KR20210078798A - 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지며, DYRK1A 유전자와 그 하위 유전자인 타우의 단백질 발현 및 인산화를 효율적으로 억제할 수 있어 치매 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Dmentia Comprising Peptide Nucleic Acid Complex with Blood-Brain Barrier Permeability}
본 발명은 혈뇌장벽 투과능을 가지는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
치매(dementia)는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상이며, 이러한 치매의 원인 질환들로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병(Huntington's disease), 크루츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease), 픽스씨 병(Pick's disease) 등이 알려져 있다.
이들 원인 질환들 중 가장 높은 발병 비율을 차지하는 것은 알츠하이머병으로 전체 치매 환자의 50~70%를 차지한다. 알츠하이머병은 원인에 따라 산발성(sporadic type)과 가족성(familial type)으로 구별되며, 환자의 80-90%는 원인을 알 수 없는 산발성으로 대부분 65세 이후에 발병하는 것으로 알려져 있다(Selkoe, 2001 Physiol Rev 81:741-66) 가족성은 전체의 20% 미만을 차지하며, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein; 이하 APP), 프리세닐린(presenilin; PS) 1형 및 2형 등 유전자의 변이가 주원인으로 발병되며 65세 이하에서도 일어난다. 알츠하이머병은 노인반(senile plaque) 및 신경원 섬유 농축체(neurofibrillary tangle)가 각각 신경세포 외부 및 내부에 축적되는 병리학적 특징을 보인다. 노인반은 구형으로 일반적으로 변연계(limbic system)나 신피질(neocortex)에서 주로 발견되며 베타 아밀로이드(β-amyloid; 이하 Aβ)라는 펩티드가 서로 결합 및 침착하여 핵을 형성하고 주위에는 퇴화된 신경섬유 축색돌기(axon), 수지상 결정(dendrites), 활성화된 아교세포(microglia)와 성상세포(astrocyte)들이 모여 있는 형태이다. 신경원 섬유 농축체는 타우(tau)라는 단백질이 비정상적으로 많이 인산화 된 후 서로 결합하여 형성된 신경세포 내의 물질로 알츠하이머병 치매 환자의 여러 뇌조직에서 다수 관찰된다. 타우단백질은 미세소관 결합 단백질의 한 종류로 엑손 수송을 조절하고 미세소관을 안정화 시킨다. 그러나 알츠하이머병 모델에서 타우단백질은 비정상적으로 과인산화가 증가하게 되고 과인산화 된 타우단백질은 PHFs(Paired helical filaments)의 형태로 응집하게 된다. 그 결과 타우단백질이 미세소관 결합 단백질로서의 기능을 상실하게 되어 알츠하이머 병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
현재 시판 중인 약물들은 기억과 관련된 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 농도를 일정하게 유지시켜 기억개선 및 단기적인 완화 효과를 보이게 하는 아세틸콜린 분해효소(acetylcholine esterase) 활성 저해제인 코그넥스(tacrine), 아리셉트(donepezyl), 엑셀론(rivastigmin), 레미닐(galantamine) 등과 Ca2+에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 NMDA 수용체 길항체인 메만틴(ebixa) 등이 있다. 여기에 니세로골린, 엘카르니틴, 은행잎 추출물 등의 혈액 순환 개선제도 간접적으로 혈관성 치매에 효과가 있다고 확인되어 사용되고 있다.
기존의 치매 치료제는 주로 콜린 작용성 약물이기 때문에 다른 콜린 작용성 약물과 병용투여가 불가하고, 항콜린성 약물의 효과를 무력화시키는 문제가 있으며, 심혈관계에 작용하여 심박률에 미주신경항진 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 중증의 천식이나 폐쇄성 폐질환의 병력이 있는 환자에게는 주의하여 사용해야 하는 단점이 있다. 또한, 뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 이러한 혈뇌장벽의 투과 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았으며, 중추 신경계에 장애가 발생해도 약물을 중추 신경계의 목적으로 하는 영역에 도달시킬 수 없는 현실이며, 효과적인 치료 방법들은 아직 개발되지 않았다.
이러한 이유로 기존 치료제와는 다른 방법으로서 치매를 효과적으로 치료, 예방할 수 있으면서도 독성이 낮은 약물을 찾는 것이 치매의 극복을 위해 무엇보다 중요한 실정이다.
한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입 또는 혈뇌장벽 투과를 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다.
따라서, 최근 약물의 보다 안전하고 효과적인 이용을 도모하기 위해, 약물에 적합한 제형뿐만 아니라 약물의 표적이 되는 생체 부위에 효율적으로 약물을 전달(drug delivery)하는 방법이 주목받고 있다. 특히, 약물을 필요한 때에, 필요한 양만큼, 필요한 장소로 효율적으로 운반하는 수송 시스템인 약물 전달 시스템(DDS; Drug Delivery System)의 실용화가 요구되고 있다. 현재 혈뇌장벽을 통과하여 약물 등을 전달해 줄 수 있는 전달체(carrier)에 대한 개발 역시 활발하게 진행 중이다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다 (PCT/KR2017/008636). 또한, 본 발명자들은 상기 구조체의 기능에 대한 연구를 지속적으로 수행하여, 우수한 효율로 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 능력을 가지는 새로운 구조체를 개발하게 되었다 (KR 10-2019-0128465).
이에, 본 발명자들은 혈뇌장벽 투과능이 우수한 핵산 복합체를 치매의 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, DYRK1A를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 치매 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 혈뇌장벽 투과능을 가지는 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지며, DYRK1A 유전자와 그 하위 유전자인 타우의 단백질 발현 및 인산화를 효율적으로 억제할 수 있어,치매 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1a는 표적 유전자 삽입 클로닝 벡터 제작에 사용된 pcDNA3.1 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 1b는 DYRK1A 유전자로 형질전환된 인간 배아 신장 세포(HEK293FT)에서 DYRK1A의 과발현을 확인한 것이다.
도 2는 DYRK1A 형질주입 세포 모델에서 펩티드 핵산 복합체에 의한 표적 유전자인 DYRK1A의 발현율 변화를 측정한 것이다.
도 3은 DYRK1A 형질주입 세포 모델에서 펩티드 핵산 복합체에 의한 표적 유전자인 DYRK1A 단백질의 발현 및 하위 경로 유전자인 타우의 인산화 변화를 확인한 것이다.
도 4a는 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 신생 랫드 측두정맥에 투여 후, 피질 영역에서 분리한 뉴런 세포에서 표적 유전자인 DYRK1A 단백질의 발현 및 하위 경로 유전자인 타우의 인산화 변화를 확인한 것이다.
도 4b는 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 신생 랫드 측두정맥에 투여 후, 해마 영역에서 분리한 뉴런 세포에서 표적 유전자인 DYRK1A 단백질의 발현 및 하위 경로 유전자인 타우의 인산화 변화를 확인한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 혈뇌장벽 투과능이 있음을 확인하고, 특히 DYRK1A를 표적하는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 DYRK1A 유전자와 그 하위 유전자인 타우의 단백질 발현 및 인산화를 효율적으로 억제하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 치매 치료에 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[구조식 (1)]
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하를 가지며,
C (+) 로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지고,
A ≡ C(+) 로 표시되는 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지며,
상기, 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)”은 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1kb 또는 500, 300, 또는 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 펩티드 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 치매 질환 표적 유전자인 DYRK1A (Dual Specificity Tyrosine-Phosphorylation-Regulated Kinase 1A)의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA : Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 3 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "핵산 복합체"는 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 혈뇌장벽을 통과하여 체내로 전달할 수 있는 능력을 가진다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 1의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 3 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 8)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histisine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 앤티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
따라서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "혈뇌장벽" 또는 "BBB (Blood-Brain Barrier)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 혈액과 뇌 조직 간에 교환되는 것을 면밀히 조절하고 심하게 제한하는 뇌 조직을 통하여 순환되기 때문에 혈액 내에 존재하는 투과성 장벽을 지칭하기 위해 사용된다. 혈액 뇌 장벽 성분에는 모든 혈관의 가장 깊은 내막을 형성하는 내피 세포, BBB와 구조적으로 상관이 있는 인접한 내피 세포들 간의 조밀한 연접부, 내피 세포의 기저 막, 및 혈관의 노출된 외부 표면의 거의 모두를 덮고 있는 가까운 성상세포의 확장된 족양 돌기 (foot process)가 포함된다. BBB는 혈액 내의 대부분의 물질, 예를 들어 대부분의 대분자, 예를 들면 Ig, 항체, 보체, 알부민 및 약물 및 소분자가 뇌 조직 내로 유입되지 못하게 한다.
본 발명의 용어 "질환" 또는 "장애"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 기능의 수행을 방해하거나 혼란시키고/시키거나 불쾌감, 기능이상, 곤란과 같은 증상을 유발시키거나 또는 심지어 병에 걸린 사람을 사망시키거나 이와 접촉한 사람을 사망에 이르게 하는, 신체 상태 또는 몇몇 기관 상의 모든 변경을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 질환은 치매인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease)에 의한 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 헌팅턴병(Huntington's disease)에 의한 치매, 크루츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)에 의한 치매 및 픽병(Pick's disease)에 의한 치매로 구성된 군에서 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 혈뇌장벽 내로 전달되는 형태의 제형으로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 치매을 치료하기 위하여 또는 치매의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 적용될 수 있다. 치매의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage)은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치매 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 치매 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 치매 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명의 핵산 복합체의 알츠하이머성 치매에 대한 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 DYRK1A (Dual Specificity Tyrosine-Phosphorylation-Regulated Kinase 1A)를 사용하였으며, 알츠하이머성 치매의 치료 효과를 확인하기 위해 DYRK1A에 대한 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
대조군으로 사용한 생활성 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 2로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 알츠하이머성 치매 치료 효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 1로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드 GLFDIIKKIAESF (서열번호 8)를 5'에 결합하였으며 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 1과 같다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 캐리어 펩티드 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 Histidine(10)과 같은 펩타이드를 5' 내지 3' 말단에 결합하였으며, 서열번호 3번 내지 7번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다 (표 1).
하기 표 1 은 DYRK1A를 표적으로 하는 알츠하이머성 치매 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
알츠하이머성 치매 치료 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 1 5'-GLFDIIKKIAESF-O-CTC(-)CTG(+)TAT(-)GCA(+)TC(-)G-O-K-3' -+-+-
서열번호 2 5'-GLFDIIKKIAESF-O-TCC(-)TCG(+)CGT(-)ATA(+)T(-)GC-O-K-3' -+-+-

캐리어 펩티드
핵산		 서열번호 3 5'-Histidine(10)-O-GAG(+)GACATA(+)CGTAG(+)C-O-K-3' +++
서열번호 4 5'-K-O-C(+)GATGC(+)ATACAG(+)GAG-O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 5 5'-Histidine(10)-O-GT(+)AG(+)C-O-K-3' ++
서열번호 6 5'-K-O-CG(+)AT(+)G-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 7 5'-Histidine(10)-O-AGG(+)AGCGCA(+)TATA(+)CG-O-K-3' +++
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드 핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 2: 인간 유래 신장 세포에서 표적 유전자 과발현을 위한 플라스미드 벡터 제작
핵산 복합체를 이용한 알츠하이머성 치매의 치료 효과를 세포 수준에서 분석하기 위해 표적 유전자가 지속적으로 과발현되는 세포주를 구축하였다. 인간 유래 세포주에서 표적 유전자인 DYRK1A의 발현이 높지 않으므로, 표적 유전자가 지속적으로 과발현되는 세포주를 구축하기 위해 표적 유전자 DYRK1A이 삽입된 클로닝 벡터를 제작하였다.
포유류 세포주에서 발현율이 높은 CMV 프로모터를 가지는 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국)의 백본 클로닝 벡터 (Backbone cloning vector)에 루시퍼라아제 (luciferase)가 삽입된 클론을 이용하여 다중 클로닝 위치 (MCS)에 표적 유전자인 DYRK1A를 삽입하였다. 제한 효소는 KpnI과 XhoI을 이용하였고, 사용한 프라이머는 다음과 같으며, 사용한 클로닝 벡터의 유전자 지도는 도 1a에 나타냈다.
정방향 프라이머 : 5’-GGGGTACCAATGCATACAGGAGGAGAGA-3’(서열번호 9)
역방향 프라이머 : 5’-CCCTCGAGCGAGCTAGCTACAGGACT-3’(서열번호 10)
두 개의 프라이머에는 각각 KpnI과 XhoI 제한효소 사이트가 들어가 있고 이를 바탕으로 PCR 반응물을 얻어낸 후, 제한효소로 반응물을 절단하여 벡터와 삽입 DNA를 겔 상에서 정제하였다. 정제한 삽입 DNA와 벡터는 T4 DNA 라이게이즈 (Elpis Biotech, 한국)를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 결합 반응을 수행하였고, 이를 대장균에 형질 전환한 후 50㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)가 포함된 플레이트에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 플레이트에 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하여 시퀀싱 분석 후, 프레임이 맞는 3개의 클론을 선별하여 인간 배아 신장 세포(HEK293FT)에 형질 주입하여 확인한 결과 도 1b에서와 같이 클론 1번과 3번에서 표적 유전자인 DYRK1A가 과발현 되는 것을 확인하였다. 최종적으로 클론 3번을 선택하여 표적 유전자 과발현을 위한 형질 주입에 사용하였다.
실시예 3: 핵산 복합체를 이용한 알츠하이머성 치매의 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 DYRK1A를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 DYRK1A 형질 주입 세포 모델에서의 알츠하이머성 치매의 치료 효과를 분석하였다.
인간 배아 신장 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA1 서열번호 1 및 3
PNA2 서열번호 1 및 4
PNA3 서열번호 1 및 5
PNA4 서열번호 1 및 6
3-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 배아 신장 세포 (HEK293FT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 표적 유전자인 DYRK1A의 과발현을 위해 실시예 2를 통하여 제조한 클로닝 벡터(cloning vector)를 형질 주입하여 24시간 배양하였다.
3-2: 인간 배아 신장 세포에서 luciferase 활성도를 이용하여 표적 유전자 발현율 측정
실시예 3-1에서의 실험 조건으로 96웰에 인간 배아 신장 세포주를 6x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, DYRK1A 클로닝 벡터 100ng을 형질 주입하여 24시간 동안 배양하였다. 클로닝 벡터 처리 24시간 후, 표 1의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 Luciferase Assay System (Promega, 미국)을 사용하여 세포 용해 후 luciferase 기질을 처리하여 나오는 형광 세기를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 표적 유전자를 과발현시킨 세포주에서 서열번호 1과 서열번호 3의 조합 핵산 복합체와 서열번호 1과 서열번호 6의 조합 핵산 복합체에 의해서 luciferase 활성도가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
3-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 표적 유전자의 단백질 발현 분석
인간 배아 신장 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, DYRK1A 클로닝 벡터 2.5μg을 형질 주입하였다. 형질 주입 24시간 후, 실시예 3-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 각각 24, 48, 72시간 배양하였고, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 DYRK1A (Cell signaling Technology, 미국), p-Tau(AT8) (Thermo Fisher, 미국), Tau (Thermo Fisher, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 서열번호 1과 서열번호 3의 조합과 서열번호 1과 서열번호 6의 조합 핵산 복합체를 처리한 군에서 농도 의존적으로 표적 유전자의 단백질 발현 및 하위 경로 유전자인 타우의 인산화된 형태의 단백질 발현이 시간에 따라 가장 많이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 뇌 투과가 가능한 핵산 복합체를 이용한 체외 (ex-vivo) 뉴런 세포에서의 알츠하이머성 치매 치료 효과 분석
본 실시예에서는 실시예 3을 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체의 생체 내 뉴런 세포에서 효과를 분석하였다. 실시예 3을 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 표적 유전자 발현이 높은 신생 쥐 (neonatal rat)의 뇌실 내에 주사한 다음, 뉴런 세포를 분리하여 생체 내 뉴런 세포에서 핵산 복합체의 효과 분석하였다.
사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
체외 뉴런 세포에서의 알츠하이머성 치매 치료 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 1 및 3
PNA 4 서열번호 1 및 6
4-1: 동물 모델에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 복합체의 투여
핵산 복합체의 혈뇌장벽 투과 확인 및 생체 내 뉴런 세포에서의 표적 유전자 억제 효과 검증을 위하여 임신 19일째 되는 SD 랫드 (나라바이오텍, 한국)를 구입하여 순화시키고, 출산 직후의 새끼 랫드의 측두정맥 (temporal vein)에 20mg/kg씩 표 3의 조건으로 조합한 핵산 복합체를 투여하였다. 주사 후 1일, 3일째 되는 날 랫드에서 뉴런 세포를 분리하여 배양하였다.
4-2: 뇌 조직에서의 뉴런 세포 분리 및 배양
핵산 복합체 투여 후 각각 1일, 3일째 되는 날 랫드의 뇌 조직에서 뉴런 세포를 분리하여 배양하였다.
분리한 뇌 조직에서 피질 (Cortex)과 해마 (Hippocampus)를 실체 현미경 (Leica, 미국) 하에서 분리한 후, 0.25% Tripsin (Gibco, 미국)와 10μM DNase (Roche, 스위스)를 넣고 37℃에서 15분 동안 방치하였다. 파이펫을 이용하여 조직을 균질화 (homogenization) 한 후 3,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액은 버리고 남은 pellet에 Neurobasal-A 배양배지(Gibco, 한국)에 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 2% B-27 supplement (Gibco, 미국)를 첨가한 NM1 배양 배지를 넣어 세포를 풀어준 후, 전날 미리 PLL (Poly-L-lysine, Sigma, 미국)로 코팅한 6웰 플레이트에 각각 그룹별로 1x105으로 세포를 씨딩하였다. 분리한 뉴런 세포의 DIV3 (Days of in vitro)에 5μM Ara-c를 첨가한 NM1 배양 배지로 교체하여 glial 세포가 자라지 않도록 막아준 후, DIV7에 뉴런 세포만 플레이트에서 배양되는 것을 현미경 하에서 확인하였다.
4-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 표적 유전자의 단백질 발현 분석
실시예 4-2의 실험 조건에서 분리된 뉴런 세포가 성숙한 뉴런 세포가 되는 DIV 14에 RIPA buffer를 각 웰마다 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 DYRK1A (Cell signaling Technology, 미국), p-Tau(AT8) (Thermo Fisher, 미국), Tau (Thermo Fisher, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 쥐의 뉴런 세포에서 표적 유전자의 단백질 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 피질 영역에서 분리한 뉴런 세포에서 서열번호 1과 서열번호 3 조합의 핵산 복합체에 의해서 표적 유전자의 단백질 발현과 하위 유전자인 타우 단백질의 인산화가 핵산 복합체 투여 후 하루가 지난 P1에서 감소한 것을 확인하였다. 핵산 복합체 투여 3일 후인 P3에서는 서열번호 1과 서열번호 3 조합의 핵산 복합체에 의해 여전히 표적 유전자 및 하위 유전자의 인산화 단백질 발현이 감소한 것을 확인할 수 있고, 서열번호 1과 서열번호 6의 조합 핵산 복합체에서는 뒤늦게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 4a).
또한, 해마에서 분리한 뉴런 세포의 경우에도 피질에서 분리한 뉴런 세포와 비슷한 경향성을 보이는 것을 확인하였으며, 피질의 뉴런 세포보다 표적 유전자의 단백질 및 하위 유전자의 인산화 단백질이 감소가 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 4b).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. DYRK1A 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 서열번호 1 또는 2의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 3 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 1의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 3 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 8) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 혈뇌장벽 투과능을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease)에 의한 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 헌팅턴병(Huntington's disease)에 의한 치매, 크루츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)에 의한 치매 및 픽병(Pick's disease)에 의한 치매로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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