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Krebs ist eine Krankheit, die auf
mehreren genetischen Veränderungen
der Zellen beruht. Im Laufe der Karzinogenese verlieren die Zellen
die Kontrolle über
die check-points des Zellzyklus, sowie die unabhängigen Mechanismen, die ungehindertes
Wachstum unterbinden sollten, wie beispielsweise die Apoptose. Derartige genetische
Fehler führen
zu einer erhöhten Überlebensfähigkeit
der Klone, Beschleunigung der Proliferation und weiterer genetischer
Instabilität
der Zellen.
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Therapien gegen Krebs umfassen klassischerweise
neben der chirurgischen Entfernung der Tumoren die Strahlen- und
die Chemotherapie. Während
die chirurgische Entfernung und die Strahlentherapie nur bei genau
lokalisierten Erkrankungen in Frage kommen, lassen sich mit der
Chemotherapie ev. auch metastasierende Krebsarten behandeln. Chemotherapien
sind aber im Allgemeinen keine sehr spezifischen Behandlungsformen,
was einerseits zu starken bis kaum zu tolerierenden Nebenwirkungen
führt und
andererseits zu einer nur begrenzten Wirksamkeit.
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Neuere Therapieformen umfassen die
Behandlung mit antisense-Oligonukleotiden,
die direkt und spezifisch in die molekulare Regulation der Zellen
eingreifen und derart den genetischen Veränderungen der Zellen, die der
Krankheit zu Grunde liegen, entgegenwirken können.
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Ein antisense-Oligonukleotid (asO)
ist eine kurzkettige synthetische Nukleinsäure mit einer definierten Basensequenz,
wobei die genaue Abfolge der Basen frei wählbar ist. Antisense-Oligonukleotide
binden über komplementäre Basenpaarung
an die entsprechende sense-Sequenz der mRNA des Zielproteins, dessen
Expression negativ beeinflußt
werden soll. Die Hemmung der Genexpression durch asOe kann auf mindestens vier
Arten erfolgen: Die gebildeten mRNA-DNA Hybride werden durch RNase
H zerschnitten, die Polyadenylierung oder der Transport der fertigen
mRNA ins Zytoplasma können
durch asOe gehemmt werden, die Initiation der mRNA-Translation kann
beispielsweise durch Interferenz mit dem Aufbau des ribosomalen
Komplexes gehemmt werden und schließlich kann die Proteinelongation
durch das gebundene asO sterisch unterbunden werden.
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Um aber ihre Wirkung entfalten zu
können,
müssen
die asOe zum einen stabil genug sein, um einem zu frühen Abbau
im Organismus zu widerstehen und andererseits müssen sie ihren Wirkungsort
innerhalb der Zelle, bzw. innerhalb des Zellkerns überhaupt
erreichen können.
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Chemische Modifikationen der asOe
stellen eine Möglichkeit
dar, eine ausreichende Stabilität
dieser Moleküle
gegenüber
im Organismus allgegenwärtigen
Exo- und Endonukleasen zu gewährleisten.
Die wichtigsten dieser Modifikationen sind Phosphorothioat- und
Methylphosphonat-Modifikationen.
Dabei wird ein Sauerstoffatom im Phosphat durch ein Schwefelatom
oder durch eine Methylgruppe ersetzt.
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Die nur geringe spontane Aufnahme
der asOe durch die Zellen ist ein schwieriger zu lösendes Problem.
Allerdings kann beispielsweise durch Verwendung bestimmter Träger-Lipide
eine Verbesserung der Aufnahme und eine für die Wirkung der asOe günstigere
intrazelluläre
Pharmakokinetik und Verteilung erreicht werden.
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Denkbare Ziele für eine asO-Krebstherapie umfassen
Gene für
die Zellproliferation, Differenzierung, Reparatur und Apoptose.
Beispielhaft seien Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren,
Zykline, zyklinabhängige
Kinasen und ihre Inhibitoren und zytosolische Serin/Threonin Kinasen
genannt.
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Spezifische Beispiele für Gene gegen
die sich eine bereits in klinischen Studien befindende asO Therapie
richtet, umfassen c-Raf-1 Kinase (ISIS 5132, ISIS/Novartis), Bcl-2(G3139,
Genta) und H-Ras (ISIS 2503, SIS).
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c-Raf-1 ist eine Serin/Threonin Kinase,
die eine wichtige Rolle beim Zellwachstum und Überleben der Zellen spielt.
Gokhale et al. (1999, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9, 191–201) berichten,
dass eine Behandlung von Tumoren mit asOen gegen c-Raf-1 zu einer
Inhibition des Tumor-Wachstums aber nicht zu einer Regression der
Tumoren führt.
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Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2
proto-oncogene) ist ein Gen dessen (krankhafte) Überexpression zu einem verhängnisvollen
Schutz der Zellen gegen Apoptose führt. Die therapeutische Hemmung
der Bildung von Bcl-2 durch asOe zielt daher auf eine Senkung der
Schwelle der Tumorzellen für
den programmierten Zelltod ab. Webb et al. (1997, Lancet 349, 1137–41) berichten
von einer Studie mit einem asO gegen Bcl-2 an einer Gruppe von 9
Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom.
Bei einem Patienten kam es zu einer kompletten Remission, bei einem
weiteren zeigte sich immerhin eine Verringerung des Tumorvolumens.
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Viele Chemotherapeutika wirken über eine
Induktion der Apoptose, daher erscheint eine Kombination von Chemotherapeutika
mit einer Hemmung der Bcl-2 Expression erfolgversprechend. Jansen
et al. (2000, Lancet 356, 1728–33)
berichten von einer Kombinationstherapie mit einem asO gegen Bcl-2
mit Decarbazin. 6 von 14 derart behandelten Patienten zeigten eine
antitumorale Antwort.
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Ein weiteres für die Zellzyklusregulation
wichtiges Gen stellt die Polo-like Kinase 1 (Plk1) dar. Es handelt
sich dabei um eine Serin/Threonin Protein Kinase die insbesondere
für den
geordneten Eintritt der Zelle in die Mitose wichtig ist. In über 90%
aller humaner Karzinome ist Plk1 überexprimiert, was mit erhöhter mitotischer
Aktivität
und einer schlechten Prognose einhergeht (Wolf et. al., 1997, Oncogene
14, 543–9;
Knecht et al., 1999, Cancer Res. 59, 2794–7). Beeinträchtigung
der Plk1 Funktion in Krebszellen führt zu abnormaler Mitose mit
anschließendem
mitotischem Zelltod (Lane and Nigg, 1995, J. Cell Biol. 2, 1701–13), daher
stellt Plk-1 ein potentiell interessantes Ziel für eine asO Krebstherapie dar.
Elez et al. (2000, Biochem. Biophys. Res. Comm. 269, 352–6 und
DE 100 11 530 A1 )
berichten von einer maßgeblichen
Verkleinerung von Tumoren in einem humanen Tumor Xenotransplantat
Mausmodell nach länger
andauernder Behaltung mit Plk1-asO. Vollständige Remission konnte aber
nicht erzielt werden.
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Wenn auch – wie ausgeführt – vielversprechende
Ansätze
für eine
antisense-Oligonukleotid
Krebstherapie vorhanden sind, verbleibt es zu lösende Aufgabe, eine Therapie
zu entwickeln, die in hohem Masse spezifisch und gleichzeitig vollständig zum
Absterben der Krebszellen führt
und dabei möglichst
wenig Nebenwirkungen hervorruft. Die Möglichkeit einer einfachen Verabreichung
und kosteneffizienter Produktion des Medikamentes wären ferner
vorteilhaft.
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Gelöst werden diese so wie weitere
nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend
diskutierten Zusammenhängen
ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch die Verwendung
eines antisense-Oligodesoxynukleotids
gegen Polo-like Kinase 1 (Plk1) in Kombination mit einem antisense-Oligodesoxynukleotid
gegen B-cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl-2) protooncogene zur Herstellung
eines Medikamentes für
die Krebstherapie. Die Kombinationstherapie mit anti-Plk1 und anti-Bcl-2
Oligonukleotiden erwies sich überrschenderweise
als in hohem Masse synergistisch. Die Proliferation von krebsartigen
Zellen wird durch die Kombination entsprechender asOe in höherem Maße inhibiert
als durch einzelne asOe gegen die Gene. Besonders ausgeprägt tritt
dieser Vorteil in-vivo zutage. Im humanen Xenotransplantat Mausmodell
kam es bei der Behandlung von MDA-MB-435 Tomorxenotransplantaten
im Gegensatz zur Therapie mit nur je einem asO bei der Kombinationstherapie
in allen Fällen
zur vollständigen
Regression der Tumoren. Im Falle von Detroit562 Xenotransplantaten
kam es in 80% der Fälle
zur vollständigen
Regression und im Falle von primären
Bauchkrebszellen kam es in 55% der Fälle zur vollständigen Regression
der Tumoren. Derartig hohe Regressionsraten konnten bisher nicht
erzielt werden. Die Konzentrationen der therapeutischen Oligonukleotide konnten
so niedrig gewählt
werden, dass keine meßbaren
Nebenwirkungen auftraten.
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Die entsprechenden antisense-Oligonukleotide
können
gleichzeitig verabreicht werden oder aber abwechselnd. Die entsprechenden
antisense-Oligonukleotide können
bei gleichzeitiger Verabreichung gemeinsam in einer pharmazeutischen
Formulierung vorliegen, oder aber getrennt formuliert sein.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die entsprechenden antisense-Oligonukleotide
zweimal wöchentlich
gemeinsam verabreicht. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die entsprechenden antisense-Oligonukleotide
jeweils einmal wöchentlich
abwechselnd verabreicht, d.h. zuerst das eine asO, wenige Tage später das
zweite, so dass zweimal wöchentlich
asOe verabreicht werden, aber jedes einzeln und daher einmal wöchentlich.
Bevorzugterweise werden die asOe in einer Menge von ungefähr 5 mg/kg
Körpergewicht
verabreicht, wobei klar ist, dass es dem Arzt obliegt, in jedem
spezifischen Falle abhängig
vom Patienten, der Erkrankung, bzw. der Krankengeschichte, die Dosis
und die Anzahl der Verabreichungen anzupassen.
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Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich
bei den antisense-Oligonukleotiden um kurzkettige Desoxyribonukleinsäuren mit
einer Länge
von 10–55
Basen, bevorzugt 12–40
und ganz besonders bevorzugt 15–30.
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Erfindungsgemäß bevorzugt sind die antisense-Oligodesoxynukleotide
gegen enzymatischen Abbau modifiziert. Als Modifikation kommen prinzipiell
die in Stand der Technik bekannten Substituenten, entweder einzeln
oder in Kombination in Frage. Geeignete Modifikationen stellen der
Einbau von Phosphotriester-, Phosphoramid-, Methylphosphonat-, Phosphorothioat
und Peptidnukleinsäurebindungen
in die Struktur der Oligonukleotide dar. Wegen seiner erhöhten Stabilität und der
Fähigkeit
RNase H Aktivität
auszulösen,
sind Phosphorothioatmodifizierte asOe besonders bevorzugt.
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Erfindungsgemäß bevorzugt sind die gegen
Plk1 gerichteten asOe gegen die humane Plk1 gerichtet. Das entsprechende
erfindungsgemäß bevorzugte
Gen findet sich unter der Genebank Acc. No.: NT_010604, von by 635298–646820.
Die entsprechende mRNA Sequenz findet sich unter der Genebank Acc.
No.: X73458. Erfindungsgemäß bevorzugt
sind die gegen Bcl-2 gerichteten asOe gegen humanes Bcl-2 gerichtet.
Das entsprechende erfindungsgemäß bevorzugte
Gen findet sich (komplementär)
unter der Genebank Acc. No.: NT_033907, by 4363332–4559938.
Die entsprechende mRNA Sequenz findet sich unter der Genebank Acc. No.:
M13994, sowie M14745, die Genebank Acc. No. der Splice-Variante α lautet NM_000633
und der Splice-Variante β lautet
NM_000657.
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Besonders bevorzugt sind als antisense-Oligodesoxynukleotide
gegen Plk1:
wobei
SEQ ID No.: 4 (JWG160) ganz besonders bevorzugt ist.
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Als antisense-Oligodesoxynukleotid
gegen Bcl-2 ist
bevorzugt.
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sBevorzugterweise kommt das erfindungsgemäße Medikament
für die
Therapie von Krebszellen, die Plk1, Bcl-2 oder beide Gene überexprimieren
zum Einsatz.
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Erfindungsgemäß bevorzugt wird die beschriebene
Therapie für
Hepatokarzinome eingesetzt. Gegen diese Art von Karzinomen gibt
es bisher keine wirksame Therapie. Die Kombinationstherapie mit
aOen gegen Plk1 und Bcl-2 erlaubt erstmalig eine erfolgreiche Therapie
dieses Krankheitsbildes.
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Weitere erfindungsgemäß bevorzugt
therapierbare Krebsarten umfassen das Mammakarzinom und das Pancreaskarzinom.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung
der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden
wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Medikamenten für die Krebstherapie,
wobei die Aufnahme der entsprechenden Medikamente durch Membranelektroporation
verbessert werden kann. Eine derartige erfindungsgemäße in-vivo
Elektroporation mit dem Ziel einer effizienten Aufnahme der asOe
in die (Krebs-)Zellen, umfasst eine lokale Verabreichung elektrischer
Pulse, welche transiente Transportporen in den Lipidanteilen der
Zellmembranen hervorrufen. Diese Therapieform ist auch als Elektrochemotherapie
(ECT) bekannt (Mir et al., 1991, C. R. Acad. Sci. III. 313, 613–8, Heller
et al., 1996, Cancer 77, 964–71,
Mir et al., 1998, Br. J. Cancer 77, 2336–42 und Heller et al., 1998,
Cancer 83, 148–57).
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Erfindungsgemäß bevorzugt werden hierzu zwei
parallele Stahlelektroden perkutan, auf gegenüberliegenden Seiten des Tumors
unter Verwendung von Kontaktpaste plaziert und dem Tumor werden
aufeinanderfolgende elektrische Pulse verabreicht. Bevorzugterweise
erfolgen die Pulse rechteckig. Weiterhin bevorzugt werden zwischen
einem und 10 aufeinanderfolgende Pulse von 200 bis 800 V/cm2 von jeweils 1 – 50 ms verabreicht, besonders
bevorzugt 3 bis 7 Pulse von 300 – 700 V/cm2 von
jeweils 5 – 25
ms, ganz besonders bevorzugt 4 bis 6 Pulse von 400 – 600 V/cm2 von jeweils 7,5 – 15 ms und am meisten bevorzugt
5 Pulse von 400 V/cm2 von jeweils 10 ms.
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Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugtes
Verfahren zur Erhöhung
der Aufnahme der therapeutischen asOe ist deren Verkapselung in
Liposomen, wie beispielsweise von Gokhale et al. (1997, Gene Ther. 12,
1289–99;
2001, Anticancer Res. 21, 3313–21
und 2002, Clin. Cancer Res. 11, 3611–21) offenbart.
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Die Verabreichung des erfindungesgemäßen Medikamentes
kann auch in Kombination mit weiteren asOen, bzw. bevorzugterweise
mit einem oder mehreren Chemotherapeutika erfolgen.
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Beschreibung der Abbildungen:
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Abb. 1: Antisense-Oligonukleotide
downregulieren die Plk1 Expression in A549 Zellen.
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(a) A549 Zellen wurden mittels Dotap
Lipofektion mit JWG160 (SEQ ID No.: 4), bzw. JWG370 (SEQ ID No.:
6) antisense Oligonukleotiden behandelt (jeweils 1 μM). Nach
48 h Inkubation wurde das Gesamtprotein extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse
untersucht. Control: nichtbehandelte Zellen. Dotap: nur Lipofektion.
JWG160-MM und JWG370-MM: entsprechende Mismatch-Oligonukleotide (SEQ ID No.: 20 und
SEQ ID No.: 21). Gleichmäßige Beladung
wurde durch Reybridisierung der Blots mit anti-β-Aktin IgG überprüft. (b) Dosisabhängige Inhibition
der Plk1 mRNA-Expression in A549 Zellen durch JWG160 Plk1-antisense-Oligonukleotide.
A549 Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an asOen
(0,5–2 μM) inkubiert.
Nach 24 h wurde die Gesamt RNA extrahiert und mittels Northern-Blot-Analyse
untersucht. Die Blots wurden mit einer radioaktiven Plk1 Sonde und
anschließend
mit GAPDH hybridisiert. (e) Dosis-abhängige Inhibition der PIk1 Proteinexpression
in A549 Zellen durch JWG160 Plk1-antisense-Oligonukleotide. A549
Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an asOen (0,5–2 μM) inkubiert.
Nach 48 h wurde das Gesamt-Protein extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse
untersucht. Die Blots wurden mit anti-Plk1-Antikörpern und anschließend mit
anti-β-Aktin
IgG hybridisiert.
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Abb. 2: Inhibition der
Proliferation durch anti-Plk1 (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2
(G3139; SEQ ID No.: 19) Ollgonukleotlde.
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Die Zellen wurden mit 1 μM asOen behandelt.
Nach 48 h wurde die Zellzahl durch direktes Auszählen ermittelt. (a) Western
Blot Analyse der Plk1 und Bcl-2 Expression in A549, MDA-MB-435,
Detroit562, primären Bauchkrebszellen
und humanen, nicht-trans-formierten, primären Fibroblasten. (b) Inhibition
der Proliferation von A549 Zellen nach der Behandlung mit JWG160
und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte +/– Standardabweichung.
(e) Inhibition der Proliferation von MDA-MB-435 Zellen nach der
Behandlung mit JWG160 und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte
+/– Standardabweichung.
(d) Unbeeinflußte
Proliferation von normalen humanen Hautfibroblasten nach der Behandlung
mit JWG160 und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte +/– Standardabweichung.
Control: unbehandelte A549, MDA-MB-435 oder normale humane Fibroblasten.
G3139: Bcl-2 antisense, JWG160: Plk1 antisense, G3139 & JWG160 Bcl-2
antisense und Plk1 antisense in Kombination, G3139-MM, JWG160-MM:
entsprechende Mismatchkontrollen (SEQ ID No.: 20 und SEQ ID No.:
22).
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Abb. 3: Fluoreszenz Mikrographien
von MDA-MB-435 Xenotransplantaten mit FITC markierten antisense-Oligonukleotiden.
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Verteilung der antisense-Oligonukleotide
nach systemischer Verabreichung (5 mg/kg) und lokaler Elektroporation.
Die FITC-konjugierten asOe wurden über die Schwanzvene verabreicht.
Die Tumoren wurden 24 h später
entnommen und mittels Fluoreszens-mikroskopie und photometrisch
untersucht. (a) nichtelektroporierte Kontrolle, (b) Elektroporation
(5 × 400
V/cm2 für
jeweils 10 ms), (e) Elektroporation (5 × 600 V/cm2 für jeweils
10 ms), (d) starke Vergrößerung von
(b).
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4:
Antitumorale Aktivität
von anti-Plk1 (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2 (G3139; SEQ
ID No.: 19) Oligonukleotiden in NMRI nackten Mäusen, die A549, MDA-MB-435,
Detroit562 und primäre
Bauchkrebs Tumoren aufweisen.
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Antisense Oligonukleotide (G3139
und JWG160) wurden zweimal wöchentlich
oder als aufeinanderfolgende Kombination jeweils in Dosen von 5
mg/kg mittels Bolus Injektion intravenös verabreicht. Fünf Minuten
nach Verabreichung der asOe wurden dem Tumor fünf Hochspannungspulse verabreicht
(400 V/cm2, in 10 ms Intervallen). Nach
vierwöchiger
Behandlung wurden die Mäuse
getötet,
die Tumoren präpariert
und die Tumormasse mit mit einer Präzisionswaage bestimmt. (a)
Inhibition des Tumorwachstums von A549 Tumoren durch Therapie mit
G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. (b) Inhibition des Tumorwachstums
von Detroit562 Tumoren durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen
und Elektroporation. (e) Inhibition des Tumorwachstums von MDA-MB-435
Tumoren durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation.
(d) Inhibition des Tumorwachstums von primären Bauchkrebs Xenotransplantaten
durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. Control:
unbehandelte Tiere, electro: nur Elektroporation, G3139: Bcl-2 antisense,
JWG160: Plk1 antisense, G3139 & JWG160
Bcl-2 antisense und Plk1 antisense in Kombination, G3139-MM, JWG160-MM:
entsprechende Mismatchkontrollen (SEQ ID No.: 11 und SEQ ID No.: 9),
electro: mit Elektroporation.
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Abb. 5: Elektroporationsunterstützte Behandlung
mit anti-Plk1 (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2 (G3139; SEQ
ID No.: 19) Oligonukleotiden inhibiert das MDA-MB-435 Tumorwachstum
in-vivo.
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JWG160: Antisense gegen Plk1 mit
Elektroporation (5 × 400
V/cm2 für
10 ms, zweimal wöchentlich während 4
Wochen). JWG160 & G3139:
Kombinationstherapie
mit asOen gegen Plk1 und Bcl-2 unter Verwendung des identischen
elektrischen Puls-Regimes. (a) Fotografie der entnommenen Tumoren
nach 4 wöchiger
elektroporationsunterstützter
Antisensetherapie. Control: unbehandelte Tiere. Electro: Elektroporation
ohne Anwendung von asOen. (b) Plk1 Proteinexpression in Tumoren
nach elektroporationsunterstützter
Antisensetherapie mit JWG160 (zweimal wöchentlich). Die Proteinextrakte
jeder einzelnen Spur wurden von unterschiedlichen Tumoren gewonnen
und mittels anti-Plk1 immunoblotting analysiert und mit anti-β-Aktin rehybridisiert.
(e) Bcl-2 Proteinexpression in Tumoren nach elektroporationsunterstützter Antisensetherapie
mit G3139 (zweimal wöchentlich).
Die Proteinextrakte jeder einzelnen Spur wurden von unterschiedlichen
Tumoren gewonnen und mittels anti-Bcl-2 immunoblotting analysiert
und mit anti-β-Aktin
rehybridisiert. (d) Plk1 und Bcl-2 Proteinexpression in Tumoren
nach vierwöchiger
elektroporationsunterstützter
antisense-Kombinationstherapie mit beiden asOen (wobei jedes einmal
wöchentlich
einzeln verabreicht wurde). Die Proteinextrakte jeder einzelnen
Spur wurden von unterschiedlichen Tumoren gewonnen und mittels anti-Plk1
und anti-Bcl-2 immunoblotting analysiert und mit anti-β-Aktin rehybridisiert.
Control: unbehandelte Xenotransplantate, electro: nur Elektroporation,
MM entsprechende Mismatch asOe.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen
der Erläuterung
der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken:
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Beispiel 1: Oligonukleotidsynthesen
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Die Herstellung der Oligonukleotide
erfolgte mit einem automatischen DNA-Synthesizer (Perseptive 8909; BioSpring
GmbH; Frankfurt) nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren.
Das Phosphorothiaot-Rückgrat
der Oligonukleotide war vollständig
modifiziert. Zur Entschützung
wurden die Oligonukleotide während
16 Stunden bei Raumtemperatur mit konzentriertem Ammoniak behandelt.
Anschließend
wurden die Oligonukleotide durch "reverse phase" Chromatographie gereinigt und lyophilisiert.
Das Lyophilisat wurde zweimal mit 1 M NaCl/Ethanol präzipitiert
und ein weiteres Mal lyophilisiert.
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Beispiel 2: RNA-Isolierung
und Northern-Blot Analyse
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Die Gesamt-RNA von kultivierten Zellen,
bzw. homogenisierten Tumoren wurde mittels RNeasyMinikit (Qiagen
AG, Hilten) isoliert. 20 μg
Gesamt-RNA wurden mittels Elektrophorese in einem denaturierenden
1 % Agarose/Formaldehyd-Gel aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran übertragen.
Hybridisierung erfolgte mit einem radioaktiven, mittels PCR gewonnenem
Plk1-Fragment als Sonde. Mit einem 380A DNA-Synthesizer von Applied
Biosystems wurden Primer hergestellt. Die radioaktive Markierung
der Sonde zur Hybridisierung der Northern Blots erfolgte nach einem
Standard-PCR-Verfahren unter Verwendung von 150 μCi α-32P
dCTP (6000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). Die radioaktive
Markierung der Antisense-Stränge
wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: Plk1 As: 5'-TGA TGT TGG CAC
CCT TTC AGC-3',
GAPDH: sense: 5'-CAC CCA
TGG CAA ATT CCA TG-3',
antisense: 5-'CAT
GGT TCA CAC CCA TGA CG-3'.
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Hybridisierung erfolgte in QuickHyb-Lösung (Stratagene,
La Jolla, CA, USA) während
1 Stunde bei 68°C.
Die Membranen wurden zweimal unter hochstringenten Bedingungen in
0,1 × SSC,
1 % SDS bei 65°C für 20 Minuten
gewaschen und über
Nacht autoradiographiert (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, NY). Sodann wurden
die Membranen von den Gensonden befreit und mit einer anderen radioaktiven
markierten Sonde (GPDH, s.o.) zur Kontrolle der Qualität und Einheitlichkeit
der mRNA-Beladung unter identischen Bedingungen rehybridisiert.
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Beispiel 3: Protein-Isolierung
und Western-Blot Analyse
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Für
die Western Blot-Analyse wurden die zellulären Proteine unter Verwendung
von 250 μl
RIPA-Puffer (1 × PBS,
1% Nonidet P-0, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS) pro T25 Zellkulturflasche
extrahiert. 20 μg
Protein wurden elektrophoretisch in einem 12% SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Blots wurden
mit anti-Plk1-, anti-Bcl-2-(Transduction
Laboratories, Lexington, KY) und anti-β-Aktin-Antikörpern (Sigma, St. Louis, MO,
USA) wurden Plk1 und Aktin inkubiert. Durch Einsatz von geeigneten
mit Meerrettich Peroxidase konjugierten sekundären IgG (Jackson Immuno Research)
und dem Chemolumineszenz-System (Amersham-Pharmacia Biotech) wurden
die Immunkomplexe sichtbar gemacht. Für eine re-Hybridisierung wurden
die Blots für
30 min bei 50°C
in Stripping-Puffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS und 100 mM β-Merkaptoethanol)
inkubiert, extensiv mit PBS gewaschen, geblockt und re-Hybridisiert.
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Beispiel 4: Behandlung
menschlicher (Krebs-)zelllinien mit antisense-Oligonukleotiden
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Die in Zellkultur verwendeten menschlichen
Krebszelllinien A549, Detroit562 und MDA-MB-435 wurden von der American
Type Culture Collection (ATCC) bzw. der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen erworben.
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2,5 × 10
5 Zellen
wurden in DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's
Medium) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS), Antibiotika
und 2 mM L-Glutamin suspendiert, in T25 Kulturflaschen ausgesät und bei
37°C in
5% CO
2/95% Luft Atmosphäre in einem angefeuchteten
Brutschrank inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen (mit einer Konfluenz
von 50–60%)
mit den jeweiligen, in sterilem entionisiertem Wasser für Zellkulturen
gelösten
Oligonukleotiden in Gegenwart des monokationischen Lipids N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl- ammoniummethylsulfat
(Dotap, Roche Diagnistics, Mannheim) in 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4 mit
NaOH) und OptiMem-Medium (Life Technologies, Rockville, MD, USA)
behandelt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das oligonukleotidhaltige
Medium durch normales Zellkultur-Medium (10% FCS) ersetzt und die
Zellen wurden für
weitere 24 oder 48 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit
("viability") der Zellen wurde
durch Anfärben
mit Trypanblau (0,1%) bestimmt, wobei die Anzahl der Trypanblau-negativen
Zellen durch Auszählen
in einer Zählkammer
ermittelt wurde. Transfizierte und nur mit Dotap behandelte Zellen
wiesen 24 h nach der Transfektion eine 95 bis 100%ige Lebensfähigkeit
auf. Mismatch
Oligonukleotide zur Kontrolle:
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Beispiel 5: Bestimmung
der Zytotoxizität,
bzw. des Einflusses von antisense-Oligonukleotiden auf die Zellproliferation
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Gegen die Zell-Proliferation gerichtete
Effekte wurden durch tägliche
Bestimmung der Zellzahl und der Lebensfähigkeit durch direktes Auszählen unter
Einsatz des Trypanblau-Verfahrens ermittelt.
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Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde täglich für 4 Tage
nach Behandlung mit dem jeweiligen antisense-Oligonukleotid ermittelt.
Die Zellen wurden in 0,1% Trypanblau suspendiert und ausgezählt. Zu
jedem Zeitpunkt wurde der Mittelwert aus drei Zählungen genommen und der Prozentsatz
der lebensfähigen
Zellen berechnet.
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Beispiel 6: Antisense-Oligonukleotid-Therapie
von humanen Xenotransplatat Tumoren in Mäusen
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Die Tierstudien erfolgten an Gruppen
mit 5–6
nackten, acht bis zehn Wochen alten Athymie-Mäusen (nu/nu) NMRI (Harlan Winkelmann,
Borchen). 2 × 106 A549-, Detroit562-, MDA-MB-435- sowie primäre Bauchkrebs-Zellen
wurden subkutan injiziert und vor Beginn der Antisense-Behandlung
einer Passage von mindestens drei aufeinanderfolgenden Transplantationen
unterworfen. Unter Betäubung
mit Urethan wurden Tumorfragmente von ca. 20 bis 25 mg subkutan
in die linke und rechte Seite des Tieres implantiert. Die antisense-Oligonukleotid-Behandlungen
begannen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von 60
bis 90 mm3 erreicht hatten (7 bis 14 Tage
nach der Transplantation). Antisense Oligonukleotide (G3139 und
JWG160) wurden zweimal wöchentlich
oder als aufeinanderfolgende Kombination jeweils in Dosen von 5
mg/kg mittels Bolus Injektion intravenös in die Schwanzvene verabreicht
(200 μl).
Fünf Minuten
nach Verabreichung der asOe wurden dem Tumor perkutan fünf Hochspannungspulse
verabreicht. Hierzu wurden perkutan zwei Stahlelektroden parallel
auf gegenüberliegenden
Seiten des Tumors unter Verwendung von Kontaktpaste plaziert und dem
Tumor 5 aufeinanderfolgende rechteckige Pulse von 400 V/cm2 von 10 ms Dauer verabreicht. Zwischen den
Pulsen lag jeweils ein Intervall von 1 s. Nach vierwöchiger Behandlung
wurden die Mäuse
getötet,
die Tumoren präpariert
und die Tumormasse mit einer Präzisionswaage
bestimmt.
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Die Tiere wurden durch allgemeine
klinische Untersuchungen, Bestimmung des Körpergewichtes und des Tumorwachstums überwacht.
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Zur Bestimmung von Plk1-, bzw. Bcl-2
Proteinexpression in Tumorxenotransplantaten wurde aus herausgeschnittenen
Tumoren das Gesamt-Protein isoliert und wie oben beschrieben mittels
Western-Blot-Analyse in Bezug auf Plk1 und Bcl-2 Protein untersucht.
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Beispiel 7: Fluoreszenz-mikroskopische
Untersuchung
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Studien an intravenös verabreichten
nichtmodifizierten (phosphodiester) Oligonukleotiden zeigten, dass
die Plasma Halbwertszeit dieser Verbindungen ungefähr 5 min
beträgt.
Eine Phosphorothioat Modifikation führt zu einer maßgeblichen
Verlängerung
der Plasma Halbwertszeit auf 30–60
min. Phosphorothioat Oligonukleotide binden an Serumalbumin und
alpha2 Makroglobulin und zeigen eine biphasische
Pharmakokinetik (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88, 7595–99).
Tierstudien der Oligonukleotid Bioverteilung zeigten, dass intravenös, subkutan
oder intraperitoneal verabreichte Oligonukleotide hauptsächlich in
der Leber, den Nieren oder anderen Organen des Reticuloendothelialen
Systems akkumulieren (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, 7595–99).
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Fluorescin-Isothiocyanat (FITC) markierte
Phosphorothioat Oligonukleotide wurden intravenös in nackte Mäuse injiziert.
Nach fünf
Minuten wurden die Tumoren elektropermeabilisiert wie in Beispiel
6 beschrieben. 24 h später
wurden die Tumoren präpariert
und bei –70°C tiefgefroren.
Fünf-Mikrometer-Schnitte wurden
Fluoreszenz-mikroskopisch untersucht.
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Beispiel 8: Immunhistochemische
Untersuchungen, Apoptose-Assay
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Mausgewebe und Tumoren aus NMRI nackten
Mäusen
wurden histologisch durch Hematoxylin und Eosin-Färbung untersucht.
Proliferierende Zellen wurden durch Anfärbung mit Ki67-Antikörpern (DAKO,
Hamburg) sichtbar gemacht und Blutgefäße wurden mit Antikörpern gegen
von Willebrand Faktor (vWF) angefärbt. Gefrorene Schnitte (5 μm) wurden
in Aceton fixiert (–20°C, 2 min).
Dann wurden die Gewebeschnitte in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)
gewaschen und mit dem polyklonalen Hasen anti-Maus Ki67 Antikörper (1:25) bzw.
dem Hasen anti-Maus
vWF Antikörper
(1:100) für
60 s bei 37°C
in feuchter Atmosphäre
inkubiert. Die Objektträger
wurden drei mal in TBS gewaschen und mit Meerrettich Peroxidase
markierten anti-Hase Antikörpern
inkubiert.
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Sichtbarmachung von programmiertem
Zelltod in gefrorenen Tumorschnitten wurde mittels "TdT-mediated dUTP
nick-end labelling assay for apoptosis" (TUNEL, Roche Diagnostics, Mannheim,
D) durchgeführt. SEQUENCE
LISTING
wobei SEQ ID No.: 4 (JWG160) ganz besonders bevorzugt ist.
