여, 장내(intestinal)투여 및 직장내(rectal)투여를 포함한다.
용어 "비경구"(parenteral)에는 정맥내투여, 복강내투여, 근육내투여, 피하투여, 직장내 및 질내(vaginal)투여를 포함한다.
용어 "국소"(topical)는 표피, 협면와동(buccal cavity) 및 귀(ear), 눈(eye) 및 코(nose)의 외부에 상기 올리고뉴클레오티드의 사용을 의미한다.
"의약 조성물"(pharmaceutical composition)은 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드를 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어와 함께 함유한 조성물 또는 그 캐리어가 없는 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한 조성물을 의미한다.
그 조성물에는 수용액 또는 식염용액, 파티클(particles), 에어로졸(aerosols), 펠릿(pellets), 그래늄(granules), 분말(powders), 정제(tablets), 코팅정제, (마이클로)캡슐,좌약, 시럽, 에멀젼(emulsions), 현탁액, 크림, 점적제(drops) 및 여러 가지의 약물투여기(drug delivery systems)의 사용에 적합한 다른 의약 조성물을 포함한다.
그 조성물은 주사, 구강, 협면(buccal), 직장 및 질내사용(vaginal use), 흡입 및 데포(depot) 사용에 적합하다.
모든 경우, 그 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균성 및 안전성을 가질 필요가 있으며 그 미생물(균) 오염을 방지하여 보존할 필요가 있다.
주사용으로, 그 조성물에는 주사용액 또는 분산액의 즉석 조제용으로 수용액 또는 분산액 및 분말을 포함한다.
이 발명에서 "분말"(powder)은 상기 올리고뉴클레오티드를 함유하는 미분산성 고체입자 함유 조성물을 말한다.
그 분말은 사용 전에 의약적으로 허용되는 다른 캐리어(즉, 물, PBS, 식염수 및 다른 의약적으로 허용되는 버퍼)와 제제할 수 있다.
그 용액은 1종 이상의 적합한 용제와 다른 필요한 성분 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 배합하여 조제할 수 있다.
분산액은 상기 올리고뉴클레오티드를 분산 매질(dispersion medium)(즉, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌글리콜 및 오일)과 다른 필요한 성분을 포함하는 비히클(vehicle)에 배합하여 조제할 수 있다.
경구투여용으로, 상기 조성물은 가식(식용) 캐리어(edible carriers)와 제제하여 정제, 환제, 당제(dragees), 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 형성한다.
구강투여용으로, 상기 조성물은 통상의 방법으로 하여 정제(tablets 또는 lozenges)로 할 수 있다.
흡입(inhalation)용으로, 상기 조성물은 가압팩(packs) 또는 분무기(nebulizer)에 의한 에어로졸 스프레이(aerosol spray) 또는 건조분말로 하며 이 기술분야의 기술자에 의해 선택할 수 있다.
또, 상기 올리고뉴클레오티드는 직장내 또는 질내 사용 또는 데포(depot) 사용에서 의약적으로 허용할 수 있는 조성물로서 제제할 수 있다.
그 조성물 중에서 상기 올리고뉴클레오티드는 단독으로 사용하거나, 화학요법제, 면역요법제 및 특정 수용체 또는 표적세포의 분자에 의해 인식된 리간드를 포함하나 한정되지 않은 1종 이상의 다른 약제(agents)와 배합하여 사용할 수 있다.
또 다른 약제와 배합한 상기 올리고뉴클레오티드는 각각의 조성물로 하여 다음과 같이 사용할 수 있다:
(1) 상기 올리고뉴클레오티드는 투여 전 하나의 제 2약제(second agent)와 혼합한다;
(2) 상기 올리고뉴클레오티드와 하나의 제 2약제를 피검자에 시간을 달리하여 투여한다;
(3) 상기 올리고뉴클레오티드와 하나의 제 2약제를 피검자의 다른 부위에 투여한다.
또, 그 조성물은 플라스미드, 세균벡터, 바이러스벡터와 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 서열을 가진 핵산 백신을 함유할 수 있다.
도 1은 Oligo-2(용량)에 의해 유발된 B-CLL 세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)(%)를 나타낸 그래프이다.
Oligo-2의 여러 가지 용량은 갖거나 갖지 않는 10% 인간 AB 혈청 배지 중에 B-CLL 세포를 배양하였다.
배양 7일에, 이들 세포를 TMRE로 염색하였다. 생존 가능한 B-CLL 세포를 TMRE-양성(+) 세포 %에 대하여 계산하였다.
도 2는 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절 향상에 따르는 Oligo-2의 효과를 나타낸다.
B-CLL 세포를 7일간 Oligo-2와 함께, 또는 Oligo-2 없이 배양한 다음, 유동 세포 계측법(flow cytometry)을 사용하여 CD40 발현분석을 위해 FITC-CD40으로 염색하였다. 그 발현 레벨(expression level)을 MFI 넘버(number)로 나타내었다.
도 3은 소 림프구성 림프종 세포에 대한 CD40의 조절 향상에 따르는 Oligo-2의 효과를 나타낸다.
상기 소 림프구성 림프종 세포를 Oligo-2와 함께 또는 Oligo-2 없이 배양하였다. 배양 7일에, 유동세포 계측법을 사용하여 CD40 발현분석을 위해 FITC-CD40 항체로 그 소 림프구성 림프종 세포를 염색하였다.
그 발현 레벨은 MFI 넘버로 나타내었다.
도 4는 Oligo-2에 의해 유발된 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)을 나타낸다.
B-ALL 세포를 Oligo-2와 함께 또는 Oligo-2 없이 배양하였다. 배양 3일, 5일 및 7일에 이들의 세포를 TMRE로 염색한 다음 유동세포 계측법 분석을 하였다.
그 생존가능 B-ALL 세포수를 TMRE-양성(+) 세포 %에 대하여 계산하였다.
도 5는 Oligo-2에 의한 B-ALL 세포 상에서의 CD40의 조절 향상을 나타낸다.
B-ALL 세포를 농도 1㎍/ml의 Oligo-2와 함께 또는 그 Oligo-2 없이 배양하였다. 배양 3일, 5일 및 7일에 유동세포 계측법을 사용하여 CD40 발현 분석을 위해 FITC-표지(labeled) 항 CD40 mAb로 이들의 세포를 염색하였다.
그 발현 레벨을 MFI 넘버로 나타내었다.
도 6은 Oligo-2에 의해 유발된 B-CLL 세포로부터 인터류킨-10의 생성을 나타낸 그래프이다.
B-CLL 세포를 혈청 없는 배지 중에서 Oligo-2와 함께 또는 Oligo-2 없이 배양하였다.
그 상증액을 그 표시시간에 수집하고, ELISA 킷트(kit)를 사용하여 IL-10에 대하여 평가하였다.
도 7은 정상 인간 PBMC의 증식에 대한 Oligo-2의 효과를 나타낸 그래프이다.
정상 인간 PBMC를 36시간 동안 각각 Oligo-2, 2216 또는 2006과 함께 배양한 다음, 이들 세포의 증식을 측정하기 위하여 [3H] 티미딘과 각각 배합하였다.
5개의 혈액 샘플을 분석하였다.
이들 세포의 증식을 자극 지수(stimulation index) SI로 나타내었다.
다음에 실시예를 설명하나, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이 분야의 기술자에 의해 합리적으로 발생하는 변형 등 여러 가지의 합리적인 변형은 여기서 본 발명의 범위 내에서 벗어남이 없이 실시할 수 있다.
실시예 1 : 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 합성
하나의 서열 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3'(Oligo-2로 지정함, SEQ ID NO:1)를 가진 하나의 올리고뉴클레오티드를 지정하여 합성하였다.
상기 Oligo-2의 기능을 분석하기 위하여, 서열 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'(SEQ ID NO:2)를 가진 2006과 서열 5'-gggggacgatcgtcggggg-3'(SEQ ID NO:3)을 가진 2216의 2종 대조 올리고뉴클레오티드(control oliginucleitude)를 또 합성하였다.
3종의 올리고뉴클레오티드 모두는 상곤 바이오테그 컴파티(Sangon Biotech Company)(중국, 상하이)에서 합성하였으며, 리뮬루스 아메바성세포 용해물 아세이(Limulus amebocyte lysate assay)를 사용하여 엔도톡신(endotoxin)(내독소)에 대하여 테스트 하였고(Associates of Cape Cod, Inc), 발열인자 없는 시약(pyrogen-free reagents) 중에서 조작(manipulation) 하였다.
상기 올리고뉴클레오티드 2006(참고문헌: J. Immunol. 2000; 164: 1617)은 충분하게 실험한 하나의 올리고뉴클레오티드이며, 정상 B림프구 세포를 강력하게 활성화하였다.
상기 올리고뉴클레오티드 2216(참고문헌: Eur. J. Immunol. 2001; 31:2154)은 충분하게 실험을 한 또 다른 올리고뉴클레오티드이며, 형질세포 형상의 수지상 세포(plamacytoid dendritic cells)에서 높은 양의 타입 1 인터페론(interferon)을 유도한다.
그 올리고뉴클레오티드의 합성방법은 이 기술분야의 기술자에 의해 주지되었으며, 기타방법 중에서 고상 합성법(solid-phase synthesis)이 일반적으로 사용되었다.
특히, 상기 고상 합성법의 프로세스에서 고상 지지체는 조절소공글라스(controlled pore glass : CPG) 비이드(bead)가 사용되었다.
이 비이드(bead)는 구멍(holes)과 채널(channels)을 가진 하나의 표면을 가지며, 이들의 구멍과 채널 내에는 보호(protected) 뉴클레오티드가 부착되어 있다.
그 올리고뉴클레오티드 합성은 상기 3'-최상(most) 뉴클레오티드에서 개시하여 상기 5'-최상 뉴클레오티드가 결합될 때까지 반복되는 5개 스텝으로 이루어진 일연의 연속 사이클(cycles)을 통하여 처리한다.
이들의 스텝에는 다음의 탈보호 작용(deprotection), 활성화 작용(activation), 커플링 작용(coupling)(동반작용), 캐핑 작용(capping) 및 안정화 작용(stabilization)이 있다.
스텝 1 : 탈보호 작용(deprotection)
CPG(controlled pore glass) 비이드(bead)에 부착된 보호 뉴클레오사이드에서의 보호기가 반응성 5'-히드록시기를 이탈하는 트리클로로아세트산(TCA)에 의해 제거된다.
스텝 2 : 활성화 작용(activation)
이 스텝에서, 테트라졸이 테트라졸릴 포스포르아미다이트 중간체를 형성하는 그 커플링 포스포르아미다이트 뉴클레오사이드를 공격한다.
스텝 3 : 커플링 작용(coupling)
테트라졸릴 포스포르아미다이트 중간체가 그 수용체의 히드록시기와 작용하여 5' ~ 3' 결합이 형성된다.
그 테트라졸은 재구성되고, 그 프로세스는 연속한다.
스텝 4 : 캐핑작용(capping)
이 스텝에서, 아세트산 무수물과 N-메틸이미다졸로 이루어진 아세틸화 시약을 사용하여 커플링 작용 장애(cuopling failure)를 회피하기 위해 그 올리고뉴클레오티드의 5'-최단부(most end) 상에서 반응성 히드록시기를 블로킹(blocking)한다.
스텝 5 : 안정화 작용(stabilization)
일단 상기 캐핑 작용 스텝이 완료될 경우, 이 사이클에서의 최종 스텝은 산화작용(oxidation)으로, 이 산화작용은 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬과 방금 전에 부가한 염기(most recently added base) 사이에서 포스페이트 결합을 안정화 한다.
이 스텝은 테트라히드로푸란(THF)과 물 중에서 온화한 산화제로서 요오드(iodine)의 존재하에 실시한다.
이 최종 스텝 다음에 이 사이클은 상기 서열에서 각각의 뉴클레오티드에 대하여 반복한다.
상기 합성이 완료된 후에 단일가닥(single stranded) DNA 분자를 HAP, PAGE, HPLC, C18 및 OPC 등의 방법에 의해 정제한다.
실시예 2 : 상기 Oligo-2에 의해 유발한 인간 B-CLL 세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
치료하지 않은 B-CLL(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제 1병원)의 혈액샘플을 혈액 채취 허가서를 발급받은 후에 채취하였다.
말초혈 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells : PBMCs)는 Ficoll-Paque(Pharmacia)의 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 분리하였다.
상기 PBMC에서 CD5 + CD19 + CD23 + B-CLL 세포는 B림프구 분리 킷(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하여 CD5 + CD19 + CD23 + 세포(B-CLL 세포) > 95%으로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자(Miltenyi Biotec)의 지침서에 의해 실시하였 다.
2. 상기 Oligo-2에 의해 유발된 인간 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
상기 B-CLL 세포는 48-웰플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 최종 농도 3㎍/ml에서 Oligo-2와 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 상기 Oligo-2, 2006 또는 2216을 희석하였다.
그 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지, HyClone)의 동일 용량을 대조(control)(배지:Medium)로 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들의 세포를 카운팅(counting)하고 10분간 테트라메틸-로드아민 에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)로 염색(staining)하였다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
TMRE 양성(+)(생존가능) 및 TMRE 음성(-)(세포사멸:apoptotic) B-CLL 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)에 의해 측정하였다(B.D. FAC Aria).
생존가능 B-CLL 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점(time point)에서의 TMRE-양성(+) 세포 %로 곱하여 계산하였다.
B-CLL 환자에서 채취한 10종의 혈액샘플로 동일하게 실험을 반복하여 실시하 였다.
평균하여 얻어진 그 결과(n=10)에서는 Oligo-2가 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 현저하게 유발하였음을 나타내었다(다음 표 1 참조).
Oligo-2에 의한 유발 효과는 2006에 의한 유발 효과보다 약 2배가 더 강력함을 나타내었다.
또, 상기 B-CLL 세포의 세포사멸에 대한 Oligo-2와 2006의 용량 효과도 관찰하였다.
그 결과에서는 농도 0.1~10㎍/ml의 범위에서 여러 가지 용량의 상기 Oligo-2가 B-CLL 세포의 세포사멸을 확실하게 유발하였음을 나타내었다(도 1 참조).
농도 1㎍/ml의 용량에서 대비할 때, Oligo-2의 세포사멸 유발 효과는 2006의 세포사멸 유발 효과보다 약 3배가 더 강력하였다.
또, 전체적으로 이들의 결과에서는 Oligo-2를 사용하여 B-CLL 세포의 세포사멸을 유발함으로써 B-CLL을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
Oligo-2에 의해 유발된 B-CLL 세포의 세포사멸(반응속도)
생종가능 B-CLL 세포(%) (n=10)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
대조(배지) 82.2±12.2 79.5±9.25 81.3±11.0
2216 67.7±18.2 57.7±16.7 50.7±13.5
2006 66.5±12.1 44.4±15.0 40.2±10.8
Oligo-2 45.5±9.5 17.6±5.6 14.2±3.1
실시예 3 : Oligo-2에 의한 인간 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절 향상(up-regulation)
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
실시예 2에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 B-CLL 환자에서 인간 B-CLL 세포를 분리하였다.
2. 상기 Oligo-2에 의한 인간 B-CLL 세포 상에서의 CD40의 조절 향상(up-regulation)
상기 B-CLL 세포는 48-웰플레이트(well plate)의 106 cells/well 에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 최종 농도 3㎍/ml에서 Oligo-2 또는 2006 또는 2216과 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 상기 Oligo-2, 2006 또는 2216을 희석하였다.
그 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지:HyClone)의 동일 용량을 대조(배지)로 사용하였다.
배양 7일 후에, 10분간 세포(cells)를 카운팅(counting)하였으며, FITC-CD40 항체로 염색하였다(Becton ickinson)(Molecular Probes Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
B-CLL 세포를 염색한 상기 CD40 항체를 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
그 결과(도 2)에서는 상기 Oligo-2가 B-CLL 세포 상에서 CD40의 발현 조절을 현저하게 향상한다는 것을 나타내었으며, 그 Oligo-2를 사용하여 B-CLL 세포 상에서 CD40의 조절향상을 통해 B-CLL을 치료할 수 있다는 것을 나타내었다.
CD40의 조절향상은 B-CLL 세포의 세포사멸(에이포토시스)을 촉진하여, B-CLL 세포의 성장 저지(growth inhibition)를 유발하고 그 B-CLL 세포를 더 면역원성(immunogenic)이 있도록 하여 B-CLL 세포에 특이성 있는 CTL의 생성을 촉진(자극)한다.
B-CLL 환자로부터 채취한 최소 10개의 혈액샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 4 : 상기 Oligo-2에 의해 유발된 인간 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸(에이포토시스)
1. 인간 소림프구성 림프종 세포의 조제
환자 혈액 채취 허가 통지서를 취득한 다음, 소림프구성 림프종(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제 1병원)의 림프절(lymph node)의 생검조직(biopsy tissue)에서 소림프 구성 림프종 세포를 분리하였다.
그 생검조직을 거친 표면의 글라스 슬리이드(glass slides)에 의해 민싱(mincing)하여 6㎝ 배양 플레이트 내에서 5㎖의 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 이들 세포(cells)를 방출하였다.
그 방출된 세포는 스테인리스 스틸제 메시를 통하여 여과하고 15ml의 혈청 없는 RPMI 1640 배지를 포함하는 50㎖용 삼각 튜브 내에 수집(collection)하였다.
그 삼각튜브를 10분간 300×g에서 원심분리한 다음, 상증액을 폐기하였다.
CD5 + CD19 +CD23 + 소림프구성 림프종 세포는 B림프구 분리키트(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 CD5 + CD19 + CD23 + 세포(소림프구성 림프종 세포) > 95%으로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자(Miltenyi Biotec)의 지침서에 따라 실시하였다.
2. 상기 Oligo-2에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포의 에이포토시스(세포사멸)
하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 최종 농도 3㎍/ml에서 Oligo-2 또는 2006 또는 2216과 함께 상기 소림프구성 림프종 세포를 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 상기 Oligo-2, 2006 또는 2216을 희석하였다.
대조(control)(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 PEMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들 세포를 10분간 카운팅(counting)하였으며, 테트라메틸-로드아민 에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)로 염색하였다.
상기 TMRE-양성(+)(생존가능) 및 TMRE-음성(-)(세포사멸) 소림프구성 림프종 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D FACS Aria)에 의해 측정하였다.
생존가능 소림프구성 림프종 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점에서 상기 TMRE-양성 세포 %와 곱하여 계산하였다.
소림프구성 림프종 환자로부터 얻은 5개 혈액 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하였다. 평균하여 그 얻어진 결과(n=5)에서는 상기 Oligo-2가 그 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸을 현저하게 유발한다는 것을 나타내었으며(다음 표 2), 상기 Oligo-2를 사용하여 그 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸을 유발함으로써 소림프구성 림프종을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
Oligo-2에 의해 유발한 소림프구성 림프종 세포의 세포사멸
생종가능 소림프구성 림프종 세포(%) (n=5)
그룹 배양시간(일)
3 5 7
대조(배지) 81.2±7.7 78.4±9.1 77.3±13.2
2216 68.5±15.0 58.7±12.3 52.1±10.2
2006 67.6±10.3 45.3±8.9 41.1±8.2
Oligo-2 60.3±12.2 23.2±5.6 15.5±6.2
실시예 5 : 상기 Oligo-2에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포 상에서 CD40의 조절 향상(up-regulation)
1. 인간 소림프구성 림프종 세포의 조제
실시예 4에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 환자로부터 인간 소림프구성 림프종 세포를 분리하였다.
2. 상기 Oligo-2에 의해 유발된 소림프구성 림프종 세포 상에서 CD40의 조절 향상
상기 소림프구성 림프종 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 3㎍/ml의 최종 농도에서 Oligo-2 또는 2006 또는 2216과 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 상기 Oligo-2, 2006 또는 2216을 희석하였다.
대조(control)(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 7일 후에, 이들 세포(cells)를 10분간 카운팅(counting)하였으며 FITC-CD40 항체로 염색하였다(Becton ickinson)(Moleculas Probes Inc)(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
상기 CD40 항체로 염색한 소림프구성 림프종 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
그 결과(도 3)에서는 상기 Oligo-2가 소림프 구성 림프종 세포 상에서 CD40의 발현 조절을 현저하게 향상한다는 것을 나타내었으며, 상기 Oligo-2를 사용하여 그 세포(cells) 상에서 CD40의 조절 향상에 의해 소림프구성 림프종을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
CD40의 조절 향상은 소림프구성 림프종 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 촉진하여, 소림프구성 림프종 세포의 성장 억제를 유발하며, 그 소림프구성 림프종 세포가 더 면역원성이 있도록 하여 소림프구성 림프종 세포에 특이성 있는 CTL의 생성을 촉진한다.
5개의 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 6 : 상기 Oligo-2에 의해 유발된 인간 B림프구 급성림프 모구성/림프구성 백혈병(B-ALL) 세포의 에이포토시스(세포사멸)
1. 인간 B-ALL 세포의 조제
환자 혈액 채취 허가 통지서를 얻은 다음에, 치료하지 않은 B-ALL(병리확인) 환자(중국, 지린대학교, 제일병원)로부터 혈액샘플을 채취하였다. PBMC는 Ficoll-Paque (Pharmacia)의 밀도구배 원심분리에 의해 분리하였다.
PBMC 에서의 CD19 + CD10 + B-ALL 세포는 B림프구 분리킷트(kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany)를 사용하여 CD19 + CD10 + 세포(B-ALL 세포) > 95%로 정제하였다.
그 세포조제는 상기 제조업자(Miltenyi Biotec)의 지침서에 따라 실시하였다.
2. 상기 Oligo-2에 의해 유발한 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)
상기 B-ALL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 3㎍/ml의 최종 농도에서 Oligo-2 또는 2216과 함께 배양하였다.
상기 Oligo-2 또는 2216은 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 희석하였다.
대조(배지)로서 동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 이들의 세포(cells)를 10분간 카운팅(counting) 하였으며 테트라메틸-로드아민 에틸에스테르(TMRE)(Molecular Probes Inc)로 염색하였다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
상기 TMRE-양성(+)(생존가능) 및 TMRE-음성(-)(세포사멸) B-ALL 세포를 유동세포 계측법(B.D FACS Aria)에 의해 측정하였다.
생존가능 B-ALL 세포수는 총 세포수(total cell count)를 각각의 시점에서 TMRE-양성(+) 세포 %와 곱하여 계산하였다.
얻은 그 결과에서는 상기 Oligo-2가 B-ALL 세포(도 4)의 에이포토시스(세포사멸)을 현저하게 유발하였다는 것을 나타내었으며, 상기 Oligo-2를 사용하여 B-ALL 세포의 에이포토시스(세포사멸)을 유발함으로써 B-ALL을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
B-ALL 환자로부터 채취한 10개의 혈액 샘플을 사용하여 실험을 동일하게 실시하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 7 : 상기 Oligo-2에 의한 B-ALL 세포 상에서 CD40의 조절 향상(up-regulation)
1. 인간 B-ALL 세포의 조제
인간 B-ALL 세포는 실시예 6에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 환자의 혈액샘플에서 조제하였다.
상기 B-ALL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 10% 인간 AB혈청 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 3㎍/ml의 최종 농도에서 Oligo-2 또는 2216과 함께 배양하였다.
혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 상기 Oligo-2 또는 2216을 희석하였다.
동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone)을 대조(배지)로서 사용하였다.
배양 3일, 5일 및 7일 후에, 그 세포(cells)를 10분간 카운팅하였으며 FITC-CD40 항체(Becton ickinson)(Molecular Probes Inc)로 염색하였다(참고문헌: Lena Thyrell 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004).
그 CD40 항체로 염색한 B-ALL 세포는 유동세포 계측법(flow cytometry)(B.D. FACS Aria)에 의해 측정하였다.
그 결과(도 5)에서는 상기 Oligo-2가 B-ALL 세포 상에서 CD40의 발현을 현저하게 조절하여 향상한다는 것을 나타내었으며, 상기 Oligo-2를 사용하여 그 세포(cells) 상에서 CD40의 조절을 향상함으로써 B-ALL을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
CD40의 조절 향상은 B-ALL 세포(cells)의 에이포토시스(세포사멸)을 촉진하여 B-ALL 세포(cells)의 성장억제를 유발하며 그 B-ALL 세포가 더 면역원성이 있도록 하여 B-ALL 세포(cells)에 특이성 있는 CTL의 생성을 촉진(자극)한다.
상기 B-ALL 환자에서 채취한 10개의 혈액 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하였으며 그 결과는 동일하였다.
실시예 8 : 상기 Oligo-2에 의해 유발된 B-CLL에서 IL-10의 생성
1. 인간 B-CLL 세포의 조제
인간 B-CLL 세포는 실시예 2에서 설명한 바와 같은 처리공정에 따라 B-CLL 환자에서 분리하였다.
2. 상기 Oligo-2에 의해 유발된 B-CLL에서 IL-10의 생성
상기 B-CLL 세포는 하나의 48-웰 플레이트(well plate)의 106 cells/well에서 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에 3㎍/ml의 최종 농도에서 각각 Oligo-2와 함께 3반복 배양하였다.
상기 Oligo-2는 혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone) 중에서 희석하였다.
동일 용량의 희석액(혈청 없는 RPMI 1640 배지(HyClone))을 대조(배지)로서 사용하였다.
그 배양 상증액은 72시간 또는 표시시간에서 수집하여 플루오로카인(Fluorokine) MAP 면역 배열구조(immunoarray) 시스템(R&D Systems)에서 IL-10에 대하여 평가하였다.
본 발명에 의한 데이터에서는 상기 Oligo-2와의 개시(triggering)가 B-CLL 세포에서 IL-10의 레벨이 높은 생성을 유발한다는 것을 나타내었다(도 6).
IL-10 생성의 현저한 증가는 6시간 배양에서 검출되었으며, 24시간 배양에서 피크를 형성하였으며, 72시간 이상의 배양에서 높은 레벨의 생성을 유지하였다(도 6 참조).
또, 본 발명의 데이터에서는 B-CLL 세포 배양액에 외인성 rh-IL-10(Schering Corp)의 첨가가 항 IL-10항체(R&D Systems)에 의해 특이성 있게 블로킹 될 수 있는 IL-10의 용량 의존성 방법으로 하여 B-CLL 세포의 에이포토시스(세포사멸)를 유발하였다는 것을 추가로 나타내었다.
이들의 실험결과에서는 상기 Oligo-2를 사용하여 자기분비(autocrine) 방식으로 B-CLL 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발하는 IL-10의 생성을 유발함으로써 B-CLL을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.
B-CLL 환자에서 얻은 최소 10개의 혈액 샘플을 사용하여 동일하게 실험을 반복하여 동일한 결과를 얻었다.
실시예 9 : 정상 인간(human normal) PBMC의 증식에서의 Oligo-2의 효과
인간 PBMC는 Ficoll-Hypaque의 밀도구배 원심분리(Pharmacia)에 의해 정상 헌혈자(중국, 지린성 혈액센터)의 연막(buffy coat)에서 분리하였다.
그 PBMC의 생존율(viability)은 트리판 블루 엑스클루젼법(trypan blue exclusion)에 의해 측정한 바와 같이 95 ~ 99% 이었다.
PBMC(6×105/웰(well)를 96-웰 U형상 저부형성 플레이트(U-bottomed plates)(Costar)내에 도포(plated)하고 Oligo-2(6㎍/ml)를 사용하거나 사용함이 없이 36시간 동안 3반복(triplicates) 배양하였다
그 다음, 이어서 16시간 동안 [3H] 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA, US)으로 표지하였다(pulsing).
그 셀(cells)을 글라스파이버필터 상에서 수집하고, 신틸레이션 카운터(scintillation counter : 섬광계수기)에서 검출하였다.
그 세포증식은 SI(자극지수: stimulation index)[3중 웰(triple wells)에서]로 나타내었다.
5개의 정상 혈액샘플에서의 데이터를 나타내었다.
2006 및 2216은 대비(controls)로 사용하였다.
그 결과에서는 상기 Oligo-2가 PBMC를 자극(촉진)하여 명백하게 증식할 수 있다는 것을 나타내었으며(도 7), 상기 Oligo-2가 세포사멸(에이포토시스)의 유발 대신 정상 인간 PBMC에 대하여 증식-자극성(proliferation-stimulatory)이 있으며, 배양세포에 대하여 비독성인 것을 나타내었다.
본 발명은 바람직한 실시예에 따라 구체적으로 설명한 바 있으나, 다음의 첨부된 청구범위에서 한정한 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 변경 및 변형이 가능하다는 것은 이 기술분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
<110> Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd <120> An oligonucleotide or its functional homologue, a composition comprising the same and a method for treating B cell neoplasm <130> IP060010 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 1 tcgtcgacgt cgttcgttct c 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence <400> 3 gggggacgat cgtcgggggg 20

Claims (26)

  1. SEQ ID NO:1로 나타낸 서열(sequences)을 가진 하나의 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide) 또는 그 기능상동체(functional homologues).
  2. 제 1항의 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)의 1 ~ 5개 복제(copies)로 이루어진 DNA 프래그멘트(fragment) 및 그 기능상동체.
  3. 하나의 기능부분(functional portion)으로서 청구항 1의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 DNA 프래그멘트(fragment) 및 그 기능상동체.
  4. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체에 있어서,
    서열 SEQ ID NO:1을 가진 올리고뉴클레오티드가 1 ~ 10개의 염기에 의해 인접(flanking)될 수 있음을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 기능상동체.
  5. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프라그멘트 및 이들의 기능상동체에 있어서,
    포스페이트 골격수식(phosphate backbone modification)을 가질 수 있는 것 을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체.
  6. 제 5항에 있어서,
    포스페이트 골격수식은 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 수식인 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체.
  7. 제 6항에 있어서,
    포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 수식은 부분(partial) 또는 완전(complets) 수식인 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체.
  8. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    이들의 염기는 화학수식을 할 수 있거나, 미량염기(rare bases)로 변화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체.
  9. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    합성(synthetic) 또는 분리(isolated)한 것임을 특징으로 하는 상기 올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체.
  10. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체로 이루어진 하나의 벡터(vector).
  11. 제 10항에 있어서,
    벡터는 하나의 세균벡터(bacterial vector), 하나의 플라스미드. 하나의 바이러스벡터(viral vector) 또는 하나의 DNA 백신인 것을 특징으로 하는 상기 벡터.
  12. 제 1항 ~ 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체를 함유한 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 상기 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 및 이들의 기능상동체는 단독 또는 최소 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어와 함께 또는 최소 1종의 다른 항 B림프구 신생물 약제와 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    항 B림프구 신생물 약제가 화학요법제, 면역요법제 또는 방사선 치료제인 것 을 특징을 하는 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 면역요법제는 항 CD20 항체를 포함하나 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 방사선 치료는 외부 방사선 치료 또는 방사능 표지항체 치료인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 피검자(subject)의 B림프구 신생물의 치료방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    B림프구 신생물은 B림프구 백혈병, B림프구 림프종 또는 골수종인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    B림프구 백혈병은 B림프구 만성 림프구성 백혈병 또는 B림프구 급성 림프구성 백혈병을 포함하나 한정되지 않으며, B림프구 림프종은 소 림프구성 림프종을 포함하나 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    피검자는 인간 또는 동물인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  21. 제 17항에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물은 소화관내 투여, 비경구투여 또는 국소투여 또는 흡입투여 하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  22. B림프구 신생세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)를 유발하는 방법에 있어서,
    제1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 B림프구 신생세포의 에이포토시스(apoptosis)(세포사멸)를 유발하는 방법.
  23. 인간 B림프구 신생세포 상에서 CD40의 발현을 증진(enhancing)하는 방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간 B림프구 신생세포 상에서 CD40의 발현을 증진하는 방법.
  24. B림프구 신생세포(B cell neoplastic cells)를 유발하여 IL-10을 생성하는 방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프래그멘트 또는 이들의 기능상동체 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 조성물을 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 B림프구 신생세포를 유발하여 IL-10을 생성하는 방법.
  25. 제 22항 내지 제 23항 중 어느 한 한에 있어서,
    B림프구 신생세포가 B림프구 백별형 세포, B림프구 림프종 세포 또는 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    B림프구 백혈병 세포는 B림프구 만성 림프구성 백혈병 세포 또는 B림프구 급 성 림프구성 백혈병 세포를 포함하나 한정되지 않으며, B림프구 림프종 세포는 소 림프구성 림프종 세포를 포함하나 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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