BRPI0609882A2 - oligonucleotìdeo, método para induzir apoptose de células neoplásicas de célula b, método para aumentar a expressão de cd40 em células neoplásicas de célula b, método para induzir células neoplásicas de célula b a produzirem il - 10, composição farmacêutica e uso de um oligonucleotìdeo - Google Patents

oligonucleotìdeo, método para induzir apoptose de células neoplásicas de célula b, método para aumentar a expressão de cd40 em células neoplásicas de célula b, método para induzir células neoplásicas de célula b a produzirem il - 10, composição farmacêutica e uso de um oligonucleotìdeo Download PDF

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Abstract

OLIGONUCLEOTìDEO, MéTODO PARA INDUZIR APOPTOSE DE CéLULAS NEOPLáSICAS DE CéLULA E, MéTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSãO DE CD40 EM CéLULAS NEOPLáSICAS DE CéLULA B, MéTODO PARA INDUZIR CéLULAS NEOPLáSICAS DE CéLULA B A PRODUZIREM IL-10, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DE UM OLIGONUCLEOTìDEO. A invenção provê nove oligonucleotídeos com seqúências de SEQ ID NO: 1-9 ou seus homólogos funcionais ou uma composição compreendendo os mesmos e um método para tratar neoplasia de célula B utilizando os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais ou a composição compreendendo os oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos induzem a apoptose de células neoplásicas de célula B, regulam ascendentemente CD40 em células neoplásicas de célula B e estimulam a produção de IL-10 a partir das células neoplásicas de célula B.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA MESMA
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção prove nove oligonucleotídeos com as seqüências como mostrado na SEQ ID NO: 1 a 9, ou seus homólogos funcionais, uma composição compreendendo os mesmos e um método para tratar neoplasia de célula B utilizando os oligonucleotídeos pela indução de apoptose de células neoplásicas de célula B, regulação ascendente CD4 0 em células neoplásicas de célula B e por estimulação de células neoplásicas de célula B para produzir IL-10. Os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais podem ser utilizados individualmente ou juntos, ou ser utilizados em combinação como quimioterapêutica, imunoterapêutica e radiação para tratar neoplasia de célula B.
ANTECEDENTES
Com base no sistema de classificação WHO (American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121), malignidades de linfóide são agrupadas em três classes principais: neoplasia de célula-B, neoplasia de célula-T/célula exterminadora natural(NK) e linfornas de Hodgkin.
A neoplasia de célula B está dividida adicionalmente em dois grupos: neoplasia de célula-B precursor e neoplasia de célula B periférica. Neoplasia de célula B precursor inclui leucemia linfoblástica aguda-B precursora (leucemia linfoblástica aguda de célula B, B-ALL)/linf orna linfoblástico (LBL). Neoplasia de célula B periférica inclui leucemia linfocítica crônica de célula B (B-CLL) , linfoma linfocítico pequeno, leucemia prolinfocítica de célula B, imunocitoma/linforna plasmacítica linfo, linfoma de célula Mantle, linfoma folicular, linfoma folicularcutâneo, linfoma de célula B de zona marginal extranodal do tipo MALT, linfoma de célula B de zona marginal nodal (+/-células B monocitóides), linfoma de zona marginal esplênica (+/- linfócitos vilosos), leucemia de células pilosas, plasmacitoma/mieloma de célula de plasma, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de célula B grande (tímico) mediastinal, linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de efusão primária e linfoma de Burkitt.
Leucemia linfocítica crônica de célula B (B-CLL) e leucemia linfocítica/linfoblástica aguda de célula B (B-ALL) são dois tipos de leucemia de célula B. As células B-CLL expressam CD19, CD5 e CD23 (Nicholas Chiorazii, M.D., e outros. N Engl J Med 2005: 352: 804-15). As células B-ALL expressam marcadores CD19 e CD10.
Linfoma linfocitico pequeno é uma neoplasia de célula B. As células de linfoma linfocitico pequeno expressam CD19, CD25 e CD23 (Catherine Thieblemont, e outros Blood. 2004: 103:2727-2737).
Dependendo da neoplasia de célula B diagnosticado, opções de tratamento atuais são quimioterapia, radioterapia e imunoterapia.
CD4 0, expresso na superfície da célula de linfócitos B normais e células dendríticas, é um membro da família do receptor de fator de necrose de tumor (TNFR). CD4 0L (CD154), expresso em linfócitos T, é um membro da família de fator de necrose de tumor (Castle BE, e outros J Immunol 1993; 151: 1777-1788). A interação de CD40L e CD40 promove a proliferação, diferenciação e apresentação de antígeno de linfócitos B, células dendríticas e monócitos (Ranheim EA e outros, J. Exp Med 1993; 177: 925-935; Yellin MJ, e outrosJ Immunol 1994; 153:666-674; Banchereau J, e outros Annu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS, e outros. Blood 2002: 99: 3319-3325).
CD4 0 também expressa nas células neoplásicas de célula B. Foi demonstrado que o aumento da expressão de CD4 0 promove a apoptose de células neoplásicas de célula B (Peter Chu, e outros PNAS, 19 de março de 2002, vol. 99, no. 6:3854-3859; Frank Dicker, e outros BLOOD, 15 de abril de 2005 volume 105, número 8, 3193-3198) .
Experimentos tanto in vitro como in vivo indicaram que a estimulação e regulação ascendente de CD40 induziu a inibição de crescimento de células neoplásicas de célula B (Funakoshi e outros, Blood 83:2787-2794, 1994; Murphy e outros, Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A.G. e outros 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A., e outros, 1999. Blood 93: 2999; Tong, A.W., NI e outros. 2001. Clin. Câncer Res. 7: 6 91).
A promoção de expressão de CD4 0 em células neoplásicas de célula B foi reportada como aumentando a antigenicidade de células neoplásicas de célula B e conseqüentemente promovendo a geração de linfócito T citotõxico (CTL) específico para as células. O CTL pode eficientemente exterminar as células neoplásicas de célula B (Dilloo D, e outros Blood 1997; 90: 1927-1933; Kato K, e outros J. Clin. Invest. 1998; 101:1133-1141; Wierda WG, e outros Blood. 2000; 96:2917-2924; Takakashi S., e outros Hum Gene Ther. 2001; 12:659-670; Takakashi S., e outros Câncer Gene Ther. 2001; 8:378-387). Na presença de CD40L, CD4 0 expressando células de leucemia linfocítica crônica decélula B podem ser mortas por linfócitos T citotõxicos CD4(Frank Dicker, e outros Blood, 15 de abril de 2005 vol. 105, núm. 8: 3193-3198). A interação de D40L e CD40 nas células do linfoma de Burkett poderia promover a célula a apresentar antígenos de tumor para CTLs específicos (Khanna, R. e outros 1997. J. Immunol. 159:5782). Experimentos in vivo e testes clínicos também demonstraram que a ativação de CD4 0 poderia aumentar a imunogenicidade de célula de leucemia linfocítica crônica de célula B (B-CLL) e conseqüentemente induzir a geração de CTLs específicas para as células (Kato, K., e outros 1998. J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W.G. e outros 2000. Blood 96: 2917).
Juntos, esses dados indicam que o aumento da expressão de CD4 0 em células neoplásicas de célula B pode estimular a imunidade anti-tumor contra neoplasia de célula B. A imunidade anti-tumor inclui porém não se limita ao seguinte:
1. promover a apoptose de células neoplásicas de célula B;
2. inibir o crescimento de células neoplásicas de célula B;
3. aumentar a imunogenicidade de células neoplásicas de célula B e portanto promovendo a geração de CTLs específicas às células.
Interleucina-10 (IL-10) é uma citocina homodímero produzida por certas células de célula T, monócitos, macrófagos e algumas das células neoplásicas desenvolvidas a partir de células B, células T ou células NK (Kitabayashi e outros, 1995; Masood e outros, 1995; Sjoberg e outros, 1996; Beatty e outros, 1997; Boulland e outros, 1998; Jonese outros, 1999). A atividade de IL-10 é mediada por seu receptor de superfície de célula específica expresso em células que apresentam antígeno, linfócitos e células de leucemia linfocítica crônica e célula B (B-CLL). Verificou-se que a adição de IL-10 exógeno inibiu a proliferação de células B-CLL recentemente isoladas de pacientes (Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, e outros, Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, vol. 89, no. 11 (Io de junho), 1997: pág. 4146-4152). IL-10 foi também reportado como inibindo a proliferação de células B-CLL e aumentando a apoptose de células B-CLL (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand, e Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179, janeiro de 1994, 91-99). A imunoestimulação de propriedades anti-câncer de IL-10 foi discutida em um exame do qual se especula que a sobreexpressao de IL-10 dentro do microambiente do tumor pode catalisar a rejeição imune de câncer (Simone Mocellin, Francesco M. Marincola e Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against câncer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005: 78 :1043-1051) .
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Na primeira modalidade, a presente invenção prove nove oligonucleotídeos também designados como Oligol, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, 01igo8, Oligo9, OligolO com as seqüências mostradas na SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 respectivamente e seus homólogos funcionais. Os oligonucleotídeos ou seus homólogosfuncionais podem ter uma modificação de estrutura de fosfato que é um fosforotioato ou modificação de fosforoditioato parcial ou completa. Os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais podem ter modificações químicas ou ter substituições com bases raras. Os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais podem ser partes funcionais de quaisquer outros fragmentos de DNA ou ser clonados em um plasmídeo, vetor bacteriano, vetor viral ou vacina de DNA respectivamente. Os oligonucleotídeos com as seqüências da SEQ ID NO: 1-9 podem ser modificados pela adição de uma ou mais bases (preferível 1 a 10 bases) a cada sua extremidade ou pela alteração de uma a mais bases nos mesmos. Aqueles versados na técnica podem determinar usar os oligonucleotídeos com as seqüências da SEQ ID NO: 1-9 ou seus homólogos funcionais individualmente ou juntos, ou utilizar fragmentos de DNA compreendendo os oligonucleotídeos com as seqüências (SEQ ID NO: 1-9) respectivamente para obter o objetivo da presente invenção com base no conhecimento da técnica e no ensinamento da presente invenção.
Na segunda modalidade, a presente invenção prove um método para tratamento de neoplasia de célula B utilizando os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção individualmente ou juntos ou pelo uso da composição compreendendo os mesmos em um sujeito. O sujeito é um ser humano ou animal. A neoplasia de célula B inclui porém não se limita à leucemia de célula B, linfoma de célula B e mieloma.
Na terceira modalidade, a presente invenção prove um método de tratar neoplasia de célula B utilizando osoligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção individualmente ou juntos ou utilizando a composição compreendendo os mesmos pela indução da apoptose de células neoplásicas de célula B.
Na quarta modalidade, a presente invenção prove um método para tratar neoplasia de célula B utilizando os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção individualmente ou juntos ou utilizando a composição compreendendo os mesmos por regulação ascendente de CD4 0 em células neoplásicas de célula B.
Na quinta modalidade, a presente invenção prove um método para tratar neoplasia de célula B utilizando os oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção individualmente ou juntos ou utilizando a composição compreendendo os mesmos por estimulação das células neoplásicas de célula B para produzir IL-10.
Em outra modalidade, a presente invenção prove uma composição compreendendo quantidade terapeuticamente eficaz dos oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção juntos ou em/com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A composição é administrada através de administração enteral, parenteral e tópica ou por inalação.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção prove um método para o tratamento de neoplasia de célula B, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos oligonucleotídeos ou seus homólogos funcionais da presente invenção individualmente ou juntos ou uma composição compreendendo os mesmos ou com pelo menos um dos agentes de neoplasia anti-célula B incluindoquimioterápicos, imunoterápicos e os agentes utilizados em radioterapia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. O efeito dos oligonucleotídeos sobre a regulação ascendente de CD4 0 em células B-CLL
As células B-CLL foram incubadas com ou sem os oligonucleotídeos por 7 dias e foram então coloridas com anticorpo FITC-CD4 0 para análise de expressão de CD4 0 utilizando citometria de fluxo. 0 nível de expressão foi indicado com número MFI.
Figura 2. O efeito de oligonucleotídeos sobre a regulação ascendente de CD4 0 em células de linfoma linfocítico pequeno
As células de linfoma linfocítico pequeno foram incubadas com ou sem os oligonucleotídeos. No 7 o dia, as células foram coloridas com anticorpo FITC-CD4 0 para análise da expressão de CD4 0 utilizando citometria de fluxo. O nível de expressão foi indicado com número MFI.
Figura 3. O efeito dos oligonucleotídeos sobre a proliferação de PBMC humano normal
Os PBMCs humanos normais foram cultivados com ou sem os oligonucleotídeos e então incorporados com [3H]timidina para determinar a proliferação das células. A proliferação das células foi expressa como cpm.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Na presente invenção, os seguintes termos terão os significados abaixo:
Um "oligonucleotídeo" significa múltiplos nucleotídeos (isto é, moléculas compreendendo um açúcar(por exemplo, desoxirribose) ligado a um grupo de fosfato ea uma base orgânica permutável). Há quatro bases orgânicascitosina (C) , timina (T) , adenina (A) e guanina (G) . Ooligonucleotídeo pode ser sintetizado por um sintetizadorde oligonucleotídeo automatizado disponível no mercado ouser preparado a partir de seqüências de ácido nucléicoexistentes utilizando técnicas conhecidas.
Uma "modificação de estrutura" de oligonucleotídeosignificará que um oligonucleotídeo pode ter uma estruturade fosfato modificado por fosforotioato (isto é, pelo menosum dos oxigênios do fosfato é substituído por enxofre) ououtra estrutura modificada.
Uma "modificação química" do oligonucleotídeosignificará a modificação pela utilização dos grupos ativosdo nucleotídeo ^u criação de análogos de nucleotídeo. Asmodificações podem ocorrer durante ou após síntese dooligonucleotídeo. Durante a síntese, bases modificadas(incluindo porém não limitado a análogos de Timidina) podemser incorporadas internamente ou na extremidade 5' . Após asíntese, a modificação pode ser realizada utilizando osgrupos ativos (através de um modificador amino, através dosgrupos de hidroxila 3' ou 5', ou através do grupo defosfato).
Uma "neoplasia de célula B" significará doençasdesenvolvidas a partir da proliferação anormal das célulasde linhagem de linfócito B. A neoplasia de célula B podeser agrupada em leucemia de célula B, linfoma de célula B emieloma (plasmacitoma/mieloma de célula de plasma).Leucemia de célula B inclui leucemia linfocítica crônica decélula B (B-CLL), leucemia linfoblástica aguda-B precursora(leucemia linfocítica aguda de célula B, B-ALL), leucemiaprolinfocítica de célula-B e leucemia de célula pilosa.Linfoma de célula B inclui linfoma linfocítico pequeno,linfoma plasmacítica linfo/imunocitoma, linfoma de célulaMantle, linfoma folicular, linfoma folicular cutâneo,linfoma de célula B de zona marginal extranodal do tipoMALT, linfoma de célula B de zona marginal nodal (+/-células-B monocitóides), linfoma de zona margina esplênica(+/- linfócitos vilosos) , linfoma de célula-B grandedifusa, linfoma de célula B grande mediastinal (tímico),linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de efusãoprimária e linfoma de Burkitt.
Um "sujeito" significará um mamífero incluindo porémnão limitado a ser humano, macaco, cão, gato, cavalo, vaca,porco, cabra, carneiro, camundongo e rato. Osoligonucleotídeos da presente invenção podem seradministrados a um sujeito com neoplasia de célula B.
Um "agente de neoplasia anti-célula B" significaráum agente utilizado para tratar neoplasia de célula B em umsujeito. O agente inclui os oligonucleotídeos da presenteinvenção, quimioterapêutica, imunoterapêutica e os agentesutilizados em radioterapia. Os oligonucleotídeos dapresente invenção podem ser administrados antes de,juntamente com ou após administração de um ou mais outrosagentes de neoplasia anti-célula B para obter efeitosinérgico no tratamento de um neoplasia de célula B.
Os "quimioterápicos" significam os quimioterápicosque tratam neoplasia de célula B em combinação com osoligonucleotídeos da presente invenção. Osoligonucleotídeos da presente invenção podem ser utilizadoscom um ou mais quimioterápicos no tratamento de neoplasiade célula B. Os quimioterápicos incluem, porém não selimitam a agentes de alquilação como ciclofosfamida ouclorambucil, vinca alcalóides (por exemplo, vincristina evinblastina), procarbazina, metotrexato, prednisona,antraciclina, L-asparaginase, análogos de purina (porexemplo, monofosfato de fludarabine, 2-clorodesoxiadenosinae pentostatina), citosina, arabinoside, cisplatina,etoposide e ifosfamida. Os oligonucleotideos da presenteinvenção também podem ser utilizados com uma ou maiscombinações de quimioterápicos na quimioterapia. Ascombinações incluem, porém não se limitam a CVP(ciclofosfamida, vincristina e prednisona), CHOP (CVP edoxorubicina), C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina,prednisona e procarbazina), CAP-BOP (CHOP mais procarbazinae bleomicina), m-BACOD (CHOP mais metotrexato, bleomicina eleucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato,doxorubicina, ciclofosfamida, etoposide e leucovorina maisMOPP padrão), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorubicina,ciclofosfamida, etoposide, citarabina, bleomicina,vincristine, metotrexato e leucovorina), MACOP-B(metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristine,prednisona de dose fixa, bleomicina e leucovorina) , IMVP-16(ifosfamida, metotrexato e etoposide) , MIME (metil-gag,ifosfamida, metotrexato e etoposide) , DHAP (dexametasona,citarabina de dose elevada e cisplatina), ESHAP (etoposide,metil predisolona, HD citarabina, cisplatina), CEPP(B)(ciclofosfamida, etoposide, procarbazina, prednisona ebleomicina), CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina eprednisona), CHOP mais bleomicina, metotrexato,procarbazina, mostarda nitrogenada, citosina arabinoside eetoposide. MOPP (meletamina (mostarda nitrogenada),vincristine (Oncovin), procarbazina e prednisona) , ABVD(por exemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastine edacarbazine), ChIVPP (clorambucil, vinblastine,procarbazina e prednisona), CABS (lomustina, doxorubicina,bleomicina e estreptozotocina), MOPP mais ABVD, MOPP maisABV (doxorubicina, bleomicina e vinblastina) ou BCVPP(carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina eprednisona) e CAP (ciclofosfamida, doxorubicina eprednisona).
Os "imunoterápicos" significam os imunoterápicos quetratam neoplasia de célula B em combinação com osoligonucleotideos da presente invenção. Osoligonucleotideos da presente invenção podem ser utilizadoscom um ou mais imunoterápicos no tratamento de neoplasia decélula B. Os imunoterápicos incluem, porém não se limitama anticorpos anti-CD20. O anticorpo CD20 incluiimunoglobulinas e seus fragmentos que são especificamentereativos com uma proteína CD20 na superfície de célula decélulas neoplásicas de célula B. Anticorpos CD20 podem seranticorpos policlonais e monoclonais, anticorposquiméricos, anticorpos bi-específicos e anticorposhumanizados. Um "CD20" é uma proteína de membrana decélula-B (Tedder e outros, Immunology Today 15: 450-454(1994)) e é expresso em célula B tanto normal comoneoplásica (John C. Byrd, e outros. J. Clin. Oncol. 2 001;19: 2165-2170; Huhn D., e outros, Blood 2001, 98: 1326-1331).
Um "veículo farmaceuticamente aceitável" indica umaou mais carga sólida ou líquida, diluentes ou substânciasde encapsular que são apropriadas para administração dosoligonucleotídeos da presente invenção a um sujeito. Oveículo pode ser orgânico, inorgânico, natural ousintético. O veículo inclui todas e quaisquer soluções,diluentes, solventes, meios de dispersão, lipossoma,emulsões, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes de retardar absorção e isotônicos, equalquer outro veículo apropriado para administração dosoligonucleotídeos da presente invenção e seu uso é bemconhecido na técnica.
A "quantidade terapeuticamente eficaz" dosoligonucleotídeos da presente invenção se referirá a umadose utilizada para obter um resultado desejado de tratarneoplasia de célula B em um sujeito. A dose pode serdeterminada por técnicas padrão bem conhecidas por aquelesversados na técnica e pode variar dependendo dos fatoresincluindo, porém não limitados ao tamanho ou/e saúde geraldo sujeito ou a gravidade da doença. A introdução dosoligonucleotídeos da invenção pode ser realizada como umúnico tratamento ou em uma série de tratamento. As dosesem questão dos oligonucleotídeos da presente invenção paraa administração variam de aproximadamente 1 (ig a 100 mg poradministração. Entretanto, doses para o tratamento deneoplasia de célula B podem ser utilizadas em uma faixa de10 a 1.000 vezes mais elevada do que as doses descritasacima. O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecero efeito terapêutico ótimo por aqueles versados na técnica.
A "via" de administração dos oligonucleotídeos dapresente invenção significará a administração enteral,parenteral e tópica ou inalação. O termo "enteral" comoutilizado aqui inclui administração oral, gástrica,intestinal e retal. O termo "parenteral" incluiadministração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular,subcutânea, retal ou vaginal. 0 termo "tópico" indica aaplicação dos oligonucleotídeos externamente à epiderme, àcavidade bucal e na orelha, olho e nariz.
Uma "composição farmacêutica" significará acomposição contendo uma quantidade terapeuticamente eficazdos oligonucleotídeos com ou sem um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição inclui porém nãose limita a soluções aquosas ou salinas, partículas,aerossóis, pelotas, grânulos, pós, tabletes, tabletesrevestidos, (micro) cápsulas, supositórios, xaropes,emulsões, suspensões, cremes, gotas e outras composiçõesfarmacêuticas apropriadas para uso em uma variedade desistemas de fornecimento de droga. As composições sãoapropriadas para uso em injeção, oral, bucal, reta evaginal, inalação e aplicação em depósito. Em todos oscasos, a composição deve ser estéril e estável sob ascondições de fabricação e armazenagem e conservada contra acontaminação microbial. Para injeção, a composiçãoincluirá soluções aquosas ou dispersões e pós para apreparação extemporânea de soluções injetáveis oudispersão. "Pó" nessa invenção se refere a uma composiçãoque contém partículas sólidas finamente dispersas contendoos oligonucleotídeos. O pó pode ser formulado com outrosveículos farmaceuticamente aceitos (por exemplo, água, PBS,solução salina e outros tampões farmaceuticamente aceitos)antes do uso. As soluções podem ser preparadas porincorporação dos oligonucleotídeos em um ou mais solventesapropriados e outros ingredientes necessários. Asdispersões podem ser preparadas pela incorporação dosoligonucleotídeos em um veículo, que contém um meio dedispersão (por exemplo, glicerol, polietileno glicóislíquidos e óleos) e os outros ingredientes necessários.Para administração oral, a composição será formulada comveículos comestíveis para formar tabletes, pílulas,drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas,suspensões e similares. Para administração bucal, acomposição será tabletes ou pastilhas no modo convencional.Para inalação, a composição será uma pulverização deaerossol a partir de pacotes pressurizados ou umnebulizador ou um pó seco e pode ser selecionada por umapessoa versada na técnica. Os oligonucleotídeos tambémpodem ser formulados como composições aceitáveisfarmacêuticas para aplicações retal ou vaginal e paraaplicação de depósito. Os oligonucleotídeos na composiçãopodem ser utilizados individualmente ou em combinação comum ou mais outros agentes incluindo porém não limitados aquimioterapêutica, imunoterapêutica e um ligandoreconhecido por um receptor específico ou molécula decélula alvo. Os oligonucleotídeos em combinação com outroagente podem ser composições separadas e utilizadas como aseguir: (1) os oligonucleotídeos são misturados com umsegundo agente antes da administração; (2) osoligonucleotídeos e um segundo agente são administrados aum sujeito em diferentes momentos; (3) os oligonucleotídeose um segundo agente são administrados em sítios diferentesde um sujeito. Além disso, a composição pode conterplasmídeo, vetores bacterianos, vetores virais e vacinas deácido nucléico contendo a seqüência dos oligonucleotideosda presente invenção.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são ilustrativos e não devemser vistos como limitando o escopo da presente invenção.Variações razoáveis, como aqueles que ocorrem ao técnico,podem ser feitas sem se afastar do escopo da presenteinvenção.
Exemplo 1. Síntese do oligonucleotídeoForam designados e sintetizados os oligonucleotideoscom as seguintes seqüências e nomenclaturas:
Oligo 1: 5 ' TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3' (indicado na SEQ ID N0:1)
Oligo 3: 5' '-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3' (indicado na SEQ ID N0:2)
Oligo 4: 5'-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3' (indicado na SEQ ID NO: 3)
Oligo 5: 5'-TCgTTgCCgTCgg-3' (indicado na SEQ ID N0:4)
Oligo 6: 5'-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3' (indicado na SEQ ID NO: 5)
Oligo 7: 5'-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3' (indicado na SEQ ID NO: 6)
Oligo 8: 5'-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3' (indicado na SEQ ID NO:)
Oligo 9: 5'-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3' (indicado na SEQ ID NO: 9)
Oligo 10: 5' -TCggggACgATCgTCgggggg-3' (indicado na SEQ ID NO: 9)
Para analisar as funções dos Oligos acima, doisoligonucleotideos de controle de 2006 com a seqüência de5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' e 2216 com a seqüência de5'-gggggacgatcgtcgggggg-3' foram também sintetizados.
Todos os oligonucleotideos foram sintetizados emSangon Biotech Company (Xangai, China), testados em relaçãoa endotoxina utilizando o ensaio de lisado amebócitoLimulus (Associates of Cape Cod., Inc.) e manipulados emreagentes isentos de pirogênio. 2006 (J Immunol 2000: 164:1617) é um oligonucleotídeo bem estudado que ativaintensamente as células B normais. 2216 (Eur J. Immunol.2001; 31:2154) é outro oligonucleotídeo bem estudado queinduz quantidades elevadas de interferon do tipo I emcélulas dendríticas plasmacitóides.
Os métodos para sintetizar o oligonucleotídeo sãobem conhecidos por aqueles versados na técnica e entreoutros, a síntese de fase sólida é genericamente utilizada.Especificamente, no processo da síntese, o suporte sólidoutilizado é microesfera de vidro com poro controlado (CPG).Essa microesfera tem uma superfície com furos e canais e énesses que o nucleotídeo protegido é fixado. A síntese deoligonucleotídeos começa com o nucleotídeo mais-3' eprossegue através de uma série de ciclos compostos de cincoetapas que são repetidas até que o nucleotídeo mais-5' sejafixado. Essas etapas são desproteção, ativação,acoplamento, cobertura e estabilização.
Etapa 1. Desproteção
O grupo de proteção no núcleoside protegido fixadoem uma microesfera CPG (vidro com poro controlado) éremovido por ácido tricloroacético (TCA) deixando um grupode hidroxila-5' reativo.
Etapa 2. Ativação
Nessa etapa, tetrazol ataca o nucleosídeo defosforamidita de acoplamento formando um intermediário defosforamidita de tetrazolila.
Etapa 3. Acoplamento
O intermediário de fosforamidita de tetrazolilareage com o grupo de hidroxila do receptor e a ligação 5' a3' é formada. O tetrazol é reconstituído e o processocontinua.
Etapa 4. Cobertura
Nessa etapa, um reagente de acetilação composto deanidrido acético e N-metil imidazol é utilizado parabloquear o grupo de hidroxila reativo em sua extremidademais 5' do oligonucleotídeo para evitar falha deacoplamento.
Etapa 5. Estabilização
Após realização da etapa de cobertura, a últimaetapa no ciclo é oxidação que estabiliza a ligação defosfato entre a cadeia de oligonucleotídeo em crescimento ea base mais recentemente adicionada. Essa etapa érealizada na presença de Iodo como um oxidante bando emtetraidrofurano (THF) e água.
Após a etapa final o ciclo é repetido para cadanucleotídeo na seqüência. Após o término da síntese, amolécula de DNA de fita única é purificada por métodos comoHAP, PAGE, HPLC, Cl8 e OPC.
Exemplo 2. Apoptose de células B-CLL humanasinduzidas pelos oligonucleotídeos
1. Preparação de células B-CLL humanas
Amostras de sangue a partir de pacientes B-CLL(patologicamente identificados) não tratados (The FirstHospital, Jilin University, China) foram tiradas apósobtenção de consentimento por escrito aprovado. Célulasmononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladaspor centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Paque(Pharmacia). CD5+CD19+CD23+ células B-CLL em PBMCs forampurificadas utilizando o kit de isolamento de célula B(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para >95% deCD5+CD19+CD23+células(células B-CLL). A preparação dascélulas foi executada sob a orientação de Miltenyi Biotec.
2. Apoptose de células B-CLL humanas induzida pelosoligonucleotideos
As células B-CLL foram incubadas com Oligol, 01igo3,01igo4, 01igo5, 01igo6, 01igo7, 01igo8, 01igo9, OligolO,2006 ou 2216 respectivamente em uma concentração final de 3ug/ml em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone)em IO6 células/cavidade em uma placa com 4 8 cavidades. Osoligonucleotideos foram diluídos em meio RPMI 1640 isentode soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI164 0 isento de soro (HyClone)) foi utilizado como controle(Meio).
No dia 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coloridas com tetrametil-rodamina etil éster(TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outros TheJournal of Biological Chemistry vol. 279, no. 23, edição de4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) por 10 minutos. Ascélulas B-CLL positivas TMRE (viáveis) e negativas-TMRE(apoptóticas) foram determinadas por citometria de fluxo(B.D. FACS Aria). O número de células B-CLL viáveis foicalculado multiplicando-se a contagem total de células coma percentagem de células positivas-TMRE em cada ponto detempo. O experimento foi repetido com dez amostras desangue a partir de pacientes B-CLL e o resultado em média(n=10) mostrou que os oligonucleotideos induziramsignificativamente a apoptose das células B-CLL (Tabela 1).
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Tabela 1. Apoptose de células B-CLL induzidas pelosoligonucleotídeos
Exemplo 3. Regulação ascendente de CD40 em célulasB-CLL humanas pelos oligonucleotídeos
5 1. Preparação de células B-CLL humanas
Células B-CLL humanas foram isoladas de pacientes B-CLL com os procedimentos como descrito no exemplo 2.
2. Regulação ascendente de CD40 em células B-CLLhumanas pelos oligonucleotídeos
As células B-CLL foram incubadas com Oligol, Oligo3,Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, OligolO,2006 ou 2216 respectivamente em uma concentração final de 3ug/ml em meio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) aIO6 células/cavidade em uma placa com 48 cavidades. Osoligonucleotídeos foram diluídos em meio RPMI 1640 isentode soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI1640 isento de soro (HyClone)) foi utilizado como controle(Meio).
No 7° dia após incubação, as células foram contadase coloridas com anticorpo FITC-CD40 (Becton Dickinson)(Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outros The Journalof Biological Chemistry vol. 279, no. 23, edição de 4 dejunho, pág. 24152-24162, 2004) por 10 minutos. As célulasB-CLL coloridas com anticorpo CD40 foram determinadas porcitometria de fluxo (B.D. FACS Aria) . O resultado (figura1) mostrou que os oligonucleotídeos regulam de formaascendente significativamente a expressão de CD4 0 emcélulas B-CLL, indicando que os oligonucleotídeos podem serutilizados para tratar B-CLL através da regulaçãoascendente de CD4 0 nas células. A regulação ascendente deCD4 0 promove a apoptose das células B-CLL, induz a inibiçãode crescimento de células B-CLL e torna as células B-CLLmais imunogênicas para estimular a geração de CTLsespecíficas às células B-CLL. O experimento foi repetidocom pelo menos dez amostras de sangue a partir de pacientescom B-CLL com resultados similares.
Exemplo 4. A apoptose de células de linfomalinfocítico pequeno humano induzida pelos oligonucleotídeos
1. Preparação de células de linfoma linfocíticopequeno humano
As células de linfoma linfocítico pequeno foramisoladas do tecido de biópsia de linfonodos de pacientes(The First Hospital, Jilin University, China) com linfomalinfocítico pequeno (patologicamente identificados) apósobtenção de consentimento por escrito aprovado. O tecidode biópsia foi triturado por lâminas de vidro de superfícieáspera para liberar as células em 5 ml de meio RPMI 1640 desoro AB humano (HyClone) em uma placa de cultura de 6 cm.As células liberadas foram filtradas através de malha deaço inoxidável e coletadas em um tubo cônico de 50 mlcontendo 15 ml de meio RPMI 164 0 isento de soro. O tubofoi centrifugado a 3 00 x g por 10 minutos e então osobrenadante foi descartado. CD5+CD19+CD23+ Células delinfoma linfocítico pequeno foram purificadas utilizando okit de isolamento de célula B (Miltenyi Biotec, BergischGladbach, Alemanha) para >95% de CD5+CD19+CD23+células(células de linfoma linfocítico pequeno). A preparação dascélulas foi executada sob a orientação de Miltenyi Biotec.
2. Apoptose de células de linfoma linfocíticopequeno induzida pelos oligonucleotídeos
As células de linfoma linfocítico pequeno foramincubadas com Oligol, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6,Oligo7, Oligo8, Oligo9, OligolO, 2006 ou 2216respectivamente em uma concentração final de 3 \x g/ml emmeio RPMI 164 0 de soro AB humano a 10% (HyClone) em IO6células/cavidade em uma placa com 48 cavidades. Osoligonucleotídeos foram diluídos em meio RPMI 1640 isentode soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI1640 isento de soro (HyClone)) foi utilizado como controle(Meio).
No dia 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coloridas com tetrametil-rodamina etil éster(TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outros TheJournal of Biological Chemistry vol. 279, no. 23, edição de4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) por 10 minutos. Ascélulas de linfoma linfocítico pequeno positivas TMRE(viáveis) e negativas-TMRE (apoptóticas) foram determinadaspor citometria de fluxo (B.D. FACS Aria) . O número decélulas de linfoma linfocítico pequeno viáveis foicalculado multiplicando-se a contagem total de células coma percentagem de células positivas-TMRE em cada ponto detempo. O experimento foi repetido com cinco amostras desangue a partir de pacientes com linfoma linfocíticopequeno e o resultado em média (n=5) mostrou que osoligonucleotídeos induziram significativamente a apoptosedas células de linfoma linfocítico pequeno (Tabela 2) ,indicando que os oligonucleotídeos podem ser utilizadospara tratar linfoma linfocítico pequeno pela indução daapoptose das células.
Células com linfoma linfocítico pequeno viáveis (%) (n=5) <table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 2. Apoptose de células de linfoma linfocíticopequeno induzidas pelos oligonucleotídeos
Exemplo 5. Regulação ascendente de CD4 0 em célulasde linfoma linfocítico pequeno induzida pelosoligonucleotídeos
1. Preparação de células de linfoma linfocíticapequeno humanas
Células de linfoma linfocítico pequeno humanas foramisoladas de pacientes com os procedimentos como descrito noexemplo 4.
2. Regulação ascendente de CD4 0 em células delinfoma linfocítico pequeno induzida pelosoligonucleotídeos
As células de linfoma linfocítico pequeno foramincubadas com Oligol, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6,Oligo7, Oligo8, Oligo9, OligolO, 2006 ou 2216respectivamente em uma concentração final de 3 [xg/ml emmeio RPMI 1640 de soro AB humano a 10% (HyClone) a IO6células/cavidade em uma placa com 48 cavidades. Osoligonucleotídeos foram diluídos em meio RPMI 164 0 isentode soro (HyClone) . Um volume igual do diluído (meio RPMI1640 isento de soro (HyClone)) foi utilizado como controle(Meio).
No 7o dia após incubação, as células foram contadase coloridas com anticorpo FITC-CD40 (Becton Dickinson)(Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outros The Journalof Biological Chemistry vol. 279, no. 23, edição de 4 dejunho, pág. 24152-24162, 2004) por 10 minutos. As célulasde linfoma linfocítico pequeno coloridas com anticorpoCD4 0 foram determinadas por citometria de fluxo (B.D. FACSAria) . O resultado (figura 2) mostrou que osoligonucleotídeos regulam de forma ascendentesignificativamente a expressão de CD40 em células delinfoma linfocltico pequeno, indicando que osoligonucleotídeos podem ser utilizados para tratar linfomalinfocltico pequeno através da regulação ascendente de CD4 0nas células. A regulação ascendente de CD40 promove aapoptose das células de linfoma linfocltico pequeno, induza inibição de crescimento de células de linfoma linfoclticopequeno e torna as células de linfoma linfocltico pequenomais imunogênicas para estimular a geração de CTLsespecíficas às células de linfoma linfocltico pequeno. 0experimento foi repetido com cinco amostras com resultadossimilares.
Exemplo 6. Apoptose de células B-ALL humanasinduzidas pelos oligonucleotídeos
1. Preparação de células B-ALL humanas
Amostras de sangue a partir de pacientes B-ALL(patologicamente identificados) não tratados (The FirstHospital, Jilin University, China) foram tiradas apósobtenção de consentimento por escrito aprovado. PBMCsforam isoladas por centrifugação de gradiente de densidadeFicoll-Paque (Pharmacia). CD19+CD10+ células B-ALL em PBMCsforam purificadas utilizando o kit de isolamento de célulaB (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para >95%de CD19+CD10+células (células B-ALL) . A preparação dascélulas foi executada sob a orientação de Miltenyi Biotec.
2. Apoptose de células B-ALL induzida pelosoligonucleotídeos
As células B-ALL foram incubadas com Oligol, Oligo3,Oligoé, 01igo5, Oligo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9, OligolO,2006 ou 2216 respectivamente em uma concentração final dex g/ml em meio RPMI 164 0 de soro AB humano a 10%(HyClone) em 10s células/cavidade em uma placa com 48cavidades. Os oligonucleotídeos foram diluídos em meioRPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual dodiluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) ) foiutilizado como controle (Meio).
No dia 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coloridas com tetrametil-rodamina etil éster(TMRE) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outros TheJournal of Biological Chemistry vol. 279, no. 23, edição de4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) por 10 minutos. Ascélulas B-ALL positivas TMRE (viáveis) e negativas-TMRE(apoptóticas) foram determinadas por citometria de fluxo(B.D. FACS Aria). O número de células B-ALL viáveis foicalculado multiplicando-se a contagem total de células coma percentagem de células positivas-TMRE em cada ponto detempo. 0 experimento foi repetido com dez amostras desangue a partir de pacientes B-ALL e o resultado em média(n=10) mostrou que os oligonucleotídeos induziramsignificativamente a apoptose das células B-ALL (Tabela 3),demonstrando que os oligonucleotídeos podem ser utilizadospara tratar B-ALL pela indução da apoptose das células B-ALL.
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Tabela 3. Apoptose de células B-ALL induzidas pelosoligonucleotídeos
Exemplo 7. Regulação ascendente de CD4 0 em célulasB-ALL pelos oligonucleotídeos
1. Preparação de células B-ALL humanas
Células B-ALL humanas foram preparadas a partir dasamostras de sangue de pacientes com os procedimentos comodescrito no exemplo 6.
As células B-ALL foram incubadas com ou sem Oligol,Oligo3, Oligo4, Oligo5, 01igo6, Oligo7, Oligo8, Oligo9,OligolO, 2006 ou 2216 respectivamente em uma concentraçãofinal de 3 n g/ml em meio RPMI 164 0 de soro AB humano a 10%(HyClone) em IO6 células/cavidade em uma placa com 48cavidades. Os oligonucleotídeos foram diluídos em meioRPMI 164 0 isento de soro (HyClone) . Um volume igual dodiluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) ) foiutilizado como controle (Meio).
No dia 3, 5 e 7 após incubação, as células foramcontadas e coloridas com FITC-CD4 0 anticorpo (BectonDickinson) (Molecular Probes Inc.) (Lena Thyrell, e outrosThe Journal of Biological Chemistry vol. 279, no. 23,edição de 4 de junho, pág. 24152-24162, 2004) por 10minutos. As células de linfoma linfocítico pequenocoloridas com anticorpo CD4 0 foram determinadas porcitometria de fluxo (B.D. FACS Aria). O experimento foirepetido com dez amostras e o resultado médio (Tabela 4)mostrou que os oligonucleotídeos regulam ascendentemente deforma significativa a expressão de CD40 em células B-ALL,indicando que os oligonucleotídeos podem ser utilizadospara tratar B-ALL pela regulação ascendente de CD4 0 nascélulas. A regulação ascendente de CD4 0 promove a apoptosede células B-ALL, induz a inibição de crescimento dascélulas B-ALL e torna as células B-ALL mais imunogênicaspara estimular a geração de CTLs específicas para ascélulas B-ALL.
Expressão de CD4 0 em células com leucemia linfocítica aguda de célula-B (MFI) (n=10)
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Tabela 4. Regulação ascendente de CD4 0 em célulasB-ALL pelos oligonucleotídeosExemplo 8. A produção de IL-10 a partir de B-CLLinduzido pelos oligonucleotídeos
1. Preparação de células B-CLL humanas
Células B-CLL humanas foram isoladas de pacientes B-CLL com os procedimentos como descrito no exemplo 2.
2. A produção de IL-10 a partir de B-CLL induzidopelos oligonucleotídeos
As células B-CLL foram cultivadas com ou seu oOligol, 0ligo3, 01igo4, 01igo5, 0ligo6, 01igo7, 01igo8,10 Oligo9, OligolO respectivamente em uma concentração finalde 3 |_i g/ml em meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) aIO6 células/cavidade em uma placa com 4 8 cavidades emtriplicatas. Os oligonucleotídeos foram diluídos em meioRPMI 1640 isento de soro (HyClone) . Um volume igual dodiluído (meio RPMI 1640 isento de soro (HyClone) ) foiutilizado como controle (Meio).
Os sobrenadantes de cultura foram coletados em 24 hou pontos de tempo indicados e avaliados em relação a IL-10em sistema Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems).
Nossos dados mostraram que o desencadeamento com osoligonucleotídeos levou à produção de um alto nível de IL-a partir das células B-CLL (Tabela 5) . Além disso,nossos dados mostram ainda que a adição de rh-IL-10 exógeno(Schering Corp.) em culturas de células B-CLL induziucélulas B-CLL apoptóticas em um modo dependente de dose deIL-10, que poderia ser especificamente bloqueado poranticorpo anti-IL-10 (R&D Systems). Essas descobertasdemonstram que os oligonucleotídeos podem ser utilizadospara tratar B-CLL pela indução da produção de IL-10 que provoca a apoptose de células B-CLL em um modo autócrino.O experimento foi repetido com pelo menos dez amostras apartir de pacientes com B-CLL com resultados similares.
Produção de IL-10 por células de B-CLL <table>table see original document page 31</column></row><table>
Tabela 5. Produção de interleucina-10 a partir decélulas de B-CLL induzidas pelos oligonucleotídeos
Exemplo 9. O efeito dos oligonucleotídeos sobre aproliferação de PBMC humano normal
PBMCs humanos foram isolados de camadasleucocitárias de doadores de sangue normais (The BloodCenter of Jilin Province, China) por centrifugação degradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Pharmacia) . Aviabilidade dos PBMCs foi de 95-99% como determinado porexclusão de tripano azul.
Os PBMCs (6xl05/cavidade) foram revestidos em placascom fundo em U de 96 cavidades (Costar) e cultivados com ousem o Oligol, Oligo3, Oligo4, Oligo5, Oligo6, Oligo7,Oligo8, Oligo9, OligolO, 2006 ou 2216 respectivamente emuma concentração final de 6 j^g/ml em triplicatas por 36 h. ,seguido por pulsação com [3H] timidina (New EnglandNuclear, Boston, MA) por 16 h. As células foram colhidasem filtros de fibra de vidro e detectadas em um contador decintilação. A proliferação de células foi expressa comocom (contagens por minuto) (a partir de cavidadestripleto). Os dados a partir de cinco amostras normais desangue são mostrados. 2006 e 2216 foram utilizados noscontroles. Os resultados mostraram que osoligonucleotídeos poderiam estimular os PBMCs aproliferarem obviamente (figura 3), indicando que osoligonucleotídeos, em vez de induzirem a apoptose, sãoestimuladores de proliferação para PBMCs humanos normais enão são tóxicos para as células cultivadas.
Tendo descrito a invenção em detalhe e mediantereferência às modalidades preferidas será evidente paraaqueles versados na técnica que modificações e variaçõessão possíveis sem se afastar do escopo da invenção comodefinido nas reivindicações apensas a seguir.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<H0> Changchun Huapu Bioteehnolegy Co., Ltd
<120> OLIGONUCLEOTÍDEO OU SEU HOMÓLOGO FUNCIONAL, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MESMO EMÉTODO PARA TRATAMENTO DE NEOPLASMA DE CÉLULAS B
<130> IP060011
<160> 11
<i?0> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> DfiA
<213> Seqüência Artificial
<40U> 1
togacgttcg lícéttcgtcg ttc 23
<210> 2
<21I> 30
<212> WA
<213> Seqüência Artificial
<400> 2
tcggcacgcg acgtgctggc cgtcírtttcc 30
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcgtcgtcgt cgttgtcgtt ggge 24
<2T0> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Seqüência ArtificialtCgtfcgGCgt Cgg
<210> 5<2U> 26<2l2> DfvA
<213> Seqüência Artificial
<400> 5
tegtcgggtg çgacgtcgca gggggg
<2I0> 6<21i> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<4O0> 6
tcgtegggtg cgatcgeagg gggg
<210> 7<211> 26
<m> ma
< 213 > Seqüência Artificial
<400> 7
tegtcgggtg catcgatgca gggggg
<2W> 8<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<4QQ> 8
tcgtcigggtg cgacgtcgca
<210> 9<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<4C0> 9
tcgggffaega tcgtcggggg g<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<400> 10
tcgtcgtttt etcgttttgt cgtt
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<400> 11

Claims (21)

1. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender: (1) um oligonucleotídeo tendo a seqüência deSEQ ID NO: 1 e (2) agente de neoplasia anti-célula B.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato do agente de neoplasia anti-célulaB ser quimioterápicos, imunoterápicos ou agentes utilizadosem radioterapia.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos quimioterápicos seremselecionados do grupo que consiste em: fludarabina,pentostatina, vincristina, ciclofosfamida e prednisona.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos quimioterápicos seremselecionados do grupo que consiste em: CVP (ciclofosfamida,vincristina e prednisona), e CHOP (ciclofosfamida,doxorubicina, vincristina e prednisona) .
5. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato do imunoterápicos ser um anticorpoanti-CD2 0.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato da radioterapia ser radiaçãoexterna ou um tratamento de anticorpo radiorrotulado.
7. Uso de uma composição farmacêutica compreendendoum oligonucleotídeo tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1,caracterizado por ser fabricação de um medicamento paratratar neoplasia de células B em um sujeito mamíferonecessitando de tratamento.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por compreender induzir apoptose de célulasneoplásicas de célula B.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por compreender regular ascendentemente CD4 0em células neoplásicas de célula B.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por compreender estimular células neoplásicasde célula B para produzir 11-10.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato da neoplasia de célula B serleucemia de célula B, linfoma de célula B ou mieloma.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato da leucemia de célula B serleucemia linfocitica crônica de célula B ou leucemialinfocítica aguda de célula B.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato do linfoma de célula B ser linfomalinfocítico pequeno.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato do sujeito mamífero ser um sujeitohumano.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato da composição farmacêutica seradministrada por via enteral, parenteral ou tópica ou porinalação.
16. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1caracterizado por ser para fabricação de um medicamentopara de induzir apoptose de células neoplásicas de célula B.
17. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1caracterizado por ser para fabricação de um medicamentopara aumentar a expressão de CD4 0 em células neoplásicas decélula B.
18. Uso de uma composição compreendendo umoligonucleotídeo tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1caracterizado por ser para fabricação de um medicamentopara induzir células neoplásicas de célula B a produziremIL-10.
19. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato dascélulas neoplásicas de célula B serem células de leucemialinfocítica crônica de célula B (B-CLL).
20. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17,caracterizado pelo fato das células neoplásicas de célula Bserem células de leucemia linfocítica aguda de célula B (B-ALL) .
21. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17,caracterizado pelo fato das células neoplásicas de célula Bserem células de linfoma linfocítico pequeno.
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