JPH06508130A

JPH06508130A - ｃ−ｍｙｂプロト−オンコジーンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる結腸直腸癌の処置

Info

Publication number: JPH06508130A
Application number: JP5500313A
Authority: JP
Inventors: カラブレッタ，ブルーノ; ゲヴィルツ，アラン　エム
Original assignee: テンプル　ユニバーシティ−オブ　ザ　コモンウェルス　システム　オブ　ハイヤー　エデュケーション
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1992-05-22
Publication date: 1994-09-14
Also published as: EP0585399A4; CA2109829A1; EP0585399A1; WO1992020348A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｃ−ｍｙｂプロトオンコジーンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる結腸直腸癌の処置発明の技術分野本発明は、プロト−オンコジーンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にｃ−ｍｙｂ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに腫瘍形成防止剤としてのこれらオリゴヌクレオチドの使用に関するものここに開示する発明は、ナショナル・インスチチュート・イブ・ヘルス認可ＣＡ４６７８号により部分的に支援された。

蛋白質をコードする。これはプロト−オンコジーンであり、すなわち正常な非腫瘍細胞の生存に必要とされる蛋白質をコードする。遺伝子が適当に変化すると、これはガン遺伝子になる可能性を有する。ガン遺伝子は、細胞内での発現が正常細胞から腫瘍細胞への形質転換において成る種の機能を果す遺伝子である。

ヒトｃ　−ｍ　ｙ　ｂ遺伝子は分離、クローン化および配列決定されている［マジュロ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは本出願人に係る米国特許第５．０９８．８９０号に開示されており、その全開示を参考のためここに引用する。そこには、ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドが血液学的腫瘍の処置および免疫抑制に有用であると開示されている。従来、ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液学的性質以外の腫瘍形成病に対し増殖防止活性を有することが知られていない。

結腸直腸癌は米国における成人の第２の最も一般的な悪性腫瘍である（皮膚癌を除く）。その発生率を越えるのは男性の肺癌および女性の乳癌のみである。同様な発生が他の多くの国でも報告されている。悪性直腸癌および結腸癌の大多数は腺癌であり、すなわちこれらは腺上皮で発生する。結腸直腸癌は一般に腺腫からその場での腺癌まで進行し、次いで浸襲性腺癌まで進行する。結腸直腸癌は「デュークの分類」に基づき４種の異なる段階に分類される：すなわちＡ、ＢＳＣおよびＤの段階である。段階Ａにおいて癌は粘膜および粘膜上組織に限られ、９０％の５年間生存率を有する。段階Ｂにおいて癌は筋もしくは漿膜まで拡大し、６０〜７５％の５年間生存率を有する。段階Ｃの癌は局部的リン７５節を含み、３０〜４０％の５年間生存率を有する。段階りにおいては肝臓、骨および肺における転移が一般に見られる。段階りの患者は典型的には僅か５％の５年間生存率しかない。

結腸直腸癌の処置に対する現在の手法は主として手術である。悪性結腸癌の切除を受ける全患者の全体的な５年間生存率は約５０％である。外科的治療は、腫瘍が腸壁以内に限られた場合のみ可能である。残念ながら、結腸直腸癌に有効な化学療法剤の開発は殆ど進歩していない。５−フルオロウラシル（５−Ｆ　Ｕ）が、最も広く使用されている薬剤である。最近、５−ＦＵがレノくミソールと組合せて使用され、Ｃ段階の結腸直腸癌を処置して成る程度の成功を収めている［マーチル等、Ｎ、Ｅｎｇｌｌ、Ｍｅｄ　１第３２２巻、第３５２〜３５８頁（１９９０）］。

５−ＦＵは肝臓への転移を有する患者に投与されるが、病例の２５％もしくはそれ以下でのみ一時的な改善が得られ、全体的生存率は顕著には影響されない。５ −ＦＵ処装は正常な分裂細胞を区別せず、化学療法の通常の毒性、すなわち貧血、感染および出血性下痢、嘔吐および脱毛を伴う。結腸直腸癌の比較的遅い細胞倍増時間が、化学療法剤に対する一般的な非反応性の説明として用いられる。明かに必要とされることは、結腸直腸癌の現在用いつる処置に対する一層効果的な代案である。

−ナー等、インターナショナル・ジャーナル・キャンサー、第４１巻、第２８７〜２８６頁（１９８８）；アリタロ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第４５３４〜４５３８頁（１９８４）；）レリ等、キャンサー・リサーチ、第４７巻、第５２６６〜５２６９頁（１９８７）；ウンタヮリ等、アンチキャンサー・リサーチ、第８巻、第１〜８頁（１９８８）］。これらの報告にも拘わらず、結腸直腸癌の遺伝子的原因を確認する最近の努力はｃ　−ｍ　ｙ互でなく他の遺伝子に集中している。たとえばヒト結腸直腸細胞増殖の抑制は野生型ヒトｐ５３遺伝子でのトランスフェクションによって達成されており、ｐ５３遺伝子生産物が腫瘍成長の抑制剤として機能しうろことを示唆している［ベーカー等、サイエンス、第２４９巻、第９１２〜９１５頁（１９９０）コ。堡」遺伝子における突然変異が、結腸直腸癌の少なくとも１種における開始原因として提案されている〔フエロン等、セル、第６１巻、第７５９〜７６７頁（１９９０）］。したがって、ｃ−ｍｙｂ発現以外の遺伝子的現象が結腸直腸癌における主たる原因として示唆されている。

腸直腸癌の処置方法を提供する。この種の処置を必要とする個人に対し、有効量の１種もしくはそれ以上のＣ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。各オリゴヌクレオチドはヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する。このオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズすることができる。好ましくはオリゴヌクレオチドは少なくとも１２量体のオリゴヌクレオチドであり、すなわち少なくとも１２個ヌクレオチド残基を有するオリゴマーである。特に、オリゴマーは有利には１部量体〜４０量体、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドである。１２量体よりも小さいオリゴヌクレオチドも使用しうるが、これらは標的でない配列に対し統計的に一層多くハイブリダイズする傾向を有し、この理由で特異性が低い。さらに、単一のミスマツチでも誤整列はハイブリッドを不安定化させる。４部量体より大きいオリゴヌクレオチドも使用しつるが、その吸収はより困難である。さらに、長い配列の部分的整列は非特異的ハイブリッド化と非特異的作用とをもたらしうる。

好ましくは、オリゴヌクレオチドは１５〜３０量体オリゴデオキシヌクレオチドであり、より有利には１８〜２６量体である。

特に好ましくは、オリゴヌクレオチドは１５〜２１量体オリゴデオキシヌクレオチドである。

原理的にｃ−ｍｙｂ遺伝子の任意の領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを本発明に用いうるが、翻訳開始コドンを含むｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の１部に対し相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが特に好適である。さらに、翻訳開始コドンから約４０ヌクレオチド上流（５′方向）または約４０ヌクレオチド下流（３′方向）以内に位置するｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の１部に対し相補的なオリゴヌクレオチドも好適である。

本明細書に使用する場合、特記しない限り「オリゴヌクレオチド」と言う用語はりボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴリボヌクレオチド）およびデオキシリボヌクレオチドのオリゴマー（すなわちオリゴデオキシリボヌクレオチド、ここでは「オリゴデオキシヌクレオチド」とも称する）の両者を包含する。オリゴデオキシヌクレオチドが好適である。

ここで用いる場合、特記しない限り「オリゴヌクレオチド」と言う用語はさらに、「ポリヌクレオチド」と称するのに充分な大きさを有するオリゴマーをも包含する。

「オリゴヌクレオチド」および「オリゴデオキシヌクレオチド」と言う用語は、一般的な生物学上重要なヌクレオチド、すなわちヌクレオチド・アデニン（ｒＡＪ　）、デオキシアデニン（ｒｄＡＪ）、グアニン（ｒＧＪ　）、デオキシグアニン（ｒｄＧＪ）、シトシン（ｒＣＪ　）、デオキシシトシン（ｒｄｃＪ）、チミン（ｒＴＪ　）およびウラシル（ｒＵＪ”）のオリゴマーおよびポリマーだけでなく、他のヌクレオチドを含有しうるｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうるオリゴマーおよびポリマーをも包含する。同様に、［オリゴヌクレオチド」および「オリゴデオキシヌクレオチド」と言う用語は、１個もしくはそれ以上のプリンもしくはピリミジン部分、糖部分またはヌクレオチド間結合が化学改変されたオリゴマーおよびポリマーをも包含する。「オリゴヌクレオチド」と言う用語はしたがって、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の改変により「オリゴヌクレオシド」と称しても良いオリゴマーを包含すると理解される。この種の改変オリゴヌクレオチドはたとえば下記するアルキルホスホネートオリゴヌクレオシドを包含する。

「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」と言う用語は、ヌクレオチド間結合の１個もしくはそれ以上が式％式％のホスホロチオエート基であるオリゴヌクレオチドを意味し、これは未改変オリゴヌクレオチドの特徴である式％式％のホスホジエステル基とは異なる。

「アルキルホスホネートオリゴヌクレオシド」と言う用語はヌクレオチド間結合の１個もしくはそれ以上が式％式％［式中、Ｒはアルキル基、好ましくはメチルもしくはエチルである］のアルキルホスホネート基であるオリゴヌクレオチドを意味する。

ヌクレオチド配列に沿った方向に関して用いる「下流」と言う用語は５’−３’ 方向を意味する。同様に、「上流」と言う用語は３’−５’方向を意味する。

ｒｅ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物」と言う用語は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子の現在公知のｍＲＮＡ転写物または解明しうる他の任意の転写物を意味する。

図面の簡単な説明第１Ａおよび１８図は、培地単独（「メジウム」）またはｃ−ｍｙｂセンス（「センス」）もしくはアンチセンス（「アンチセンス」）オリゴデオキシヌクレオチドが添加された培地の存在下で培養した結腸癌細胞ラインＬ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘ　、　Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ、Ｃｏ１ｏ　２０５およびＨＴ　２９の、（Ａ）増殖および（Ｂ）Ｈ３−チミジン組込みを示すグラフである。

第２Ａおよび２Ｂ図は、ｃ−ｍｙｂセンス（「センス」）または変化量のアンチセンス（ｒＡｓＪ）オリゴデオキシヌクレオチドにより処理された癌細胞ラインＣａ１０２０５、Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘおよびＬｏＶｏの、（Ａ）Ｈ３− チミジン吸収およびＣＢ）細胞増殖の投与量依存性の抑制を示す。

腸瘍の増殖に重要であることが突き止められた。細胞増殖におけるこのプロトオンコジーンの役割は、従来考えられたような造血源の細胞に限定されない。上皮の腫瘍形成細胞であって血液源でない結腸直腸癌細胞の増殖はである。しかしながら驚くことに、ｃ−ｍｙｂ発現は結腸直腸癌細胞ラインの増殖がｃ−ｍｙｂ蛋白質の合成と全く無関係であることから示されるように腸瘍形成上皮細胞の増殖に関する絶対的要件でない。特定患者の癌がｃ−ｍｙｂを発現し、したがってアンチセンスオリゴヌクレオチドにより潜在的に処理しつるかどうかは、Ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡを検出するための適当なオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリッド化試験によって容易に決定することができる。代表的なスクリーニング技術については実施例２に後記するが、遺伝子発現レベルを決定するための他の方法は当業者に周知されていることが了解されよう。この種の他の方法はたとえば逆転写酵素ポリラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を包含する。

ヒｈｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対し相補的な推定ＤＮＡ配列はマジュロ等、プロシーディング・ナショナル拳アカデミーφサイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第９６３６〜９６４０頁（１９８６）および米国特許第５．０９８．８９０号公報に報告されている。ざらにマジェロ等は、推定ｃ−ｍｙｂ蛋白質の予想される６４０アミノ酸配列を開示している。開始コドンＡＴＧが位置１１４に存在し、その前に５′−未翻訳領域が存在する。

位置２０３４における停止コドンＴＧＡに続き約１２００ヌクレオチドの間隔で３′−未翻訳領域が存在し、その後に約１４０ヌクレオチドのポリ・（Ａ）末端が続く。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の化学的なオリゴヌクレオチド合成法で合成することができる。この種の方法は一般に、たとえばウィンナツカ−１「遺伝子からクローンまで：遺伝子工学の序論」、ｖｃＨフエアラークスゲゼルシャフトｍｂＨ社（Ｈ，アイベルガラフッ・トランスレージタン、１９８７）に記載されている。

任意公知のオリゴヌクレオチド合成法を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成に用いることができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは最も有利には、任意の市販自動化核酸合成装置を用いて作成される。この種の１つの装置、すなわちアプライド・バイオシステムス３８０Ｂ型　ＤＮＡ合成装置はβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用いる。

ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物に対し相補的なりＮＡ（７）完全ヌクレオチド合成は公知であるので、ｍＲＮＡ転写物の任意の部分に対しハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドは当業者に公知のオリゴヌクレオチド合成法により作成することができる。

任意長さのオリゴヌクレオチドを本発明の実施に用いつるが、１２塩基よりも短い配列は標的ｃ−ｍｙｂｍＲＮＡに対しハイブリダイズする特異性が低く、酵素切断によって容易に破壊され、さらに酵素切断によって不安定化されうる。したがって、１２もしくはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好適である。

長い配列、特に約４０ヌクレオチドよりも長い配列は、標的細胞による吸収が低下するためｃ−ｍｙｂ翻訳の抑制において若干効果が低い。したがって１２〜４０ヌクレオチドのオリゴマーが好適であり、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド、特に好ましくは１８〜２６ヌクレオチドである。１８〜２１ヌクレオチドの配列が最も好適である。

ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の任意の部分に対し相補的かつハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドは、原理的に転写物の翻訳抑制に有効であると共にここに記載した作用を誘発することができる。翻訳は開始コドンの部位またはそれに近い部位にてｍＲＮＡを封鎖することにより最も効果的に抑制されると思われる。

したがって、。−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の５′−末端領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドが好適である。ハイブリッド化を妨げるような二次もしくは三次構造はこの領域にて最小であると思われる。さらに、開始部位から３′方向にて離れ過ぎる配列は「リードスルー」現象のためｍＲＮＡ転写物のハイブリッド化において効果が低いことも示唆されており、したがってリボリゾームはアンチセンス／センスデユープレックスを解きほぐしてメツセージの翻訳を可能にすると思われる［たとえばシエーキン、ジャーナル・バイオケミストリー、第２６１巻、第１６０１８頁（１９８６）参照］。

好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛋白質合成のための開始コドンの部位またはその近くに指向する。開始コドン（完全転写物のヌクレオチド１１４〜１１６からなるｃ−ｍｙｂ転写物の翻訳部分の５′末端に位置する第１コドン）を含むｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡに対し相補的なオリゴヌクレオチドが好適である。

ｃ−ｍｙｂ転写物の５′−末端領域、特に開始コドンを含む領域に対し相補的なアンチセンスオリゴマーが好適であるが、有用なアンチセンスオリゴマーはｍＲＮＡの翻訳部分（ヌクレオチド１１４〜２０３１）に存在する配列に対し相補的なものに限定されず、５′−および３′−未翻訳領域に含まれ或いはそこまで延びるヌクレオチド配列に対し相補的なオリゴマーをも包含する。相ると思われる。

転写物の５′−未翻訳領域に対し相補的な好適オリゴヌクレオチドは、キャップヌクレオチド（すなわち転写物の５′−最末端におけるヌクレオチド）を含むｃ −ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する分子を包含する。モレキュラ・クローニング、第２版［サムプルツク等編（１９８９）、第７゜６６〜７．７０頁、参考のためここに引用する］の８１ヌクレア一ゼ分析法に実質的にしたがってｃ−ｍｙｂキャップ部位の位置を決定し、その際高レベルのｃ　−ｍ　ｙｂ　ｍＲＮＡを発現する白血病細胞ラインＣＣＲＦ−ＣＥＭから分離されたｍＲＮＡを用いた。最長の明瞭に見えるバンドが、公表されたｃ−ｍｙｂ　ｃＤＮＡの９０塩基対上流に位置し［マジュロ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第９５３６〜９６４０頁（１９８６）］、推定の原則キャップ部位を示す。この部位の位置は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞からクローン化されたＣ−ｍｙｂ　ｃＤＮＡの長さと完全に一致する［クラーケ等、モレキュラ・セルラーメ・バイオロジー、第８巻、第８８４〜８９２頁（１９８８）］。さらに＄１保護分析は、キャップ部位に対応する主バンドの他に薄いバンドをも示した。これらの他のバンドは希な或いは不安定なｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ転写物を示しうる。転写開始の複数部位は、たとえば完全ＴＡＴＡＡ枠を欠如するｃ−ｍｙｂのような遺伝子において希でない。キャップヌクレオチドで始まるｍＲＮＡ転写物５′−末端のヌクレオチド配列は容易に確認することができ、これに対し相補的かつハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成することができる。

以下の４０量体オリゴデオキシヌクレオチドは、転写物の開始コドンから始まってその下流（５′方向）に延びるｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物に対し相補的である：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１゜上記配列に基づく小さいオリゴマー（特に開始コドンを有するｃ−ｍｙｂメツセージのセグメントに対しハイブリダイズしうるオリゴマー）を用いることができる。

次の２６〜１５量体が特に好適である：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１　、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３゜転写物の翻訳部分（完全転写物のヌクレオチド１１７〜１１９）の第２コドンで始まるｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物に対し相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが他の好適オリゴマー群である。この種のオリゴマーはたとえば次の２１〜１５量体を包含する：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０゜用いるオリゴヌクレオチドは未改変オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体を示すことができる。

すなわち、本発明による用途を有するｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドは生物学上重要な天然ヌクレオチド、すなわちＡｌｄＡ、Ｇ、ｄＧ、Ｃ５ｄａ、ＴおよびＵのオリゴマーだけでなく、向上した安定性および／または脂質可溶性につき改変されたオリゴヌクレオチド種類をも包含する。

たとえば、向上した脂質可溶性および／またはヌクレアーゼ切断に対する耐性は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合におけるホスフェート酸素の代わりにアルキル基もしくはアルコキシ基を用いてアルキルホスホネートオリゴヌクレオシドもしくはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを生成させることにより生ずることが知られている。特にホスホロチオエートはヌクレアーゼ切断に対し安定でありかつ脂質に可溶性である。これらは公知の自動合成法により合成することができる。

たとえばこれらの非イオン型オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ加水分解に対する向上した耐性および／または向上した細胞吸収を特徴とすると共に、相補的核酸配列との安定な複合体を形成する能力を保持する。特にアルキルホスホネートはヌクレアーゼ切断に対し安定であり、かつ脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオシドの製造については米国特許第４，４６９゜８６３号公報に開示されている。特にメチルホスホネートが好適である。

メチルホスホネートオリゴマーは、溶液中および不溶性ポリマー支持体上の両者にて各種の方法で作成することができる［アグローワルおよびリフチナ、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第６巻、第３００９〜３０２４頁（１９７９）；ミラー等、バイオケミストリー、第１８巻、第５１３４〜５１４２頁（１９７９）、ミラー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、第９６５９〜９６６５頁（１９８０）；ミラー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻、第５１８９〜５２０４頁（１９８３）、ミラー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻、第６２２５〜６２４２頁（１９８３）、ミラー等、バイオケミストリー、第２５巻、第５０９２〜５０９７頁（１９８６）；エンゲルスおよびジャガー、アンゲバンテ・ヘミ−・サブルメント、第９１２頁（１９８２）；シンハ等、テトラヘドロン・レタース、第２４巻、第８７７〜８８０頁（１９８３）、ドルマン等、テトラヘドロン、第４０巻、第９５〜１０２頁（１９８４）：ジャガーおよびエンゲルス、テトラヘドロン・レタース、第２５巻、第１４３７〜１４４０頁（１９８４）；ノープル等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１２巻、第３３８７〜３４０４頁（１９８４）：キャラハン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第１６１７〜１６２１頁（１９８６）；コジオルキエウィッツ等、ケミ力・スフリプタ、第２６巻、第２５１〜２６０頁（１９８６）：アグローワルおよびグツドチャイルド、テトラヘドロン・レタース、第３８巻、第３５３９〜３５４２頁（１９８７）；レスニコウスキー等、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第５５３５〜５５３８頁（１９８７）；サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ。

第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）］。

メチルホスホネートオリゴヌクレオシドの最も効率的な製造方法は、オリゴデオキシリボヌクレオチドを作成するために使用されるメトキシもしくはβ−シアノエチルホスホルアミダイト試薬と同様である５′　−〇−ジメトキントリチルデオキシヌクレオシド−３′　−〇−ジイソプロピルメチルホスホルアミダイト中間体の使用を含む。メチルホスホネートオリゴマーは、自動化ＤＮＡ合成装置を用い調節気孔のガラスポリマー支持体にて作成することができる［サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）］。

さらに、ヌクレアーゼ切断に対する耐性も５′末端と３′末端との両者におけるヌクレオチド間結合をダブル等の方法［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１８巻、第４７５１〜４７５７頁（１９９０）］に従いホスホロアミダイトで改変して達成することができる。

ここに記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するのに適したヌクレオチド同族体は、限定はしないが米国特許第４，４６９，８６３号公報に開示されたエチルもしくはメチルホスホネート同族体を包含する。

ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合に硫黄と酸素との置換を有する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、デユープレックス形成のための効果的ハイブリッド化の性質と実質的なヌクレアーゼ耐性とを兼備すると共に帯電したホスフェート同族体の水溶性を保持する。

帯電は、リセプタを介する細胞吸収の性質を付与すると思われる［ローフ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８６巻、第３４７４〜３４７８頁（１９８９）］。

ホスホロチオエート改変オリゴデオキシヌクレオチドはラブランシエ等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、第９０８１頁（１９８６）およびステック等、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０６巻、第６０７７頁（１９８４）に記載されている。

ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一般的合成法はスタイン等［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１６巻、第３２０９〜３２２１頁（１９８８）］により改変されて、これら化合物をホスホロアミダイト手法により自動合成装置で容易に合成しつるようにした。

さらに、オリゴリボヌクレオチド同族体の製造における最近の進歩は、上記目的で他の試薬、たとえば２′　−〇−メチルリボヌクレオチド［イノラブ等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第６１３１頁（１９８７）］および複合ＲＮＡ−，ＤＮＡ同族体であるキメラオリゴヌクレオチド［イノラブ等、ＦＥＢＳレタース、第２１５巻、第３２７頁（１９８７）］をも使用しうろことを意味する。

ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ翻訳の抑制はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドもしくはオリゴデオキシリボヌクレオチドのいずれを用いても可能であるが、遊離オリゴリボヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチドよりもリボヌクレアーゼによる酵素攻撃に対し感受性が大である。したがって、本発明の実施にはオリゴデオキシリボヌクレオチドが好適である。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡとのハイブリッド化に際し得られるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデユーブレックスがＲＮアーゼＨ（これはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を特異的に攻撃する）の基質であるため一層好適である。デユープレックスのｍＲＮＡストランドの減成は、他のｃ−ユニ上メツセージとのハイブリッド化のためのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドストランドを遊離する。

一般に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｂメツセージの標的部分に対し完全に相補的な配列を有する。しかしながら、特に大型オリゴマーでは絶対的相補性を必要としない。したがって、ｃ−ｍｙｂのｒｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列」と言う表現は必ずしも転写物に対し１００％の相補性を有する配列を意味しない。一般に、Ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡとの安定なデユープレックスを形成するのに充分な相補性を有するオリゴヌクレオチドが適している。安定なデユープレックス形成は、ハイブリッド化するオリゴヌクレオチドの配列および長さ並びにＣ−ｍｙｂメツセージの標的領域に対する相補性の程度に依存する。一般に、ハイブリッド化するオリゴマーが大きい程、より大きいミスマツチを許容することができる。

２個以上のミスマツチは恐らく約２１ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴマーについては許容されない。当業者は、任意所定のアンチセンスオリゴマーと標的Ｃ−ｍｙｂメツセージ配列との間で許容しうるミスマツチの程度を融点に基づき（したがって得られるデユープレックスの安定性に基づき）容易に決定することができる。

所定塩基対の組成を有するデユープレックスの融点は標準的文献［たとえばモレキュラ・クローニング：ラボラトリ−・マニューアル（第２版、１９８９）、Ｊ、サムブック等、編］から容易に決定することができる。

ｃ−ｍｙｂメツセージの領域と安定にハイブリッド化しつるオリゴヌクレオチドが本発明の範囲内であるが、開始コドンを含む領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドが特に効果的であると思われる。開始コドンの４０ヌクレオチド上流（５ ′方向）まで或いは開始コドンの４０ヌクレオチド下流（３′方向）までのｃ− ｍｙｂｍＲＮＡの領域に対しハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが特に好適である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは正常なヒト造血作用を抑制することが観察された。しかしながら、これらは正常細胞よりも顕著に低い濃度にてｃ− ｍｙｂ結腸直腸癌細胞の増殖を抑制する。以下に確認されるように、正常結腸細胞は検出可能レベルのｃ−ｍｙｂ転写物を発現しない。その増殖はしたがって、結腸癌細胞により抑制されない。この医薬上顕著な感度差は、結腸直腸癌の処置に本発明のオリゴヌクレオチドを有用にする。

治療用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドをたとえば適する液体ビークルもしくは賦形薬のような医薬キャリアおよび適宜の添加剤、補助添加剤と組合せることができる。液体ビークルおよび賦形剤は慣用のもので、市販されている。

その例は蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液などである。ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは非経口的、特に好ましくは静脈内に投与される。それに応じてビークルが設計される。結腸直腸癌から生ずる肝臓転移を処置するには、オリゴヌクレオチドの直接的な動脈内投与を用いることができる。他の可能なオリゴマー投与ルートは直腸内および経口投与を包含する。

慣用のキャリヤによる投与の他に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは各種の特殊なオリゴヌクレオチド供給技術によって投与することもできる。たとえば、オリゴヌクレオチドを治療的供給のためリポソーム内にカプセル化することもできる。オリゴヌクレオチドはその溶解度に応じ水層および脂質層の両者に存在させることがで　′き、或いは一般にリポソーム懸濁物と称するものに存在させることもできる。疎水性層は一般に、限定はしないがたとえばレシチンおよびスフィンゴミエリンのような燐脂質；たとえばコレステロールのようなステロイド；たとえばジアセチルホスフェート、ステアリルアミンもしくはホスファチジン酸のようなイオン性表面活性剤；および／または疎水性を有する他の物質を包含する。オリゴヌクレオチドはユニラメラリポソームにカプセル化することに成功している。

再編成されたセンダイ・ウィルス・エンベロツブを用いて、ＲＮＡおよびＤＮＡを細胞に供給することに成功している［アラド等、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ、第８５９巻、第８８〜９４頁（１９８６）］さらに、アンチセンスオリゴマーもポリ（Ｌ−リジン）結合体として供給されている。この種の結合体はレメトワ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第６４８〜６５２頁（１９８７）に記載されている。

ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは、罹患した個人における結腸直腸癌の増殖を抑制すると共に正常細胞の生存を維持するのに有効な量にて投与することができる。この種の量は腫瘍の性質および程度、用いる特定のオリゴヌクレオチド、および他の因子に応じて変化することができる。実際の投与量は患者の体格および体重２、処置の性質が予防もしくは治療のいずれであるか、或いは患者の年齢、健康および性別、投与ルートおよび他の因子を考慮することができる。当業者は、患者の特定環境および必要性に適する投与の量および計画を容易に得ることができる。結腸直腸癌細胞増殖の顕著な抑制が、成る種の細胞ラインにつき１部ｇ／ｍ１位の低アンチセンス濃度にて観察された。４０μｇ／ｍｌにて抑制が最も顕著であった。約１〜約１００μｇ　／　ｍ　Ｉの濃度、好ましくは約１０〜約１００μｇ　／　ｍ　ｌ　、特に好ましくは約４０〜約６０μｇ／ｍｌの濃度を用いることができる。患者は、これらの薬剤の細胞間濃度を達成するのに充分なアンチセンスオリゴヌクレオチドの１日投与量を摂取すべきである。

１日投与量は１日当たり約０．１〜１．０００ｍｇのオリゴヌクレオチド、好ましくは１日当り約１０〜約１，０００ｍｇの範囲とすることができる。それより多量もしくは少量のオリゴヌクレオチドを所要に応じ投与することもできる。当業者は、各場合に最適投与量を容易に決定することができる。

以下、限定はしないが実施例により本発明を一層詳細に説明する。

全てヒト結腸腺癌に由来のＬｏＶｏＳＣｏ　Ｉｏ　２０５およびＨＴ　２９細胞ライン［トレーナ−等、インターナショナル・ジャーナル・キャンサー、第４１巻、第２８７〜２９６頁（１９８８）］を次の実験に用いた。

ドキソルビシン耐性をＩ、ｏＶｏ細胞の１部に誘発させて、グランジ等の方法［ブリティッシュ・ジャーナル・キャンサー、第５４巻、第５１５〜５１８頁（１９８６）］にしたがいドキソルビシンを含有する培地にて長時間培養することによりＬ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘサプラインを形成させた。

細胞を１０％胎児牛血清（バイオロジカル・インダストリース社）が補充されたＨａｍ、’ｓ　Ｆ　１２培地（ギブコ社）で培養し、２ｍＭグルタミンと抗生物質（ＭＡバイオプロダクツ社）とにより６５℃にて１５分間予備処理した。３Ｘ１０’個の細胞を２４穴プレート（コスタ−社）にシーディングし、次いでｃ− ｍｙｂセンス（Ｓ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○＝２１）もしくはアンチセンス（Ａｓ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１７）をそれぞれ４　Ｑ　 μｇ　／　ｍ　Ｌ　、　３０　μｇ／ｍｌおよび２０μｇ　／　ｍ　Ｌにて３日間にわたり培地に添加した。ＳおよびＡＳオリゴヌクレオチドは、翻訳ｃ−ｍｙｂメツセージのコドン２〜７に相当する。細胞を３つの異なる減少量のＡＳに露出して、上記の初期投与量（４０μｇ／ｍｌ）の１／３．１／１０および１／４０である濃度を得た。センスオリゴヌマーは最高投与量でのみ投与した。比較細胞をオリゴデオキシヌクレオチドなしに同じ条件下で培養した。３日間の後、細胞を機械的脱着により回収し、計数し、次いでトリノ々ンブルー染色処理によって生存率につき分析した。細胞増殖割合を測定するため、３Ｘ１０’のＳ−およびＡＳ−処理細胞および未処理細胞をオリゴデオキシヌクレオチドでの処理の後に洗浄し、Ｈ３−ＴｄＲ（１μＣｉ／穴１個）で処理すると共に３７℃にて６時間培養した。次いで細胞を洗浄し、細胞回収装置（タイターチク・セル・ハーベスタ−５５０、フロー・ラボラドリース社）を用いてガラス繊維器に固定した。

βカウンタを用いて放射能を測定した。非特異性の放射能を培地で測定し、カウントから差引いた。

第１Ａ図に示したように、３日間にわたりｃ−ｍｙｂＡＳオリゴデオキシヌクレオチドの最高投与量に露出したＬ　ｏ　Ｖ　ｏ　、　Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘおよびＣｏ１ｏ　２０５細胞の増殖数は、培地単独で増殖させた細胞と比較し、それぞれ５５％、５６％および７３％減少した。Ｈ３−ＴｄＲ組込については、ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドに対する露出の後にＬｏＶｏにて８４％、Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　ＤＸにて８３％およびＣｏ１ｏ２０５細胞にて６８％減少した（第１Ｂ図）。増殖活性における差は、未処理細胞Ｔ　２９細胞の増殖はｃ− ｍｙｂＡＳ処理により顕著には影響されないことが判明した。

第２図によれば、Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘおよびＣｏ１ｏ　２０５細胞は最低投与量のＡＳオリゴデオキシヌクレオチドにより抑制されなかったが、これはＬｏＶｏ細胞に対してはまだ有効であった。したがってＡｓ投与量の低下は投与量依存性の抑制差をもたらしつる。各細胞ラインにおける細胞増殖の抑制は、実施例に２に説明するようにｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡレベルに相関した。

ｃ−ｍｙｂ発現の測定定常期のｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡレベルをＬｏＶｏ、Ｌｏｖｏ／Ｄｘ、Ｃｏ１ｏ　２０５およびＨＴ　２９ヒト癌細胞ラインのノーサン・プロット分析により次のように測定した。上記の結腸癌細胞ライン並びに新鮮な正常結腸粘膜からのＲＮＡおよびＤＮＡの同時的分離をグアニジンイソチオシアネート／塩化セシウム法により行った［デービス等、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジー［エルセビール出版、ニューヨーク、１９８６］。細胞を４Ｍグアニジンイソチオシアネート／　２５　ｍ　Ｍクエン酸ナトリウム１０．５％サルコシル１０、　７％β−メルカプトエタノールに回動によって溶解させた。細胞溶解物を塩化セシウムクッション（４，９５Ｍ　ＣｓＣ１１０，ＬＭ酢酸ナトリウム１５ｍＭＥＤＴＡ）に添加し、３５０００ｒｐｍにて２５℃で１６時間にわたり遠心分離した。全ＲＮＡをチューブの底部におけるベレットから超遠心分離で回収した。全ＲＮＡをクロロホルム／イソブタノールで２回抽出し、次いでエタノール沈殿させた。全ＲＮＡ（２０Ｍｇ）を変性させ、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離し、次いでナイロンフィルタ（ハイポンドＮ１アメルシヤム社）に移した。核酸を８０℃にて２時間にわたりフィルタに結合させた。予備ハイブリッド化およびノーサン・プロット・ハイブリッド化をコロンボ等、イミュノジェネティックス、第２６巻、第９９〜１０４頁（１９８７）に記載されたように行った。フィルタを２Ｘ　５ＳＣ１０，１％　ＳＤＳにて室温で１５分間にわたり２回洗浄し、次いで０．２ｘ　ＳＳＣ／１．０９６　ＳＤＳ＋：ｒ５２℃で３０分間にわたり２回もしくは３回洗浄した。Ｃ−ｍｙｂＲ現を定量するため、ノーサン・プロットの濃度測定走査をＬＫＢウロトロスキャンＸＬで行った。

て発現されかつＣｏ１ｏ　２０５では過剰に発現され（恐らく遺伝子増大による）たのに対し、ＨＴ　２９も正常結腸粘膜も６日間未満のｎ８時間にて検出しつるレベルの転写物を示さながったことを示した。ノーサン・プロットの濃度測定走査は、ｃ　−ｍ　ｙ　ｂ発現がＬＯＶＯ／　Ｄ　ｘにてＬｏＶｏよりも１５倍高いことを示した。Ｌ込分析により示されるように、この細胞ラインの高い増殖活性に相関すると思われた。

ウザンプロットにより示した。

Ｌ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘの全ＲＮＡから、ヌクレオチド２２５４〜２４８７からのｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡの３′−未翻訳領域に相当する２３４ヌクレオチド部分を逆転写および合成ヒトｃ−ｍｙｂ特異性プライマ［カラシオロ等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲーション、第４１巻、第２８７〜２９６頁（１９８８）］でのＰＣＲ増大により次のように発生させた。全ＲＮＡを、ｃ　−ｍ　ｙた。ＲＮＡを２０Ｍｇのイー・コリｔＲＮＡで沈殿させ、１×逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ社）に再懸濁し、１００ｎＨの３’　ｃ−ｍｙ　ｂプライマ（合成的に作成）を５５℃で９０分間にわたりアニールし、次いでｃＤＮＡの第１ストランドを４００Ｕのモロニーネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＢＲＬ社）を用い３７℃にて１時間にわたり合成した。反応を停止させ、混合物を１×テルムス・アクアチフス（ＴａＱ）ポリメラーゼ緩衝液で希釈した。５′および３′プライマをそれぞれ２ｎｇ／リットルの最終濃度まで添加すると共に、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（センス）を添加してｃＤＮＡ断片を増大させた。６０サイクルのＰＣＲをパーキン・エルマーφサーマル・サイクラ−にて行い、これは５５ ℃でアニールし、７２℃で合成すると共に９５℃で変性させて行った。

陽性比較および陰性比較を用いて、汚染配列の増大を排除した。ＰＣＲ生成物を２％ヌシーブ・アガロースゲルで分離し、アルカリ性プロットによりナイロンフィルタ（ハイポンドＮ１アメルシヤム社）に移した。得られたプロットを５０℃ にて、ヌクレオチド２．３５１〜２゜へ合成装置により作成）とハイブリッド化させた。このプローブをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（プロメガ・バイオチク社、マジソン、ｗＢおよびγ−Ｐ３２−ＡＴＰで５′末端標識した。ハイブリッド化の後、フィルタを２ｘ　５ＳＣ１０，１％　ＳＤＳにて室温で１０分間にわたり洗浄し、次いで５０”Ｃにて３０分間洗浄した後、８０℃にてＸ線フィルムに１晩露出した。

オリゴデオキシヌクレオチド処理および未処理のＬＯるｃ−ｍｙｌ）転写物の存在を示したが、ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに露出したＬｏＶｏ　／　Ｄ　ｘ細胞では存在しながった。２−マイクログロブリンｍＲＮＡレベルは全試料にて一定であった。これは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる遺伝子発現の特異的抑制を示す。ｃ　−ｍ　ｙ　りアンチセンスオリゴヌクレオチドに露出されたＬ　ｏ　Ｖ　ｏ　／　Ｄ　ｘ細胞にて、θＨ− チミジン組込は細胞増殖よりも明確に抑制され、けるＤＮＡ合成を防止したことを示唆する。

胞の増殖はアンチセンスオリゴヌクレオチドにより効果的に抑制することができる。抑制作用を発揮するアンチセンスの投与量はｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ発現のレベルに関連する。結腸癌細胞の増殖、したがって付随する腫瘍成長および病気進行は高レベルのｃ−ｍｙｂ発現によって維持される。

以上、本発明の詳細な説明したが、本発明はその思想および範囲を逸脱することなく改変することができ、したがって本発明の範囲は上記説明だけでなく請求の範囲を参照すべきである。

配ｌＬジ里二に上（１）一般的情報：（ｉ）出願人：テンプル　ユニバージティー　−イブ　ザ　コモンウェルス　システム　イブハイヤー　エデュヶーション（ｉｉ）発明の名称：ｃ−ユニ上プロト−オンコジーンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる結腸癌の処置（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数：２１（ｉ　ｖ）通信宛先：（Ａ）宛先：テンプル　ユニバージティー　−イブ　ザ　コモンウェルス　システム　イブハイヤー　エデュヶーション（Ｂ）街名＝４０６ユニバーシテイー　サービス（Ｄ）州名：ペンシルバニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：　１９１２２（ｖ）コンピュータ解読形態：（Ａ）メディア種類：ディスケット、３．５０インチ、７２０Ｋｂ（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）作動シスチムニＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェアー：ワードパーフェクト５．１（ｖｉ）出願データ：（Ａ）８願番号：未知（Ｂ）出願日　同時出願（Ｃ）分類　未知（ｖｉｉ）先行出願データ：（Ａ）出願番号：０７／７０４．８６２（Ｂ）出願日：１９９１年５月２３日（ｖｉｉｉ）代理人の情報：（Ａ）氏名：モナコ、ダニエル　エイ（Ｂ）登録番号：３０，４８０（Ｃ）参照／ドケット番号＋　６０５６−１４１（ｉｘ）電信情報：（Ａ）電話：　（２１５）５６８−８３８３（Ｂ）テレファックス：（Ｃ）テレックス：なしく２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ＝４０ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＣＧＴＣＡＣＴＧＣＴ　ＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧ　ＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡＴ　４０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ、２６ヌクレオチド（Ｂ）種類　核酸（Ｃ）鏡型・一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ａ’ｒｃｃ’ｒｃ’ｒｃｃｃ　ＧＧＧＧＴＣ’Ｉ’ｒＣＧ　ＧＧＣＣＡＴ　２６（２）ＳＥＱ　ｉＤ　ＮＯ：３（７）情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ・２５ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧ　ＧＧＧＴＣＴＴＣにＧ　ＧＣＣＡＴ　２５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　４の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ、　）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鏡型ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：４：ＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧ　ＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧ　ＣＣＡＴ　２４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝２３ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧ　ｃ’ｒｃ ’ｒｒｃｃｃｃｃ　ＣＡＴ　２３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２２ヌクレオチド（Ｂ）種類、核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘ　ｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：ＴＧＴＧＣＣＧＧＧＧ　ＴｃＴｒＣＧＧＧＣＣＡＴ　２２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア（７）情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２１ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア・ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴ　ＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡ　Ｔ　２１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：ＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＩ’ＣＧＧＧＣＣＡＴ　２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１９ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘ　ｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴ　ＴＣＧＧＧＣＣＡＴ　１９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（７）情報：（＋）配列特性：（Ａ）長さ：１８ヌクレオチＶ（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：ＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴ　ＣＧＧＧＣＣＡＴ　１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：ＣＧＧＧＧＴＣＷＣＧＧＧＣＣＡＴ　１７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝１６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＧＧＧＧＴＣＩ’ｒＣＧ　ＧＧＣＣＡＴ　１６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝１５ヌクレオチド（Ｂ）種類、核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘ　ｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：ｃｃｃ’ｒｃ’ｒｒｃｃｃ　ＧＣＣＡＴ　１５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２１ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧ　ＧＧＴＣＴ’ｒＣＧＧＧ　Ｃ２１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧ　ＧＴＣＴｒＣＧＧＧＣ２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１９ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ｒｐ　ＮＯ：１６：ＴＧＴＧＣＣＧＧＧＧ　ＴＣＴＴＣＧＧＧＣ１９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１８ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７・ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴ　ＣＴＴＣＧＧＧＣ１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：ＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣ１７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：、１９の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１６ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１．９：ＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴ　ＴＣＧＧＧＣ１６（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２Ｃｌ）情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１５ヌクレオチド（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配Ｍ説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０：ＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴ　ＣＧＧＧＣ１，５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１の情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１８ヌクレオチド（Ｂ）Ｍ類：核酸（Ｃ）鏡型、−重鎖（Ｄ）トポロジー、線状（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１ＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＣ１８ＦＩＧ、　ＩＡ処　置ＦＩＧ、　ＩＢ処　置３ＨＴｄＲ組込みの抑制（％）ＦＩＧ、２Ｂ　’　２°　４０　６０　８０抑　制　％（細胞数）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｃ−ｍｙｂ遺伝子を発現する結腸直腸癌の処置方法において、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの有効量を処置を必要とする患者に投与し、前記オリゴヌクレオチドは前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうることを特徴とする結腸直腸癌の処置方法。
２．オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体である請求の範囲第１項に記載の方法。
３．オリゴヌクレオチドがメチルホスホネートオリゴヌクレオシドもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである請求の範囲第２項に記載の方法。
４．オリゴヌクレオチドが翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に位置するｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２項に記載の方法。
５．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって、前記転写物の翻訳開始コドンおよび／または開始コドンから直ぐ下流のコドンを含むｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡ転写物の１部に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２項に記載の方法。
６．オリゴヌクレオチドが１２量体〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲第２項に記載の方法。
７．オリゴヌクレオチドがメチルホスホネートオリゴヌクレオシドもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである請求の範囲第６項に記載の方法。
８．オリゴヌクレオチドが１５量体〜３０量体である請求の範囲第６項に記載の方法。
９．オリゴヌクレオチドが１８量体〜２６量体である請求の範囲第６項に記載の方法。
１０．オリゴマーが１８量体〜２１量体である請求の範囲第８項に記載の方法。
１１．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第８項に記載の方法。
１２．オリゴデオキシヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１０に対応するヌクレオチド配列を有する請求の範囲第９項に記載の方法。
１３．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第８項に記載の方法。
１４．オリゴヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７に対応するヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡ転写物に対しハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの、ｃ−ｍｙｂ遺伝子を発現する結腸直腸癌を処置する薬物を製造するための使用。
１６．オリゴヌクレオチドが少なくとも１２量体である請求の範囲第１５項に記載の使用。
１７．オリゴヌクレオチドがメチルホスホネートオリゴヌクレオシドもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである請求の範囲第１６項に記載の使用。
１８．オリゴヌクレオチドが、翻訳開始コドンの約４０ヌクレオチド以内に位置するｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮＡの１部に対し相補的なヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１６項に記載の使用。
１９．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって、転写物の翻訳開始コドンおよび／または開始コドンから直ぐ下流のコドンを含むｃ−ｍｙｂｍＲＮＡ転写物の１部に対し相補的なデオキシヌクレオチド配列を有する請求の範囲１６項に記載の使用。
２０．オリゴヌクレオチドが１２量体〜４０量体オリゴデオキシヌクレオチドからなる請求の範囲１６項に記載の使用。
２１．オリゴヌクレオチドがメチルホスホネートオリゴヌクレオシドもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである請求の範囲第２０項に記載の使用。
２２．オリゴヌクレオチドが１５量体〜３０量体である請求の範囲第２０項に記載の使用。
２３．オリゴヌクレオチドが１８量体〜２６量体である請求の範囲第２項に記載の使用。
２４．オリゴマーが１８量体〜２１量体である請求の範囲第３項に記載の使用。
２５．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２項に記載の使用。
２６．オリゴデオキシヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１０に対応するヌクレオチド配列を有する請求の範囲第５項に記載の使用。
２７．オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドであって：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２項に記載の使用。
２８．オリゴヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７に対応するヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２７項に記載の使用。