EA035756B1 - Композиции и способы ингибирования экспрессии генов вируса гепатита в - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к двунитевой рибонуклеиновой кислоте (днРНК) для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит днРНК, или молекулы нуклеиновой кислоты, или векторы, кодирующие их, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; к способам для лечения заболеваний, вызванных инфекцией вируса гепатита В, с применением указанной фармацевтической композиции; и способам ингибирования экспрессии гена вируса геатита В в клетке.

Description

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к двунитевым рибонуклеиновым кислотам (днРНК) и к их применению при опосредовании РНК-интерференции для ингибирования экспрессии генов, необходимых для репликации и патогенеза вируса гепатита В, в частности, для ингибирования вирусной полимеразы, поверхностного антигена, антигена Е и белка X. Более того, применение указанных днРНК для лечения или предотвращения хронических заболеваний/нарушений печени, воспалений, фиброзных состояний и нарушений пролиферации, таких как рак, образующихся в результате инфекции вирусом гепатита В, также является частью настоящего изобретения.

Вирус гепатита В представляет собой строго гепатотропный вирус, содержащий двунитевую ДНК. Хотя генетический материал представлен ДНК, цикл репликации включает этап обратной транскрипции с копированием прегеномной РНК в ДНК. Для выполнения этого важного этапа кодируемая вирусом полимераза обладает обратнотранскриптазной активностью. Вирус гепатита В согласно классификации принадлежит к гепаднавирусам и относится к семейству Hepadnaviridae. Первичное заражение взрослых людей вирусом гепатита В вызывает острый гепатит с симптомами воспаления органов, лихорадкой, желтушностью и повышенным уровнем трансаминаз печени в крови. Около 95% случаев острого гепатита проходят без лечения. Пациенты, которые не способны побороть вирусную инфекцию, страдают от хронического развития заболевания в течение многих лет с повышенным риском развития цирроза печени или рака печени. Перинатальная передача новорожденным от матерей, инфицированных вирусом гепатита В, также приводит к хроническому гепатиту. Средства для лечения инфекции хроническим гепатитом В ограничены и только в некоторых случаях приводят к полной и длительной ремиссии. Дополнительные клинические и терапевтические осложнения возникают у пациентов с вирусом гепатита В, коинфицированных вирусами гепатита С, гепатита D или вирусом иммунодефицита человека.

Вирус гепатита В передается через кровь или продукты крови, сперму, вагинальный секрет или слюну. Употребление наркотиков и половое сношение являются факторами риска и поддерживают распространение вируса. Для инфекции может быть достаточно контакта поврежденного слизистого эпителия с зараженными жидкостями организма.

Инкубационный период составляет от 40 до 200 дней. Риск инфекции пропорционален количеству полученных частиц вируса гепатита В. Младенцы часто заражаются перинатально от матерей, имеющих вирус гепатита В, что является основной проблемой здоровья на эндемичных территориях.

Приблизительно 2 млрд человек инфицированы вирусом гепатита В и 400 млн являются хроническими носителями. Территориями широкого распространения являются Африка и Юго-Восточная Азия с локальной концентрацией инфицированных лиц 20-80%.

Основываясь на гомологии последовательностей, вирусы гепатита В классифицируют на генотипы А-Н; наиболее важными из которых являются генотипы A-D. Генотип А часто встречается в СевероЗападной Европе, США, Южной и Центральной Америке. Генотипы В и С преобладают в Китае, Японии, Индонезии и других странах Восточной Азии. Генотип D обнаружен в Южной Европе, Северной Африке и Южной Африке. Течение заболевания и ответ на фармацевтическое лечение различаются между генотипами.

Инфекционные частицы вируса гепатита В имеют диаметр приблизительно 42 нм. Внешняя двуслойная мембрана содержит большой, средний и малый поверхностные белки. Когнатный рецептор на гепатоцитах для связывания поверхностных белков и интернализации неизвестен. Множество копий корового белка образуют сферическую нуклеокапсидную структуру внутри вирусной частицы. Каждый нуклеокапсид несет частичную двунитевую ДНК в качестве генетического материала вместе с вирусной полимеразой.

После захвата гепатоцитами нуклеокапсид переносится в ядро и ДНК высвобождается. Синтез цепи ДНК завершается, и двуцепочечные разрывы восстанавливаются для образования ковалентно замкнутой кольцевой (кзк) суперспирализованной ДНК размером 3,2 т.н. кзк ДНК выступает в качестве матрицы для транскрипции четырех основных вирусных мРНК, по 3,5; 2,4; 2,1 и 0,7 т.н. длиной. Все мРНК являются 5'-кэпированными и полиаденилированными на 3'-конце. Существует перекрывание последовательностей на 3'-конце между всеми четырьмя мРНК.

мРНК размером 3,5 т.н. выступает в качестве матрицы для образования корового белка и полимеразы. Дополнительно этот транскрипт выступает в качестве прегеномного промежуточного продукта репликации и позволяет вирусной полимеразе инициировать обратную транскрипцию ДНК. Коровый белок необходим для образования нуклеокапсида. Кроме того, последующие этапы процессинга преобразуют некоторые коровые белки в секретируемый антиген Е. Количество антигена Е в крови коррелирует с репликацией вируса гепатита В в печени и выступает важным диагностическим маркером для мониторинга течения болезни.

мРНК размером 2,4 и 2,1 т.н. несут открытые рамки считывания pre-S1, pre-S2 и S2 для экспрессии большого, среднего и малого поверхностного антигена вируса. Антиген S связан с полноценными инфекционными частицами. Дополнительно кровь инфицированного пациента также содержит неинфекционные частицы, образованные только из антигена S, свободного от геномной ДНК или полимеразы. Функция этих частиц не до конца понятна. Полное и устойчивое истощение обнаруживаемого антигена S

- 1 035756 в крови рассматривают как надежный индикатор клиренса вируса гепатита В и, таким образом, успешного лечения.

мРНК размером 0,7 т.н. кодирует белок X. Этот генный продукт важен для эффективной транскрипции вирусных генов, а также выступает трансактиватором экспрессии генов хозяина. Последняя активность представляется важной для трансформации гепатоцитов во время развития рака печени.

Рекомбинантный антиген S вируса гепатита В используют для вакцинации. Введение трех доз приготовленного в виде лекарственной формы антигена S во временных точках день 1, 4 недели и 6 месяцев обычно вызывает образование достаточного титра нейтрализующих антител. Вакцинированные пациенты защищены в течение 10 лет или дольше. Однако вакцины не являются заменителями терапии.

Пациентов с острой инфекцией вирусом гепатита В не подвергают лечению из-за высокого природного уровня ремиссии. Однако пациентов с обнаруживаемым антигеном S, антигеном Е или вирусной ДНК в крови в течение более чем 6 месяцев рассматривают как хронически инфицированных. Аналоги нуклеозидов в качестве ингибиторов активности обратной транскриптазы являются первым средством лечения для многих пациентов. Ламивудин, Тенофовир или Энтекавир подавляют репликацию вируса гепатита В, иногда до необнаруживаемого уровня. Наиболее важными эффектами являются улучшение функции печени и уменьшение воспаления печени. Однако только немногие пациенты достигают полной и длительной ремиссии после окончания лечения. Более того, вирус гепатита В развивает устойчивость к лекарственным препаратам с увеличением длительности лечения. Это особенно критично для пациентов, коинфицированных вирусами гепатита В и иммунодефицита человека. Оба вируса являются восприимчивыми к препаратам на основе аналогов нуклеозидов и могут совместно развивать устойчивость к ним.

Вторым средством для лечения является введение интерферона альфа. В данном случае пациент получает большие дозы интерферона альфа в течение 6 месяцев. В зависимости от генотипа вируса лечению поддаются более 50% хронических инфекций. Однако азиатский генотип В дает очень слабый уровень ответа. Коинфекция с гепатитом D или вирусом иммунодефицита человека делает терапию интерфероном альфа полностью неэффективной. Для пациентов с существенными повреждениями печени и тяжелыми фиброзными состояниями терапия интерфероном альфа не рекомендуется.

Несмотря на существенные достижения в области лечения вируса гепатита В остается потребность в агенте, способном селективно и эффективно подавлять экспрессию генов вируса, блокировать репликацию и последовательно снижать вирусную нагрузку у хронически инфицированных пациентов.

Было показано, что молекулы двунитевой РНК (днРНК) способны блокировать экспрессию генов в результате высоко консервативного регуляторного механизма, известного как РНК интерференция (РНКи). Настоящее изобретение обеспечивает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), а также композиции и способы для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В, в частности экспрессии гена вируса гепатита В, в клетке, в ткани или в млекопитающем с использованием таких днРНК. Настоящее изобретение также предусматривает композиции и способы для лечения или предотвращения патологических состояний и заболеваний, вызванных инфекцией вирусом гепатита В, таких как хронические заболевания/нарушения печени, воспаления, фиброзные состояния и нарушения пролиферации, такие как рак.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), способные селективно и эффективно снижать экспрессию гена вируса гепатита В. Применение РНКи вируса гепатита В обеспечивает способ для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний/нарушений, связанных с хроническими заболеваниями/нарушениями печени, воспалениями, фиброзными состояниями и нарушениями пролиферации, такими как рак; указанные способы включают введение днРНК, нацеленной на вирус гепатита В, в организм человека или животного.

В одном предпочтительном варианте реализации описанная молекула днРНК способна ингибировать экспрессию гена вируса гепатита В по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80%.

В одном варианте реализации настоящее изобретение предусматривает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК) для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В, в частности экспрессии генов, относящихся к репликации или патогенезу вируса гепатита В. днРНК включает по меньшей мере две последовательности, комплементарные друг другу. днРНК включает кодирующую цепь, включающую первую последовательность, и некодирующую цепь, включающую вторую последовательность, см. последовательности, представленные в перечне последовательностей, а также специфичные пары днРНК в прилагаемых табл. 1 и 2. В одном варианте реализации кодирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична по меньшей мере части мРНК вируса гепатита В. Указанная последовательность расположена в области комплементарности кодирующей цепи к некодирующей цепи, предпочтительно в пределах нуклеотидов 2-7 с 5'-конца некодирующей цепи. В одном предпочтительном варианте реализации днРНК специфически нацелена на ген вируса гепатита В, который кодирует коровый белок, вирусную полимеразу, поверхностный антиген, антиген Е или белок X. Более того, предпочтительно, что днРНК специфически нацелена на консенсусную последовательность, которая имеет высоко консервативную последовательность нуклеиновой ки

- 2 035756 слоты среди геномных последовательностей генотипов А, В, С и D вируса гепатита В. Предпочтительно консенсусная последовательность представляет собой по меньшей мере 13 последовательных нуклеотидов в длину, более предпочтительно по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 19 последовательных нуклеотидов. Предпочтительные высоко консервативные последовательности нуклеиновой кислоты представлены в табл. 5.

В одном варианте реализации, некодирующая цепь включает нуклеотидную последовательность, в значительной степени комплементарную по меньшей мере части мРНК, кодирующей указанный ген вируса гепатита В, и область комплементарности наиболее предпочтительно менее чем 30 нуклеотидов вдлину. Более того, предпочтительно, что длина описанных в настоящей заявке молекул днРНК согласно настоящему изобретению (длина дуплекса) находится в диапазоне от 16 до 30 нуклеотидов, в частности, в диапазоне от 18 до 28 нуклеотидов. Особенно полезными в контексте настоящего изобретения являются длины дуплексов приблизительно 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. Наиболее предпочтительными являются участки дуплекса длиной 19, 21 или 23 нуклеотидов. днРНК после доставки в клетку, инфицированную вирусом гепатита В, ингибирует экспрессию гена вируса гепатита В in vitro по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80%.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Табл. 1. Коровые последовательности днРНК, нацеленных на ген вируса гепатита В. Заглавные буквы обозначают нуклеотиды РНК.

Фиг. 2 Табл. 2. Характеристика днРНК, нацеленных на вирус гепатита В: Исследование активности с единичной дозой. Заглавные буквы обозначают нуклеотиды РНК, строчные буквы с, g, а и u обозначают 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, s обозначает фосфотиоат, dT обозначает дезокситимидин, заглавные буквы А, С, G, U, за которыми следует f, обозначают 2'-фтор нуклеотид. Строчная р обозначает 5'-фосфат. (invdT) обозначает инвертированный дезокситимидин (3'-3'связанный).

Фиг. 3. Табл. 3. Характеристика днРНК, нацеленных на вирус гепатита В: Стабильность. t¹/₂ = период полужизни цепи, как определено в примерах.

Фиг. 4. Табл. 4. Коровые последовательности днРНК, нацеленных на ген вируса гепатита В, и их модифицированные копии. Заглавные буквы обозначают нуклеотиды РНК, строчные буквы с, g, а и u обозначают 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, s обозначает фосфотиоат, dT r обозначает дезокситимидин, заглавные буквы А, С, G, U, за которыми следует f, обозначают 2'-фтор нуклеотид. Строчная р обозначает 5'-фосфат. (invdT) обозначает инвертированный дезокситимидин (3'-3'связанный).

Фиг. 5. Табл. 5. Последовательности сайта-мишени днРНК, нацеленных на вирус гепатита В, и их степень перекрывания по отношению к генотипам А, В, С и D вируса гепатита В. n = количество доступных последовательностей вируса гепатита В (ВГВ) каждого генотипа.

Фиг. 6. Табл. 6. Учетные номера в базе NCBI Genbank геномных последовательностей вируса гепатита В.

Фиг. 7. Табл. 7. Сравнение эффективности нокдауна и перекрывания геномов ВГВ для единичной днРНК и их комбинаций. Изучение активности для комбинации двух днРНК проводили в конечной концентрации 10 нМ и 1 нМ с наибольшей эффективностью днРНК в соответствии с табл. 2 и сравнивали с соответствующими данными.

Фиг. 8. Табл. 8. Последовательности отрицательного контроля днРНК, использованные в скрининговом анализе psiCHECK™-2.

Подробное описание изобретения

Прилагаемая табл. 1 относится к предпочтительным молекулам, используемым в качестве днРНК в соответствии с настоящим изобретением. Также в настоящей заявке предусматриваются модифицированные молекулы днРНК, которые являются, в частности, раскрытыми в прилагаемой табл. 2, представляющей иллюстративные примеры модифицированных молекул днРНК согласно настоящему изобретению. Как указано выше по тексту, табл. 2 содержит иллюстративные примеры модифицированных днРНК согласно настоящему изобретению (тем самым, соответствующие кодирующая цепь и некодирующая цепь приведены в данной таблице). Взаимосвязь предпочтительных немодифицированных молекул, приведенных в табл. 1, с модифицированными днРНК из табл. 2 проиллюстрирована в табл. 4. При этом иллюстративные модификации этих компонентов днРНК согласно настоящему изобретению приведены в настоящей заявке в качестве примеров модификаций.

В табл. 3 приведены селективные биологически, клинически и фармацевтически значимые параметры определенных молекул днРНК согласно настоящему изобретению.

Некоторые из предпочтительных молекул днРНК представлены в прилагаемой табл. 1, где, среди прочего и предпочтительно, кодирующая цепь выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 26. Некодирующая цепь выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NO: 157, 158, 160, 161, 162, 163, 164 и 186. Соответственно молекула днРНК согласно настоящему изобретению

- 3 035756 может, среди прочего, включать пары последовательностей, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1/157, 2/158, 3/160, 4/161, 5/162, 6/163, 7/164 и 26/186. В контексте специфичных молекул днРНК, предусмотренных настоящей заявкой, пары номеров SEQ ID NO относятся к соответствующим последовательностям кодирующей и некодирующей цепи (от 5' до 3'), как показано в таблицах.

В одном варианте реализации молекулы днРНК включают некодирующую цепь с 3' липким концом длиной 1-5 нуклеотидов, предпочтительно длиной 1-2 нуклеотида. Предпочтительно липкий конец некодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, которые являются комплементарными мРНК, кодирующей белок, который необходим для репликации или патогенеза вируса гепатита В, в частности коровый белок, вирусную полимеразу, поверхностный антиген, антиген Е и белок X. В другом предпочтительном варианте реализации указанные молекулы днРНК включают кодирующую цепь с 3' липким концом длиной 1-5 нуклеотидов, предпочтительно длиной 1-2 нуклеотида. Предпочтительно указанный липкий конец кодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, которые являются идентичными мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза вируса гепатита В.

В другом предпочтительном варианте реализации молекулы днРНК включают кодирующую цепь с 3' липким концом длиной 1-5 нуклеотидов, предпочтительно длиной 1-2 нуклеотида и некодирующую цепь с 3' липким концом длиной 1-5 нуклеотидов, предпочтительно длиной 1-2 нуклеотида. Предпочтительно указанный липкий конец кодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными прегеномной РНК и/или мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза вируса гепатита В, и указанный липкий конец некодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, которые являются по меньшей мере на 90% комплементарными мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза вируса гепатита В.

Молекулы днРНК согласно настоящему изобретению могут состоять из нуклеотидов, существующих в природе, или могут состоять из по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида, такого как 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид, инвертированный дезокситимидин, нуклеотид, включающий 5'-фосфотиоатную группу, и концевой нуклеотид, связанный с производным холестерина или бисдециламидной группой додекановой кислоты. 2'-модифицированные нуклеотиды могут иметь дополнительное преимущество, заключающееся в том, что происходит подавление определенных иммуностимулирующих факторов или цитокинов при применении молекул днРНК согласно настоящему изобретению in vivo, например, в медицинском учреждении. В качестве альтернативы и без ограничений, модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, нуклеотида, лишенного азотистого основания, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида морфолино, фосфорамидата и нуклеотида, включающего основание, не встречающееся в природе. В одном предпочтительном варианте реализации, молекулы днРНК содержат по меньшей мере один из следующих модифицированных нуклеотидов: 2'-О-метилмодифицированный нуклеотид, нуклеотид, включающий 5'-фосфотиоатную группу, и дезокситимидин. Предпочтительные молекулы днРНК, который содержат модифицированные нуклеотиды, представлены в табл. 2. В другом предпочтительном варианте реализации, один из нуклеотидов дезокситимидина на 3'конце обеих цепей представляет собой инвертированный дезокситимидин.

В предпочтительном варианте реализации молекулы днРНК согласно настоящему изобретению содержат модифицированные нуклеотиды, подробно описанные в последовательностях, представленных в табл. 2. В одном предпочтительном варианте реализации молекула днРНК согласно настоящему изобретению включает пары последовательностей, которые выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1/157, 2/158, 3/160, 4/161, 5/162, 6/163, 7/164 и 26/186, и включает липкие концы на некодирующей и/или кодирующей цепи, состоящие из 1-2 дезокситимидинов. В одном предпочтительном варианте реализации, молекула днРНК согласно настоящему изобретению включает пары последовательностей, которые выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1/157, 2/158, 3/160, 4/161, 5/162, 6/163, 7/164 и 26/186, и содержит модификации, детально описанные в табл. 2. Предпочтительные молекулы днРНК, включающие модифицированные нуклеотиды, перечислены в табл. 2-4, из них наиболее предпочтительные молекулы днРНК представлены в SEQ ID NO: 321/485, 322/486, 324/488, 325/489, 326/490, 327/491, 328/492 и 350/514.

В другом варианте реализации днРНК согласно настоящему изобретению содержат модифицированные нуклеотиды в положениях, отличных от тех, которые раскрыты в табл. 2. В одном предпочтительном варианте реализации, два дизокситимидиновых нуклеотида находятся на 3'-концах обеих цепей молекулы днРНК. Предпочтительно указанные дезокситимидиновые нуклеотиды образуют липкий конец.

В одном варианте реализации молекулы днРНК согласно настоящему изобретению включают кодирующую и некодирующую цепи, причём обе цепи имеют период полужизни, который составляет по меньшей мере 0,9 ч. В одном предпочтительном варианте реализации, молекулы днРНК согласно настоящему изобретению включают кодирующую и некодирующую цепи, где обе цепи имеют период полу-жизни, который составляет по меньшей мере 48 ч, предпочтительно в сыворотке крови человека.

В другом варианте реализации предусматривается последовательность нуклеиновой кислоты, кото

- 4 035756 рая кодирует кодирующую цепь и/или некодирующую цепь, включенную в днРНК, как определено в настоящей заявке.

Изобретение также предусматривает клетки, которые содержат по меньшей мере одну из днРНК согласно настоящему изобретению. Клетки предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих, такие как клетки человека. Более того, ткани и/или организмы, не относящиеся к человеку, которые включают определенные в настоящей заявке молекулы днРНК, представляют собой варианты реализации настоящего изобретения, при условии, что указанный организм, не относящийся к человеку, является особенно полезным для использования в исследовательских целях или в качестве инструмента исследования, например, при исследовании лекарственных препаратов.

Помимо этого настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В, в частности, гена вируса гепатита В, который кодирует коровый белок, вирусную полимеразу, поверхностный антиген, антиген Е или белок X, в клетке, ткани или организме, включая следующие этапы:

(a) введение в клетку, ткань или организм двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), как определено в настоящей заявке; и (b) поддержание указанной клетки, ткани или организма, полученного на этапе (а), в течение времени, достаточного для достижения деградации мРНК транскрипта гена вируса гепатита В, тем самым ингибируя экспрессию гена вируса гепатита В в данной клетке.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, который содержат по меньшей мере один вид днРНК согласно настоящему изобретению. Эти фармацевтические композиции являются особенно полезными для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В в клетке, ткани или организме.

Предпочтительно указанный по меньшей мере один вид молекул двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению нацелен на область прегеномной РНК и/или мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза гена вируса гепатита В. Более предпочтительно указанная область-мишень для молекул двуцепочечной рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает консенсусную последовательность, которая является высоко консервативной среди геномных последовательностей генотипов А, В, С и D вируса гепатита В, и указанная консенсусная последовательность представляет собой по меньшей мере 13 последовательных нуклеотидов в длину, предпочтительно по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 19 последовательных нуклеотидов. Предпочтительные высоко консервативные последовательности нуклеиновых кислот перечислены в табл. 5. Фармацевтические композиции можно использовать для лечения пациентов, инфицированных вирусом гепатита В любого генотипа или коинфицированных различными генотипами вируса гепатита В.

В случае если фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере два вида молекул двуцепочечной рибонуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, предпочтительно, что мишени указанных молекул двуцепочечной рибонуклеиновой кислоты отличаются друг от друга. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов и для предотвращения развития устойчивости вируса гепатита В к фармацевтическим композициям. В предпочтительном варианте реализации, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат комбинацию молекул днРНК, детально описанных в последовательностях, представленных в табл. 7. В одном предпочтительном варианте реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат комбинации пар днРНК, которые выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 322/486 и 333/497, 322/486 и 346/510, 322/486 и 330/494 и 322/486 и 324/488.

Фармацевтические композиции, описанные выше, могут также содержать фармацевтически приемлемый/приемлемые носитель/носители, растворитель/растворители и/или вспомогательное вещество/вспомогательные вещества.

В другом варианте реализации настоящее изобретение предусматривает способы лечения, предотвращения или контроля над хроническими заболеваниями/нарушениями печени, воспалениями, фиброзными состояниями и/или пролиферативными нарушениями, такими как рак, обусловленными вирусом гепатита В; указанный способ, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, предотвращении или контроле, терапевтически или профилактически эффективного количества одной или более днРНК согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанный субъект представляет собой млекопитающее, наиболее предпочтительно пациента - человека.

В одном варианте реализации настоящее изобретение предусматривает способ лечения субъекта, имеющего патологическое состояние, вызванное инфекцией вируса гепатита В. Такие состояния включают нарушения, связанные с хроническими заболеваниями/нарушениями печени, воспалениями, фиброзными состояниями и/или нарушениями пролиферации, такими как рак, как описано выше. В данном варианте реализации днРНК выступает в качестве терапевтического агента для контроля экспрессии гена вируса гепатита В. Способ включает введение пациенту (например, человеку) фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, в результате чего подавляется экспрессия гена вируса гепатита В. Благодаря своей высокой специфичности днРНК согласно настоящему изобретению специфичным

- 5 035756 образом нацелена на мРНК гена вируса гепатита В. В одном предпочтительном варианте реализации описанная днРНК специфически снижает уровень мРНК вируса гепатита В и не влияет непосредственно на экспрессию и/или уровень мРНК нецелевых генов в клетке.

В одном предпочтительном варианте реализации описанная днРНК уменьшает уровень мРНК вируса гепатита В в печени in vivo по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80%. В другом варианте реализации описанные днРНК уменьшают уровень мРНК вируса гепатита В in vivo в течение по меньшей мере 4 дней. В другом предпочтительном варианте реализации, днРНК согласно настоящему изобретению применяют для приготовления фармацевтической композиции для лечения хронических заболеваний/нарушений печени, воспалений, фиброзных состояний и/или нарушений пролиферации, таких как рак. Заболевания, которые можно подвергать лечению с помощью указанной фармацевтической композиции, включают, но не ограничиваются ими: хронический гепатит (ХГ), цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярную карциному (ГПК).

В другом варианте реализации настоящее изобретение предусматривает векторы для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В в клетке, в частности, гена вируса гепатита В, которые содержат регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь молекул днРНК согласно настоящему изобретению.

В другом варианте реализации настоящее изобретение предусматривает клетку, которая содержит вектор для ингибирования экспрессии гена вируса гепатита В в клетке. Указанный вектор содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь молекулы днРНК согласно настоящему изобретению. При этом предпочтительно, что указанный вектор содержит помимо указанной регуляторной последовательности последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну кодирующую цепь днРНК согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одну некодирующую цепь указанной днРНК. Также предусмотрено, что заявленная клетка содержит два или более векторов, которые содержат, помимо указанных регуляторных последовательностей, определенную в настоящей заявке последовательность, которая кодирует (или последовательности, которые кодируют) по меньшей мере одну цепь молекул днРНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте реализации способ включает введение композиции, которая содержит днРНК, причём днРНК включает нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части РНК транскрипта гена вируса гепатита В млекопитающего, которого подвергают лечению. Как указано выше, векторы и клетки, включающие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют по меньшей мере одну цепь молекул днРНК, определенных в настоящей заявке, также можно применять в качестве фармацевтических композиций и можно вследствие этого также применять в способах лечения субъекта, нуждающегося в медицинском вмешательстве, описанных в настоящей заявке. Примечательно также, что эти варианты реализации, относящиеся к фармацевтическим композициям и к соответствующим способам лечения субъекта (человека), также относятся к таким подходам, как подходы генной терапии.

Молекулы днРНК, специфичные к гену вируса гепатита В, предусмотренные в настоящей заявке, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие отдельные цепи этих молекул днРНК согласно настоящему изобретению, можно также встраивать в векторы и применять в качестве векторов генной терапии для пациентов людей. Векторы генной терапии можно доставлять субъекту посредством, например, внутривенной инъекции, местного введения (см. Патент США 5328470) или посредством стереотаксической инъекции (см., например Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать вектор генной терапии в подходящем растворителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включен наполнитель для доставки генов. В качестве альтернативы, если полноценный вектор доставки генов можно в готовом виде получить из рекомбинантных клеток, например ретровирусные векторы, фармацевтические препараты могут включать одну или более клеток, которые продуцируют систему доставки генов.

В другом аспекте настоящего изобретения молекулы днРНК, специфичные к вирусу гепатита В, которые модулируют активность экспрессии генов вируса гепатита В, экспрессируют из транскрипционных единиц, встроенных в векторы на основе ДНК или РНК (см., например, Skillem A et al., международная заявка РСТ № WO 00/22113). Эти трансгены можно вводить в качестве линейной конструкции, циклической плазмиды или вирусного вектора, который можно встраивать в геном хозяина и который будет передаваться по наследству в качестве трансгена, встроенного в геном хозяина. Трансген также можно сконструировать таким образом, чтобы он обладал способностью наследоваться в виде экстрахромосомальной плазмиды (Gassmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Отдельные цепи днРНК можно транскрибировать с помощью промоторов в двух отдельных векторах экспрессии и котрансфицировать в клетки-мишени. В качестве альтернативы каждую отдельную цепь днРНК можно транскрибировать с помощью промоторов, оба из которых расположены на одной и той же экспрессирующей плазмиде. В предпочтительном варианте реализации, днРНК экспрессируют в виде инвертированного повтора, объединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, в

- 6 035756 результате чего днРНК образует структуру стебель-петля.

Векторы, экспрессирующие рекомбинантную днРНК, предпочтительно представляют собой ДНКплазмиды или вирусные векторы. Вирусные векторы, экспрессирующие днРНК, можно сконструировать на основе, но не ограничиваясь ими, аденоассоциированного вируса (для обзора, см. Muzyczka et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129); аденовируса (см., например, Berkner et al., BioTechniques (1998) 6:616; Rosenf eld et la Science (1991) 252:431-434; и Rosenf el det al. Cell (1992) 68:143-155); или альфавируса, а также других, известных в данной области техники. Ретровирусы использовали для введения множества генов в клетки различных типов, включая эпителиальные клетки, in vitro и/или in vivo (см., например, Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464). Рекомбинантные ретровирусные векторы, способные трансдуцировать и экспрессировать гены, встроенные в геном клетки, можно получать путем трансфицирования рекомбинантного ретровирусного генома в подходящие пакующие клеточные линии, такие как РА317 и Psi-CRIP (Comette et al., Human Gene Therapy (1991) 2:5-10; Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы можно использовать для инфицирования широкого разнообразия клеток и тканей в восприимчивых хозяевах (например, крыса, хомяк, собака и шимпанзе) (Hsu et al., J. Infectious Disease, (1992) 166:769); они обладают преимуществом, которое заключается в отсутствии потребности в миотически активных клетках для инфицирования.

Промотор, управляющий экспрессией днРНК в ДНК-плазмидном или вирусном векторе согласно настоящему изобретению, может представлять собой эукариотическую РНК-полимеразу I (например, рибосомальный РНК промотор), РНК-полимеразу II (например, ранний промотор CMV или актиновый промотор, или промотор мяРНК U1) или предпочтительно промотор РНК-полимеразы III (например, промотор U6 мяРНК или 7SK РНК) или прокариотический промотор, например, промотор Т7; предусмотренная экспрессирующая плазмида также кодирует РНК-полимеразу Т7, необходимую для транскрипции промотора Т7. Промотор может также направлять экспрессию трансгена в поджелудочную железу (см., например, регуляторную последовательность инсулина для поджелудочной железы (Bucchini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:2511-2515).

Экспрессию трансгена можно также точно регулировать, например, используя индуцибельную регуляторную последовательность и экспрессирующие системы, такие как регуляторная последовательность, чувствительная к определенным физиологическим регуляторам, например к уровню циркулирующей глюкозы в крови, или к гормонам (Docherty et al., FASEB J. (1994) 8:20-24). Такие индуцибельные системы экспрессии, подходящие для контроля экспрессии трансгена в клетках или в млекопитающих, включают регуляцию с помощью экдизона, эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-бета-О1-тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области техники способен выбрать подходящую регуляторную последовательность/последовательность промотора на основании предполагаемого применения днРНК трансгена.

Рекомбинантные векторы, обеспечивающие экспрессии молекул днРНК, предпочтительно доставляют, как описано ниже, и поддерживают в клетках-мишенях. В качестве альтернативы, можно использовать вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул днРНК. Такие векторы при необходимости можно вводить неоднократно. Один раз экспрессированная днРНК связывается с РНК-мишенью и модулирует ее функцию или экспрессию. Доставка векторов, экспрессирующих днРНК, может быть системной, например, путем внутривенного или внутримышечного введения в клеткимишени, отобранные от пациента, с последующим повторным введением пациенту, или может осуществляться любым другим способом, который позволяет введение в желаемую клетку-мишень.

ДНК плазмиды, экспрессирующие днРНК, обычно трансфицируют в клетки-мишени в виде комплекса с катионными липидными носителями (например, олигофектамином) или некатионными носителями на основе липидов (например, Transit-TKO™). Настоящее изобретение также рассматривает множественные липидные трансфекции для днРНК-опосредованных нокдаунов, нацеленные на различные области единичного гена вируса гепатита В или нескольких генов вируса гепатита В, в течение недели или более. Успешное введение векторов согласно настоящему изобретению в клетки хозяина можно изучать, используя различные известные способы. Например, временную трансфекцию можно идентифицировать с помощью репортера, такого как флуоресцентный маркер, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильную трансфекцию клеток ex vivo можно подтвердить, используя маркеры, которые предают трансфицированным клеткам устойчивость к специфическим факторам окружающей среды (например, антибиотикам или лекарственным препаратам), такую как устойчивость к гигромицину В.

Следующее подробное описание раскрывает процессы создания и применения днРНК и композиций, содержащих днРНК, для ингибирования экспрессии целевого гена вируса гепатита В, а также композиции и способы для лечения заболеваний и нарушений, вызванных инфекцией указанного вируса гепатита В.

Определения

Для удобства ниже представлено значение некоторых терминов и фраз, используемых в настоящей заявке, в примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если существует видимое расхождение между применением термина в других частях настоящей заявки и его значением, представленным в данной сек

- 7 035756 ции, должно превалировать определение из данной секции.

Каждый из G, С, A, U и Т или dT соответственно обычно означает нуклеотид, который содержит в качестве основания гуанин, цитозин, аденин, урацил и дезокситимидин соответственно. Однако термин рибонуклеотид или нуклеотид может также относиться к модифицированному нуклеотиду, как более детально описано ниже, или к заместительной группе-заменителю. Последовательности, включающие такие заместительные группы, представляют собой варианты реализации настоящего изобретения. Как детально описано ниже, описанные в настоящей заявке молекулы днРНК могут также включать липкие концы, т.е. неспаренные выступающие нуклеотиды, которые не вовлечены непосредственно в двунитевую структуру РНК, в норме образуемую определенной в настоящей заявке парой кодирующей цепи и некодирующей цепи. Часто такой выступающий участок содержит нуклеотид дезокситимидин, а в большинстве вариантов реализации - два дезокситимидина на 3'-конце. Такие липкие концы будут описаны и проиллюстрированы ниже.

Термин ген вируса гепатита В, используемый в настоящей заявке, относится к генам, необходимым для репликации и патогенеза вируса гепатита В, в частности к генам, которые кодируют коровый белок, вирусную полимеразу, поверхностный антиген, антиген Е или белок X, и к генам, которые кодируют их функциональные фрагменты. Термин ген/последовательность вируса гепатита В относится не только к последовательности/последовательностям дикого типа, но также и к мутациям и изменениям, которые могут быть включены в указанный ген/последовательность. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается специфичными молекулами днРНК, предусмотренными в настоящей заявке. Настоящее изобретение также относится к молекулам днРНК, которые включают некодирующую цепь, которая по меньшей мере на 85% комплементарна соответствующему участку нуклеотидов РНК транскрипта гена вируса гепатита В, который содержит такие мутации/изменения.

Термин консенсусная последовательность, используемый в настоящей заявке, относится к по меньшей мере 13 последовательным нуклеотидам, предпочтительно по меньшей мере 17 последовательным нуклеотидам, наиболее предпочтительно по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам, которые являются высоко консервативными среди геномных последовательностей генотипов А, В, С и D вируса гепатита В.

Используемый в настоящей заявке термин последовательность-мишень относится к последовательной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной при транскрипции гена вируса гепатита В, включая мРНК, которая представляет собой результат процессинга первичного транскрипционного продукта РНК.

Термин цепь, включающая последовательность, используемый в настоящей заявке, относится к олигонуклеотиду, включающему цепь нуклеотидов, которые описаны с помощью последовательности со ссылкой на использование стандартной нуклеотидной номенклатуры. Однако, как детально описано в настоящей заявке, такая цепь, включающая последовательность может также включать модификации, такие как модифицированные нуклеотиды.

Термин комплементарный, используемый в настоящей заявке, если не указано обратное, при применении для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, включающего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать структуру дуплекса при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, включающим первую нуклеотидную последовательность. Комплементарные последовательности, при применении в настоящей заявке, могут также включать (или могут быть образованными исключительно ими) пары не уотсонкриковских оснований, образованные не существующими в природе и модифицированными нуклеотидами, при условии, что выполнены вышеизложенные требования относительно их способности к гибридизации.

Последовательности, обозначаемые как полностью комплементарные, включают спаривание оснований олигонуклеотидов или полинуклеотидов, включающих первую последовательность нуклеотидов, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, включающим вторую последовательность нуклеотидов, по всей длине первой и второй нуклеотидной последовательности.

Однако если первую последовательность именуют в настоящей заявке как в значительной степени комплементарную по отношению ко второй последовательности, эти две последовательности могут быть полностью комплементарными или они могут образовывать в ходе гибридизации одну или более, но предпочтительно не более 13 пар оснований, спаренных не по принципу комплементарности.

Термины комплементарный, полностью комплементарный и в значительной степени комплементарный в настоящей заявке могут использоваться в отношении соответствия оснований между кодирующей цепью и некодирующей цепью днРНК или между некодирующей цепью днРНК и последовательностью-мишенью, что будет понятно из контекста их использования.

Термин двунитевая РНК, молекула днРНК или днРНК, используемый в настоящей заявке, относится к молекуле рибонуклеиновой кислоты или к комплексу молекул рибонуклеиновой кислоты, имеющих структуру дуплекса, включающую две антипараллельные и в значительной степени комплементарные цепи нуклеиновой кислоты. Две цепи, образующие структуру дуплекса, могут представлять

- 8 035756 собой различные части одной большей молекулы РНК или могут представлять собой отдельные молекулы РНК. Когда две цепи являются частями одной большей молекулы, в результате чего являются соединенными непрерывной цепью нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образуя структуру дуплекса, соединяющую цепь РНК обозначают как петля шпилька. Когда две цепи связаны ковалентно с помощью цепи, не являющейся непрерывной цепью нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образуя структуру дуплекса, соединяющую структуру обозначают как линкер. Цепи РНК могут иметь одинаковое или различное количество нуклеотидов. В дополнение к структуре дуплекса, днРНК может включать один или более липких концов нуклеотидов. Нуклеотиды в указанных липких концах могут включать от 0 до 5 нуклеотидов. где О означает отсутствие дополнительного нуклеотида/нуклеотидов, образующего липкий конец, и где 5 означает пять дополнительных нуклеотидов на отдельных цепях дуплекса днРНК. Эти дополнительные липкие концы расположены на З'-конце отдельных цепей. Как будет детально описано ниже, молекулы днРНК, которые включают только липкий конец на одной из двух цепей, также могут быть полезными и даже предпочтительными в контексте настоящего изобретения. Липкий конец содержит предпочтительно от 0 до 2 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно два нуклеотида dT (дезокситимидин) обнаружены на З'-конце обеих цепей днРНК. Также два нуклеотида U (урацил) можно использовать в качестве липких концов на З'-конце обеих цепей днРНК. Соответственно, термин нуклеотиды липкого конца относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают из структуры дуплекса днРНК, когда З'-конец одной цепи днРНК выступает более 5'-конца другой цепи, или наоборот. Например, некодирующая цепь содержит 23 нуклеотида и кодирующая цепь содержит 21 нуклеотид, образуя два нуклеотида липкого конца на З'-конце некодирующей цепи. Предпочтительно, два нуклеотида липкого конца являются полностью комплементарными мРНК гена-мишени. Тупой или тупой конец означает отсутствие неспаренных нуклеотидов на конце днРНК, т.е., отсутствие нуклеотидов липкого конца. днРНК с тупым концом представляет собой днРНК, которая является двунитевой по всей ее длине, т.е., нуклеотиды липкого конца отсутствуют на обоих концах молекулы.

Термин некодирующая цепь относится к цепи днРНК, которая включает область, в значительной степени комплементарную последовательности-мишени. Термин область комплементарности, используемый в настоящей заявке, относится к области некодирующей цепи, которая в значительной степени комплементарна последовательности, например, последовательности-мишени. Если область комплементарности не полностью комплементарна последовательности-мишени, нарушения комплементарности наиболее допустимы за пределами нуклеотидов 2-7 от 5'-конца некодирующей цепи.

Термин кодирующая цепь, используемый в настоящей заявке, относится к цепи днРНК, которая включает область, которая в значительной степени комплементарна области некодирующей цепи. В значительной степени комплементарна означает, что предпочтительно по меньшей мере 85% перекрывающихся нуклеотидов в кодирующей и некодирующей цепях являются комплементарными.

Введение в клетку по отношению к днРНК означает содействие захвату или абсорбции в клетку, как это понимают специалисты в данной области техники. Абсорбция или захват днРНК может возникать в результате спонтанного диффузионного или активного клеточного процессов или с помощью вспомогательных агентов или устройств. Значение данного термина не ограничивается клетками in vitro; днРНК можно также вводить в клетку, если клетка представляет собой часть живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, для доставки in vivo днРНК можно инъецировать в участок ткани или вводить системно. Предусматривается, что, например, молекулы днРНК согласно настоящему изобретению вводят субъекту, нуждающемуся в медицинском вмешательстве. Такое введение может включать инъекцию днРНК, вектора или клетки согласно настоящему изобретению в участок, пораженный болезнью, в указанном субъекте, например, в ткань/клетки печени или в раковые ткани/клетки, такие как ткань рака печени. Также предусматривается инъекция предпочтительно в тесной близости к ткани, пораженной болезнью. Введение в клетку in vitro включает способы, известные в данной области техники, такие как электропорация и липофекция.

Используемый в настоящей заявке термин хронические заболевания/нарушения печени относится к функциональным отклонениям печени, длящимся более чем шесть месяцев, которые могут быть вызваны инфекцией вирусом. Примером хронических заболеваний/нарушений печени является хронический гепатит (ХГ).

Термин воспаление, используемый в настоящей заявке, относится к биологическому ответу тканей тела на повреждение, раздражение или заболевание, которые могут быть вызваны вредным стимулом, например, патогенами, поврежденными клетками или раздражителями. Воспаление обычно характеризуется болью и отеком. Термин воспаление призван охватить как острые ответы, в которых воспалительный процесс является активным (например, нейтрофилы и лейкоциты), так и хронические ответы, которые характеризуются медленным течением, изменением типа клеток, представленных в участке воспаления, и образованием соединительной ткани. Одним из примеров заболевания, вызванного воспалением, является фиброз.

Термин фиброзные состояния, используемый в настоящей заявке, относится к функциональной проблеме органов, которая может быть вызвана ростом фиброзной ткани. Примером такого типа заболе

- 9 035756 вания является цирроз печени (ЦП).

Термин пролиферативный и пролиферация, используемый в настоящей заявке, относится к клеткам, осуществляющим митоз. Во всем объеме настоящейй заявки термин нарушение пролиферации относится к любому заболеванию/нарушению, которое характеризуется нежелательной или неправильной пролиферацией ткани. Используемый в настоящей заявке термин нарушение пролиферации также относится к условиям, в которых нерегулируемый и/или ненормальный рост клеток может привести к развитию нежелательного состояния или заболевания, которое может являться злокачественным или доброкачественным.

Рак, который подвергают лечению, включает, но не ограничивается им, рак печени, где указанный рак печени можно, среди прочего, выбирать из группы, состоящей из гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), гепатобластомы, смешанного рака печени, рака, происходящего из мезенхимальной ткани, саркомы печени или холангиокарциномы.

Термины подавлять, ингибировать экспрессию и нокдаун по отношению к гену вируса гепатита В относятся в настоящей заявке к по меньшей мере частичному подавлению экспрессии гена вируса гепатита В, что проявляется в уменьшении количества мРНК, транскрибируемой с гена вируса гепатита В, которую можно выделить из первой клетки из группы клеток, в которых транскрибируется ген вируса гепатита В и которую обработали/которые обработали таким образом, что экспрессия гена вируса гепатита В была ингибирована, в сравнении со второй клеткой из группы клеток, в значительной степени идентичных первой клетке из группы клеток, но которые не подвергали такой обработке (клетки контроля). Степень ингибирования обычно выражают в значениях:

(мРНК в клетках контроля) (мРНК в обработанных клетках) х 100% (мРНК в клетках контроля)

В качестве альтернативы, степень ингибирования можно представить в контексте уменьшения параметра, функционально связанного с транскрипцией гена вируса гепатита В, например, количества белка, кодируемого геном вируса гепатита В, который секретируется клеткой, или числом клеток, демонстрирующих определенный фенотип.

Как проиллюстрировано в прилагаемых примерах и прилагаемых таблицах, представленных в настоящей заявке, молекулы днРНК согласно настоящему изобретению способны ингибировать экспрессию вируса гепатита В по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80% в анализе in vitro, т.е. in vitro. Термин in vitro, используемый в настоящей заявке, включает, но не ограничивается им, анализ на культуре клеток. Специалист в данной области техники может легко определить степень такого ингибирования и связанных с ним эффектов, в частности в свете анализов, представленных в настоящей заявке.

Термин нецелевой, используемый в настоящей заявке, относится ко всем нецелевым мРНК транскриптома, которые, как прогнозируют с помощью методов in silico, способны гибридизироваться с описанной днРНК на основании комплементарности последовательности. днРНК согласно настоящему изобретению предпочтительно специфически ингибирует экспрессию гена вируса гепатита В, т.е. не ингибирует экспрессию любого нецелевого гена.

Термин период полужизни, используемый в настоящей заявке, представляет собой измерение стабильности соединения или молекулы; его можно оценить способами, известными специалисту в данной области техники, особенно в свете анализов, предусмотренных в настоящей заявке.

Термин неиммуностимулирующий, используемый в настоящей заявке, относится к отсутствию любой индукции иммунного ответа молекулами днРНК согласно настоящему изобретению. Способы для определения иммунных ответов хорошо известны специалисту в данной области техники, например, определение путем оценки высвобождения цитокинов, как описано в разделе примеров.

Термины лечить, лечение и тому подобные означают в контексте настоящего изобретения облегчение или уменьшение нарушения, связанного с инфекцией вирусом гепатита В, такого как хронические заболевания/нарушения печени, воспаления, фиброзные состояния и нарушения пролиферации, такие как рак.

Используемый в настоящей заявке термин фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество по меньшей мере одного вида днРНК и фармацевтически приемлемый носитель. Однако такая фармацевтическая композиция может также включать отдельные цепи таких молекул днРНК или вектора/векторов, описанных в настоящей заявке, включающих регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь из кодирующей или некодирующей цепи, включенной в днРНК согласно настоящему изобретению. Также предусматривается, что клетки, ткани или изолированные органы, которые экспрессируют или включают определенные в настоящей заявке днРНК, могут быть использованы в качестве фармацевтических композиций. Используемый в настоящей заявке термин фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество относится к такому количеству РНК, которое является эффективным для получения предполгаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата.

Термин фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю для введения терапевтиче

- 10 035756 ского агента. Такие носители включают, но не ограничиваются ими, солевой раствор, буферный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Термин специфически исключает культуральную клеточную среду. Для препаратов, которые вводят орально, фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как инертные растворители, разрыхлители, связывающие агенты, смазывающие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты, как известно специалистам в данной области техники.

В частности предусматривается, что фармацевтически приемлемый носитель позволяет осуществлять системное введение днРНК, векторов или клеток согласно настоящему изобретению. Поскольку также предусматрено кишечное введение, возможными путями введения пациенту, нуждающемуся в медицинском вмешательстве соединений согласно настоящему изобретению, является парентеральное введение, а также трансдермальное или трансмукозальное введение (например, инсуфляция, буккальное, вагинальное, анальное введение), а также ингаляция препарата. Если применяют парентеральное введение, оно может включать прямую инъекцию соединений согласно настоящему изобретению в ткань, подверженную заболеванию, или по меньшей мере в тесной близости от нее. Однако также и внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутрикожное, внутриоболочечное и другие пути введения соединений согласно настоящему изобретению находятся в рамках компетенции специалиста в данной области техники, например, лечащего врача.

Фармацевтические композиции для внутримышечного, подкожного и внутривенного применения согласно настоящему изобретению будут обычно поставляться в стерильных водных растворах или суспензиях, забуференных до подходящего рН и изотоничности. В предпочтительном варианте реализации носитель состоит исключительно из водного буфера. В данном контексте, исключительно означает отсутствие вспомогательных агентов или инкапсулирующих субстанций, которые могут влиять или опосредовать захват днРНК клетками, экспрессирующими ген вируса гепатита В. Водные суспензии в соответствии с настоящим изобретением могут включать суспендирующие агенты, такие как производные целлюлозы, альгинат натрия, поливинил-пирролидон и трагантовую камедь, и увлажняющий агент, такой как лецитин. Подходящие консерванты для водных суспензий включают этил и n-пропил ргидроксибензоат. Фармацевтические композиции, полезные в соответствии с настоящим изобретением, также включают инкапсулированные составы для защиты днРНК от быстрого выведения из организма, такие как составы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Способы приготовления таких составов будут очевидными специалистам в данной области техники. В качестве фармацевтически приемлемых носителей можно также использовать липосомальные суспензии и биспецифические антитела. Их можно приготовить в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например, описанными в публикации РСТ WO91/06309 и WO 2011/003780, которые включены посредством ссылки в настоящую заявку.

Используемый в настоящей заявке термин трансформированная клетка представляет клетку, в которую был встроен по меньшей мере один вектор, с которого может экспрессироваться молекула днРНК или по меньшей мере одна цепь такой молекулы днРНК. Такой вектор предпочтительно представляет собой вектор, включающий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну кодирующую цепь или некодирующую цепь днРНК согласно настоящему изобретению.

Можно обоснованно ожидать, что более короткие днРНК, включающие одну из последовательностей из табл. 1 и 4 за вычетом нескольких нуклеотидов на одном или обоих концах, могут иметь подобную эффективность в сравнении с днРНК, описанной выше.

В одном предпочтительном варианте реализации молекулы днРНК согласно настоящему изобретению включают нуклеотиды 1-19 последовательностей, представленных в табл. 1.

Как было указано выше, в большинстве вариантов реализации настоящего изобретения молекулы днРНК, предусмотренные в настоящей заявке, включают дуплекс (без липких концов) длиной от приблизительно 16 до приблизительно 30 нуклеотидов. Особенно полезные дуплексы днРНК имеют длину от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов. Наиболее предпочтительными являются дуплексные структуры длиной 19 нуклеотидов. В молекулах днРНК согласно настоящему изобретению некодирующая цепь является по меньшей мере частично комплементарной кодирующей цепи.

днРНК согласно настоящему изобретению могут содержать одно или более нарушений комплементарности к последовательности-мишени. В предпочтительном варианте реализации, днРНК согласно настоящему изобретению содержит не более 13 нарушений комплементарности. Если некодирующая цепь днРНК содержит нарушения комплементарности к последовательности-мишени, предпочтительно, что участок нарушения комплементарности не располагается в пределах нуклеотидов 2-7 от 5' конца некодирующей цепи. В другом варианте реализации предпочтительно, чтобы участок нарушения комплементарности не располагался в пределах нуклеотидов 2-9 от 5' конца некодирующей цепи.

Как указано выше, по меньшей мере один конец/одна цепь днРНК может иметь одноцепочечный липкий конец, состоящий из от 1 до 5, предпочтительно 1 или 2 нуклеотидов. днРНК, имеющая по

- 11 035756 меньшей мере один липкий конец, имеет неожиданно превосходящие ингибиторные свойства, чем ее копия с тупыми концами. Более того, авторы настоящего изобретения установили, что наличие липкого конца из всего лишь одного нуклеотида усиливает интерферирующую активность днРНК без влияния на ее общую стабильность. Было доказано, что днРНК, имеющая только один липкий конец, является чрезвычайно стабильной и эффективной in vivo, также как в разнообразии клеток, культуральных сред клеток, крови и сыворотки. Предпочтительно одноцепочечный липкий конец расположен на 3'-конце некодирующей цепи или, в качестве альтернативы, на 3'-конце кодирующей цепи. днРНК может также иметь тупой конец, предпочтительно расположенный на 5'-конце некодирующей цепи. Предпочтительно некодирующая цепь днРНК имеет липкий конец на 3'-конце, и 5'-конец является тупым. В другом варианте реализации один или более из нуклеотидов на липком конце заменены на нуклеозидтрифосфат.

днРНК согласно настоящему изобретению можно также химически модифицировать для повышения стабильности. Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению можно синтезировать и/или модифицировать с помощью методов, прочно установившихся в данной области техники. Химические модификации могут включать, но не ограничиваться ими, 2'-модификации, введение оснований, не существующих в природе, ковалентное присоединение к лиганду и замену фосфатных связей тиофосфатными связями, инвертированные дезокситимидины. В данном варианте реализации целостность структуры дуплекса усилена по меньшей мере одной, а предпочтительно двумя химическими связями. Химические связи можно образовать с помощью любой из разнообразия хорошо известных методик, например, путем введения ковалентных, ионных или водородных связей; гидрофобных взаимодействий, вандерваальсовых или стекинг-взаимодействий, с помощью координации ионами металлов или посредством использования аналогов пурина. Предпочтительно химические группы, которые можно использовать для модификации днРНК, включают, без ограничения, метиленовый синий; бифункциональные группы, предпочтительно бис-(2-хлорэтил)амин; №ацетил-Ы'-(р-глиоксибензоил)цистамин; 4-тиоурацил и псорален. В одном предпочтительном варианте реализации линкер представляет собой гексаэтиленгликолевый линкер. В данном случае днРНК получают с помощью твердофазного синтеза, и гекса-этиленгликолевый линкер встраивают в соответствии со стандартными способами (например, Williams DJ and Hall KB, Biochem. (1996) 35:14665-14670). В частном варианте реализации 5'-конец некодирующей цепи и 3'-конец кодирующей цепи химически связаны посредством гексаэтиленгликолевого линкера. В другом варианте реализации по меньшей мере один нуклеотид днРНК содержит фосфотиоатную или фосфодитиоатную группы. Химическая связь на концах днРНК предпочтительно образована связями тройной спирали.

В некоторых вариантах реализации химическая связь может быть образована с помощью одной или нескольких связывающих групп, где такие связывающие группы являются предпочтительно поли(оксифосфиникокси-1,3-пропандиолом) и/или цепями полиэтиленгликоля. В других вариантах реализации химическая связь может также быть образована с помощью аналогов пурина, введенного в двунитевую структуру вместо пуринов. В дальнейших вариантах реализации химическая связь может быть образована единицами азабензена, которые вводят в двунитевую структуру. В еще одних вариантах реализации химическая связь может быть образована разветвленными аналогами нуклеотидов, введенными в двунитевую структуру вместо нуклеотидов. В определенных вариантах реализации образование химической связи может быть индуцировано воздействием ультрафиолетового света.

В других вариантах реализации нуклеотиды на одной или на обеих из двух отдельных цепей могут быть модифицированы для предотвращения или ингибирования активации клеточных ферментов, например определенных нуклеаз. Методики для ингибирования активации клеточных ферментов известны в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, 2'-аминомодификации, 2'-аминомодификации сахаров, 2'-Е-модификации сахаров, 2'-Е-модификации, 2'-алкил-модификации сахаров, незаряженные модификации остова, модификации морфолино, 2'-О-метил-модификации и фосфорамидат (см., например, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Таким образом, по меньшей мере одну 2'гидроксильную группу нуклеотидов днРНК заменяют химической группой, предпочтительно 2'-амино или 2'-метильной группой. Также по меньшей мере один нуклеотид можно модифицировать для образования замкнутого нуклеотида. Такой замкнутый нуклеотид содержит метиленовый мостик, который соединяет 2'-кислород рибозы с 4'- углеродом рибозы. Введение замкнутого нуклеотида в олигонуклеотид улучшает аффинность комплементарных последовательностей и повышает температуру плавления на несколько градусов.

Модификации молекул днРНК, предусмотренных в настоящей заявке, могут положительно влиять на их стабильность in vivo, как же как in vitro, а также улучшить их доставку к (подверженному заболеванию) участку-мишени. Более того, такие структурные и химические модификации могут положительно влиять на физиологические реакции на молекулы днРНК во время введения, т.е. высвобождение цитокинов, которое предпочтительно угнетается. Такие химические и структурные модификации известны в данной области техники и, среди прочего, освещены в Nawrot Current Topics in Med Chem, (2006) 6:913925.

Конъюгирование лиганда с днРНК может повысить клеточную абсорбцию последней, а также нацеленность на конкретную ткань. В некоторых случаях, гидрофобный лиганд конъюгируют с днРНК для

- 12 035756 облегчения прямого проникновения через клеточную мембрану. В качестве альтернативы, лиганд, конъюгированный с днРНК, является субстратом для рецептор-опосредованного эндоцитоза. Эти подходы использовали для облегчения клеточного проникновения антисмысловых нуклеотидов. Например, холестерин конъюгировали с различными антисмысловыми нуклеотидами, приводя к образованию соединений, которые являются существенно более активными в сравнении с их неконъюгированными аналогами (см. Manoharan M, Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002) 12:103). Другие липофильные соединения, которые конъюгировали с олигонуклеотидами, включают 1-пиренмасляную кислоту, 1,3-бисО-(гексадецил)глицерин и ментол. Одним из примеров лиганда для рецептор-опосредованного эндоцитоза является фолиевая кислота. Фолиевая кислота проникает в клетки в результате эндоцитоза, опосредованного рецептором фолиевой кислоты. Соединения днРНК, несущие фолиевую кислоту, будут эффективно транспортироваться в клетку в результате эндоцитоза, опосредованного рецептором фолиевой кислоты. Присоединение фолиевой кислоты к 3'-концу олигонуклеотида приводит к увеличению эффективности клеточного захвата олигонуклеотида (Li S, Deshmukh HM, and Huang L, Pharm. Res. (1998) 15:1540). Другие лиганды, которые конъюгировали с олигонуклеотидами, включают полиэтиленгликоли, кластеры углеводов, перекрестносшивающие агенты, конъюгаты порфирина и пептиды для доставки.

В некоторых случаях конъюгация катионного лиганда с олигонуклеотидами часто приводит к улучшенной устойчивости к нуклеазам. Типичными примерами катионных лигандов являются пропиламмоний и диметилпропиламмоний. Примечательно, что антисмысловые нуклеотиды, как было сообщено, сохраняют свою высокую связывающую аффинность к мРНК, когда катионный лиганд диспергируют по всей длине олигонуклеотида. См. Manoharan M, Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002) 12:103 и включенные в нее ссылки.

днРНК согласно настоящему изобретению, конъюгированную с лигандом, можно синтезировать с применением днРНК, которая поддерживает реактивные функциональные свойства, такие как свойства, происходящие от присоединения связывающей молекулы к днРНК. Этот реактивный олигонуклеотид может вступить в реакцию непосредственно с коммерчески доступными лигандами, синтезированными лигандами, несущими любую из множества защитных групп, или лигандами, несущими связывающую группу, присоединенную к ним. Способы согласно настоящему изобретению облегчают синтез днРНК, конъюгированной с лигандом, с использованием в некоторых предпочтительных вариантах реализации мономеров нуклеозидов, которые были соответствующим образом конъюгированы с лигандами, которые можно затем присоединить к материалу твердой подложки. Такие лиганд-нуклеозидные конъюгаты, при необходимости присоединенные к материалу твердой подложки, готовят в соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами реализации способов согласно настоящему изобретению посредством реакции выбранного связывающегося с сывороткой лиганда со связывающей группой, расположенной в 5'-части нуклеозида или олигонуклеотида. В некоторых случаях днРНК, несущая аралкильный лиганд, присоединенный к 3'-концу днРНК, готовят с помощью первоначального ковалентного присоединения блока, связывающего мономер, к подложке из стелка с контролируемыми порами через длинноцепочечную аминоалкильную группу. Затем нуклеотиды присоединяют посредством стандартных методик твердофазного синтеза к блоку, связывающему мономер, присоединенному к твердой подложке. Блок, связывающий мономер, может представлять собой нуклеозид или другое органическое соединение, совместимое с твердофазным синтезом.

днРНК, используемую в конъюгатах согласно настоящему изобретению, можно беспрепятственно в установленном порядке создавать посредством хорошо известной методики твердофазного синтеза. Также известно применение подобных методик для подготовки других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоаты и алкилированные производные.

Указания, относящиеся к синтезу конкретных модифицированных олигонуклеотидов, можно найти в следующих Патентах США: Патенте США № 5218105, который описывает нуклеотиды, конъюгированные с полиамином, Патент США №№ 5541307, который описывает олигонуклеотиды с модифицированными остовами; Патент США № 5521302, который описывает процессы для приготовления олигонуклеотидов, имеющих хиральные фосфорные связи; Патент США № 5539082, который описывает пептидо-нуклеиновые кислоты; Патент США № 5554746, который описывает олигонуклеотиды с Рлактамными остовами; Патент США № 5,571,902, который описывает способы и материалы для синтеза олигонуклеотидов; Патент США № 5578718, который описывает нуклеотиды, имеющие алкилтиольные группы, где такие группы можно использовать в качестве линкеров к другим группам, присоединенным к любому из множества положений нуклеозида; Патент США № 5587361, который описывает олигонуклеотиды, имеющие фосфотиоатные связи высокой хиральной чистоты; Патент США № 5506351, который описывает процессы приготовления 2'-О-алкилгуанозина и родственных соединений, включая соединения 2,6-диаминопурина; Патент США № 5587469, который описывает олигонуклеотиды, имеющие N-2-замещенные пурины; Патент США № 5587470, который описывает олигонуклеотиды, имеющие 3деазапурины; Патент США № 5608046, который описывает конъюгированные с аналогами 4'десметильного нуклеозида; Патент США № 5610289, который описывает остов-модифицированные аналоги нуклеотидов; Патент США № 6262241, который описывает, среди прочего, способы синтеза 2'фторолигонуклеотидов.

- 13 035756

В днРНК, конъюгированной с лигандом, и в связанных нуклеозидах согласно настоящему изобретению, специфичных к последовательности, несущих молекулы лиганда, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды можно объединить на подходящем синтезаторе олигонуклеотидов, используя стандартные предшественники нуклеотидов или нуклеозидов или предшественники конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающую группу, предшественники конъюгатов лиганд-нуклеотид или нуклеозид, которые уже несут молекулу лиганда, или связывающие блоки, несущие лиганд и не несущие нуклеозид.

При использовании предшественников, конъюгированных с нуклеотидом, которые уже несут связывающую группу, синтез специфичных к последовательности связывающих нуклеозидов завершают обычным образом, и молекула лиганда затем реагирует со связывающей группой с образованием нуклеотида, конъюгированного с лигандом. Конъюгаты олигонуклеотидов, несущие разнообразие молекул, таких как стероиды, витамины, липиды и репортерные молекулы, были описаны ранее (см. Manoharan et al., Заявка РСТ WO 93/07883). В предпочтительных вариантах реализации олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезируют с помощью автоматического синтезатора, используя фосфорамидиты, происходящие от конъюгатов лиганд-нуклеозид в дополнение к коммерчески доступным фосфорамидитам.

Включение 2'-О-метил, 2'-О-этил, 2'-О-пропил, 2'-О-аллил, 2'-О-аминоалкил или 2'-дезокси-2'-фтор группы в нуклеозиды нуклеотида повышает гибридизационные свойства олигонуклеотида. Также олигонуклеотиды, содержащие фосфотиоатные остовы, имеют повышенную стабильность к воздействию нуклеаз. Таким образом, замещенные связанные нуклеозиды согласно настоящему изобретению могут быть дополнены для включения одного или обоих фосфотиоатных остовов или 2'-О-метил, 2'-О-этил, 2'-Опропил, 2'-О-аллил, 2'-О-аминоалкил или 2'-дезокси-2'-фтор групп.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации, последовательности замещенных нуклеозидов согласно настоящему изобретению, обладающие аминогруппой на 5'-конце, готовят, используя синтезатор ДНК, и затем проводят реакцию с активным производным эфира выбранного лиганда. Активные производные эфиров являются хорошо известными специалистам в данной области техники. Типичные активные эфиры включают эфиры N-гидросукцинимида, тетрафторофеноловые эфиры, пентафторфеноловые эфиры и пентахлорфеноловые эфиры. В результате реакции аминогруппы и активного эфира образуется олигонуклеотид, в котором выбранный лиганд присоединен к 5'-положению посредством линкерной группы. Аминогруппа на 5'-конце может быть приготовлена, используя реагент 5'аминомодификатор С6. В предпочтительных вариантах реализации молекулы лигандов можно конъюгировать с олигонуклеотидами в положении 5' с применением фосфорамидита лиганд-нуклеозид, где лиганд связан с 5'-гидроксигруппой непосредственно или опосредованно через линкер. Такие фосфорамидиты лиганд-нуклеозид обычно используют по окончании процедуры автоматизированного синтеза для получения олигонуклеотида, конъюгированного с лигадом, несущего лиганд на 5'-конце.

В одном предпочтительном варианте реализации способов согласно настоящему изобретению получение олигонуклеотидов, конъюгированных с лигандом, начинают с выбора молекул подходящего предшественника, на основании которого конструируют молекулу лиганда. Обычно предшественник представляет собой соответствующим образом защищенное производное широко используемых нуклеозидов. Например, синтетические предшественники для синтеза олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению, конъюгированных с лигандом, включают, но не ограничиваются ими, 2'-аминоалкилокси5'-ODMT-нуклеозиды, 2'-6-аминоалкuлαмино-5'-ODMT-нуклеозиды, 5'-6-аминоалкокси-2'-дезоксинуклеозиды, 5'-6-аминоалкокси-2-защищенные-нуклеозиды, 3'-6-аминоалкокси-5'-ODMT-нуклеозиды и 3'аминоалкuламино-5'-ODMT-нуклеозиды, которые могут быть защищены в части нуклеинового основания молекулы. Способы синтеза таких аминосвязанных защищенных предшественников нуклеозидов известны среднему специалисту в данной области техники.

Во многих случаях, в ходе получения соединений согласно настоящему изобретению используют защитные группы. Используемый в настоящей заявке термин защищенный означает, что указанная группа имеет защитную группу, присоединенную к ней. В некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения, соединения содержат одну или более защитную группу. Широкое разнообразие защитных групп можно применять в способах согласно настоящему изобретению. В общем виде защитные группы делают химические функциональные группы интертными к специфическим условиям реакции, и могут быть введены в или удалены из таких функциональных групп в молекуле без существенного повреждения остальной части молекулы.

Защитные группы в целом и гидроксильные защитные группы в частности хорошо известны в данной области техники (Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991). Аминозащитные группы, стабильные по отношению к обработке кислотой, можно селективно удалить обработкой основанием; данные группы применяют, чтобы сделать реактивные аминогруппы селективно доступными для замещения. Примерами таких групп являются Fmoc и различные замещенные сульфонилэтилкарбаматы, примером которых является группа Nsc.

Дополнительно защитные группы для аминогрупп включают, но не ограничиваются ими, карбаматные защитные группы, такие как 2-триметилсилилэтоксикарбонил (Теос), 1-метил-1-(4-бифенилил)

- 14 035756 этоксикарбонил (Врос), t-бутоксикарбонил (ВОС), аллилоксикарбонил (Alloc), 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) и бензилоксикарбонил (Cbz); амидные защитные группы, такие как формил, ацетил, тригалоацетил, бензоил и нитрофенилацетил; сульфонамидные защитные группы, такие как 2нитробензенсульфонил; и имино- и циклические имидные защитные группы, такие как фталимид и дитиасукциноил. Соединения и способы согласно настоящему изобретению также предусмотривают эквиваленты этих аминозащитных групп.

Многие твердые подложки являются коммерчески доступными, и средний специалист в данной области техники может легко выбрать твердую подложку для использования на этапах твердофазного синтеза. В определенных вариантах реализации используют универсальные подложки. Универсальная подложка, хорошо известная в данной области техники, позволяет получать олигонуклеотиды, имеющие необычные или модифицированные нуклеотиды, расположенные на 3'-конце олигонуклеотида. В дополнение, было сообщено, что олигонуклеотид можно удалить с универсальной подложки под действием более мягких условий реакции, если олигонуклеотид присоединен к твердой подложке посредством син1,2-ацетоксифосфатной группы, которая легче подвергается щелочному гидролизу. См. Guzaev AI, and Manoharan MJ. Am. Chem. Soc. (2003) 125:2380.

Нуклеозиды связаны фосфорсодержащими или не содержащими фосфор ковалентными внутринуклеозидными связями. С целью идентификации такие конъюгированные нуклеозиды можно охарактеризовать как лиганд-несущие нуклеозиды или конъюгаты лиганд-нуклеозид. Связанные нуклеозиды, имеющие аралкильный лиганд, конъюгированный с нуклеозидом в рамках их последовательности, будут демонстрировать повышенную активность днРНК в сравнении с соединениями днРНК, которые не являются конъюгированными.

Олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению, конъюгированные с лигандом аралкилом, также включают конъюгаты олигонуклеотидов и связанных нуклеозидов, где лиганд присоединен непосредственно к нуклеозиду или нуклеотиду без посредничества линкерной группы. Лиганд может предпочтительно быть присоединен посредством связывающих групп через его карбоксильную, амино- или оксогруппу. Типичными связывающими группы могут быть сложноэфирные, амидные или карбаматные группы.

Конкретные примеры предпочтительных модифицированных олигонуклеотидов, предусмотренных для применения в нуклеотидах согласно настоящему изобретению, конъюгированных с лигандом, включают олигонуклеотиды, содержащие модифицированные остовы или внутринуклеозидные связи, не существующие в природе. Как определено в настоящей заявке, олигонуклеотиды, имеющие модифицированные остовы или внутринуклеозидные связи, включают олигонуклеотиды, которые содержат атом фосфора в остове, и олигонуклеотиды, которые не содержат атома фосфора в остове. Для целей настоящего изобретения модифицированные олигонуклеотиды, которые не содержат атома фосфора во внутрисахаридном остове, можно также рассматривать в качестве олигонуклеотидов.

Конкретные химические модификации олигонуклеотидов описаны ниже. Не обязательно все положения в представленном соединении должны быть единообразно модифицированными. Напротив, в отдельное соединение днРНК или даже в ее отдельный нуклеотид можно включать более чем одну модификацию.

Предпочтительные модифицированные внутринуклеозидные связи или остовы включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'5' связи, их 2'-5' связанные аналоги, и аналоги, имеющие инвертированную полярность, где смежные пары нуклеозидных единиц связаны от 3'-5' к 5'-3' или от 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.

Типичные Патенты Соединенных Штатов, имеющие отношение к получению вышеописанных связей, содержащих атом фосфора, включают, но не ограничиваются ими, Патенты США №№ 4469863, 5023243, 5264423, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233 и 5466677, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Предпочтительные модифицированные внутринуклеозидные связи или остовы, которые не включают атом фосфора (т.е., олигонуклеозиды), имеют остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными внутрисахаридными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными внутрисахаридными связями или одной или более короткоцепочечной гетероатомной или гетероциклической внутрисахаридными связями. Они включают остовы, которые имеют связи морфолино (образованные частично сахаридной частью нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы, метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленимино и метиленгидразино остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, имеющие смешанные части компонентов N, О, S и CH2.

Типичные Патенты Соединенных Штатов, имеющие отношение к получению вышеописанных оли

- 15 035756 гонуклеотидов, включают, но не ограничиваются ими, Патенты США №№ 5034506, 5214134, 5216141, 5264562, 5466677, 5470967, 5489677, 5602240 и 5663312, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

В других предпочтительных миметиках олигонуклеотидов, как сахар, так и внутринуклеозидная связь (т.е. остов) единиц нуклеозидов замещены новыми группами. Единицы нуклеинового основания поддерживаются для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Один такой нуклеотид, миметик олигонуклеотида, для которого были продемонстрированы превосходные гибридизационные свойства, называют пептидо-нуклеиновой кислотой (ПНК). В соединениях ПНК сахарный остов олигонуклеотида замещен амидосодержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеиновые основания сохраняются и являются связанными непосредственно или опосредованно с атомами амидной части остова. Указания относительно соединений ПНК можно найти, например, в Патенте США № 5539082.

Некоторые предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения применяют олигонуклеотиды с фосфотиоатными связями и олигонуклеотиды с гетероатомными остовами, в частности CH2NHOCH2, CH₂N(CH₃)OCH₂ [известный как метиленовый (метилимино) или MMI остов], CH₂ON(CH₃)CH₂, CH₂N(CH₃)N(CH₃)CH₂ и ON(CH₃)CH₂CH₂ [где нативный фосфодиэфирный остов представлен как ОРОСН2] согласно данной выше ссылке на Патент США № 5489677, и амидные остовы согласно данной выше ссылке на Патент США № 5602240. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, имеющие остов из структур морфолино согласно данной выше ссылке на Патент США № 5034506.

Олигонуклеотиды, применяемые в олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, конъюгированных с лигандами, могут дополнительно или в качестве альтернативы включать модификации или замены нуклеотидного основания (часто обозначаемого в данной области техники просто как основание). Используемый в настоящей заявке термин немодифицированные или существующие в природе нуклеотидные основания включает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеиновые основания включают другие синтетические и существующие в природе нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин (5me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил урацил и цитозин, 6азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в особенности 5-бромо, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3- деазагуанин и 3- деазааденин.

Другие нуклеиновые основания включают основания, раскрытые в Патенте США № 3,687,808, или каким-либо другим образом известные в данной области техники или коммерчески доступные. Некоторые из этих нуклеиновых оснований являются особенно полезными для повышения связывающей аффинности олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и О-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Замены на 5-метилцитозин, как было показано, повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С и являются в настоящее время предпочтительными заменами оснований, даже более предпочтительными при комбинации с 2'-метоксиэтиловыми модификациями сахара.

Примеры патентов Соединенных Штатов, имеющие отношение к получению некоторых из вышеупомянутых модифицированных нуклеиновых оснований, также как и других модифицированных нуклеиновых оснований, включают, но не ограничиваются ими, Патент США № 3687808, а также Патенты США №№ 5134066, 5459255, 5552540, 5594121 и 5596091, все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации, олигонуклеотиды, применяемые в олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, конъюгированных с лигандами, могут дополнительно или в качестве альтернативы включать одну или более замещенных групп сахаров. Предпочтительные олигонуклеотиды включают одну из следующих групп в положении 2': ОН; F; О-, S- или N-алкил, О-, S- или N-алкенил или О, S- или N-алкенил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенные с Ci-CKj-алкил или С₂-С1₀-алкенил и алкинил. Особенно предпочтительными являются O[(CH2)nO]mCH₃, O(CH2)nOCH₃, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH₃, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH₃)]2, где n и m представляют собой числа от 1 до приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды включают одну из следующих групп в положении 2': C1-C10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH3, SO₂ CH₃, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил и РНК-расщепляющая группа, репортерная группа, интеркалятор, группа для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группа для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и другие заместители, имеющие подобные свойства. Предпочтительная моди

- 16 035756 фикация включает 2'-метоксиэтокси (2'-OCH₂CH₂OCH₃, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'МОЕ), т.е., алкоксиалкоксигруппу. Еще одна предпочтительная модификация включает 2'диметиламинооксиэтокси, т.е., группу O(CH₂)₂ON(CH₃)₂, также известную как 2'-DMAOE, как описано в Патенте США № 6127533.

Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси(2'-OCH₃), 2'-аминопропокси (2'OCH₂CH₂CH₂NH₂) и 2'-фтор (2'-F). Подобные модификации можно также осуществить в других положениях олигонуклеотида, особенно в положении 3' сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5' связанных олигонуклеотидах.

Используемый в настоящей заявке термин замещающая группа сахара или 2'-замещающая группа включает группы, присоединенные к положению 2' рибофуранозильной группы с или без атома кислорода. Замещающие группы сахара включают, но не ограничиваются ими, фтор, О-алкил, Оалкиламино, О-алкилалкокси, защищенную О-алкиламино, О-алкиламиноалкил, О-алкилимидазол и полиэфиры формулы (О-алкил)m, где m представляет собой число от 1 до приблизительно 10. Предпочтительными среди этих полиэфиров являются линейные и циклические полиэтиленгликоли (PEG) и (PEG)содержащие группы, такие как краун-эфиры и, среди прочего, раскрытые Delgardo с соавт. (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1992) 9:249). Дополнительные модификации сахаров были раскрыты Cook (Anti-fibrosis Drug Design, (1991) 6:585-607). Фтор, О-алкил, О-алкиламино, Оалкилимидазол, О-алкиламиноалкил и алкиламино-заместители описаны в Патенте США № 6166197 под названием Олигомерные соединения, имеющие пиримидиновый(ые) нуклеотид(ы) с 2' и 5'заместителями, включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

Дополнительные замещающие группы сахара, соотвествующие настоящему изобретению, включают группы 2'-SR и 2'-NR2, где каждый R представляет собой независимо водород, защитную группу или замещенный или незамещенный алкил, алкенил или алкинил. Нуклеозиды 2'-SR раскрыты в Патенте США № 5670633, включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Включение синтонов мономера 2'-SR раскрыто Hamm с соавторами (J. Org. Chem., (1997) 62:3415-3420). Нуклеозиды 2'-NR раскрыты Thomson JB, J. Org. Chem., (1996) 61:6273-6281; и Polushin с соавторами, Tetrahedron Lett., (1996) 37:3227-3230. Еще одни типичные 2'-замещенные группы, соответствующие настоящему изобретению, включают замещенные группы, имеющие группу согласно формуле I или II

где

Е представляет собой ^-С^-алкил, N(Q3)(Q4) или N=C(Q3)(Q4);

каждый из Q3 и Q4 представляет собой, независимо, Н, ^-С^-алкил, диалкиламиноалкил, защитную группу азота, связанную или несвязанную группу конъюгата, линкер к твердой подложке, или Q3 и Q4, оба, вместе образуют защитную группу азота или кольцевую структуру, дополнительно включающую по меньшей мере один дополнительный гетероатом, который выбирают из N и О;

q1 представляет собой число от 1 до 10;

q2 представляет собой число от 1 до 10;

q3 представляет собой 0 или 1;

q4 представляет собой 0, 1 или 2;

каждый из Z1, Z2 и Z3 представляет собой, независимо, С₄-С₇-циклоалкил, С₅-С1₄-арил или С₃-С₁₅гетероциклил, где гетероатом в указанной гетероциклильной группе выбирают из кислорода, азота и серы;

Z4 представляет собой ОМ1, SM1 или N(M1)₂;

каждый M1 представляет собой, независимо, Н, ^-^-алкил, Cl-C₈-галоалкил, C(=NH)N(H)M2, C(=O)N(H)M2 или OC(=O)N(H)M2;

M2 представляет собой Н или ^-^-алкил и

Z5 представляет собой Cj-Сю-алкил, ^-Сю-галоалкил, С₂-С10-алкенил, С₂-С10-алкинил, ^-^4^^, N(Q3)(Q4), OQ3, гало, SQ3 или CN.

Типичные замещающие группы для 2'-О-сахаров согласно формуле I раскрыты в Патенте США № 6172209 под названием Копированные 2'-оксиэтоксиолигонуклеотиды, включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Типичные циклические замещающие группы для 2'-Осахаров согласно формуле II раскрыты в Патенте США № 6271358 под названием Нацеленные на РНК 2'-модифицированные олигонуклеотиды, которые являются конформационно предварительно организованными, включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

Сахара, имеющие О-заместители на рибозильном кольце, также соответствуют настоящему изобретению. Типичные заместители для О кольца включают, но не ограничиваются ими, S, CH2, CHF и CF2.

Олигонуклеотиды могут также иметь миметики сахара, такие как циклобутиловые группы, вместо пентофуранозного сахара. Типичные Патенты Соединенных Штатов, относящиеся к получению таких

- 17 035756 модифицированных сахаров, включают, но не ограничиваются ими, Патенты США №№ 5359044, 5466786, 5519134, 5591722, 5597909, 5646,265 и 5700920, все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Дополнительные модификации можно также вводить в других положениях олигонуклеотида, особенно в положении 3' сахара на 3'-концевом нуклеотиде. Например, одна дополнительная модификация олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению, конъюгированных с лигандом, включает химическое связывание с олигонуклеотидом одной или более дополнительных нелигандных групп или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточный захват олигонуклеотида. Такие группы включают, но не ограничиваются ими, липидные группы, такие как группа холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) 86:6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., (1994) 4:1053), тиоэфир, например, гексил^-тритилгиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., (1992) 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, (1993) 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., (1992) 20:533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., (1991) 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., (1990) 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, (1993) 75:49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, (1995) 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., (1990) 18:3777), полиаминовую или полиэтиленгликолевую цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, (1995) 14:969) или уксусную кислоту адамантана (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, (1995) 36:3651), палмитильную группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, (1995) 1264:229), или окстадециламин- или гексиламинокарбонил-оксихолестериновую группу (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., (1996) 277:923).

Настоящее изобретение также охватывает композиции, в которых используют олигонуклеотиды, которые являются в значительной степени хирально чистыми по отношению к конкретным положениям олигонуклеотидов. Примеры в значительной степени хирально чистых олигонуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, имеющие фосфотиоатные связи, которые по меньшей мере на 75% являются Sp или Rp (Cook et al., Патент США № 5587361), и олигонуклеотиды, имеющие в значительной степени хирально чистые (Sp или Rp) алкилфосфонатные, фосфорамидатные или фосфотриэфирные связи (Cook, Патенты США №№ 5212295 и 5521302).

В некоторых случаях олигонуклеотид можно модифицировать с помощью нелигандной группы. Количество нелигандных молекул, конъюгированных с олигонуклеотидами с целью повышения активности, улучшения клеточного распределения или клеточного захвата олигонуклеотида, и процедуры для осуществления такого конъюгирования доступны в научной литературе. Такие нелигандные группы включают липидные группы, такие как холестерин (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989, 86:6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., (1994) 4:1053), тиоэфир, например, гексил^-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., (1992) 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., (1993) 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., (1992) 20:533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., (1991) 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., (1990) 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, (1993) 75:49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Нфосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, (1995) 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., (1990) 18:3777), полиаминовую или полиэтиленгликолевую цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, (1995) 14:969) или уксусную кислоту адамантана (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., (1995) 36:3651), палмитильную группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, (1995) 1264:229), или окстадециламин- или гексиламинокарбонил-оксихолестериновую группу (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., (1996) 277:923). Типичные процедуры конъюгации включают синтез олигонуклеотидов, несущих аминолинкер в одном или более положении последовательности. Аминогруппа затем реагирует с конъюгируемой молекулой, при участии соответствующего связывающего или активирующего агента. Реакцию конъюгации можно осуществлять с олигонуклеотидом, который остается связанным с твердой подложкой, или после отделения олигонуклеотида в жидкой фазе. Очистка конъюгата олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ обычно позволяет получать чистый конъюгат.

В качестве альтернативы, молекулу, которую необходимо конъюгировать, можно преобразовать в структурный элемент, такой как фосфорамидит, посредством спиртовой группы, присутствующей в молекуле, или путем присоединения линкера, несущего спиртовую группу, которая может быть фосфорилирована.

Важно, что каждый из этих подходов можно применять для синтеза олигонуклеотидов, конъюгированных с лигандом. Аминосвязанные олигонуклеотиды можно объединить непосредственно с лигандом посредством использования связывающих реагентов или после активации лиганда в качестве NHS Nгидроксисукцинимида или пентфторфенолатным сложным эфиром. Лиганды фосфорамидиты можно синтезировать посредством присоединения аминогексанольного линкера к одной из карбоксильных групп с последующим фосфитилированием терминальной спиртовой функциональной группы. Можно также использовать другие линкеры, такие как цистамин, для конъюгирования с хролацетильным линкером, присутствующим на синтезированном олигонуклеотиде.

- 18 035756

Специалисту в данной области техники хорошо известны способы включения молекул согласно настоящему изобретению в клетки, ткани и организмы. Соответствующие примеры были также предоставлены выше в детальном описании настоящего изобретения. Например, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы согласно настоящему изобретению, кодирующие по меньшей мере одну цепь днРНК согласно настоящему изобретению, могут быть включены в клетки или ткани с помощью способов, известных в данной области техники, таких как трансфекции и т.п.

Также были представлены пути и способы введения молекул днРНК. Например, направленная доставка с помощью гликозилированных и модифицированных фолиевой кислотой молекул, включая использование полимерных носителей с лигандами, такими как галактоза и лактоза, или присоединение фолиевой кислоты к различным макромолекулам, позволяет осуществлять связывание молекул, которые необходимо доставить, с рецепторами фолиевой кислоты. Известна направленная доставка с помощью пептидов и белков, отличных от антител, например, включая RGD-модифицированные наночастицы для доставки миРНК in vivo или мультикомпонентные (невирусные) системы доставки, включая короткие циклодекстрины, адамантин-PEG. Также предусмотрена направленная доставка с использованием антител или фрагментов антител, включая (моновалентные) Fab-фрагменты антитела (или другие фрагменты такого антитела) или одноцепочечные антитела. Подходы для инъекций для целевой направленной доставки включают, среди прочего, гидродинамическую внутривенную инъекцию. Также для направленной доставки можно использовать холестериновые конъюгаты днРНК, где конюгация с липофильными группами повышает клеточный захват и улучшает фармакокинетику и биораспределение олигонуклеотидов в тканях. Также известны катионные системы доставки, в соответствии с которыми синтетические векторы с результирующим положительным (катионным) зарядом облегчают образование комплекса с полианионной нуклеиновой кислотой и взаимодействие с отрицательно заряженной мембраной клетки. Такие катионные системы доставки включают также катионные липосомальные системы доставки, катионные системы доставки на основе полимеров и пептидов. Другие системы доставки для клеточного захвата днРНК/миРНК представляют собой аптамерные дс/миРНК. Также подходы генной терапии могут быть использованы для доставки молекул днРНК согласно настоящему изобретению или молекул нуклеиновой кислоты, их кодирующих. Такие системы включают использование непатогенных вирусов, модифицированных вирусных векторов, а также доставку посредством наночастиц или липосом. Другие способы доставки для клеточного захвата днРНК являются экстракорпоральными, например, обработка клеток, органов и тканей ех vivo. Некоторые из этих технологий описаны и обобщены в публикациях, таких как Akhtar, Journal of Clinical Investigation (2007) 117:3623-3632, Nguyen et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics (2008) 10:158-167, Zamboni, Clin Cancer Res (2005) 11:8230-8234 or Ikeda et al., Pharmaceutical Research (2006) 23:1631-1640.

Если не определено обратное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, можно использовать на практике или при тестировании изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки и патенты включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Предусмотренные выше варианты реализации и пункты настоящего изобретения иллюстрируются следующими не ограничивающими примерами.

Примеры

Идентификация днРНК для терапевтического применения. Конструирование днРНК проводили для идентификации днРНК, специфически нацеленной на генотипы А, В, С и D вируса гепатита В для терапевтического применения.

Сначала известные геномные последовательности вируса гепатита В загружали из базы NCBI Genbank (учетные номера приведены в табл. 6). Информацию о генотипах брали из файлов NCBI Genbank или определяли с помощью компьютерного полуавтоматического сравнения с базовыми геномами (учетные номера приведены в табл. 6).

Геномные последовательности генотипов A-D вируса гепатита В изучали с помощью компьютерного анализа для идентификации оптимальных областей-мишеней для агентов РНКи, а именно высоко консервативных последовательностей участков длиной 17 нуклеотидов, которые были бы идентичны по меньшей мере на 90% для всех последовательностей.

При идентификации агентов иРНК выбор ограничивали последовательностями 17меров, имеющих по меньшей мере два нарушения комплементарности по отношению к любой последовательности в базе данных человека Ref Seq (версия 41), которая, как мы предполагаем, представляет полный транскриптом человека, используя соответствующий алгоритм.

Все последовательности 17меров, содержащие четыре или более последовательных G (поли-G последовательности), исключали из синтеза.

Последовательности длиной 19 нуклеотидов определяли как скрывающие выбранные 17меры в по

- 19 035756 ложениях со 2 по 18.

Эти последовательности 19меров дали агенты РНК интерференции (РНКи), перекрестнореактивные с геномными последовательностями генотипов A-D вируса гепатита В, и образовали основу для синтеза агентов РНКи в прилагаемых табл. 1 и 2.

Синтез днРНК.

Олигонуклеотиды синтезировали в соответствии с фосфорамидитной технологией на твердой фазе. В зависимости от масштаба использовали синтезатор ABI 394 (Applied Biosystems) или АКТА oligopilot 100 (GE Healthcare, Фрайбург, Германия). Синтез осуществляли на твердой подложке, изготовленной из стекла с контролируемым размером пор (CPG, 520А, с нагрузкой 75 микроМоль/г, полученной от Prime Synthesis, Астон, Пенсильвания, США). Все 2'-модифицированные фосфорамидиты РНК, а также вспомогательные реактивы заказывали у SAFC (Гамбург, Германия). Использовали следующие 2'-Ометилфосфорамидиты: (5'-О-диметокситритил-Н⁶-(бензоил)-2'-О-метиладенозин-3'-О-(2-цианоэтил-НХдиизопропиламино)фосфорамидит, 5'-О-диметокситритил-Н⁴-(ацетил)-2'-О-метилцитидин-3'-О-(2цианоэтил-ЫХ-идиизопропиламино)фосфорамидит, (5'-О-диметокситритил-Н²-(изобутирил)-2'-О-метилгуанозин-3 '-О-(2-цианоэтил-ЫХ-диизопропиламино)фосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-О-метилуридин-3'-О-(2-цианоэтил-ЫХ-диизопропиламино) фосфорамидит. 2'-дезокси-2'-фтор-фосфорамидиты несли те же защитные группы, что 2'-О-метил РНК амидиты. Все амидиты растворяли в безводном ацетонитриле (100 мМ) и добавляли молекулярные сита (3А). Для образования 5'-фосфата использовали 2[2-(4,4'-диметокситритилокси)этилсульфонил]этил-(2-цианоэтил)-(Х№диизопропил)фосфорамидит производства Glen Research (Стерлинг, Вирджиния, США). Для введения С-6 аминолинкера на 5'-конец олигомеров применяли 6-(трифтороацетиламино)гексил-(2-цианоэтил)-(Х№диизопропил)-фосфорамидит производства Thermo Fisher Scientif ю(Милуоки, Висконсин, США) 5'-модификации вводили без какихлибо изменений цикла синтеза. В качестве активирующего раствора использовали 5-этилтиотетразол (ЕТТ, 500 мМ в ацетонитриле). Время контакта составляло 6 мин. Для введения фосфотиоатных связей применяли 50 мМ раствор 3-((диметиламино-метилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-3-тиона (DDTT, полученный от AM Chemicals, Оушенсайд, Калифорния, США) в безводном ацетонитриле/пиридине (1:1 об./об.).

Отделение и снятие защитных групп с присоединенного к подложке олигомера. После окончания твердофазного синтеза удаляли цианоэтильные защитные группы с помощью 30-минутной обработки 20% диэтиламином в ацетонитриле без отделения олигонуклеотидов от подложки. Затем высушенную твердую подложку переносили в пробирку вместимостью 15 мл и обрабатывали концентрированным водным аммиаком (Aldrich) в течение 18 ч при 40°С. После центрифугирования супернатант переносили в новую пробирку и промывали стекла с контролируемым размером пор водным аммиаком. Объединенные растворы испаряли, твердый остаток растворяли в буфере А (см. ниже).

Очистка олигонуклеотидов.

Неочищенные олигомеры очищали с помощью анионообменной ВЭЖХ, используя колонку, заполненную Source Q15 (GE Helthcare), и систему АКТА Explorer (GE Helthcare). Буфер А представлял собой 10 мМ перхлорат натрия, 20 мМ Трис, 1 мМ EDTA, рН 7,4 (Fluka, Букс, Швейцария) и содержал 20% ацетонитрила, буфер В представлял собой буфер А за исключением 500 мМ перхлората натрия. Применяли градиент от 22%В до 42%В в 32 объемах колонки (CV). Регистрировали УФ-поглощение при 280 нм Соответствующие фракции объединяли и преципитировали с помощью 3М NaOAc, pH=5,2 и 70% этанола. Затем осадок промывали 70% этанолом. В качестве альтернативы проводили обессоливание, используя колонки Sephadex HiTrap (GE Helthcare) в соответствии с инструкцией производителя.

Отжиг олигонуклеотидов для образования миРНК. Комплементарные цепи смешивали с помощью объединения эквимолярных растворов РНК. Смесь лиофилизовали и восстанавливали соответствующим объемом буфера для отжига (100 мМ NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН 6,8) для достижения желаемой концентрации. Раствор помещали на водяную баню при 80°С, которую охлаждали до комнатной температуры в течение 3 ч.

Скрининг ВГВ мРНК-направленной днРНК in vitro. Вектор psiCHECK™-2 (Promega) содержит два репортерных гена для мониторинга активности РНКи: синтетическую версию гена люциферазы renilla (hRluc) и синтетический ген люциферазы светлячков (hluc+). Измерение активности люциферазы светлячков позволяет оценивать изменения, не связанные с активностью РНКи исследуемой днРНК. Активность люциферазы renilla и светлячков измеряли, используя систему анализа люциферазы Dual-Glo® (Promega). Интересующие сайты-мишени ВГВ встраивали после клонирования в вектор psiCHECK™-2, во множественную клонирующую область, расположенную на 3' от стоп-кодона трансляции и полиА хвоста синтетического гена люциферазы renilla. Линию клеток COS-7 трансфицировали вектором и последовательно обрабатывали липоплексами днРНК-липофектамин 2000, направленными на последовательности ВГВ. Эффект РНКи, которым обладает днРНК в отношении клонированного сайта-мишени ВГВ, определяли, измеряя активность слитого гена люциферазы renilla.

Создание векторов psiCHECK, содержащих последовательности-мишени.

С целью изучения активности днРНК в отношении ВГВ, конструировали двойной люциферазный

- 20 035756

ВГВ репортер. Области с 84 по 805, с 1075 по 1992, с 2165 по 2530 и с 2718 по 2940 геномной последовательности вируса гепатита В с учетным номером EU554538.1 (генотип С) объединяли in silico. Преднамеренно вводили две мутации (128 А^Т. 598 Т^С, положения относятся к EU554538.1). Одна мутация была необходима для удаления внутреннего сайта XhoI. Вторая мутация привела к удалению единичного нарушения комплементарности к днРНК. Эту ВГВ конструкцию-мишень удлиняли добавлением рестрикционных сайтов как на 5', так и на 3'-конце. Искусственную последовательность ДНК химически синтезировали в Geneart (Регенсбург, Германия) и клонировали в сайт XhoI/NotI двойного люциферазного вектора psiCHECK™-2.

Трансфекция и количественное определение люциферазы. Клетки Cos-7 (DSMZ, Брауншвейг, Германия, каталожный №. АСС-60) высевали с плотностью 2,25x104 клеток/лунка на 96-луночные планшеты. Трансфекцию плазмидой осуществляли в концентрации 50 нг/лунка с 0,5 мкл/лунка Липофектамина 2000 (Invitrogen GmbH, Карлсруэ, Германия, каталожный № 11668-019), как описано производителем. Через 4 ч после трансфекции вектора среду отбирали и добавляли свежую среду. После этого к клеткам добавляли днРНК в концентрации 10 нМ или 1 нМ, используя Липофектамин 2000, как описано выше. С целью оптимизации перекрывания генотипа ВГВ и минимизации развития резистентности к днРНК можно использовать две различные днРНК в комбинации одновременно. Для демонстрации обоснованности такого подхода пары двух различных днРНК выбирали из наиболее эффективных днРНК с дополнительной склонностью к оптимизированному перекрыванию генотипа.

днРНК добавляли к клеткам в концентрации 5 или 0,5 нМ для каждой днРНК, получая в результате суммарную концентрацию днРНК 10 или 1 нМ, используя Липофектамин 2000, как описано выше. Клетки лизировали через 48 ч, используя реактивы люциферазы, как описано производителем. Уровень белка люциферазы renilla нормировали по отношению к уровню люциферазы светлячков для оценки эффективности трансфекции. Для каждой днРНК собирали данные с четырех отдельных точек. По меньшей мере одну днРНК, неродственную ко всем сайтам-мишеням, использовали в качестве отрицательного контроля для определения относительного уровня белка люциферазы renilla в клетках, обработанных днРНК (табл. 8). Для сравнения подавляющей активности в условиях полной комплементарности синтезировали днРНК с полной комплементарностью открытой рамке считывания renilla и изучали в параллели с ВГВ днРНК.

Данные относительно ингибирования представлены в прилагаемой табл. 2.

Стабильность днРНК. Стабильность днРНК, нацеленной на вирус гепатита В человека, определяли в анализе in vitro с любой одной из сыворотки человека, яванского макака или мыши с помощью измерения периода полужизни каждой отдельной цепи.

Измерения проводили в трех повторах для каждой временной точки, используя 3 мкл образца 50 мкМ днРНК, смешанного с 30 мкл сыворотки человека (Sigma), сыворотки яванского макака (Sigma) или сыворотки мыши (Sigma). Смеси инкубировали в течение 0, 30 мин., 1, 3, 6, 24 или 48 ч при 37°С. В качестве контроля неспецифической деградации днРНК инкубировали с 30 мкл Ix ФБР рН 6,8 в течение 48 ч. Реакции останавливали добавлением 4 мкл протеиназы К (20 мг/мл), 25 мкл Раствора для лизиса тканей и клеток (Epicentre) и 38 мкл воды Миллипор в течение 30 мин при 65°С. Образцы затем фильтровали через 0,2 мкм 96-луночный фильтровальный планшет при 1400 об./мин в течение 8 мин, дважды промывали с помощью 55 мкл воды миллипор и снова фильтровали.

Для разделения отдельных цепей и анализа оставшегося полноразмерного продукта (ПРП) образцы разделяли методом ионообменной ВЭЖХ на хроматографе Dionex Summit в денатурирующих условиях, используя в качестве элюента А 20 мМ Na3PO4 в 10% ацетонитриле рН=11 и в качестве элюента В 1М NaBr в элюенте А.

Применяли следующий градиент:

Время (мин)	%А	%В
1,о	75	25
1,00	75	25
19,0	38	62
19,5	0	100
21,5	0	100
22,0	75	25
24,0	75	25

Для каждой инжекции хроматограммы интегрировали автоматически с помощью программного обеспечения ВЭЖХ Dionex Chromeleon 6.60 и при необходимости оценивали вручную. Все площади пиков корректировали относительно пика внутреннего стандарта (ВС) и нормировали по отношению ко времени инкубации t = 0 мин. Площадь пика и полученное значение ПРП рассчитывали для каждой отдельной цепи и трех повторов отдельно. Период полужизни (t¹/₂) цепи определяли по средней временной точке (h) для трех повторов, в которой деградировала половина ПРП. Результаты представлены в прилагаемой табл. 3.

Claims (23)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты, способная ингибировать экспрессию гена вируса гепатита В, причем указанная молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты включает некодирующую цепь, содержащую по порядку нуклеотиды 2-18 SEQ ID NO: 158, 159, 160 или 163, и кодирующую последовательность, в значительной степени комплементарную указанной некодирующей последовательности, где указанная кодирующая последовательность содержит любую из SEQ ID NO: 2, 3 или 6, и при этом указанная последовательность имеет длину менее чем 30 нуклеотидов.
2. 2. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что некодирующая цепь дополнительно включает 3' липкий конец длиной 1-5 нуклеотидов.
3. 3. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.2, отличающаяся тем, что указанный липкий конец некодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, комплементарные прегеномной РНК и/или мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза вируса гепатита В.
4. 4. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что кодирующая цепь дополнительно включает 3' липкий конец длиной 1-5 нуклеотидов.
5. 5. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.4, отличающаяся тем, что указанный липкий конец кодирующей цепи содержит урацил или нуклеотиды, идентичные прегеномной РНК и/или мРНК, кодирующей белок, необходимый для репликации или патогенеза вируса гепатита В.
6. 6. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что указанная молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
7. 7. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.6, отличающаяся тем, что указанный модифицированный нуклеотид содержит 2'-модифицированный нуклеотид.
8. 8. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.7, отличающаяся тем, что указанный 2'-модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида.
9. 9. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.6, отличающаяся тем, что указанный модифицированный нуклеотид содержит 5'-фосфотиоатную группу, терминальный нуклеотид, связанный с производным холестерина, терминальный нуклеотид, связанный с бисдециламидной группой додекановой кислоты, замкнутый нуклеотид, нуклеотид, лишенный азотистого основания, дезокситимидин, инвертированный дезокситимидин, нуклеотид морфолино, фосфорамидат и нуклеотид, включающий основание, не встречающееся в природе.
10. 10. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.8, отличающаяся тем, что указанная молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты содержит 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид, нуклеотид, включающий 5'-фосфотиоатную группу, и дезокситимидин.
11. 11. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что указанная кодирующая цепь или указанная некодирующая цепь включает липкий конец из 1-2 дезокситимидинов.
12. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну молекулу двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно любому из пп.1-11.
13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку, ткань или отличный от человека организм, включающие по меньшей мере одну молекулу двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно любому из пп.1-11.
14. 14. Фармацевтическая композиция согласно п.12 или 13, дополнительно содержащая вторую молекулу двунитевой рибонуклеиновой кислоты, способную ингибировать экспрессию вируса гепатита В.
15. 15. Фармацевтическая композиция согласно любому из пп.12-14, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, стабилизатор и/или растворитель.
16. 16. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что некодирующая цепь с SEQ ID NO: 158 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 486.
17. 17. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что некодирующая цепь с SEQ ID NO: 159 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 487.
18. 18. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что некодирующая цепь с SEQ ID NO: 160 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 488.
19. 19. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.1, отличающаяся тем, что некодирующая цепь с SEQ ID NO: 163 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 491.
20. 20. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.2, отличающаяся тем, что кодирующая цепь с SEQ ID NO: 2 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 322.
21. 21. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.2, отличающаяся тем, что кодирующая цепь с SEQ ID NO: 3 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 323.
22. 22. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.2, отличающаяся тем, что коди

    - 22 035756 рующая цепь с SEQ ID NO: 3 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 324.
23. 23. Молекула двунитевой рибонуклеиновой кислоты согласно п.2, отличающаяся тем, что кодирующая цепь с SEQ ID NO: 6 модифицирована в соответствии с SEQ ID NO: 327.