JP4837033B2

JP4837033B2 - オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体、それらを含有する組成物およびｂ細胞腫瘍を治療する方法

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Publication number: JP4837033B2
Application number: JP2008511531A
Authority: JP
Inventors: ワン，リ−イン; バオ，ム−シェン; ユ，ヨン−リ
Original assignee: チャンチュンファプバイオテクノロジーカンパニーリミテッド
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2026-02-13
Also published as: ZA200710311B; EP1883647A4; EP1883411A1; PL1883411T3; RU2413519C2; US20090162279A1; CY1114844T1; WO2006122463A1; US20120142761A1; ES2433129T3; SI1883411T1; PT1883411E; IL187281A0; BRPI0609885A2; RU2007146705A; JP2008539767A; CA2609067A1; MX2007014145A; CA2609062A1; PL1883647T3

Description

本発明は、配列番号１〜９に示される配列を有する９種のオリゴヌクレオチド、またはそれらの機能的相同体、それらを含有する組成物、ならびにオリゴヌクレオチドを用いてＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートし、かつＢ細胞腫瘍細胞を刺激してＩＬ−１０を産生させることによってＢ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を個別にもしくは一緒に使用するか、または化学療法剤、免疫療法剤および放射線と併用することで、Ｂ細胞腫瘍の治療が可能である。

リンパ性悪性疾患は、ＷＨＯ分類系(American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121)に基づき、Ｂ細胞腫瘍、Ｔ細胞／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞腫瘍およびホジキンリンパ腫という３つの主要なクラスに分類される。

Ｂ細胞腫瘍は、前駆Ｂ細胞腫瘍および末梢Ｂ細胞腫瘍という２つのグループにさらに分かれる。前駆Ｂ細胞腫瘍は、前駆体Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）／リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）を含む。末梢Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚の濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、形質細胞腫／形質細胞骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。

Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびＢ細胞急性リンパ芽球性／リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）は、Ｂ細胞白血病の２つのタイプである。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Nicholas Chiorazzi, M. D., et al. N Engl J Med 2005;352:804-15)。Ｂ−ＡＬＬ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ１０マーカーを発現する。

小リンパ球性リンパ腫はＢ細胞腫瘍である。小リンパ球性リンパ腫細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Catherine Thieblemont,et al. Blood. 2004; 103:2727-2737)。

現行の治療オプションには、診断されたＢ細胞腫瘍に応じて、化学療法、放射線療法および免疫療法がある。

正常Ｂリンパ球および樹状細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。Ｔリンパ球上で発現されるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである(Castle BE, et al. J Immunol 1993; 151 : 1777-1788)。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用は、Ｂリンパ球、樹状細胞および単球の増殖、分化および抗原提示を促進する(Ranheim EA, et al. J Exp Med 1993;177: 925-935; Yellin MJ et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Annu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325)。

ＣＤ４０はＢ細胞腫瘍細胞上でも発現する。ＣＤ４０の発現を高めることでＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスが促進されることが実証されている(Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 April 2005 Volume 105, Number 8: 3193-3198)。in vitroとin vivoの双方での実験で、ＣＤ４０の刺激およびアップレギュレーションによりＢ細胞腫瘍細胞の成長阻害が誘発されることが示された(Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953 ,1995; Eliopoulos, A. G, et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A.,et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al. 2001.Clin. Cancer Res. 7:691)。

Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０発現の促進が、Ｂ細胞腫瘍細胞の抗原性を増強し、その結果、同細胞に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を促進することが報告された。ＣＴＬはＢ細胞腫瘍細胞を効率的に殺滅しうる(Dilloo D, et al. Blood. 1997;90: 1927-1933; Kato K, et al. J Clin Invest. 1998;101 :1133-1141 ; Wierda WG, et al. Blood. 2000;96:2917-2924 ; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, et al. Cancer Gene Ther.2001 ;8:378-387)。ＣＤ４０Ｌの存在下で、ＣＤ４０を発現するＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞は、ＣＤ４細胞傷害性Ｔリンパ球によって殺滅されうる(Frank Dicker, et al. Blood, 15 April 2005 Vo1 105, Num 8: 3193-3198)。バーキットリンパ腫の細胞上におけるＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用により、細胞における腫瘍抗原の特異的ＣＴＬに対する提示の促進が可能となる(Khanna, R.et al. 1997. J. Immunol. 159:5782)。in vivo実験および臨床試験では、ＣＤ４０の活性化によりＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の免疫原性が増強され、その結果、同細胞に特異的なＣＴＬの産生が誘導されうることも実証された(Kato, K.,et al. 1998.J. Clin. Invest. 101 :1133; Wierda, W. G.,et al. 2000. Blood 96: 2917)。

これらのデータを併せると、Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進することでＢ細胞腫瘍に対する抗腫瘍免疫性が刺激されうることが示唆される。抗腫瘍免疫性は、
１．Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスの促進、
２．Ｂ細胞腫瘍細胞の成長の阻害、
３．Ｂ細胞腫瘍細胞の免疫原性の増強と、それによる同細胞に特異的なＣＴＬの産生促進
を含むがこれらに限定されない。

インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、特定のＴ細胞の細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞から発生した新生細胞の一部によって産生されるホモ二量体サイトカインである(Kitabayashi et at., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997; Boulland et al., 1998; Jones et al., 1999)。ＩＬ−１０活性は、抗原提示細胞、リンパ球Ｂ細胞および慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の上に発現されるそれに特異的な細胞表面受容体によって仲介される。外因性ＩＬ−１０の添加により患者から新たに単離されたＢ−ＣＬＬ細胞の増殖が阻害されることが見出された(Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89, No 11 (June 1), 1997: pp 4146-4152)。ＩＬ−１０は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の増殖を阻害し、且つＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進することも報告された(Anne-Catherine Fluckiger, lsabelle Durand, and Jacques Banchereau. lnterleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99)。ＩＬ−１０の免疫刺激性の抗癌特性についてはレビューで論じられており、それからは腫瘍微環境内でのＩＬ−１０の過剰発現が癌の免疫拒絶を触媒しうることが推定される(Simone Mocellin, Francesco M. Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78:1043-1051)。

第１の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９で示される各配列を有するオリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０としても指定された９種のオリゴヌクレオチドおよびそれらの機能的相同体を提供する。オリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体は、部分的または完全なホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であるリン酸塩骨格修飾を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体は、化学修飾を有しうるかまたは微量塩基との置換を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体は、任意の他のＤＮＡ断片の機能的部分でありうるか、あるいはプラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンにそれぞれクローニングされうる。配列番号１〜９の配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数の塩基（好ましくは１〜１０塩基）をそれら各々の末端に付加するかまたはオリゴヌクレオチド内で１つまたは複数の塩基を変化させることにより修飾されうる。当業者は、当該技術分野で周知の内容および本発明における教示内容に基づいて、本発明の目的を達成するために、配列番号１〜９の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を個別にもしくは一緒に使用すること、または該配列（配列番号１〜９）を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ含むＤＮＡ断片を使用することを決定することができる。

第２の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を被験者において個別にもしくは一緒に使用するか、またはそれらを含有する組成物を使用することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。被験者はヒトまたは動物である。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫を含むがこれらに限定されない。

第３の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を個別にもしくは一緒に使用するか、またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。

第４の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を個別にもしくは一緒に使用するかまたはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートすることにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。

第５の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を個別にもしくは一緒に使用するか、またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を刺激することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を単独で含む組成物、または１種もしくは複数種の医薬的に許容できる担体中に含む組成物、または該担体とともに含む組成物を提供する。組成物は、経腸投与、非経口投与および局所投与または吸入投与される。

さらに別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法であって、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的相同体を個別にまたは一緒に投与する、またはそれらを含有する組成物を投与する、または化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む抗−Ｂ細胞腫瘍剤の少なくとも１種と共に投与するステップを含む、方法を提供する。

定義
本発明では、以下の用語は下記の意味を有するものとする。

「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結される糖（例えばデオキシリボース）を有する分子）を意味する。有機塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）の４種が存在する。オリゴヌクレオチドは、市販されている自動オリゴヌクレオチドシンセサイザで合成するか、または既知の技術を用いて既存の核酸配列から調製することができる。

オリゴヌクレオチドの「骨格修飾」は、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートで修飾されたリン酸塩骨格（すなわちリン酸塩の酸素の少なくとも１つが硫黄と置換される）または他の修飾骨格を有することを意味するものとする。

オリゴヌクレオチドの「化学修飾」は、ヌクレオチドの活性基を利用するかまたはヌクレオチド類似体を生成することによる修飾を意味するものとする。修飾はオリゴヌクレオチドの合成の間または合成後に生じうる。合成の間、修飾塩基（チミジン類似体を含むがこれに限定されない）が内部にまたは５’末端側に取り込まれうる。合成後、（アミノ修飾因子、３’もしくは５’水酸基、またはリン酸基を介して）活性基を用いて修飾がなされうる。

「Ｂ細胞腫瘍」は、Ｂリンパ球系の細胞の異常な増殖から発生した疾患を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫（形質細胞腫／形質細胞骨髄腫）に分類されうる。Ｂ細胞白血病は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病およびヘアリー細胞白血病を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。

「被験者」は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウスおよびラットを含む（がこれらに限定されない）哺乳動物を意味するものとする。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍を有する被験者に投与されうる。

「抗−Ｂ細胞腫瘍剤」は、被験者におけるＢ細胞腫瘍を治療するために用いられる作用物質を意味するものとする。作用物質は、本発明のオリゴヌクレオチド、化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを、１種もしくは複数種の他の抗−Ｂ細胞腫瘍剤の投与に先立ち、投与と同時にまたは投与後に投与することで、Ｂ細胞腫瘍の治療において相乗効果が得られる可能性がある。

「化学療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する化学療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。化学療法剤は、シクロホスファミドまたはクロラムブシル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサート、プレドニゾン、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、プリン類似体（例えば、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシンおよびペントスタチン）、シトシン、アラビノシド、シスプラチン、エトポシドならびにイホスファミドなどのアルキル化剤を含むがこれらに限定されない。化学療法においては、本発明のオリゴヌクレオチドをさらに１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。併用剤として、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰに加え、プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰに加え、メトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリンに加え、標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量のシタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）、ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰに加えてブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、窒素マスタード、シトシンアラビノシドおよびエトポシド、ＭＯＰＰ（メクロレタミン（窒素マスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶＤ、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ならびにＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびプレドニゾン）が挙げられるがこれらに限定されない。

「免疫療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する免疫療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の免疫療法剤と併用してもよい。免疫療法剤には抗−ＣＤ２０抗体が含まれるがこれに限定されない。ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞腫瘍細胞の細胞表面上でＣＤ２０タンパク質と特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含む。ＣＤ２０抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体ならびにヒト化抗体でありうる。「ＣＤ２０」はＢ細胞膜タンパク質であり(Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994))、正常Ｂ細胞および腫瘍Ｂ細胞の双方の上で発現される(John C. Byrd,et al. J Clin Oncol 2001 ; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98: 1326-1331)。

「医薬的に許容できる担体」は、本発明のオリゴヌクレオチドを被験者に投与するのに適する、１種もしくは複数種の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体は、有機物、無機物、天然物または合成物でありうる。担体は、あらゆる溶液、希釈剤、溶媒、分散媒、リポソーム、エマルジョン、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドの投与に適する任意の他の担体を含み、それらの使用は当該技術分野で周知である。

本発明のオリゴヌクレオチドの「治療有効量」は、被験者におけるＢ細胞腫瘍の治療において所望の結果を得るのに用いられる用量を示すものとする。用量は、当業者に周知の標準的な技術によって決定可能であり、かつ被験者の大きさまたは／および健康全般あるいは疾患の重篤度を含む（がこれらに限定されない）因子に応じて変化しうる。本発明のオリゴヌクレオチドの導入は、単回の治療として行っても、一連の複数回の治療にわたって行ってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドにおける投与の用量は、１投与当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。しかし、Ｂ細胞腫瘍の治療における用量は、上記用量よりも１０〜１，０００倍高い範囲内で使用されうる。投与計画は、最適な治療効果をもたらすように当業者により調節されうる。

本発明のオリゴヌクレオチドを投与する「経路」は、経腸投与、非経口投与および局所投与または吸入を意味するものとする。本明細書で用いられる用語「経腸」は、経口投与、胃内投与、腸内投与および直腸投与を含む。用語「非経口」は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣投与を含む。用語「局所」は、オリゴヌクレオチドの表皮、口腔ならびに耳、目および鼻への外部からの適用を意味する。

「医薬組成物」という用語は、医薬的に許容できる担体を伴うかまたは伴わない、治療有効量のオリゴヌクレオチドを含有する組成物を意味するものとする。組成物は、水溶液または食塩水、粒子、エアロゾル、ペレット、顆粒、粉末、タブレット、被覆タブレット、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップおよび種々の薬剤送達系における使用に適する他の医薬組成物を含むがこれらに限定されない。組成物は、注射、経口、口腔、直腸および膣使用、吸入ならびにデポー剤における適用に適する。組成物は、すべての場合に製造および保存の条件下で無菌かつ安定であり、微生物汚染に対して保護されなければならない。注射においては、組成物は、注射可能な溶液または分散液の即時調製のための水溶液または分散液および粉末を含むことになる。本発明における「粉末」は、オリゴヌクレオチドを含有する微細分散した固体粒子を含有する組成物を示す。粉末は、使用前に他の医薬的に許容できる担体（例えば、水、ＰＢＳ、食塩水および他の医薬的に許容できる緩衝液）と調合されうる。オリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の適切な溶媒および他の必要とされる成分に混和させることで溶液を調製してもよい。オリゴヌクレオチドを分散媒（例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびオイル）および他の必要とされる成分を含有する賦形剤に混和させることで分散液を調製してもよい。経口投与においては、組成物を食用担体と調合することで、タブレット、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などが形成されることになる。口腔投与においては、組成物は、従来式のタブレットまたはロゼンジとなる。吸入においては、組成物は、加圧パックからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーまたは乾燥粉末となり、当業者により選択可能である。オリゴヌクレオチドはまた、直腸用または膣用およびデポー用の医薬的に許容できる組成物として調合されうる。組成物中においてオリゴヌクレオチドは、単独使用してもよく、あるいは化学療法剤、免疫療法剤、および標的細胞の特異的な受容体もしくは分子によって認識されるリガンドを含む（がこれらに限定されない）１種もしくは複数種の他の作用物質と併用してもよい。別の作用物質と併用するオリゴヌクレオチドは、別々の組成物としてもよく、（１）オリゴヌクレオチドが第２の作用物質と投与前に混合される、（２）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が異なる時刻に被験者に投与される、（３）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が被験者の異なる部位に投与されるといったような方法で使用可能である。さらに、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を有する、プラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターおよび核酸ワクチンを含有しうる。

以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書においては、例えば合理的な当業者が着想するような理にかなった変形を本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。

実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
発明者らは、以下の配列および名前を有するオリゴヌクレオチドを設計し、合成している。

上記オリゴの機能を分析するため、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’の配列を有する２００６、および５’−ｇｇｇｇｇａｃｇａｔｃｇｔｃｇｇｇｇｇｇ−３’の配列を有する２２１６という２つの対照オリゴヌクレオチドも合成した。

すべてのオリゴヌクレオチドを、サンゴン・バイオテック・カンパニー（ＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏｍｐａｎｙ）（上海、中国）にて合成し、リムラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞分解産物アッセイ（アソシエイツ・オブ・ケープ・コッド（ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓｏｆＣａｐｅＣｏｄ，Ｉｎｃ））を利用してエンドトキシンについて試験し、発熱物質を含有しない試薬中で操作した。２００６(J Immunol 2000: 164: 1617)は、正常Ｂ細胞を強く活性化させるよく研究されたオリゴヌクレオチドである。２２１６(Eur J Immunol 2001 ; 31:2154)は、形質細胞様樹状細胞内で大量のタイプＩインターフェロンを誘導するもう一つのよく研究されたオリゴヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に周知であり、特に固相合成が一般に用いられている。具体的には、合成のプロセスにおいて用いられる固体支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ）ビーズである。このビーズは表面に孔およびチャネルを有し、それらの内部に保護されたヌクレオチドが結合する。オリゴヌクレオチド合成は、３’−末端ヌクレオチドで開始し、５’−末端ヌクレオチドが結合するまで繰り返される５つのステップからなる一連のサイクルを通して進行する。これらのステップは、脱保護、活性化、共役、キャッピングおよび安定化である。

ステップ１：脱保護
ＣＰＧ（制御多孔質ガラス）ビーズに付着した保護ヌクレオシド中の保護基が、反応性の５’−水酸基を残してトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって除去される。

ステップ２：活性化
このステップでは、テトラゾールが、テトラゾリルホスホラミダイト中間体を形成する共役ホスホラミダイトヌクレオシドを攻撃する。

ステップ３：共役
テトラゾリルホスホラミダイト中間体がレシピエントの水酸基と反応し、５’から３’への連結が形成される。テトラゾールが再構成され、プロセスが継続する。

ステップ４：キャッピング
このステップでは、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールからなるアセチル化試薬を用いることで、オリゴヌクレオチドのその５’−末端上の反応性水酸基が遮断され、共役できない事態が回避される。

ステップ５：安定化
一旦キャッピングステップが完了すると、サイクルにおける最終ステップは、伸長するオリゴヌクレオチド鎖と直前に付加された塩基の間のリン酸塩連結を安定化させる酸化である。このステップを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および水の中で弱酸化剤のヨウ素の存在下で行う。

この最終ステップ後、配列内の各ヌクレオチドについてサイクルを繰り返す。合成の完了後、一本鎖ＤＮＡ分子をＨＡＰ、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｃ１８およびＯＰＣなどの方法によって精製する。

実施例２オリゴヌクレオチドにより誘発されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＣＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル（ＴｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ）、ジリン大学（ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、中国）由来の血液試料を、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール・パック（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋Ｂ−ＣＬＬ細胞をＢ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、ベルギッシュグラートバハ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ）を用いてＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（Ｂ−ＣＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製はミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。

２．オリゴヌクレオチドにより誘導されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞数は、全細胞数にＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝１０）は、オリゴヌクレオチドがＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示した（表１）。

実施例３オリゴヌクレオチドによるヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。

２．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のオリゴヌクレオチドによるアップレギュレーション
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ））（モレキュラー・プローブス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓｌｎｃ））(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色したＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。結果（図１）は、オリゴヌクレオチドがＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴヌクレオチドを用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＣＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＣＬＬ細胞における免疫原性を高めることにより、Ｂ−ＣＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の少なくとも１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。

実施例４オリゴヌクレオチドにより誘導されるヒト小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
承認された書面によるインフォームドコンセントの取得後、小リンパ球性リンパ腫細胞を、（病理学的に同定された）小リンパ球性リンパ腫を有する患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）由来のリンパ節の生検組織から単離した。生検組織を粗表面のスライドグラスで磨り潰し、６ｃｍの培養プレート内で１０％のヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）５ｍｌに細胞を放出した。放出された細胞を、ステンレス鋼メッシュを通して濾過し、１５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を含む５０ｍｌのコニカルチューブ内に回収した。チューブを３００×ｇで１０分間遠心し、次いで上清を廃棄した。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋小リンパ球性リンパ腫細胞をＢ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いてＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（小リンパ球性リンパ腫細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製はミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。

２．オリゴヌクレオチドにより誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度を３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）の小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。生存している小リンパ球性リンパ腫細胞数は、全細胞数にＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。小リンパ球性リンパ腫を有する患者由来の５種の試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝５）は、オリゴヌクレオチドが小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（表２）、これはオリゴヌクレオチドを使用し、細胞のアポトーシスを誘発することで小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。

実施例５オリゴヌクレオチドにより誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
実施例４に記載の手順を用い、ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞を患者から単離した。

２．オリゴヌクレオチドにより誘発される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレーション
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色した小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。結果（図２）は、オリゴヌクレオチドが小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴヌクレオチドを用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションを通して小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションが、小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを促進し、小リンパ球性リンパ腫細胞の成長阻害を誘発し、かつ小リンパ球性リンパ腫細胞における免疫原性を高めることで、小リンパ球性リンパ腫細胞に特異的なＣＴＬの産生が刺激される。５種の試料を用いて実験を繰り返し、類似の結果が得られた。

実施例６オリゴヌクレオチドにより誘導されるヒトＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＡＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）から、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後、血液試料を採取した。ＰＢＭＣをフィコール・パック（ファルマシア）密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ１９＋ＣＤ１０＋Ｂ−ＡＬＬ細胞を、Ｂ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いてＣＤ１９＋ＣＤ１０＋細胞（Ｂ−ＡＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製はミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。

２．オリゴヌクレオチドにより誘導されるＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度を３μｇ／ｍｌとして）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＡＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＡＬＬ細胞数は、全細胞数にＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。Ｂ−ＡＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を行い、平均した結果（ｎ＝１０）は、オリゴヌクレオチドがＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（表３）、これはオリゴヌクレオチドを使用し、Ｂ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを誘導することでＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。

実施例７オリゴヌクレオチドによるＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
実施例６に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＡＬＬ細胞を患者の血液試料から調製した。

Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで１０^６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度を３μｇ／ｍｌとして）とともにあるいはそれらを伴わずにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

インキュベーションの３、５、７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色した小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。１０種の試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（表４）は、オリゴヌクレオチドがＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴヌクレオチドを用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＡＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＡＬＬ細胞における免疫原性を高めることでＢ−ＡＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。

実施例８オリゴヌクレオチドにより誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。

２．オリゴヌクレオチドにより誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、４８ウェルプレートで、１０^６細胞／ウェルとし、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにあるいはそれらを伴わずにトリプリケートで培養した。オリゴヌクレオチドを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。

培養上清を２４時間後または指定時刻に回収し、フルオロカインＭＡＰイムノアレイ（ＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅＭＡＰＩｍｍｕｎｏａｒｒａｙ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ））システムで、ＩＬ−１０について評価した。我々のデータは、オリゴヌクレオチドを誘因としてＢ−ＣＬＬ細胞から高レベルのＩＬ−１０の産生がもたらされることを示した（表５）。さらに、我々のデータは、外因性ｒｈ−ＩＬ−１０（シェリング（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐ））のＢ−ＣＬＬ細胞培養物への添加により、ＩＬ−１０の用量に依存的にアポトーシス性Ｂ−ＣＬＬ細胞が誘発され、それは抗−ＩＬ−１０抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）によって特異的に遮断されうることをさらに示した。これらの実験結果は、オリゴヌクレオチドを用い、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを自己分泌的に引き起こすＩＬ−１０の産生を誘導することでＢ−ＣＬＬが治療されうることを示している。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の少なくとも１０種の試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果を得た。

実施例９ヒト正常ＰＢＭＣの増殖に対するオリゴヌクレオチドの作用
ヒトＰＢＭＣを、フィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離（ファルマシア）により健常な供血者（ザ・ブラッド・センター・オブ・ジリン・プロヴィンス、中国）の軟膜から単離した。ＰＢＭＣの生存率は、トリパンブルー排除による測定によると９５〜９９％であった。

ＰＢＭＣ（６×１０^５／ウェル）を９６ウェルＵ底プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に播種し、オリゴ１、オリゴ３、オリゴ４、オリゴ５、オリゴ６、オリゴ７、オリゴ８、オリゴ９、オリゴ１０、２００６または２２１６（各々、最終濃度６μｇ／ｍｌ）とともにあるいはそれらを伴わずにトリプリケートで３６時間培養後、［^３Ｈ］チミジン（ニューイングランド・ニュークリア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）で１６時間パルスを与えた。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、シンチレーションカウンターで検出した。細胞増殖を（トリプリケートのウェルからの）ｃｐｍ（カウント／分）として表した。５種の正常血液試料からのデータを示す。２００６および２２１６を対照として用いた。結果は、オリゴヌクレオチドがＰＢＭＣの増殖を明らかに刺激しうることを示し（図３）、これはオリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘導することなく正常ヒトＰＢＭＣに対して増殖促進性を示しかつ培養細胞に対して毒性を示さないことを示した。

本発明を詳細に説明してきたが、当業者にとっては、好ましい実施形態を参照することにより、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく改良および変形を行えることは明らかであろう。

Ｂ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴヌクレオチドの作用Ｂ−ＣＬＬ細胞が、オリゴヌクレオチドとともにまたはそれらを伴わずに７日間インキュベートされ、次いでフローサイトメトリーを用いたＣＤ４０の発現分析のためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴヌクレオチドの作用小リンパ球性リンパ腫細胞はオリゴヌクレオチドとともにまたはそれらを伴わずにインキュベートされた。７日目、細胞はフローサイトメトリーを用いたＣＤ４０の発現分析のためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。正常ヒトＰＢＭＣの増殖に対するオリゴヌクレオチドの作用正常ヒトＰＢＭＣはオリゴヌクレオチドとともにまたはそれらを伴わずに培養され、次いで細胞の増殖を測定するために［^３Ｈ］チミジンと混和された。細胞の増殖はｃｐｍとして表された。

Claims

配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む、Ｂ細胞腫瘍の治療のための医薬組成物。
前記Ｂ細胞腫瘍が、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫または骨髄腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記Ｂ細胞白血病が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病またはＢ細胞急性リンパ性白血病である、請求項２に記載の医薬組成物。
前記Ｂ細胞リンパ腫が、小リンパ球性リンパ腫である、請求項２に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、経腸的投与、非経口的投与、局所的投与、または吸入投与される、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
さらに、抗Ｂ細胞腫瘍剤を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記抗Ｂ細胞腫瘍剤が、化学療法剤、免疫療法剤、または放射線療法で使用される作用物質である、請求項６に記載の医薬組成物。
前記化学療法剤が、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ビンクリスチン、シクロホスファミドおよびプレドニゾンからなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
前記化学療法剤が、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）またはＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）である、請求項７に記載の医薬組成物。
前記免疫療法剤が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項７に記載の医薬組成物。
前記放射線療法が、体外照射または放射性標識抗体治療である、請求項７に記載の医薬組成物。
Ｂ細胞腫瘍の治療薬を製造するための、配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記Ｂ細胞腫瘍が、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫または骨髄腫である、請求項１２に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記Ｂ細胞白血病が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病またはＢ細胞急性リンパ性白血病である、請求項１３に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記Ｂ細胞リンパ腫が、小リンパ球性リンパ腫である、請求項１３に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記治療薬が、経腸的投与、非経口的投与、局所的投与、または吸入投与される、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記治療薬が、さらに抗Ｂ細胞腫瘍剤を含む、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記抗Ｂ細胞腫瘍剤が、化学療法剤、免疫療法剤、または放射線療法で使用される作用物質である、請求項１７に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記化学療法剤が、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ビンクリスチン、シクロホスファミドおよびプレドニゾンからなる群より選択される、請求項１８に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記化学療法剤が、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）またはＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）である、請求項１８に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記免疫療法剤が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項１８に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
前記放射線療法が、体外照射または放射性標識抗体治療である、請求項１８に記載の配列番号１〜９で示される配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。