CN101426912A

CN101426912A - 介导rna干扰的化学修饰短干扰核酸分子

Info

Publication number: CN101426912A
Application number: CNA2006800387766A
Authority: CN
Inventors: D·莫里西; J·麦斯维根; L·贝格尔曼
Original assignee: Sirna Therapeutics Inc
Current assignee: Sirna Therapeutics Inc
Priority date: 2005-08-17
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2009-05-06
Also published as: ZA200801099B

Abstract

本发明涉及用于研究、诊断和治疗对基因表达和/或活性的调节有反应的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法。本发明还涉及与对基因的表达和/或活性的调节有反应的性状、疾病和状况有关的化合物、组合物和方法，其中该基因参与了介导这类性状、疾病和状况的维持和发展的基因表达途径或其它细胞过程。具体地，本发明涉及双链核酸分子，包括小核酸分子，如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小分子RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子，它们能介导针对基因表达的RNA干扰(RNAi)，包括这类小核酸分子的混合物以及这类小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。本发明还涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA以及其它可通过干扰内源RNA或与内源RNA结合的蛋白(如RISC)的调节功能而抑制这类内源RNA分子(如内源小分子RNA(miRNA)，(如miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)，(如siRNA抑制剂))功能或者抑制RISC功能(如RISC抑制剂)，以调节基因表达，包括这类小核酸分子的混合物以及这类小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。这类小核酸分子可例如用于提供防止、抑制或减弱与个体或生物体中基因表达或活性有关的各种疾病、性状和状况的组合物。

Description

介导RNA干扰的化学修饰短干扰核酸分子

[0001]本申请是2005年12月8日提交的美国专利申请11/299,254的部分继续申请，该申请又是2005年9月23日提交的美国专利申请11/234,730的部分继续申请，该申请又是2005年8月17日提交的美国专利申请11/205,646的部分继续申请，该申请又是2005年4月4日提交的美国专利申请11/098,303的部分继续申请，该申请又是2004年8月20日提交的美国专利申请10/923,536的部分继续申请，该申请又是2004年5月24日提交的国际专利申请PCT/US04/16390的部分继续申请，该申请又是2004年4月16日提交的美国专利申请10/826,966的部分继续申请，该申请又是2004年1月14日提交的美国专利申请10/757,803的部分继续申请，该申请又是2003年11月24日提交的美国专利申请10/720,448的部分继续申请，该申请又是2003年10月23日提交的美国专利申请10/693,059的部分继续申请，该申请又是2003年5月23日提交的美国专利申请10/444,853的部分继续申请，该申请又是2003年2月20日提交的国际专利申请PCT/US03/05346和2003年2月20日提交的国际专利申请PCT/US03/05028的部分继续申请，它们二者又要求了于2002年2月20日提交的美国临时申请60/358,580、于2002年3月11日提交的美国临时申请60/363,124、于2002年6月6日提交的美国临时申请60/386,782、于2002年8月29日提交的美国临时申请60/406,784、于2002年9月5日提交的美国临时申请60/408,378、于2002年9月9日提交的美国临时申请60/409,293、以及于2003年1月15日提交的美国临时申请60/440,129的权益。本申请还是2004年4月30日提交的国际专利申请PCT/US04/13456的部分继续申请，该申请又是2004年2月13日提交的美国专利申请10/780,447的部分继续申请，该申请又是2003年4月30日提交的美国专利申请10/427,160的部分继续申请，该申请又是2002年5月17日提交的国际专利申请PCT/US02/15876的部分继续申请，该申请又要求了于2001年5月18日提交的美国临时申请60/292,217、于2002年3月6日提交的美国临时申请60/362,016、于2001年7月20日提交的美国临时申请60/306,883、以及于2001年8月13日提交的美国临时申请60/311,865的权益。本申请还是于2003年12月3日提交的美国专利申请10/727,780的部分继续申请。本申请还是2005年2月9日提交的国际专利申请PCT/US05/04270的部分继续申请，该申请要求了于2004年2月10日提交的美国临时申请60/543,480的权益。本申请还是2006年2月14日提交的美国专利申请11/353,630的部分继续申请，该申请又要求了于2005年2月14日提交的美国临时专利申请60/652,787、于2005年5月6日提交的美国临时专利申请60/678,531、于2005年7月29日提交的美国临时专利申请60/703,946、以及于2005年11月15日提交的美国临时专利申请60/737,024的权益。本申请要求所有列出申请的权益，在此通过参考将它们整体(包括附图)并入本文。

发明领域

[0002]本发明涉及用于研究、诊断和治疗对基因表达和/或活性的调节有反应的性状(trait)、疾病和状况的化合物、组合物和方法。本发明还涉及与对基因的表达和/或活性的调节有反应的性状、疾病和状况有关的化合物、组合物和方法，其中该基因参与了介导这类性状、疾病和状况的维持或发展的基因表达途径或其它细胞过程。具体地，本发明涉及双链核酸分子，包括小核酸分子，如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小分子RNA(micro-RNA，miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子，它们能介导针对基因表达的RNA干扰(RNAi)，包括这类小核酸分子的混合物以及这类小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。本发明还涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA等，它们可通过干扰内源RNA或与内源RNA结合的蛋白(如RISC)的调节功能而抑制这类内源RNA分子(如内源小分子RNA(miRNA)，(如miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)，(如siRNA抑制剂))功能或者抑制RISC功能(如RISC抑制剂)，以调节基因表达，包括这类小核酸分子的混合物以及这类小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。这类小核酸分子可例如用于提供预防、抑制或减弱与个体(subject)或生物体中基因表达或活性有关的各种疾病、性状和状况的组合物。

发明背景

[0003]下文是对与RNAi有关的技术的讨论。所提供的讨论仅用于理解以下的发明。这种概述并非承认任何以下描述的工作为本发明的现有技术。

[0004]RNA干扰指动物中通过短干扰RNAs(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33；Fire etal.，1998，Nature，391，806；Hamilton et al.，1999，Science，286，950-951；Lin et al.，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，genes & Dev.，13：139-141；以及Strauss，1999，Science，286，886)。植物中的相应过程(Heifetz et al.，国际PCT公开号WO 99/61631)通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中也称为压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于防止外来基因表达的进化上保守的细胞防御机制，为不同植物群和门所共有(Fire et al.，1999，Trends genet.，15，358)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是应答源自病毒感染或源自转座子元件随机整合进宿主基因组的双链RNAs(dsRNAs)生成而进化的，其通过特异破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA而实现。细胞中dsRNA的存在通过目前还未完全了解的机制触发RNAi反应。该机制看起来不同于其它已知的涉及双链RNA特异的核糖核酸酶的机制，例如干扰素反应，其源于dsRNA介导的蛋白激酶PKR和2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活化，导致核糖核酸酶L对mRNA的非特异性切割(参见，例如US Patent Nos.6,107,094；5,898,031；Clemens et al.，1997，J.Interferon & Cytokine Res.，17，503-524；Adah et al.，2001，Curr.Med.Chem.，8，1189)。

[0005]长dsRNAs在细胞中的存在刺激称为dicer的核糖核酸酶III的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33；Hammond et al.，2000，Nature，404，293)。dicer参与了将dsRNA加工为短片段的dsRNA，称为短干扰RNAs(siRNAs)(Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein et al.，2001，Nature，409，363)。衍生自dicer活性的短干扰RNAs通常为约21至约23核苷酸长度，并包含约19碱基对双链体(Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33；Elbashir et al.，2001，genes Dev.，15，188)。dicer还参与了从参与翻译控制的结构保守的前体RNA切除21和22核苷酸的小暂时RNAs(small temporal RNAsstRNAs)(Hutvagner et al.，2001，Science，293，834)。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合体，通常称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其介导对具有与siRNA双链体反义链的序列互补性的单链RNA的切割。对靶RNA的切割发生在互补于siRNA双链体反义链的区域中间(Elbashir et al.，2001，genes Dev.，15，188)。

[0006]已在各种系统中研究了RNAi。Fire et al.，1998，Nature，391，806首次在C.elegans中观察到RNAi。Bahramian and Zarbl，1999，Molecular and Cellular Biology，19，274-283和Wianny and Goetz，1999，Nature Cell Biol.，2，70描述了哺乳动物系统中dsRNA介导的RNAi。Hammond et al.，2000，Nature，404，293描述了用dsRNA转染的Drosophila细胞中的RNAi。Elbashir et al.，2001，Nature，411，494和Tuschl et al.，国际PCT公开WO 01/75164描述了在包括人胚胎肾细胞和Hela细胞在内的培养哺乳动物细胞中通过引入合成的21核苷酸RNA双链体诱导的RNAi。最近在果蝇胚裂解物方面的工作(Elbashir et al.，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl et al.，国际PCT公开WO 01/75164)揭示了对介导有效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列方面的要求。这些研究证实当含有3′-末端二核苷酸突出时21核苷酸siRNA双链体是最有活性的。此外，以2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全置换一条或两条siRNA链消除了RNAi活性，然而以2′-脱氧核苷酸(2′-H)置换3′-末端siRNA突出核苷酸则被证实是可耐受的。siRNA双链体中心内的单个错配序列也显示消除RNAi活性。此外，这些研究还表明，靶RNA中的切割位点位置由siRNA引导序列的5’-末端而不是引导序列的3′-末端确定(Elbashiret al.，2001，EMBO J.，20，6877)。其它的研究已指出，siRNA双链体的靶互补链上的5′-磷酸为siRNA活性所需，以及ATP被用于维持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen et al.，2001，Cell，107，309)。

[0007]已有研究证实，以脱氧核糖核苷酸替换具有二核苷酸3′-突出的21聚(21-mer)siRNA双链体的3′-末端核苷酸突出片段对RNAi活性没有负面影响。已报道以脱氧核糖核苷酸替换siRNA每一端上多至4个核苷酸被很好地耐受，而用脱氧核糖核苷酸完全替换则导致无siRNA活性(Elbashir et al.，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl et al.，国际PCT公开WO 01/75164)。此外，上文Elbashir et al.还报道了以2′-O-甲基核苷酸置换siRNA完全消除了RNAi活性。Li et al.，国际PCT公开WO 00/44914和Beach et al.，国际PCT公开WO 01/68836初步提示，siRNA可以包括向磷酸糖骨架或核苷引入的修饰以包括至少一个氮或硫杂原子，然而，既没有提供应用条件达到什么程度这类修饰在siRNA分子中是可耐受的，也没有提供这类修饰siRNA的任何进一步的指导或实例。Kreutzer et al.，Canadian Patent Application No.2,359,180也描述了某些用在dsRNA构建体中以便拮抗双链RNA依赖的蛋白激酶PKR活化的化学修饰，尤其是2′-氨基或2′-O-甲基核苷酸，以及含有2′-O或4′-C亚甲基桥的核苷酸。但是，类似地，Kreutzer et al.也没有提供达到什么程度这类修饰在siRNA分子中是可耐受的的实例或指导。

[0008]Parrish et al.，2000，Molecular Cell，6，1077-1087采用长(>25nt)siRNA转录本测试了某些靶向C.elegans中unc-22基因的化学修饰。该作者描述了通过以T7和T3RNA聚合酶并入硫代磷酸酯核苷酸类似物向这些siRNA转录本引入硫代磷酸酯残基，并观察到具有两硫代磷酸酯修饰的碱基的RNAs也在作为RNAi的有效性方面有显著降低。此外，Parrish etal.报道对超过两个残基的硫代磷酸酯修饰明显使RNA在体外不稳定，使得不能测定干扰活性。上文1081。该作者还测试了长siRNA转录本中在核苷酸糖2′位的某些修饰，发现以脱氧核糖核苷酸置换核糖核苷酸导致干扰活性的显著降低，尤其是对于尿嘧啶至胸腺嘧啶和/或胞嘧啶至脱氧胞嘧啶取代的情况。上文。此外，该作者测试了某些碱基修饰，包括siRNA有义和反义链中4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶置换尿嘧啶以及次黄嘌呤核苷置换鸟嘌呤核苷。尽管4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶置换看起来可被耐受，Parrish报道，当并入任一条链时，次黄嘌呤核苷都导致干扰活性显著减弱。Parrish还报道，在反义链中并入5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶也导致RNAi活性的显著降低。

[0009]已有使用较长dsRNA的描述。例如，Beach et al.，国际PCT公开WO 01/68836描述了采用内源获得的dsRNA减弱基因表达的特异方法。Tuschl et al.，国际PCT公开WO 01/75164描述了Drosophila体外RNAi系统，以及将特异siRNA分子用于某些功能基因组和某些治疗应用；即使Tuschl，2001，Chem.Biochem.，2，239-245对RNAi可被用于治疗遗传病或病毒感染表示怀疑(由于激活干扰素反应的危险)。Li et al.，国际PCT公开WO 00/44914描述了将特异的长(141bp-488bp)的酶合成的或载体表达的dsRNAs用于减弱某些靶基因的表达。Zernicka-Goetz et al.，国际PCT公开WO 01/36646描述了一些采用某些长的(550bp-714bp)酶学合成的或载体表达的dsRNA分子抑制哺乳动物细胞中特定基因表达的方法。Fire et al.，国际PCT公开WO 99/32619描述了将某些长dsRNA分子引入细胞用于抑制线虫中基因表达的特定方法。Plaetinck et al.，国际PCT公开WO 00/01846描述了一些采用特异的长dsRNA分子鉴定负责赋予细胞特定表型的特异基因的方法。Mello et al.，国际PCT公开WO 01/29058描述了鉴定参与dsRNA介导的RNAi的特定基因。Pachuck et al.，国际PCT公开WO 00/63364描述了某些长(至少200核苷酸)dsRNA构建体。Deschamps Depaillette et al.，国际PCT公开WO 99/07409描述了由特定dsRNA分子与某些抗病毒剂组合构成的特定组合物。Waterhouse et al.，国际PCT公开99/53050和1998，PNAS，95，13959-13964描述了一些采用某些dsRNAs减弱植物中核酸表型表达的方法。Driscoll et al.，国际PCT公开WO 01/49844描述了用于在靶生物体中促进基因沉默的特异DNA表达构建体。

[0010]其它研究人员报道了各种RNAi和基因沉默系统。例如，Parrishet al.，2000，Molecular Cell，6，1077-1087描述了靶向C.elegans的unc-22基因的特异化学修饰dsRNA构建体。Grossniklaus，国际PCT公开WO01/38551描述了一些采用某些dsRNAs调节植物中polycomb基因表达的方法。Churikov et al.，国际PCT公开WO 01/42443描述了一些采用某些dsRNAs修饰生物体遗传特征的方法。Cogoni et al，国际PCT公开WO01/53475描述了一些分离链孢霉沉默基因的方法以及该基因的用途。Reed et al.，国际PCT公开WO 01/68836描述了一些用于植物中基因沉默的方法。Honer et al.，国际PCT公开WO 01/70944描述了一些将转基因线虫用作帕金森病模型采用某些dsRNAs进行药物筛选的方法。Deak et al.，国际PCT公开WO 01/72774描述了一些可能与Drosophila中RNAi有关的Drosophila衍生基因产物。Arndt et al.，国际PCT公开WO 01/92513描述了一些通过使用增强RNAi的因子介导基因抑制的方法。Tuschl et al.，国际PCT公开WO 02/44321描述了某些合成的siRNA构建体。Pachuk et al.，国际PCT公开WO 00/63364和Satishchandran et al.，国际PCT公开WO01/04313描述了一些采用某些长的(超过250bp)载体表达的dsRNAs抑制某些多核苷酸序列功能的方法和组合物。Echeverri et al.，国际PCT公开WO 02/38805描述了某些通过RNAi鉴定的C.elegans基因。Kreutzer et al.，International PCT Publications Nos.WO 02/055692、WO 02/055693和EP1144623 B1描述了某些采用dsRNA抑制基因表达的方法。Graham et al.，International PCT Publications Nos.WO 99/49029和WO 01/70949，以及AU 4037501描述了某些载体表达的siRNA分子。Fire et al.，US 6,506,559描述了一些采用某些长的介导RNAi的dsRNA(299bp-1033bp)构建体体外抑制基因表达的方法。Martinez et al.，2002，Cell，110，563-574描述了一些单链siRNA构建体，包括某些在Hela细胞中介导RNA干扰的5’-磷酸化的单链siRNAs。Harborth et al.，2003，Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment，13，83-105描述了一些化学上和结构上经修饰的siRNA分子。Chiu and Rana，2003，RNA，9，1034-1048描述了一些化学上和结构上经修饰的siRNA分子。Woolf et al.，国际PCT公开WO 03/064626和WO03/064625描述了一些化学上经修饰的dsRNA构建体。Hornung et al.，2005，Nature Medicine，11，263-270描述了短干扰RNA在浆细胞样树突状细胞中通过TLR7序列特异性地强力诱导IFN-α。Judge et al.，2005，NatureBiotechnology，Published online：20March 2005描述了合成siRNA的序列依赖性刺激哺乳动物先天免疫应答。Yuki et al.，国际PCT公开WO05/049821和WO 04/048566描述了一些设计短干扰RNA序列的方法和具有优化活性的短干扰RNA序列。Saigo et al.，美国专利申请公开US20040539332描述了一些设计用于实现RNA干扰的寡核苷酸序列或多核苷酸序列(包括短干扰RNA序列)的方法。Tei et al.，国际PCT公开WO03/044188描述了一些抑制靶基因表达的方法，其包括以双链多核苷酸转染细胞、组织、或单个生物体，该双链多核苷酸包括具有与靶基因的至少一部分核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的DNA和RNA。

[0011]Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy et al.，2006，RNA，12，192-197；Czech，2006NEJM，354，11：1194-1195；Hutvagner et al.，US 20050227256，以及Tuschlet al.，US 20050182005都描述了反义分子，它们可通过空间阻碍抑制miRNA功能，在此通过参考将这些文献都整体并入本文。

发明概述

[0012]本发明涉及可用于采用短干扰核酸(siNA)分子通过RNA干扰(RNAi)调节基因表达的化合物、组合物和方法，所述基因例如为与涉及基因表达或活性的疾病、性状以及状况的发展或维持有关的基因。本发明还涉及可用于采用小核酸分子通过RNA干扰(RNAi)调节一个或多个参与基因表达和/或活性途径的基因的表达和活性的化合物、组合物和方法。具体地，本发明描述了小核酸分子以及用于调节基因和/或其它参与基因表达和/或活性途径的基因的表达的方法，所述小核酸分子例如为短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小分子RNA(miRNA)、以及短发夹RNA(shRNA)分子。

[0013]本发明还涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA等，它们可通过干扰内源RNA或与内源RNA结合的蛋白(如RISC)的调节功能而抑制这类内源RNA分子(如内源小分子RNA(miRNA)，(如miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)，(如siRNA抑制剂))功能或者抑制RISC功能(如RISC抑制剂)，以调节基因表达。这类分子在本文中统称为RNAi抑制剂。

[0014]本发明的siNA或RNAi抑制剂可为经化学修饰的或未经修饰的。本发明的siNA或RNAi抑制剂可为化学合成的、从载体表达的或酶学合成的。本发明还描述了多种能够通过RNA干扰(RNAi)调节细胞中靶基因表达或活性的经化学修饰的合成短干扰核酸(siNA)分子。本发明还描述了多种经化学修饰的合成短核酸(siNA)分子，它们能够通过与miRNA、siRNA或RISC相互作用并由此下调或抑制细胞或生物体中的RNA干扰(RNAi)、翻译抑制或转录沉默而调节细胞中的RNAi活性。经化学修饰的siNA和/或RNAi抑制剂的使用通过增加的对体内核酸酶降解的抗性和/或通过改善的细胞摄取改进了天然siNA分子和/或RNAi抑制剂的多种性能。此外，与较早发表的研究相反，本发明具有多重化学修饰的siNA分子(包括完全修饰的siNA)保留了其RNAi活性。因此，申请人在此讲述了保留或改进了天然siRNA活性的经化学修饰siRNA(本文中泛称为siNA)。本发明的siNA分子为多种治疗、预防、兽医、诊断、靶标确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组学应用提供了有用的试剂和方法。

[0015]在一个实施方案中，本发明描述了一种或多种siNA分子和/或RNAi抑制剂以及方法，它们独立地或联合调节编码蛋白(例如与本文中所描述的或现有技术中已知的疾病、性状、病症和/或状况的维持和/或发展有关的蛋白)的靶基因的表达，例如包括在美国临时申请60/363,124、USSN 10/923,536、以及PCT/US03/05028中以GenBank登记号指明的序列的基因编码序列，这些序列在本文中统称为“靶”序列，将这些文献通过参考并入本文。以下参照示例性靶基因(本文中称为基因靶)提供对本发明的各个方面和实施方案的说明。本发明还涉及与性状、疾病和状况有关的化合物、组合物和方法，这些性状、疾病和状况应答对参与介导这类性状、疾病和状况的维持或发展的基因表达途径或其它细胞过程的基因的表达和/或活性的调节。但是，这种参照仅是示例性的，本发明的各个方面和实施方案还涉及其它表达备选(alternate)靶基因的基因，例如突变体靶基因、靶基因的剪接变体、种间或个体间的靶基因变体、以及本文所述的或现有技术中已知的其它靶途径基因。这类其它基因可采用本文描述的用于本文示例性靶基因和序列的方法来分析靶位点。因此，可如本文所述完成对所述其它基因的调节和这类调节的作用。换言之，下文所定义的并在所描述的实施方案中提及的术语“靶”和“靶基因”意味着包括与本文的疾病、性状和状况的发展和/或维持有关的基因，例如编码多肽的基因、调节性多核苷酸(例如miRNAs和siRNAs)、突变体基因和基因的剪接突变体，以及其它参与基因表达和/或活性途径的基因。因此，本文描述的每个提及术语“靶”的实施方案都可应用于所有由术语“靶”所囊括的蛋白、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如本文对该术语所定义的。广而言之，这类基因靶在本文中也被统称为“靶”序列。

[0016]在一个实施方案中，本发明描述了包含本发明两种或多种不同的靶向不同多核苷酸靶的siNA分子和/或RNAi抑制剂(例如，siNA、形成双链体的siNA或多功能siNA或其任意组合)的组合物，所述多核苷酸靶例如为靶RNA或DNA的不同区域(例如，两个不同的靶位点，如本文所提供的，或者靶或途径靶点的任意组合)或编码和非编码靶。这类siNA分子池可提供增加的治疗效果。

[0017]在一个实施方案中，本发明描述了本发明两种或多种不同siNA分子(例如，siNA、形成双链体的siNA或多功能siNA或其任意组合)池，这些分子对不同的多核苷酸靶有特异性，例如靶RNA或DNA的不同区域(例如，其中两个不同的靶位点，或者靶或途径靶的任意组合)或编码和非编码靶，其中所述池(pool)包含靶向约2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多种不同靶的siNA分子。

[0018]由于不同生物体或不同个体间可能有基因组序列差异，针对广泛治疗应用的siNA分子的选择很可能涉及基因的保守区。在一个实施方案中，本发明涉及靶向基因组的保守区域或在不同靶间保守的区域的siNA分子和/或RNAi抑制剂。设计为靶向不同靶保守区域的siNA分子和/或RNAi抑制剂使得在不同患者群中有效抑制靶基因表达成为可能。

[0019]在一个实施方案中，本发明描述了双链核酸分子，例如siNA分子，其中一条链包含与靶核酸分子或其部分中的预定核苷酸序列互补的核苷酸序列。该预定的核苷酸序列可为核苷酸靶序列，例如本文所述的或现有技术中已知的序列。在另一实施方案中，该预定的核苷酸序列为靶序列或途径靶序列，如现有技术中所已知的。

[0020]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，其中所述siNA分子包含约15至约28碱基对。

[0021]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其指导对靶RNA的切割，其中所述siNA分子包含约15至约28碱基对。

[0022]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其通过RNA干扰(RNAi)指导对靶RNA的切割，其中双链siNA分子包括第一链和第二链，该siNA分子的每一链为约18至约28(如约18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，或28)核苷酸长度，该siNA分子的第一链包括与靶RNA有足够互补性的核苷酸序列以用于该siNA分子指导通过RNA干扰进行的对靶RNA的切割，所述siNA分子的第二链包含与第一链互补的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，例如，该siNA分子的每一链为约18至约27核苷酸长度。

[0023]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其指导通过RNA干扰(RNAi)对靶RNA进行的切割，其中该双链siNA分子包括第一链和第二链，该siNA分子的每一链为约18至约23(如约18，19，20，21，22或23)核苷酸长度，该siNA分子的第一链包括与靶RNA有足够互补性的核苷酸序列以用于该siNA分子指导通过RNA干扰进行的对靶RNA的切割，所述siNA分子的第二链包含与第一链互补的核苷酸序列。

[0024]在一个实施方案中，本发明描述了化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其指导通过RNA干扰(RNAi)对靶RNA进行的切割，其中该siNA分子的每一链为约18至约28核苷酸长度；并且该siNA分子的一条链包括与靶RNA有足够互补性的核苷酸序列以用于该siNA分子指导通过RNA干扰进行的对靶RNA的切割。

[0025]在一个实施方案中，本发明描述了化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其指导通过RNA干扰(RNAi)对靶RNA进行的切割，其中该siNA分子的每一链为约18至约23核苷酸长度；并且该siNA分子的一条链包括与靶RNA有足够互补性的核苷酸序列以用于该siNA分子指导通过RNA干扰进行的对靶RNA的切割。

[0026]在一个实施方案中，本发明描述了下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割的siNA分子，例如，其中该靶基因或RNA包含蛋白编码序列。在一个实施方案中，本发明描述了下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割的siNA分子，例如，其中靶基因或RNA包含参与靶基因表达的非编码序列或调节元件(例如非编码RNA、miRNA、stRNA等)。

[0027]在一个实施方案中，本发明的siNA被用于抑制靶基因或靶基因家族的表达，其中该基因或基因家族序列共有序列同源性。如现有技术中已知的，这类同源序列可被鉴定，例如采用序列比对。siNA分子可被设计为靶向这类同源序列，例如使用完全互补的序列，或者并入可提供额外靶序列的非标准碱基对，例如错配和/或摆动(wobble)碱基对。在鉴定了错配的情况下，非标准碱基对(例如错配和/或摆动碱基)可被用于生成靶向一种以上基因序列的siNA分子。在非限定性实例中，非标准碱基对如UU和CC碱基对被用于生成能够靶向共有序列同源性的不同多核苷酸靶的序列的SiNA分子。就此而言，使用本发明siNA的一个优点是，单一siNA可被设计为包括互补于在同源基因间保守的核苷酸序列的核酸序列。这种方法中，单一siNA可被用于抑制一种以上基因的表达，而不是使用一种以上的靶向不同基因的siNA分子。

[0028]在一个实施方案中，本发明描述了对靶RNA(例如编码或非编码RNA)有RNAi活性的siNA分子，其中该siNA分子包含与任意RNA序列互补的序列，该任意RNA序列例如为具有显示在PCT/US03/05028、U.S临时专利申请60/363,124和/或USSN 10/923,536中的GenBank登录号的序列，通过参考将这些文献都并入本文。在另一实施方案中，本发明描述了对靶RNA有RNAi活性的siNA分子，其中该siNA分子包含互补于具有变体编码序列的RNA的序列，例如其它现有技术中已知的与本文所述或现有技术中已知的疾病、性状、病症和/或状况的维持和/或发展有关的突变体基因。显示在表I中或本文所描述的化学修饰可应用于本发明的任何siNA构建体。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括可与靶基因核苷酸序列相互作用并由此介导靶基因表达沉默的核苷酸序列，例如其中该siNA通过细胞过程调节靶基因表达，该细胞过程调节靶基因的染色质结构或甲基化模式并阻止靶基因的转录。

[0029]在一个实施方案中，本发明的siNA分子被用于下调或抑制与个体或生物体中性状、疾病或状况有关的单倍体多态性产生的蛋白的表达。对基因、或蛋白、或RNA水平的分析可被用于鉴定具有这种多态性的个体，或者鉴定具有发展本文所述的性状、状况或疾病的危险的个体。这些个体可服从治疗，例如以本发明siNA分子和任何其它可用于治疗与靶基因表达有关的疾病的组合物进行的治疗。就此而言，对蛋白或RNA水平的分析可被用于确定个体治疗中的治疗类型和疗程。对蛋白或RNA水平的监测可被用于预测治疗结果并确定调节某些与性状、病症、状况或疾病有关的蛋白的水平和/或活性的化合物和组合物的有效性。

[0030]在本发明的一个实施方案中，siNA分子包括反义链，该反义链包含互补于编码靶蛋白的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。该siNA还包括有义链，其中所述有义链包含靶基因或其部分的核苷酸序列。

[0031]在另一实施方案中，siNA分子包括反义区，该反义区包含互补于编码靶蛋白或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。该siNA分子还包括有义区，该有义区包含靶基因或其部分的核苷酸序列。

[0032]在另一实施方案中，本发明描述了包含核苷酸序列的siNA分子，例如在该siNA分子中的反义区的核苷酸序列互补于靶基因序列的核苷酸序列或其部分。在另一实施方案中，本发明描述了包含一区域的siNA分子，例如该siNA构建体的反义区，其互补于包含靶基因序列或其部分的序列。

[0033]在一个实施方案中，本发明的siNA分子的有义区或有义链互补于该siNA分子的反义区或反义链的一部分，而其又互补于靶多核苷酸序列。

[0034]在另一实施方案中，本发明描述了siNA分子，其包含一序列，例如该siNA构建体的反义序列，其互补于包含由显示在PCT/US03/05028、U.S临时专利申请60/363,124和/或USSN10/923,536中的GenBank登录号所指明的序列的序列或部分序列，通过参考将这些文献都并入本文。表I的和本文所描述的化学修饰可被应用于任何本发明的siNA构建体。描述在表IV中的LNP制剂可被应用于本文的任何siNA分子或siNA分子组合。

[0035]在本发明的一个实施方案中，siNA分子包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的反义链，其中该反义链互补于靶RNA序列或其部分，并且其中所述siNA还包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的有义链，以及其中所述有义链和所述反义链为不同的核苷酸序列，其中每一链中有至少约15核苷酸互补于另一链。

[0036]在一个实施方案中，本发明的siNA分子(如双链核酸分子)包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的反义(引导)链，其互补于靶RNA序列或其部分。在一个实施方案中，靶RNA序列的至少15核苷酸(如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸)互补于本发明siNA分子的反义(引导)链。

[0037]在一个实施方案中，本发明的siNA分子(如双链核酸分子)包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的有义(信使)链，其包含靶RNA序列或其部分。在一个实施方案中，靶RNA序列的至少15核苷酸(如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸)互补于本发明siNA分子的有义(信使)链。

[0038]在本发明另一实施方案中，本发明的siNA分子包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的反义区，其中该反义区互补于靶DNA序列，其中所述siNA还包括具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的有义区，其中所述有义区和所述反义区被包含在线性分子中，其中所述有义区包含至少约15核苷酸，其互补于所述反义区。

[0039]在一个实施方案中，本发明的siNA分子具有调节由基因编码的RNA的表达的RNAi活性。由于基因可彼此间共有某些程度的序列同源性，通过选择不同靶间共有的或者特异靶独有的序列，siNA分子可被设计为靶向一类基因。因此，在一个实施方案中，siNA分子可被设计为靶向靶多核苷酸序列的保守区(在几个基因变体之间具有同源性)，以便以一种siNA分子靶向一类基因。相应地，在一个实施方案中，本发明的siNA分子调节个体或生物体中一个或多个靶基因亚型(isoform)或变体的表达。在另一实施方案中，由于该siNA分子介导RNAi活性所需的高度特异性，该siNA分子可被设计为靶向特异多核苷酸序列所独有的序列(例如，单个靶基因亚型或单核苷酸多态性(SNP))。

[0040]在一个实施方案中，用作RNA干扰基因沉默反应的介导剂的本发明核酸分子为双链核酸分子。在另一实施方案中，本发明的siNA分子由双链体核酸分子组成，在包含15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸的寡核苷酸间含有约15至约30碱基对。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括具有约1至约3(例如，约1、2、或3)个核苷酸突出末端的双链体核酸分子，例如具有约19碱基对和3′-末端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出的约21核苷酸双链体。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括具有平末端的双链体核酸分子，其中两端都是平的，或者其中一端是平的。

[0041]在一个实施方案中，双链核酸(例如siNA)分子包括核苷酸或非核苷酸突出。“突出”指双链核酸分子两条链间未碱基配对的核苷酸序列末端部分(例如参见图6)。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子可在双链核酸分子的一条或两条链的3’末端包括核苷酸或非核苷酸突出。例如，本发明的双链核酸分子可在双链核酸分子的引导链或反义链/区的3’末端、信使链或有义链/区的3’末端或引导链或反义链/区和信使链或有义链/区包括核苷酸或非核苷酸突出。在另一实施方案中，本发明双链核酸(siNA)分子的核苷酸突出部分包含2’-O-甲基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(FANA)、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、非环状或5-C-甲基核苷酸。在另一实施方案中，本发明双链核酸(siNA)分子的非核苷酸突出部分包括甘油基、脱碱基或反向脱氧脱碱性非核苷酸。

[0042]在一个实施方案中，构成本发明双链核酸(如siNA)分子的突出部分的核苷酸对应于构成该siNA分子的靶多核苷酸序列的核苷酸。相应地，在这类实施方案中，构成本发明siNA分子的突出部分的核苷酸构成基于靶多核苷酸的序列，其中构成本发明siNA分子的引导链或反义链/区的突出部分的核苷酸可与靶多核苷酸序列中的核苷酸互补以及构成本发明siNA分子的信使链或有义链/区的突出部分的核苷酸可包括靶多核苷酸序列中的核苷酸。这类核苷酸突出包括Dicer加工天然dsRNA成siRNA所产生的序列。

[0043]在一个实施方案中，构成本发明双链核酸(如siNA)分子的突出部分的核苷酸互补于靶多核苷酸序列，并且任选地被化学修饰，如本文所描述的。因此，在一个实施方案中，构成本发明siNA分子的引导链或反义链/区的突出部分的核苷酸可与靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，即靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置互补于siNA分子的引导链或反义链/区的突出部分的核苷酸位置。在另一实施方案中，构成本发明siNA分子的信使链或有义链/区的突出部分的核苷酸可包括靶多核苷酸序列中的核苷酸，即靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置对应于siNA分子的信使链或有义链/区的突出部分的相同核苷酸位置。在一个实施方案中，该突出包括两个核苷酸(例如，3’-GA；3’-GU；3’-GG；3’GC；3’-CA；3’-CU；3’-CG；3’CC；3’-UA；3’-UU；3’-UG；3’UC；3’-AA；3’-AU；3’-AG；3’-AC；3’-TA；3’-TU；3’-TG；3’-TC；3’-AT；3’-UT；3’-GT；3’-CT)突出，其互补于靶多核苷酸序列的一部分。在一个实施方案中，该突出包括两个核苷酸(例如，3’-GA；3’-GU；3’-GG；3’GC；3’-CA；3’-CU；3’-CG；3’CC；3’-UA；3’-UU；3’-UG；3’UC；3’-AA；3’-AU；3’-AG；3’-AC；3’-TA；3’-TU；3’-TG；3’-TC；3’-AT；3’-UT；3’-GT；3’-CT)突出，其不互补于靶多核苷酸序列的一部分。在另一实施方案中，本发明siNA分子的突出核苷酸为2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在另一实施方案中，本发明siNA分子的突出核苷酸为2’-O-甲基核苷酸(在突出核苷酸为嘌呤核苷酸情况下)和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(在突出核苷酸为嘧啶核苷酸情况下)。在另一实施方案中，本发明siNA分子的突出中的嘌呤核苷酸(当存在时)为2’-O-甲基核苷酸。在另一实施方案中，本发明siNA分子的突出中的嘧啶核苷酸(当存在时)为2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸。

[0044]在一个实施方案中，构成本发明双链核酸(如siNA)分子的突出部分的核苷酸不互补于靶多核苷酸序列，并且任选地被化学修饰，如本文所描述的。在一个实施方案中，该突出包括3’-UU突出，其不互补于靶多核苷酸序列的一部分。在另一实施方案中，构成本发明siNA分子的突出部分的核苷酸为2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸。

[0045]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(如siNA)包括两或三核苷酸突出，其中突出中的核苷酸相同或不同。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(如siNA)包括两或三核苷酸突出，其中突出中的核苷酸相同或不同，且其中突出中的一个或多个核苷酸在碱基、糖和/或磷酸骨架被化学修饰。

[0046]在一个实施方案中，本发明描述了一种或多种经化学修饰的siNA构建体，它们对靶核酸分子有特异性，该靶核酸分子例如为DNA，或编码蛋白的RNA或与靶基因的表达有关的非编码RNA。在一个实施方案中，本发明描述了对核酸分子特异的基于RNA的siNA分子(例如包含2’-OH核苷酸的siNA)，其包括一种或多种本文所描述的化学修饰。这类化学修饰的非限定性实例包括但不限于核苷酸间硫代磷酸酯键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4’-硫基核糖核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(例如，2004年11月5日提交的USSN10/981,966，通过参考并入本文)、“通用碱基”核苷酸、“非环状”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(FANA，参见例如Dowler et al.，2006，Nucleic Acids Research，34，1669-1675)和末端甘油基和/或反向脱氧无碱基(abasic)残基插入。当用在各种siNA构建体(如，基于RNA的siNA构建体)中时，这些化学修饰被证实在细胞中保留了RNAi活性，而同时显著增加了这些化合物的血清稳定性。

[0047]在一个实施方案中，本发明的siNA分子在该siNA分子的内部位置包含本文所描述的化学修饰(例如，2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4’-硫基核糖核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、LNA)。“内部位置”指siNA双链体的碱基配对位置。

[0048]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含经修饰的核苷酸，同时维持了介导RNAi的能力。该经修饰的核苷酸可被用于改进体外或体内性能，例如稳定性、活性、毒性、免疫反应和/或生物利用度。例如，本发明的siNA分子可包括占存在于该siNA分子中核苷酸总数一定百分比的经修饰的核苷酸。就此而言，本发明的siNA分子一般可包括约5％至约100％经修饰的核苷酸(例如，约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸)。例如，在一个实施方案中，本发明siNA分子中核苷酸位置的约5％至约100％(例如，约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸)包括核酸糖修饰，例如2’-糖修饰，如2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(2’-deoxy-2’-fluoroarabino)、2’-O-甲氧基乙基核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或2’-脱氧核苷酸。在另一实施方案中，本发明siNA分子中核苷酸位置的约5％至约100％(例如，约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸)包括核酸碱基修饰，例如次黄嘌呤核苷、嘌呤、嘧啶-4-酮、嘧啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿嘧啶核苷(如核糖胸腺嘧啶核苷)、5-卤代尿嘧啶核苷(如5-溴尿嘧啶核苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿嘧啶核苷)、或丙炔修饰。在另一实施方案中，本发明siNA分子中核苷酸位置的约5％至约100％(例如，约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸)包括核酸骨架修饰，例如具有本文式I的骨架修饰。在另一实施方案中，本发明siNA分子中核苷酸位置的约5％至约100％(例如，约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸)包括核酸糖、碱基、或骨架修饰或其任意组合(例如，本文核酸糖、碱基、骨架或非核苷酸修饰的任意组合)。在一个实施方案中，本发明siNA分子包含至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸在给定siNA分子中的实际百分比将取决于存在于该siNA分子中的核苷酸总数。如果该siNA分子为单链，则修饰百分比可基于存在于单链siNA分子中的核苷酸总数。同样，如果该siNA分子为双链，则修饰百分比可基于存在于有义链、反义链或有义链和反义链二者中的核苷酸总数。

[0049]本发明的siNA分子可在该siNA分子的不同位置包含经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子在siNA双链体内的内部碱基配对位置包含经修饰的核苷酸。例如，内部位置可包括21核苷酸siNA双链体的从有义或反义链或区的5’-端起的约3至约19核苷酸位置，该21核苷酸siNA双链体具有19碱基对和两核苷酸的3’-突出。在另一实施方案中，本发明的双链siNA分子在该siNA分子的非碱基配对或突出区包含经修饰的核苷酸。“非碱基配对的”指该核苷酸未在该siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间碱基配对。该突出核苷酸可与对应的靶多核苷酸序列互补或碱基配对(参见，例如图6C)。例如，突出位置可包括21核苷酸siNA双链体的从有义或反义链或区的5’-端起的约20至约21核苷酸位置，该21核苷酸siNA双链体具有19碱基对和两核苷酸的3’-突出。在另一实施方案中，本发明的双链siNA分子可在该siNA分子的末端位置包括经修饰的核苷酸。例如，这类末端区域包括该siNA分子的有义和/或反义链或区的3’-位置、5’-位置或3’和5’-位置二者。在另一实施方案中，本发明的双链siNA分子在碱基配对的或内部位置、非碱基配对的或突出区、和/或末端区、或其任何组合包括经修饰的核苷酸。

[0050]本发明的一方面描述了(features)双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割。在一个实施方案中，该双链siNA分子包括一个或多个化学修饰，并且该双链siNA的每一链为约21核苷酸长。在一个实施方案中，该双链siNA分子不含有任何核糖核苷酸。在另一实施方案中，该双链siNA分子包含一个或多个核糖核苷酸。在一个实施方案中，该双链siNA分子的每条链独立地包含约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸，其中每条链包括约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸互补于另一链的核苷酸。在一个实施方案中，该双链siNA分子的一条链包括互补于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，并且该双链siNA分子的第二条链包括基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。

[0051]在另一实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，包括反义区和有义区，其中该反义区包括互补于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，有义区包括基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，该反义区和有义区独立地包括约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸，其中该反义区包含约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸互补于该有义区的核苷酸。

[0052]在另一实施方案中，本发明描述了双链短短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，包括有义区和反义区，其中该反义区包括互补于由靶基因或其部分编码的RNA的核苷酸序列的核苷酸序列，有义区包括与反义区互补的核苷酸序列。

[0053]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括平末端，即不包括任何突出核苷酸的末端。例如，包括本文所描述的修饰(例如，包括式I-VII的核苷酸或siNA构建体包括“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab36F”(表I)或其任何组合)的siNA分子和/或本文所描述的任何长度的siNA分子可包括平末端或无突出核苷酸的末端。

[0054]在一个实施方案中，本发明的任何siNA分子都可包括一个或多个平末端，即，其中平末端不具有任何突出核苷酸。在一个实施方案中，该平末端SiNA分子所具有的碱基对数等于该siNA分子的每一链中存在的核苷酸数。在另一实施方案中，该siNA分子包括一个平末端，例如其中反义链的5’-端和有义链的3’-端不具有任何突出核苷酸。在另一实施方案中，该siNA分子包括一个平末端，例如，其中反义链的3’-端和有义链的5’-端不具有任何突出核苷酸。在另一实施方案中，siNA分子包括两个平末端，例如，其中反义链的3’-端和有义链的5’-端以及反义链的5’-端和有义链的3’-端不具有任何突出核苷酸。平末端siNA分子可包括例如约15至约30核苷酸(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸)。存在于平末端siNA分子中的其它核苷酸可包括例如错配、突起(bulge)、环或摆动碱基对，以调节siNA分子介导RNA干扰的活性。

[0055]“平末端”指双链siNA分子的对称末端或末端，其不具有突出核苷酸。双链siNA分子的两条链相互对齐，在末端没有突出核苷酸。例如，平末端siNA构建体包括的末端核苷酸在该siNA分子的有义和反义区之间互补。

[0056]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，其中该siNA分子从两个独立的寡核苷酸片段组装而来，其中一个片段包括该siNA分子的有义区，第二片段包括反义区。有义区可通过接头分子如多核苷酸接头或非核苷酸接头被连接至反义区。

[0057]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(如siNA分子)在维持或增强RNAi活性的位置包括核糖核苷酸。在一个实施方案中，核糖核苷酸存在于该siNA分子有义链或有义区，其可通过使RISC内的酶能够切割该有义链或有义区而提供RNAi活性(例如，核糖核苷酸存在于信使链、有义链或有义区切割位置，例如在RISC中被AGO2酶切割的19碱基对双链体的信使链的9位。参见，例如Matranga et al.，2005，Cell，123：1-114和Rand et al.，2005，Cell，123：621-629)。在另一实施方案中，该siNA分子引导链或引导区(也称为反义链或反义区)5’-端的一个或多个(例如1，2，3，4或5)个核苷酸是核糖核苷酸。

[0058]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(如siNA分子)在信使链或信使区(也称为有义链或有义区)内的位置包含一个或多个核糖核苷酸，其使得RISC复合体中的酶可切割该信使链或信使区，(例如，核糖核苷酸存在于信使链的位置，例如在RISC中被切割的19碱基对双链体的信使链的9位，参见，例如Matranga et al.，2005，Cell，123：1-114 andRand et al.，2005，Cell，123：621-629)。

[0059]在一个实施方案中，本发明的siNA分子含有至少2，3，4，5或更多的化学修饰，它们可以相同或不同。在一个实施方案中，本发明的siNA分子含有至少2，3，4，5，或更多的不同化学修饰。

[0060]在一个实施方案中，本发明的siNA分子为双链短干扰核酸(siNA)，其中该双链核酸分子包括约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)碱基对，其中该siNA分子每条链中的一个或多个(例如，至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸位置包含化学修饰。在另一实施方案中，该siNA含有至少2，3，4，5，或更多的不同化学修饰。

[0061]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，其中该siNA分子包括约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)碱基对，以及其中该siNA分子的每条链包含一个或多个化学修饰。在一个实施方案中，该双链siNA分子的每条链包含至少两个(例如2，3，4，5，或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或骨架修饰。在另一实施方案中，该双链siNA分子的一条链包含互补于靶基因或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，该双链siNA分子的另一条链包含基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一实施方案中，该双链siNA分子的一条链包含互补于靶基因或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，该双链siNA分子的另一条链包含基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一实施方案中，该siNA分子的每条链包括约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸，并且每条链包含至少约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸互补于另一链的核苷酸。靶基因可包括例如本文指出的序列，通过参考将它们并入本文。该基因例如可包括由本文GenBank登录号指出的序列。

[0062]在一个实施方案中，本发明双链siNA分子的每条链包含不同的化学修饰模式，例如本文的任何“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab36F”(表I)修饰模式或其任意组合。这类具有不同修饰模式的siNA分子的有义和反义链的非限定性实例显示在表II以及图4和5中。

[0063]在一个实施方案中，本发明siNA分子不包含核糖核苷酸。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个核糖核苷酸(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多核糖核苷酸)。

[0064]在一个实施方案中，本发明siNA分子包括反义区，其包含互补于靶基因或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，该siNA还包含有义区，其包含基本上相似于靶基因或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一实施方案中，该反义区和有义区每一个包含约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸，并且反义区包含至少约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)互补于有义区核苷酸的核苷酸。在一个实施方案中，该双链siNA分子的每条链包含至少两个(例如，2，3，4，5，或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或骨架修饰。靶基因可包括例如本文指出的序列，通过参考将它们并入本文。在另一实施方案中，该siNA为双链核酸分子，其中该双链siNA分子的每条链独立地包括约15至约40(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，23，33，34，35，36，37，38，39，或40)核苷酸，以及其中该siNA分子的一条链可包括至少约15(如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25或更多)互补于靶基因或其部分的核酸序列的核苷酸。

[0065]在一个实施方案中，本发明siNA分子包括有义区和反义区，其中反义区包含互补于由靶基因或其部分编码的RNA的核苷酸序列的核苷酸序列，有义区包含互补于反义区的核苷酸序列。在一个实施方案中，该siNA分子是由两独立的寡核苷酸片段组装而来，其中一个片段包括该siNA分子的有义区，另一片段包括反义区。在另一实施方案中，有义区通过接头分子连接至反义区。在另一实施方案中，有义区通过诸如核苷酸或非核苷酸接头的接头分子连接至反义区。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少两个(如，2，3，4，5，或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或骨架修饰。所述靶基因可例如包括本文指出的序列，或通过参考将它们并入本文的序列。

[0066]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多)2’-脱氧-2’-氟嘧啶修饰(例如，其中该siNA的一个或多个或所有嘧啶(例如，U或C)位置被2’-脱氧-2’-氟核苷酸修饰)。在一个实施方案中，该2’-脱氧-2’-氟嘧啶修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2’-脱氧-2’-氟嘧啶修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，该2’-脱氧-2’-氟嘧啶修饰存在于该siNA分子有义链和反义链中。

[0067]在一个实施方案中，本发明siNA分子包含一个或多个(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多)2’-O-甲基嘌呤修饰(例如，其中该siNA的一个或多个或所有嘌呤(例如A或G)位置被2’-O-甲基核苷酸修饰)。在一个实施方案中，该2’-O-甲基嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2’-O-甲基嘌呤修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，该2’-O-甲基嘌呤修饰存在于该siNA分子有义链和反义链中。

[0068]在一个实施方案中，本发明siNA分子包含一个或多个(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多)2’-脱氧嘌呤修饰(例如，其中该siNA的一个或多个或所有嘌呤(例如A或G)位置被2’-脱氧核苷酸修饰)。在一个实施方案中，该2’-脱氧嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2’-脱氧嘌呤修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，该2’-脱氧嘌呤修饰存在于该siNA分子有义链和反义链中。

[0069]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或指导对靶RNA的切割，包括有义区和反义区，其中该反义区包含互补于该靶基因或其部分编码的RNA的核苷酸序列，该有义区包含互补于该反义区的核苷酸序列，以及其中该siNA分子具有一个或多个经修饰的嘧啶和/或嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，该双链siNA分子的每条链包含至少两个(例如，2，3，4，5，或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或骨架修饰。在一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸为2′-O-甲基嘧啶核苷酸或2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，反义区的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基或2′-脱氧嘌呤核苷酸。在任意上述siNA分子的另一实施方案中，任何存在于有义链的非互补区(例如，突出区)的核苷酸为2’-脱氧核苷酸。

[0070]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或者指导对靶RNA的切割，其中该siNA分子是从两独立的寡核苷酸片段组装而来，其中一个片段包括该siNA分子的有义区，另一个片段包括反义区，以及其中包括有义区的片段在该片段的5′-末端、3′-末端或5′-和3′-末端包括末端帽部分。在一个实施方案中，该末端帽部分为反向脱氧的无碱基部分(abasic moiety)或甘油基部分。在一个实施方案中，该siNA分子两片段的每一个独立地包含约15至约30(如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸。在另一实施方案中，该siNA分子两片段的每一个独立地包含约15至约40(如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，23，33，34，35，36，37，38，39，或40)核苷酸。在非限定性实例中，该siNA分子两片段的每一个包含约21核苷酸。

[0071]在一个实施方案中，本发明描述了包含至少一个经修饰的核苷酸的siNA分子，其中该经修饰的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或任何其它本文以及2004年11月5日提交的USSN 10/981,966(通过参考并入)中描述的经修饰的核苷/核苷酸。在一个实施方案中，本发明描述了包含至少两个(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)经修饰的核苷酸的siNA分子，其中所述经修饰的核苷酸选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或任何其它本文以及2004年11月5日提交的USSN 10/981,966(通过参考并入)中描述的经修饰的核苷/核苷酸。所述经修饰的核苷酸/核苷可相同或不同。该siNA可例如为约15至约40核苷酸长度。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，所述siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-脱氧-2’-氟胞苷或2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在另一实施方案中，所述siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-脱氧-2’-氟胞苷和至少一个2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有尿苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有胞苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有腺苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有鸟苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟鸟苷核苷酸。该siNA还可包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2’-脱氧-2’-氟核苷酸存在于该siNA中特异选定的位置，它们对核糖核苷酸酶的切割敏感，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0072]在一个实施方案中，本发明描述了增强siNA分子抗核糖核酸酶切割的稳定性的方法，包括向该siNA分子引入至少一个经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有嘧啶核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，该siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-脱氧-2’-氟胞苷或2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在另一实施方案中，该siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-氟胞苷和至少一个2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有尿苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有胞苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有腺苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有鸟苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟鸟苷核苷酸。该siNA还可包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2’-脱氧-2’-氟核苷酸存在于该siNA中特异选定的位置，它们对核糖核苷酸酶的切割敏感，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0073]在一个实施方案中，本发明描述了增强siNA分子抗核糖核酸酶切割的稳定性的方法，包括向该siNA分子引入至少一个经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有嘧啶核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，该siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胞苷或2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在另一实施方案中，该siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2’-氟胞苷和至少一个2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有尿苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有胞苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胞苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有腺苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖腺苷核苷酸。在一个实施方案中，存在于该siNA中的所有鸟苷核苷酸都为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖鸟苷核苷酸。该siNA还可包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸存在于该siNA中特异选定的位置，它们对核糖核苷酸酶的切割敏感，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0074]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或者指导对靶RNA的切割，包括有义区和反义区，其中反义区包含互补于由靶基因或其部分编码的RNA的核苷酸序列的核苷酸序列，该有义区包含互补于反义区的核苷酸序列，以及其中存在于反义区的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，存在于反义区中的嘌呤核苷酸包含2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在任一上述实施方案中，该反义区可在反义区3′端包含硫代磷酸酯核苷酸间键。或者，在任一上述实施方案中，该反义区可在反义区的3′端包括甘油基修饰。在任意上述siNA分子的其它实施方案中，任何存在于反义链的非互补区(如，突出区)的核苷酸都为2’-脱氧核苷酸。

[0075]在一个实施方案中，本发明siNA分子的反义区包括互补于内源转录本的一部分的序列，该内源转录本具有为个体或生物体中特定疾病或性状相关等位基因所特有的序列，例如包含与疾病或性状特异等位基因有关的单核苷酸多态性(SNP)的序列。就此而言，本发明siNA分子的反义区可包含互补于特定等位基因特有序列的序列，以提供介导针对疾病、状况或性状相关等位基因的选择性RNAi的特异性。

[0076]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其下调靶基因的表达或者指导对靶RNA的切割，其中该siNA分子从两独立寡核苷酸片段组装而来，其中一个片段包括该siNA分子的有义区，另一片段包括反义区。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链为约21核苷酸长，其中该siNA分子的每个片段约19核苷酸与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对，其中该siNA分子的每个片段的至少两个3’末端核苷酸未与该siNA分子的另一片段的核苷酸碱基配对。在另一实施方案中，该siNA分子为双链核酸分子，其中每条链为约19核苷酸长，并且其中该siNA分子的每个片段的核苷酸与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对以形成至少约15(例如15，16，17，18，或19)碱基对，其中该siNA分子的一端或两端为平末端。在一个实施方案中，该siNA分子的每个片段的两3’末端核苷酸之一为2’-脱氧-嘧啶核苷酸，例如2’-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，该siNA分子的每个片段的两3’末端核苷酸均为2’-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2’-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一实施方案中，该siNA分子的每个片段的所有核苷酸都与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对。在另一实施方案中，该siNA分子为约19至约25碱基对的双链核酸分子，具有有义区和反义区，其中该反义区的约19核苷酸与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在另一实施方案中，该反义区的约21核苷酸与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在任意上述实施方案中，包含所述反义区的片段的5’端可任选地包括磷酸基团。

[0077]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其抑制靶RNA序列的表达，其中该siNA分子不含有任何核糖核苷酸以及其中该双链siNA分子的每条链为约15至约30核苷酸。在一个实施方案中，该siNA分子为21核苷酸长。含有非核糖核苷酸的siNA构建体的实例为显示在表I中的稳定化学物(stabilization chemistries)以任何有义/反义化学组合形式的组合，例如Stab 7/8，Stab 7/11，Stab 8/8，Stab 18/8，Stab 18/11，Stab 12/13，Stab 7/13，Stab 18/13，Stab 7/19，Stab 8/19，Stab18/19，Stab 7/20，Stab 8/20，Stab 18/20，Stab 7/32，Stab 8/32，或Stab18/32(例如，任何具有Stab 7，8，11，12，13，14，15，17，18，19，20，或32有义或反义链或其任意组合的siNA)。本文中，以数字表示的Stab化学物可包括显示在表I中化学物的2’-氟和2’-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。在一个实施方案中，本发明描述了化学合成的双链RNA分子，其指导通过RNA干扰对靶RNA进行的切割，其中所述RNA分子的每条链为约15至约30核苷酸长度；该RNA分子的一条链包含与靶RNA分子有足够互补性的核苷酸序列，以便该RNA分子指导通过RNA干扰对靶RNA进行的切割；以及其中所述RNA分子的至少一条链任选地包含一个或多个上述经修饰的核苷酸，例如但不限于脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖、2’-O-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫基核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-氟甲氧基-乙基核苷酸等，或者它们的任何组合。

[0078]在一个实施方案中，本发明的靶RNA包含编码蛋白的序列。

[0079]在一个实施方案中，本发明的靶RNA包含非编码RNA序列(例如，miRNA、snRNA、siRNA等)，例如参见Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy et al.，2006，RNA，12，192-197；以及Czech，2006NEJM，354，11：1194-1195。

[0080]在一个实施方案中，本发明描述了包含本发明siNA分子的药物。

[0081]在一个实施方案中，本发明描述了包含本发明siNA分子的活性成分。

[0082]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子抑制、下调或减弱靶基因表达的用途，其中该siNA分子包含一个或多个化学修饰，并且该双链siNA的每条链独立地为约15至约30或更多(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30或更多)核苷酸长。在一个实施方案中，本发明siNA分子为双链核酸分子，其包含一个或多个化学修饰，其中该siNA分子的两个片段每一个独立地包含约15至约40(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，23，33，34，35，36，37，38，39，或40)核苷酸，以及其中一链包含至少15个互补于编码RNA或其部分的靶的核苷酸序列。在非限定性实例中，该siNA分子的两个片段每一个包含约21核苷酸。在另一实施方案中，该siNA分子为双链核酸分子，包含一个或多个化学修饰，其中每条链为约21核苷酸长，以及其中该siNA分子的每个片段的约19核苷酸与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对，其中该siNA分子的每个片段的至少两3’末端核苷酸不与该siNA分子的另一片段的核苷酸互补。在另一实施方案中，该siNA分子为双链核酸分子，包含一个或多个化学修饰，其中每条链为约19核苷酸长，以及其中该siNA分子的每个片段的核苷酸与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对以形成至少约15(例如15，16，17，18，或19)碱基对，其中该siNA分子的一端或两端为平末端。在一个实施方案中，该siNA分子的每个片段的两3’末端核苷酸均为2’-脱氧-嘧啶核苷酸，例如2’-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，该siNA分子的每个片段的两3’末端核苷酸的每一个为2’-O-甲基嘧啶核苷酸，如2’-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一实施方案中，该siNA分子的每个片段的所有核苷酸都与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对。在另一实施方案中，该siNA分子为约19至约25碱基对的双链核酸分子，具有有义区和反义区并包含一个或多个化学修饰，其中反义区的约19核苷酸与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在另一实施方案中，反义区的约21核苷酸与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在任何上述实施方案中，包含所述反义区的片段的5’-端可任选地包含磷酸基团。

[0083]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子抑制、下调或减弱靶基因表达的用途，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，另一条链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少两个(例如2，3，4，5，或更多)化学修饰，它们可相同或不同，例如核苷酸、糖、碱基或骨架修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘌呤核苷酸包含糖修饰。

[0084]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其抑制、下调、或减弱靶基因的表达，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，其中另一条链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少两个(例如2，3，4，5，或更多)化学修饰，它们可相同或不同，例如核苷酸、糖、碱基或骨架修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘌呤核苷酸包含糖修饰。

[0085]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其抑制、下调、或减弱靶基因的表达，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于编码蛋白的靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，另一条链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列，以及其中存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，该siNA分子的每一链包含约15至约30或更多(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30或更多)核苷酸，其中每一链包含至少约15个互补于另一链核苷酸的核苷酸。在一个实施方案中，该siNA分子是从两寡核苷酸片段组装而来，其中一个片段包含该siNA分子的反义链的核苷酸序列，另一片段包含该siNA分子的有义区的核苷酸序列。在一个实施方案中，该有义链通过接头分子如多核苷酸接头或非核苷酸接头连接至反义链。在另一实施方案中，存在于有义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’氟嘧啶核苷酸，且存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，存在于有义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’氟嘧啶核苷酸，存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基嘌呤核苷酸。在再一实施方案中，存在于反义链中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且存在于反义链中的任何嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，该反义链包含一个或多个2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸和一个或多个2’-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，存在于反义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，且存在于反义链中的任何嘌呤核苷酸为2’-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，有义链包括3′端和5′端，其中末端帽部分(例如反向脱氧无碱基部分(an inverted deoxy abasic moiety)或反向脱氧核苷酸部分，如反向胸苷)存在于有义链的5′端、3′端、或5′和3′端。在另一实施方案中，反义链在反义链的3′端包含核苷酸间硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，该反义链在3′端包含甘油基修饰。在另一实施方案中，该反义链的5′端任选地包括磷酸基团。

[0086]在抑制靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子的任何上述实施方案(其中存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰)中，该siNA分子的两条链每条可包含约15至约30或更多(例如，如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30或更多)核苷酸。在一个实施方案中，该siNA分子每条链的约15至约30或更多(例如，如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30或更多)核苷酸与该siNA分子的另一链的互补核苷酸碱基配对。在另一实施方案中，该siNA分子每条链的约15至约30或更多(例如，如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30或更多)核苷酸与该siNA分子的另一链的互补核苷酸碱基配对，其中该siNA分子每条链的至少两3’末端核苷酸不与该siNA分子另一链的核苷酸碱基配对。在另一实施方案中，该siNA分子的每个片段的两3’末端核苷酸的每一个均为2’-脱氧-嘧啶，例如2’-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，该siNA分子的每条链与该siNA分子的另一链的互补核苷酸碱基配对。在一个实施方案中，反义链的约15至约30(例如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸与靶RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在一个实施方案中，反义链的约18至约25(例如约18，19，20，21，22，23，24，或25)核苷酸与靶RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。

[0087]在一个实施方案中，本发明描述了抑制靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，另一链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少两个(例如，2，3，4，5，或更多)不同的化学修饰，例如核苷酸糖、碱基或骨架修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，存在于该双链siNA分子中的大部分嘌呤核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，反义链的5’端任选地包括磷酸基团。

[0088]在一个实施方案中，本发明描述了抑制靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，另一链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列，以及其中存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰，其中反义链的核苷酸序列或其部分互补于靶RNA的非翻译区核苷酸序列或其部分。

[0089]在一个实施方案中，本发明描述了抑制靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中该双链siNA分子的一条链为反义链，其包含互补于靶RNA的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列，另一链为有义链，其包含互补于反义链的核苷酸序列的核苷酸序列，其中存在于该双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包含糖修饰，以及其中反义链的核苷酸序列互补于靶RNA的核苷酸序列或存在于该靶RNA中的其一部分。

[0090]在一个实施方案中，本发明描述了包含本发明siNA分子以及药用载体或稀释剂的组合物。在另一实施方案中，本发明描述了两种或多种不同的本发明siNA分子(例如，靶向靶RNA不同区域的siNA分子或靶向SREBP1途径RNA的siNA分子)和药用载体或稀释剂。

[0091]在非限定性实例中，将化学修饰的核苷酸引入核酸分子可在克服外源输送的天然RNA分子所固有的体内稳定性和生物利用度的潜在局限性方面提供有效工具。例如，使用化学修饰的核酸分子能使较低剂量的特定核酸分子产生指定的疗效，这是由于化学修饰的核酸分子倾向于具有更长的血清半衰期。此外，某些化学修饰可通过靶向特定细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞吸收而改善核酸分子的生物利用度。因此，即使化学修饰的核酸分子的活性与天然核酸分子(例如，当与全RNA核酸分子相比时)相比减弱了，但由于改善的稳定性和/或分子输送，该经修饰的核酸分子的总活性可比天然分子的更高。与天然未修饰的siNA不同，化学修饰的siNA还可使激活人体内干扰素活性或免疫刺激的可能性最小化。因此，这些特性相对于天然siRNA或最低程度修饰的siRNA在多种体外和体内情况下介导RNAi，包括在研究和治疗应用中的使用，的能力有改善。申请人在此描述与相应未修饰或最低程度修饰的siRNA分子相比具有改善的RNAi活性的经化学修饰的siNA分子。本文公开的经化学修饰的siNA基序提供了维持RNAi活性的能力，该活性基本上类似于未经修饰的或最低限度修饰的有活性siRNA(参见，例如Elbashir etal.，2001，EMBO J.，20：6877-6888)，同时提供核酸酶抗性和适合于治疗应用的药物动力学特性。

[0092]在本文所述siNA分子的任何实施方案中，本发明siNA分子的反义区可在所述反义区的3′端包含核苷酸间硫代磷酸酯键。在本文所述siNA分子的任何实施方案中，所述反义区可在所述反义区的5′端包含约1个至约5个核苷酸间硫代磷酸酯键。在本文所述siNA分子的任何实施方案中，本发明siNA分子的3’-端核苷酸突出可包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，它们在核酸糖、碱基或骨架上被化学修饰。在本文所述siNA分子的任何实施方案中，3′末端核苷酸突出可包含一个或多个通用碱基核苷酸。在本文所述siNA分子的任何实施方案中，3′末端核苷酸突出可包含一个或多个无环核苷酸。

[0093]本发明的一个实施方案提供了表达载体，其以允许核酸分子表达的方式含有编码至少一种本发明siNA分子的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了包含这种表达载体的哺乳动物细胞。该哺乳动物细胞可为人细胞。该表达载体的siNA分子可包括有义区和反义区。该反义区可包含互补于编码靶的RNA或DNA序列的序列，该有义区可包含互补于反义区的序列。该siNA分子可包括两条具有互补的有义区和反义区的不同链。该siNA分子可包括单条具有互补的有义区和反义区的链。

[0094]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的双链短干扰核酸(siNA)分子，其能够在细胞内或体外重建的系统中介导RNA干扰(RNAi)，其中化学修饰包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)含有式I的骨架修饰核苷酸间键的核苷酸：

其中，每个R1和R2独立地为任何核苷酸、非核苷酸或多核苷酸，它们可为天然产生的或经化学修饰的并且可被包括在siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点，每个X和Y独立地为O、S、N，烷基或取代的烷基，每个Z和W独立地为O、S、N、烷基、取代的烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基或乙酰基，其中W、X、Y、和Z任选地不都为O。在另一实施方案中，本发明的骨架修饰包含膦酰基乙酸酯和/或硫代膦酰基乙酸酯核苷酸间键(例如参见Sheehan et al.，2003，Nucleic AcidsResearch，31，4109-4118)。

[0095]具有式I的化学修饰核苷酸间键(例如，其中任何Z、W、X、和/或Y独立地包含硫原子)可存在于siNA双链体的一条或两条核苷酸链中，例如有义链、反义链或两条链中。本发明的siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端、5′端或3′和5′端包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)具有式I的化学修饰核苷酸间键。例如，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的5′端包含约1至约5或更多(例如，约1，2，3，4，5，或更多)具有式I的化学修饰核苷酸间键。在另一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链中包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)具有式I的化学修饰核苷酸间键的嘧啶核苷酸。在又一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链中包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)具有式I的化学修饰核苷酸间键的嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，本发明具有式I的核苷酸间键的siNA分子还包含具有式I-VII的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。

[0096]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的双链短干扰核酸(siNA)分子，其能够在细胞内或体外重建的系统中介导RNA干扰(RNAi)，其中化学修饰包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)具有式II的核苷酸或非核苷酸：

其中每个R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11和R12独立地为H、OH、烷基、取代的烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨基烷基、氨基酸、氨基酰基、ONH2、O-氨基烷基、O-氨基酸、O-氨基酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、或具有任何式I、II、III、IV、V、VI和/或VII的基团，它们中的任一个可被包括进siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点；R9为O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，B为核苷碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤，或任何其它的可与靶RNA互补或不互补的非天然产生的碱基，或非核苷碱基如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素(nebularine)、吡啶酮(pyridine)、吡啶酮(pyridinone)，或任何其它的可与靶RNA互补或不互补的非天然产生的通用碱基。在一个实施方案中，R3和/或R7包含偶联部分和接头(例如，本文所描述的或现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头)。偶联部分的非限定性实例包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺(spermidine)。在一个实施方案中，本发明具有式II的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明具有式II的核苷酸为2’-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明具有式II的核苷酸为2’-脱氧核苷酸。

[0097]式II的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可存在于siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或两条链中。本发明的siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端、5′端或3′和5′端包含一个或多个式II的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的5′端包含约1至约5或更多(例如，约1，2，3，4，5，或更多)式II的化学修饰核苷酸或非核苷酸。在另一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端中包含约1至约5或更多个(例如，约1，2，3，4，5，或更多)式II的化学修饰核苷酸或非核苷酸。

[0098]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的双链短干扰核酸(siNA)分子，其能够在细胞内或体外重建的系统中介导RNA干扰(RNAi)，其中化学修饰包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)具有式III的核苷酸或非核苷酸：

其中每个R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11和R12独立地为H、OH、烷基、取代的烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨基烷基、氨基酸、氨基酰基、ONH2、O-氨基烷基、O-氨基酸、O-氨基酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、或具有任何式I、II、III、IV、V、VI和/或VII的基团，它们中的任一个可被包括进siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点；R9为O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，B为核苷碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤，或任何其它的可与靶RNA互补或不互补的非天然产生的碱基，或非核苷碱基如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、吡啶酮(pyridine)、吡啶酮(pyridinone)，或任何其它的可与靶RNA互补或不互补的非天然产生的通用碱基。在一个实施方案中，R3和/或R7包含偶联部分和接头(例如，本文所描述的或现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头)。偶联部分的非限定性实例包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺。

[0099]式III的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可存在于存在于siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或两条链中。本发明的siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端、5′端或3′和5′端包含一个或多个式III的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的5′端包含约1至约5或更多(例如，约1，2，3，4，5，或更多)式III的化学修饰核苷酸或非核苷酸。在另一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端包含约1至约5或更多个(例如，约1，2，3，4，5，或更多)式III的化学修饰核苷酸或非核苷酸。

[00100]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包含具有式II或III的核苷酸，其中具有II或III的核苷酸为反向构型。例如，具有式II或III的核苷酸以3′-3′、3′-2′、2′-3′、或5′-5′构型例如在一条或两条siNA链的3′端、5′端或3′和5′端连接至siNA构建体。

[00101]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其能够在细胞内或体外重建的系统中介导RNA干扰(RNAi)，其中化学修饰包含具有式IV的5′-末端磷酸基团：

其中每个X和Y独立地为O、S、N、烷基、取代的烷基或烷基卤代；其中每个Z和Y独立地为O、S、N、烷基、取代的烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基、烷基卤代或乙酰基；以及其中W、X、Y和Z任选地不都为O且Y用作与siNA分子的结合点。

[00102]在一个实施方案中，本发明描述了在靶互补链(例如，互补于靶RNA的链)上具有式IV的5′-末端磷酸基团的siNA分子，其中该siNA分子包括全RNA siNA分子。在另一实施方案中，本发明描述了在靶互补链上具有式IV的5′-末端磷酸基团的siNA分子，其中该siNA分子还包含约1至约3个(例如，约1、2、或3)核苷酸的3′-末端核苷酸突出，在一条或两条链的3′端具有约1至约4个(例如，约1、2、3、或4)脱氧核糖核苷酸。在另一实施方案中，具有式IV的5′末端磷酸基团存在于本发明siNA分子(例如，具有任何式I-VII的化学修饰的siNA分子)的靶互补链上。

[00103]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其能够在细胞内或体外重建的系统中介导RNA干扰(RNAi)，其中该化学修饰包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。例如，在非限定性实例中，本发明描述了在一条siNA链中具有约1，2，3，4，5，6，7，8或更多核苷酸间硫代磷酸酯键的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。在又一实施方案中，本发明描述了在两条siNA链中分别具有约1，2，3，4，5，6，7，8或更多核苷酸间硫代磷酸酯键的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。该核苷酸间硫代磷酸酯键可存在于siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或两条链中。本发明的siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′端、5′端或3′和5′端包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。例如，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链的5′端包含约1至约5或更多(例如，约1，2，3，4，5，或更多)连续的核苷酸间硫代磷酸酯键。在另一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链中包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)嘧啶核苷酸间硫代磷酸酯键。在另一非限定性实施方案中，本发明的示例性siNA分子可在有义链、反义链或两条链中包含一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)嘌呤核苷酸间硫代磷酸酯键。

[00104]双链siNA分子的每条链可具有一个或多个化学修饰，使每条链包含不同的化学修饰模式。本文提供了几个非限定性的修饰方案实例，其可产生不同的修饰模式。

[00105]在一个实施方案中，本发明描述了siNA分子，其中有义链包含一个或多个、例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或约一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在有义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子；以及其中反义链包含约1个至约10个或更多、具体地约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在反义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子。在另一实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多嘧啶核苷酸被2′-脱氧、2′-O-甲基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸化学修饰，带有或不带有一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的核苷酸间硫代磷酸酯键和/或在3′端、5′端或3′和5′端带有或不带有末端帽分子，存在于相同或不同链中。

[00106]在另一实施方案中，本发明描述了siNA分子，其中有义链包含约1或约5个、具体地约1，2，3，4，或5个核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在有义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子；以及其中反义链包含约1个至约5个或更多、具体地约1，2，3，4，5，或更多核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在反义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子。在另一实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多嘧啶核苷酸被2′-脱氧、2′-O-甲基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸化学修饰，带有或不带有约1个至约5个或更多，如约1，2，3，4，5，或更多的核苷酸间硫代磷酸酯键和/或在3′端、5′端或3′和5′端带有或不带有末端帽分子，存在于相同或不同链中。

[00107]在一个实施方案中，本发明描述了siNA分子，其中反义链包含一个或多个、例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或约一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在有义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子；以及其中反义链包含约1个至约10个或更多、具体地约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在反义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子。在在另一实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多嘧啶核苷酸被2′-脱氧、2′-O-甲基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸化学修饰，带有或不带有一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的核苷酸间硫代磷酸酯键和/或在3′端、5′端或3′和5′端带有或不带有末端帽分子，存在于相同或不同链中。

[00108]在另一实施方案中，本发明描述了siNA分子，其中反义链包含约1个至约5个或更多、例如约1，2，3，4，5，或更多个核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或约一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在有义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子；以及其中反义链包含约1个至约5个或更多、具体地约1，2，3，4，5，或更多核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)通用碱基修饰的核苷酸，并任选地在反义链3′端、5′端或3′和5′端包含末端帽分子。在另一实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多嘧啶核苷酸被2′-脱氧、2′-O-甲基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基、4’-硫基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸化学修饰，带有或不带有约1个至5个，如约1，2，3，4，5，或更多的核苷酸间硫代磷酸酯键和/或在3′端、5′端或3′和5′端带有或不带有末端帽分子，存在于相同或不同链中。

[00109]在一个实施方案中，本发明描述了化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，在该siNA分子的每条链中具有约1个至5个或更多(具体地约1，2，3，4，5，或更多)核苷酸间硫代磷酸酯键。

[00110]在另一实施方案中，本发明描述了包含2′-5′核苷酸间键的siNA分子。该2′-5′核苷酸间键可在一条或两条siNA序列链的3′端、5′端或3′和5′端。此外，该2′-5′核苷酸间键可存在于一条或两条siNA序列链内的各个其它位置，例如该siNA分子的一条或两条链中约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多(包括每个核苷酸间键)嘧啶核苷酸可包括2′-5′核苷酸间键，或者该siNA分子的一条或两条链中约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多(包括每个核苷酸间键)嘌呤核苷酸可包括2′-5′核苷酸间键。

[00111]在另一实施方案中，本发明的经化学修饰的siNA分子包括具有两条链的双链体，其中的一条或两条链可被化学修饰，其中每条链独立地为约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸长度，其中该双链体具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)碱基对，以及其中化学修饰包含任何式I-VII的结构。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括具有两条链的双链体，其中一条或两条可被具有任何式I-VII的化学修饰或其任意组合化学修饰，其中每条链由约21核苷酸组成，每个具有2-核苷酸3’-末端核苷酸突出，以及其中该双链体具有约19碱基对。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括单链发夹结构，其中该siNA为约36至约70(例如，约36，40，45，50，55，60，65，或70)核苷酸长度，具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)碱基对，以及其中该siNA可包括包含任何式I-VII的结构或其任意组合的化学修饰。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括具有约42至约50(例如，约42，43，44，45，46，47，48，49，或50)核苷酸的线性寡核苷酸，其被具有任何式I-VII的化学修饰或其任意组合化学修饰，其中该线性寡核苷酸形成具有约19至约21(例如，19，20，或21)碱基对以及2-核苷酸3’末端核苷酸突出的发夹结构。在另一实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子含有茎环基序，其中该siNA分子的环部分是可生物降解的。例如，本发明的线性发夹siNA分子被如此设计，使得该siNA分子的环部分在体内降解可生成具有3′-末端突出的双链siNA分子，例如包含约2核苷酸的3′末端核苷酸突出。

[00112]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括发夹结构，其中该siNA为25至约50(例如，约25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50)核苷酸长度，具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)碱基对，以及其中该siNA可包括一个或多个包含任何式I-VII的结构或其任意组合的化学修饰。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括具有约25至约35(例如，约25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，或35)核苷酸的线性寡核苷酸，其被一个或多个具有任何式I-VII的化学修饰或其任意组合所化学修饰，其中该线性寡核苷酸形成具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)碱基对以及可如本文所描述被化学修饰的5’末端磷酸基团(例如，具有式IV的5′末端磷酸基团)的发夹结构。在另一实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子含有茎环基序，其中该siNA分子的环部分是可生物降解的。在一个实施方案中，本发明线性发夹siNA分子包括含有非核苷酸接头的环部分。

[00113]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括不对称发夹结构，其中该siNA为25至约50(例如，约25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50)核苷酸长度，具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)碱基对，以及其中该siNA可包括一个或多个包含任何式I-VII的结构或其任意组合的化学修饰。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括具有约25至约35(例如，约25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，或35)核苷酸的线性寡核苷酸，其被一个或多个具有任何式I-VII的化学修饰或其任意组合所化学修饰，其中该线性寡核苷酸形成具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)碱基对以及可如本文所描述被化学修饰的5’末端磷酸基团(例如，具有式IV的5′末端磷酸基团)的不对称发夹结构。在一个实施方案中，本发明的不对称发夹siNA分子含有茎环基序，其中该siNA分子的环部分是可生物降解的。在一个实施方案中，本发明不对称发夹siNA分子包括含有非核苷酸接头的环部分。

[00114]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包含不对称双链结构，具有包含有义和反义区的分开的多核苷酸链，其中该反义区为约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸长度，该有义区为约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)核苷酸长度，其中该有义区和反义区具有至少3个互补核苷酸，以及其中该siNA可包括一个或多个包含任何式I-VII或其任意组合的结构的化学修饰。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括不对称双链结构，具有包含有义和反义区的分开的多核苷酸链，其中该反义区为约18至约23(例如，约18，19，20，21，22，或23)核苷酸长度，该有义区为约3至约15(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15)核苷酸长度，其中该有义区和反义区具有至少3个互补核苷酸，以及其中该siNA可包括一个或多个包含任何式I-VII或其任意组合的结构的化学修饰。在另一实施方案中，该不对称双链siNA分子还可具有5’末端磷酸基团，其可如本文所描述被化学修饰(例如，具有式IV的5′-末端磷酸基团)。

[00115]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包括环状核酸分子，其中该siNA为约38至约70(例如，约38，40，45，50，55，60，65，或70)核苷酸长度，具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)碱基对，以及其中该siNA可包括化学修饰，其包含具有任何式I-VII或其任意组合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰siNA分子包括具有约42至约50(例如，约42，43，44，45，46，47，48，49，或50)核苷酸的环状寡核苷酸，其被具有任何式I-VII或其组合的化学修饰所化学修饰，其中该环状寡核苷酸形成具有约19碱基对和2个环的哑铃形结构。

[00116]在另一实施方案中，本发明的环状siNA分子含有两个环基序，其中该siNA分子的一个或两个环部分为可生物降解的。例如，本发明的环状siNA分子被如此设计，使得该siNA分子的环部分在体内降解可生成具有3′-末端突出的双链siNA分子，例如包含约2核苷酸的3′末端核苷酸突出。

[00117]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)无碱基部分(abasic moiety)，例如具有式V的化合物：

其中每个R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11，R12和R13独立地为H、OH、烷基、取代的烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨基烷基、氨基酸、氨基酰基、ONH2、O-氨基烷基、O-氨基酸、O-氨基酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、或具有任何式I、II、III、IV、V、VI和/或VII的基团，它们中的任一个可被包括进siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点；R9为O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2。在一个实施方案中，R3和/或R7包含偶联部分和接头(例如，本文所描述的或现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头)。偶联部分的非限定性实例包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺。

[00118]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)的反向无碱基部分(inverted abasicmoiety)，例如具有式VI的化合物：

其中每个R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11，R12和R13独立地为H、OH、烷基、取代的烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨基烷基、氨基酸、氨基酰基、ONH2、O-氨基烷基、O-氨基酸、O-氨基酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、或具有任何式I、II、III、IV、V、VI和/或VII的基团，它们中的任一个可被包括进siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点；R9为O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，以及R2，R3，R8或R13用作与本发明siNA分子的结合点。在一个实施方案中，R3和/或R7包含偶联部分和接头(例如，本文所描述的或现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头)。偶联部分的非限定性实例包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺。

[00119]在另一实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)取代的多烷基部分，例如具有式VII的化合物：

其中每个n独立地为1至12的整数，每个R1、R2和R3独立地为H、OH、烷基、取代的烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨基烷基、氨基酸、氨基酰基、ONH2、O-氨基烷基、O-氨基酸、O-氨基酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、或具有任何式I、II、III、IV、V、VI和/或VII的基团，它们中的任一个可被包括进siNA分子结构中或用作与siNA分子的结合点。在一个实施方案中，R3和/或R1包含偶联物部分和接头(例如，本文所描述的或现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头)。偶联部分的非限定性实例包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺。

[00120]“ZIP码”序列指任何参与细胞topogenic信号介导的输送的肽或蛋白(参见，例如Ray et al.，2004，Science，306(1501)：1505)。

[0100]该双链siNA分子内的每个核苷酸可独立地具有包含任何式I-VIII的结构的化学修饰。因此，在一个实施方案中，本发明siNA分子的一个或多个核苷酸位置包含具有任何式I-VII的结构的化学修饰或本文任何其它的修饰。在一个实施方案中，本发明siNA分子的每个核苷酸位置包含具有任何式I-VII的结构的化学修饰或本文任何其它的修饰。

[0101]在一个实施方案中，本发明双链siNA分子的一条或两条链的一个或多个核苷酸位置包含具有任何式I-VII的结构的化学修饰或本文任何其它的修饰。在一个实施方案中，本发明双链siNA分子的一条或两条链的每个核苷酸位置包含具有任何式I-VII的结构的化学修饰或本文任何其它的修饰。

[0102]在另一实施方案中，本发明描述了具有式VII的化合物，其中R1和R2为羟基(OH)基团，n＝1，以及R3包括O并且是与本发明双链siNA分子的一条或两条链的3′端、5′端或3′和5′端的结合点，或者与本发明单链siNA分子的结合点。这种修饰在本文中被称为“甘油基”(例如图10中的修饰6)。

[0103]在另一实施方案中，本发明化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有任何式V、VI或VII的部分)位于本发明siNA分子的3′端、5′端或3′和5′端。例如，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可存在于该siNA分子的反义链、有义链或反义和有义链的3′端、5′端或3′和5′端。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有任何式V、VI或VII的部分)位于本发明双链siNA分子的有义链的5′端和3′端以及反义链的3′端。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有任何式V、VI或VII的部分)位于本发明双链siNA分子的有义链的5′端和3′端以及反义链的3′端的末端位置。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有任何式V、VI或VII的部分)位于本发明双链siNA分子的有义链的5′端和3′端以及反义链的3′端的两末端位置。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有任何式V、VI或VII的部分)位于本发明双链siNA分子的有义链的5′端和3′端以及反义链的3′端的次末端位置(penultimate position)。此外，具有式VII的部分可存在于如本文所述发夹siNA分子的3′端或5′端。

[0104]在另一实施方案中，本发明siNA分子包含具有式V或VI的无碱基残基，其中该具有式V或VI的无碱基残基以3′-3′，3′-2′，2′-3′，或5′-5′构型例如在一条或两条siNA链的3′端、5′端或3′和5′端连接至该siNA构建体。

[0105]在一个实施方案中，本发明siNA分子例如在该siNA分子的5′端、3′端、5′和3′端或其任意组合处包含一个或多个(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)核苷酸。

[0106]在一个实施方案中，本发明siNA分子例如在该siNA分子的5′端、3′端、5′和3′端或其任意组合处包含一个或多个(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)4’-硫基核苷酸。

[0107]在另一实施方案中，本发明siNA分子例如在该siNA分子的5′端、3′端、5′和3′端或其任意组合处包含一个或多个(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)非环状核苷酸。

[0108]在一个实施方案中，本发明的化学修饰短干扰核酸(siNA)分子包括具有一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(如，2’-O-甲基)、2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧、FANA或无碱基化学修饰或它们的任意组合的有义链或有义区。

[0109]在一个实施方案中，本发明的化学修饰短干扰核酸(siNA)分子包括反义链或反义区，其具有一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(如，2’-O-甲基)、2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧、FANA或无碱基化学修饰或它们的任意组合。

[0110]在一个实施方案中，本发明的化学修饰短干扰核酸(siNA)分子包括有义链或有义区和反义链或反义区，其每一个具有一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(如，2’-O-甲基)、2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧、FANA或无碱基化学修饰或它们的任意组合。

[0111]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

[0112]在一个实施方案中，本发明描述了含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为FANA嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为FANA嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为FANA嘧啶核苷酸)。

[0113]在一个实施方案中，本发明描述了含有反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

[0114]在一个实施方案中，本发明描述了含有有义区和反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区和反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

[0115]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0116]在一个实施方案中，本发明描述了包含反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸)。

[0117]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0118]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)，其中任何构成存在于所述有义区中的3′末端核苷酸突出的核苷酸为2′-脱氧核苷酸。

[0119]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

[0120]在一个实施方案中，本发明描述了包含有义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，以及其中任何构成存在于所述有义区中的3′末端核苷酸突出的核苷酸为2′-脱氧核苷酸。

[0121]在一个实施方案中，本发明描述了包含反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

[0122]在一个实施方案中，本发明描述了包含反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，以及其中任何构成存在于所述反义区中的3′末端核苷酸突出的核苷酸为2′-脱氧核苷酸。

[0123]在一个实施方案中，本发明描述了包含反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0124]在一个实施方案中，本发明描述了包含反义区的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何(例如一个或多个或所有)存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0125]在一个实施方案中，本发明描述了能够在细胞或体外重建系统内介导RNA干扰(RNAi)的本发明化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，包含有义区和反义区，其中一个或多个存在于有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及一个或多个存在于有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)，其中一个或多个存在于反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及一个或多个存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。该有义区和/或反义区可具有末端帽修饰，例如本文所描述的或图10中所显示的任何修饰，其可任选地存在于有义和/或反义序列的3′端、5′端或3′和5′端。该有义和/或反义区可任选地还包括具有约1至约4个(例如，约1，2，3，或4)2′-脱氧核苷酸的3′末端核苷酸突出。所述突出核苷酸还可包含一个或多个(例如，约1，2，3，4或更多)核苷酸间硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯、和/或硫代膦酰基乙酸酯键。这些化学修饰的siNA的非限定性实例显示在本文图4和5以及表II中。在这些描述的实施方案的任一个中，存在于有义区中的嘌呤核苷酸可选择地为2’-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且一个或多个存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。此外，在这些实施方案任一个中，一个或多个存在于有义区中的嘌呤核苷酸任选地为嘌呤核糖核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为嘌呤核糖核苷酸，或者多个(即一个以上)嘌呤核苷酸为嘌呤核糖核苷酸)且存在于反义区中的任何嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个(即，一个以上)嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。而且，在这些实施方案的任一个中，存在于有义区和/或存在于反义区中的一个或多个嘌呤核苷酸可选择地选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫基核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸和2’-O-甲基核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫基核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸和2’-O-甲基核苷酸或者多个(即一个以上)嘌呤核苷酸选自2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫基核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸和2’-O-甲基核苷酸)。

[0126]在另一实施方案中，存在于本发明siNA分子中的任何经修饰的核苷酸，优选存在于本发明siNA分子反义链中的核苷酸，但任选地还有存在于有义链和/或反义和有义链中的核苷酸，包括与天然产生的核糖核苷酸有类似性质或特性的经修饰核苷酸。例如，本发明描述了包括具有Northern构象(例如，Northern假旋转环，参见例如Saenger，Principles ofNucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)的经修饰核苷酸的siNA分子，也称为“核糖样”或“A型螺旋”构型。就此而言，存在于本发明siNA分子中的化学修饰核苷酸，优选存在于本发明siNA分子反义链中的核苷酸，但任选地还有存在于有义链和/或反义和有义链中的核苷酸，抗核酸酶降解，但同时保留了介导RNAi的能力。具有northern构型的核苷酸的非限定性实例包括锁核酸(LNA)核苷酸(如，2′-O、4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2’-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2’-甲基-硫基-乙基、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氯核苷酸、2’-叠氮核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、4’-硫基核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。

[0127]在一个实施方案中，本发明双链siNA分子的有义链在该有义链的3’端、5’端或3’和5’端包含末端帽部分(参见，例如图10)，例如反向脱氧无碱基部分。

[0128]在一个实施方案中，本发明描述了能够在细胞或体外重建的系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰短干扰核酸分子(siNA)，其中该化学修饰包含与该化学修饰的siNA分子共价结合的偶联物。本发明所关注的偶联物的非限定性实例包括Vargeese等人的于2003年4月30日提交的USSN 10/427,160中所描述的偶联物和配体，通过参考将其整体并入本文，包括附图。在另一实施方案中，该偶联物通过可生物降解接头共价结合到该化学修饰的siNA分子。在一个实施方案中，偶联物分子结合在该化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的3′端。在另一实施方案中，偶联物分子结合在该化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的5′端。在又一实施方案中，偶联物分子结合在该化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的3′和5′端，或其任意组合。在一个实施方案中，本发明的偶联分子包括有助于将该化学修饰的siNA分子输送进生物学系统如细胞中的分子。在另一实施方案中，结合到该化学修饰的siNA分子的偶联分子为细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，以及多胺，如PEI、精胺或亚精胺。本发明所关注的可被结合至该化学修饰siNA分子的特异偶联物分子的实例为Vargeese等人的于2002年7月22日提交的美国序列号10/201,394中所描述的，通过参考将其并入本文。在保留siNA介导RNAi活性的能力情况下，可对所使用的偶联物的类型和本发明siNA分子的偶联程度在siNA构建体的改善的药物动力学性能、生物利用度、和/或稳定性方面进行评估。这样，本领域技术人员可筛选以不同偶联物修饰的siNA构建体，以确定siNA偶联物复合体在保留了例如在现有技术中公知的动物模型中介导RNAi的能力的同时是否具有改善的性能。

[0129]在一个实施方案中，本发明描述了本发明的短干扰核酸(siNA)分子，其中该siNA还包括连接该siNA的有义区和该siNA的反义区的核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一个实施方案中，核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头被用于例如将偶联物部分偶联至该siNA。在一个实施方案中，本发明的核苷酸接头可为≥2核苷酸长度的接头，例如约3，4，5，6，7，8，9，或10核苷酸长度。在另一实施方案中，核苷酸接头可为核酸适体。用在本文时，“适体”或“核酸适体”指特异结合靶分子的核酸分子，其中该核酸分子的序列包含在其天然状态下可被靶分子识别的序列。或者，适体可为结合靶分子的核酸分子，其中靶分子并不天然地结合核酸。该靶分子可为任何目的分子。例如，该适体可被用于结合蛋白的配体结合结构域，由此阻止天然产生的配体与蛋白的相互作用。这是一个非限定性实例，本领域技术人员会意识到采用现有技术中公知的技术可容易地产生其它实施方案。(参见，例如，Gold et al.，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody and Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann and Patel，2000，Science，287，820；以及Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628.)

[0130]在又一实施方案中，本发明的非核苷酸接头包括无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂、碳氢聚合物(polyhydrocarbon)或其它聚合化合物(例如，聚乙二醇，例如那些具有2至100乙二醇单元的)。具体实例包括Seela and Kaiser，Nucleic AcidsRes.1990，18：6353和Nucleic Acids Res.1987，15：3113；Cload andSchepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：6324；Richardson and Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：5109；Ma et al.，Nucleic Acids Res.1993，21：2585和Biochemistry1993，32：1751；Durand etal.，Nucleic Acids Res.1990，18：6353；McCurdy et al.，Nucleosides & Nucleotides 1991，10：287；Jschke et al.，Tetrahedron Lett.1993，34：301；Ono et al.，Biochemistry 1991，30：9914；Arnold et al.，International Publication No.WO 89/02439；Usmanet al.，International Publication No.WO 95/06731；Dudycz et al.，International Publication No.WO 95/11910以及Ferentz and Verdine，J.Am.Chem.Soc.1991，113：4000中所描述的那些，在此通过参考将它们都并入本文。“非核苷酸”还指可被并入核酸链替换一个或多个核苷酸单元的任何基团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，并且允许剩余的碱基显示它们的酶学活性。该基团或化合物可为无碱基的，由于其例如在糖的C1位置不含有通常所认为的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。

[0131]在一个实施方案中，本发明描述了能够在细胞或体外重建的系统内介导RNA干扰(RNAi)的短干扰核酸分子(siNA)，其中从两分开的寡核苷酸组装而来的该siNA分子的一条或两条链不包含任何核糖核苷酸。例如，siNA分子可从单一寡核苷酸组装而来，其中该siNA的有义和反义区包括分开的寡核苷酸，它们在该寡核苷酸中不具有任何核糖核苷酸(例如具有2’-OH基团的核苷酸)。在另一实例中，siNA分子可从单一寡核苷酸组装而来，其中该siNA的有义和反义区由本文所描述的核苷酸或非核苷酸接头连接或环化，其中在该寡核苷酸中不具有任何核糖核苷酸(例如具有2’-OH基团的核苷酸)。申请人惊奇地发现，该siNA分子内核糖核苷酸(例如具有2’-OH基团的核苷酸)的存在并非为支持RNAi活性所要求或必需。这样，在一个实施方案中，该siNA内的所有位置可包括化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸，例如具有式I、II、III、IV、V、VI、或VII或其任何组合的核苷酸和或非核苷酸，其程度为该siNA分子支持细胞内RNAi活性的能力被维持。

[0132]在一个实施方案中，本发明的siNA分子为在细胞或体外重建系统中介导RNAi活性的单链siNA分子，其包括与靶核酸序列有互补性的单链多核苷酸。在另一实施方案中，本发明的单链siNA分子包括5’末端磷酸基团。在另一实施方案中，本发明的单链siNA分子包括5’末端磷酸基团和3’末端磷酸基团(例如2’，3’环磷酸)。在另一实施方案中，本发明的单链siNA分子包含约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸。在又一实施方案中，本发明的单链siNA分子包含一个或多个本文所描述的化学修饰核苷酸或非核苷酸。例如，该siNA分子内的所有位置可包括化学修饰的核苷酸，例如具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，其程度为该siNA分子支持细胞内RNAi活性的能力被维持。

[0133]在一个实施方案中，本发明的siNA分子为单链siNA分子，其在细胞或体外重建系统中介导RNAi活性或调节RNAi活性，其包括与靶核酸序列有互补性的单链多核苷酸，其中存在于该siNA中的一个或多个嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或者多个嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，以及其中任何存在于反义区中的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸为2′-O-甲基、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、或2’-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，以及末端帽修饰，例如本文所描述的或显示在图10中的任何修饰，其任选地存在于该反义序列的3′端、5′端或3′和5′端。该siNA任选地还在该siNA分子的3′端包含约1个至约4个或更多(例如，约1，2，3，4或更多)的末端2’-脱氧核苷酸，其中该末端核苷酸还可包含一个或多个(例如，约1，2，3，4或更多)硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯和/或硫代膦酰基乙酸酯核苷酸间键，以及其中该siNA任选地包含末端磷酸基团，例如5’末端磷酸基团。这些实施方案的任一个中，存在于反义区中的任何嘌呤核苷酸可选择地为2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸都为2′-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸)。此外，在这些实施方案的任一个中，存在于该siNA中的任何嘌呤核苷酸(即，存在于有义和/或反义区的嘌呤核苷酸)可选择地为锁核酸(LNA)核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸都为LNA核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸为LNA核苷酸)。此外，在这些实施方案的任一个中，存在于该siNA中的任何嘌呤核苷酸可选择地为2’-甲氧基乙基嘌呤核苷酸(例如，其中所有的嘌呤核苷酸都为2’-甲氧基乙基嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸为2’-甲氧基乙基嘌呤核苷酸)。在另一实施方案中，任何存在于本发明单链siNA分子中的经修饰核苷酸包括性能或特性类似于天然产生的核糖核苷酸的经修饰核苷酸。例如。本发明描述了包括具有Northern构象(例如，Northern假旋转环，参见例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)的经修饰核苷酸的siNA分子。这样，存在于本发明单链siNA分子中的化学修饰核苷酸优选抗核酸酶降解，同时保留了介导RNAi的能力。

[0134]在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包括具有两个或更多个(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(例如2’-O-甲基)修饰或其任意组合的有义链或有义区。在另一实施方案中，该2’-O-烷基修饰处于该siNA的有义链或有义区的不同位置，例如1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21等位置或2，4，6，8，10，12，14，16，18，20等位置。

[0135]在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包括具有两个或多个(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(例如2’-O-甲基)或修饰其任意组合的反义链或反义区。在另一实施方案中，该2’-O-烷基修饰处于该siNA的反义链或反义区的不同位置，例如1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21等位置或2，4，6，8，10，12，14，16，18，20等位置。

[0136]在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包括有义链或有义区和反义链或反义区，每个具有两个或多个(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多)2’-O-烷基(例如2’-O-甲基)、2’-脱氧-2’-氟、2’-脱氧或无碱基化学修饰或其任意组合。在另一实施方案中，该2’-O-烷基修饰位于该siNA的有义链或有义区的不同位置，例如1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21等位置或2，4，6，8，10，12，14，16，18，20等位置。在另一实施方案中，2’-O-烷基修饰位于该siNA的反义链或反义区的不同位置，例如1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21等位置或2，4，6，8，10，12，14，16，18，20等位置。

[0137]在一个实施方案中，本发明的siNA分子在该siNA分子的一条或两条链或区内的不同位置包含化学修饰的核苷酸或非核苷酸(例如，具有任意式I-VII，例如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基或2’-O-甲基核苷酸)。例如，这类化学修饰可在基于RNA的siNA分子的每隔一个位置引入，从该siNA的3’端或5’端起的第一或第二核苷酸开始。在非限定性实例中，本发明描述了双链siNA分子(其中该siNA的每条链为约21核苷酸长)，其中每条链的1，3，5，7，9，11，13，15，17，19和21位被化学修饰(例如，用具有任何式I-VII的化合物修饰，如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基或2’-O-甲基核苷酸)。在另一非限定性实例中，本发明描述了双链siNA分子(其中该siNA的每条链为21核苷酸长)，其中每条链的2，4，6，8，10，12，14，16，18，和20位被化学修饰(例如，用具有任何式I-VII的化合物修饰，如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基或2’-O-甲基核苷酸)。在一个实施方案中，双链siNA分子的一条链在2，4，6，8，10，12，14，16，18，和20位以及在1，3，5，7，9，11，13，15，17，19和21位包含化学修饰。这类siNA分子还可包含末端帽部分和/或骨架修饰，如本文所述。

[0138]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括以下特征：如果嘌呤核苷酸存在于该siNA分子的反义链或反义区(或者称为引导序列或引导链)的5’端(例如，从5’端起的任何末端核苷酸位置1，2，3，4，5，或6)，则这些嘌呤核苷为核糖核苷酸。在另一实施方案中，如果存在，则所述嘌呤核糖核苷酸与该siNA分子的有义链或有义区(或者称为信使链)的核苷酸碱基配对。这些嘌呤核糖核苷酸可存在于siNA稳定基序中，要不然该基序就包含经修饰的核苷酸。

[0139]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括以下特征：如果嘧啶核苷酸存在于该siNA分子的反义链或反义区(或者称为引导序列或引导链)的5’端(例如，从5’端起的任何末端核苷酸位置1，2，3，4，5，或6)，则这些嘧啶核苷为核糖核苷酸。在另一实施方案中，如果存在，则所述嘧啶核糖核苷酸与该siNA分子的有义链或有义区(或者称为信使链)的核苷酸碱基配对。这些嘧啶核糖核苷酸可存在于siNA稳定基序中，要不然该基序就包含经修饰的核苷酸。

[0140]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括以下特征：如果嘧啶核苷酸存在于该siNA分子的反义链或反义区(或者称为引导序列或引导链)的5’端(例如，从5’端起的任何末端核苷酸位置1，2，3，4，5，或6)，则这些嘧啶核苷为经修饰的核苷酸。在另一实施方案中，如果存在，则所述经修饰的嘧啶核苷酸与该siNA分子的有义链或有义区(或者称为信使链)的核苷酸碱基配对。经修饰的嘧啶核苷酸的非限定性实例包括具有任何式I-VII的核苷酸，例如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、4’-硫基、2’-O-三氟甲基、2’-O-乙基-三氟甲氧基、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基或2’-O-甲基核苷酸。

[0141]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SI的双链核酸分子：

B————————N_X3——————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SI

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示核苷酸位置，其中当存在时任何嘌呤核苷酸为核糖核苷酸；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约30的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在17-36之间；X5为约1至约6的整数；NX3互补于NX4和NX5，以及

(a)任何存在于反义链(下链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于反义链(下链)中的嘌呤核苷酸独立地为2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’氟核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸独立地为2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；以及

(c)任何(N)核苷酸任选地为2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0142]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SII的双链核酸分子：

B——————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

SII

(a)任何存在于反义链(下链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于反义链(下链)中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为核糖核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸为核糖核苷酸；以及

[0143]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SIII的双链核酸分子：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SIII

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸为核糖核苷酸；以及

[0144]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SIV的双链核酸分子：

B——————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

SIV

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸为脱氧核糖核苷酸；以及

[0145]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SV的双链核酸分子：

B——————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SV

(a)任何存在于反义链(下链)中的嘧啶核苷酸为具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于反义链(下链)中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；以及

[0146]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SVI的双链核酸分子：

B————————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

SVI

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示核苷酸位置，包含使得反义链(下链)的5’端比有义链(上链)的5’端热稳定性差的序列；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约30的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在17-36之间；X5为约1至约6的整数；NX3互补于NX4和NX5，以及

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸独立地为2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；以及

[0147]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SVII的双链核酸分子：

B——————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————-5′

SVII

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约30的整数；X4为约11至约30的整数；NX3互补于NX4，以及任何(N)核苷酸为2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸。

[0148]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SVIII的双链核酸分子：

B————N_X7——[N]_X6—N_X3————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

SVIII

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示核苷酸位置，包含使得反义链(下链)的5’端比有义链(上链)的5’端热稳定性更差的序列；[N]表示核苷酸位置，它们为核糖核苷酸；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约15的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在17-36之间；X5为约1至约6的整数；X6为约1至约4的整数；X7为约9至约15的整数；NX7、NX6、和NX3互补于NX4和NX5，以及

(b)任何存在于有义链(上链)中的嘧啶核苷酸为不同于[N]核苷酸的2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于有义链(上链)中的嘌呤核苷酸独立地为不同于[N]核苷酸的2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；以及

[0149]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SIX的双链核酸分子：

B——————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

SIX

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示核苷酸位置，它们为核糖核苷酸；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约30的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在17-36之间；X5为约1至约6的整数；NX3互补于NX4和NX5，以及

[0150]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SX的双链核酸分子：

B——————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4——————[N]_X5-5′

SX

[0151]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SXI的双链核酸分子：

B——————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4————————[N]_X5-5′

SXI

[0152]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SXII的双链核酸分子：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SXII

[0153]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SXIII的双链核酸分子：

B————————N_X3——————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1——————N_X4————————[N]_X5-5′

SXIII

[0154]在一个实施方案中，本发明描述了具有以下结构SXIV的双链核酸分子：

其中每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它们可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示核苷酸位置，它们为核糖核苷酸；[N]表示核苷酸位置，它们为核糖核苷酸；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约15的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在17-36之间；X5为约1至约6的整数；X6为约1至约4的整数；X7为约9至约15的整数；NX7、NX6、和NX3互补于NX4和NX5，以及

[0155]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在该核酸分子的反义链或反义区的5’端包含末端磷酸基团。

[0156]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包括X5＝1，2，或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30，以及X4＝15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30。

[0157]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包括X5＝1；每个X1和X2＝2；X3＝19，以及X4＝18。

[0158]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包括X5＝2；每个X1和X2＝2；X3＝19，以及X4＝17。

[0159]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包括X5＝3；每个X1和X2＝2；X3＝19，以及X4＝16。

[0160]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在有义链或有义区的3’和5’端包括B。

[0161]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在反义链或反义区的3’和5’端包括B。

[0162]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在有义链或有义区的3’和5’端包括B以及在反义链或反义区的3’端包括B。

[0163]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子还在该核酸分子的有义链、反义链或有义和反义链的3’端上的第一末端(N)包含一个或多个核苷酸键硫代磷酸酯键。例如，双链核酸分子可包括X1和/或X2＝2，在突出核苷酸位置带有核苷酸间硫代磷酸酯键，例如(NsN)，其中“s”表示硫代磷酸酯。

[0164]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包含为2’-O-甲基核苷酸的(N)核苷酸。

[0165]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子包含为2’-脱氧核苷酸的(N)核苷酸。

[0166]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在反义链(下链)中包含(N)核苷酸，它们互补于与反义(下)链的N和[N]核苷酸有互补性的靶多核苷酸序列中的核苷酸。

[0167]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在有义链(上链)中包含(N)核苷酸，它们包括靶多核苷酸序列的约15至约30核苷酸的连续核苷酸序列。

[0168]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子在有义链(上链)中包含对应于靶多核苷酸序列的核苷酸序列，该靶多核苷酸序列与反义(下)链有互补性，以至于有义链的(N)和N核苷酸序列包括靶核酸序列的核苷酸序列。

[0169]在一个实施方案中，具有任何结构SVIII或SXIV的双链核酸分子仅在该双链核酸分子的有义(上)链的5’端包含B。

[0170]在一个实施方案中，具有任何结构SI，SII，SIII，SIV，SV，SVI，SVII，SVIII，SIX，SX，SXII，SXIII，或SXIV的双链核酸分子还在反义(下)链的5’端包含未配对的末端核苷酸。该未配对的核苷酸不与有义(上)链互补。在一个实施方案中，该未配对的核苷酸互补于与反义(下)链的N和[N]核苷酸有互补性的靶多核苷酸序列。在另一实施方案中，该未配对的核苷酸不互补于与反义(下)链的N和[N]核苷酸有互补性的靶多核苷酸序列。

[0171]在一个实施方案中，具有任何结构SVIII或SXIV的双链核酸分子包括X6＝1和X3＝10。

[0172]在一个实施方案中，具有任何结构SVIII或SXIV的双链核酸分子包括X6＝2和X3＝9。

[0173]在一个实施方案中，本发明描述了包含siNA分子或双链核酸分子或RNAi抑制剂的组合物，按任何配方LNP-051；LNP-053；LNP-054；LNP-069；LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104(参见表IV)被配制。

[0174]在一个实施方案中，本发明描述了包含第一双链核酸和第二双链核酸分子的组合物，第一双链核酸和第二双链核酸分子每一个具有彼此互补的第一和第二链，其中第一双链核酸分子的第二链包括互补于第一靶序列的序列，第二双链核酸分子的第二链包括互补于第二靶序列或途径靶序列的序列。在一个实施方案中，该组合物还包含阳离子脂质、中性脂质和聚乙二醇偶联物。在一个实施方案中，该组合物还包含阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇偶联物和胆固醇。在一个实施方案中，该组合物还包含聚乙二醇偶联物、胆固醇和表面活性剂。在一个实施方案中，该阳离子脂质选自CLinDMA，pCLinDMA，eCLinDMA，DMOBA，和DMLBA。在一个实施方案中，该中性脂质选自DSPC，DOBA，和胆固醇。在一个实施方案中，该聚乙二醇偶联物选自PEG-二豆蔻酰甘油和PEG-胆固醇。在一个实施方案中，该PEG为2KPEG。在一个实施方案中，该表面活性剂选自鲸蜡醇、硬脂醇、油醇和亚油醇。在一个实施方案中，该阳离子脂质为CLinDMA，该中性脂质为DSPC，该聚乙二醇偶联物为2KPEG-DMG，该胆固醇为胆固醇，以及该表面活性剂为亚油醇。在一个实施方案中，CLinDMA、DSPC、2KPEG-DMG、胆固醇和亚油醇各自以43:38:10:2:7的摩尔比存在。

[0175]在本文任何实施方案中，本发明的siNA分子通过RNA干扰或抑制RNA干扰调节一种或多种靶的表达。在一个实施方案中该RNA干扰为RISC介导的对靶的切割(例如，siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，该RNA干扰为靶的翻译抑制(例如，miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，该RNA干扰为靶的转录抑制(例如，siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，该RNA干扰发生在细胞质中。在一个实施方案中，该RNA干扰发生在细胞核中。

[0176]在本文任何实施方案中，本发明的siNA分子通过抑制内源靶RNA如内源mRNA、siRNA、miRNA或通过抑制RISC来调节一种或多种靶的表达。

[0177]在一个实施方案中，本发明描述了一种或多种RNAi抑制剂，其通过miRNA抑制、siRNA抑制或RISC抑制调节一个或多个基因靶的表达。

[0178]在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂为本文所描述的siNA分子，其具有一条或多条互补于一种或多种靶miRNA或siRNA分子的链。

[0179]在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂为反义分子，其互补于靶miRNA或siRNA分子或其部分。本发明的反义RNAi抑制剂可为约10至约40核苷酸长度(例如，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或40核苷酸长度)。本发明的反义RNAi抑制剂可包含一个或多个本文所述的经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见，例如具有任何式I-VII或其任意组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-O-甲氧基-乙基(也称为2’-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可在该反义RNA抑制剂的3’端、5’端或3’和5’端包含末端帽部分。

[0180]在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂为与RISC有结合亲和力的核酸适体，例如可调节适体(参见，例如An et al.，2006，RNA，12：710-716)。本发明的适体RNAi抑制剂可为约10至约50核苷酸长度(例如，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50核苷酸长度)。本发明的适体RNAi抑制剂可包含一个或多个本文所述的经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见，例如具有任何式I-VII或其任意组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为2’-O-甲氧基-乙基(也称为2’-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可包含一个或多个或全为硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可在该适体RNA抑制剂的3’端、5’端或3’和5’端包含末端帽部分。

[0181]在一个实施方案中，本发明描述了调节细胞内靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0182]在一个实施方案中，本发明描述了调节细胞内靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列，以及其中该siNA的有义链序列包括与靶RNA的序列相同或基本上类似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0183]在另一实施方案中，本发明描述了调节细胞内一个以上靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0184]在另一实施方案中，本发明描述了调节细胞内两个或多个靶基因表达的方法，包括：(a)合成一种或多种本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列，以及其中该siNA的有义链序列包括与靶RNA的序列相同或基本上类似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将siNA分子引入细胞。

[0185]在另一实施方案中，本发明描述了调节细胞内一个以上靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列，以及其中该siNA的有义链序列包括与靶RNA的序列相同或基本上类似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0186]在另一实施方案中，本发明描述了调节细胞内靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的或未修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列，其中该siNA的有义链序列包括与靶RNA的序列相同或基本上类似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0187]在一个实施方案中，本发明的siNA分子被用作离体应用中的试剂。例如，为了治疗作用，siNA试剂被引入植入个体的组织或细胞中。所述细胞和/或组织可衍生自后来接受该移植物的生物体或个体，或者源自移植前的另一生物体或个体。所述siNA分子可被用于调节细胞或组织内一个或多个基因的表达，以便该细胞或组织在植入体内时获得所期望的表型或者能够执行功能。在一个实施方案中，从患者提取某些靶细胞。使这些提取的细胞与靶向该细胞内特定核苷酸序列的siNA接触，其条件适合于这些细胞摄取siNA(例如，采用输送试剂如阳离子脂质、脂质体等或采用诸如电穿孔的技术来促进siNA输送进细胞)。然后将这些细胞再返回至相同患者或其它患者。

[0188]在一个实施方案中，本发明描述了调节组织移植物中靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织移植物内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入源自特定生物体的组织移植物的细胞。在另一实施方案中，该方法还包括在适合于调节(例如，抑制)生物体中靶基因表达的条件下将组织移植物返回至该组织的来源生物体或另一生物体。

[0189]在一个实施方案中，本发明描述了调节组织移植物中靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列，以及其中该siNA的有义链序列包括与靶RNA的序列相同或基本上类似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织移植物内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入源自特定生物体的组织移植物的细胞。在另一实施方案中，该方法还包括在适合于调节(例如，抑制)生物体中靶基因表达的条件下将组织移植物返回至该组织的来源生物体或另一生物体。

[0190]在另一实施方案中，本发明描述了调节组织移植物中一个以上靶基因(more than one target gene)的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织移植物内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入源自特定生物体的组织移植物的细胞。在另一实施方案中，该方法还包括在适合于调节(例如，抑制)生物体中靶基因表达的条件下将组织移植物返回至该组织的来源生物体或另一生物体。

[0191]在一个实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体内靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入该个体或生物体内。可采用现有技术中各种公知的方法确定靶蛋白或RNA的水平。

[0192]在另一实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体内一个以上靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入该个体或生物体内。可采用现有技术中各种公知的方法确定靶蛋白或RNA的水平。

[0193]在一个实施方案中，本发明描述了调节细胞靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入细胞。

[0194]在另一实施方案中，本发明描述了调节细胞内一个以上靶基因表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞内靶基因表达的条件下使细胞与该siNA分子在体外或体内接触。

[0195]在一个实施方案中，本发明描述了调节组织移植物(例如可从一个生物体移植到另一生物体或返回到器官、组织或细胞的来源生物体的任何器官、组织或细胞)中靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织移植物内靶基因表达的条件下使来自特定个体或生物体的组织移植物的细胞与该siNA分子接触。在另一实施方案中，该方法还包括在适合于调节(例如，抑制)生物体中靶基因表达的条件下将组织移植物返回至该组织的来源个体或生物体或另一个体或生物体。

[0196]在另一实施方案中，本发明描述了调节组织移植物(例如可从一个生物体移植到另一生物体或返回到器官、组织或细胞的来源生物体的任何器官、组织或细胞)中一个以上靶基因的表达的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织移植物内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入来自特定个体或生物体的组织移植物的细胞。在另一实施方案中，该方法还包括在适合于调节(例如，抑制)个体或生物体中靶基因表达的条件下将组织移植物返回至该组织的来源个体或生物体或另一个体或生物体。

[0197]在一个实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体中靶基因表达的方法，例如：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；以及(b)在适合于调节(例如，抑制)个体或生物体内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入该个体或生物体。

[0198]在另一实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体中一个以上靶基因表达的方法，例如：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中该siNA包括与靶基因的RNA有互补性的单链序列；以及(b)在适合于调节(例如，抑制)个体或生物体内靶基因表达的条件下将该siNA分子引入该个体或生物体。

[0199]在一个实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体中靶基因表达的方法，包括在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体内靶基因表达的条件下使本发明的siNA分子与该个体或生物体接触。

[0200]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中与基因表达或活性有关的疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。基因表达的减少，以及由此各自的蛋白/RNA水平的降低在某种程度上缓解该疾病、病症、性状或状况的症状。

[0201]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中癌症的方法，包括在适合于调节该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止癌症。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如癌细胞和组织)局部给药使个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中癌症的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体(subject)或生物体癌症的治疗处理和用药方式联合。

[0202]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中增生性疾病或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止增生性疾病或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与增殖性疾病的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中增殖性疾病或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中增殖性疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0203]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中移植和/或组织排斥(同种异体移植物排斥)的方法，包括在适合于调节该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止移植和/或组织排斥(同种异体移植物排斥)。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与移植和/或组织排斥(同种异体移植物排斥)的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与个体或生物体内移植和/或组织排斥(同种异体移植物排斥)的维持或发展的细胞和组织)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中移植和/或组织排斥(同种异体移植物排斥)的治疗处理和用药方式联合。

[0204]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中自身免疫性疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止自身免疫性疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与自身免疫性疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与个体或生物体内自身免疫性疾病、病症、性状或状况的维持或发展的细胞和组织)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中自身免疫性疾病、病症、性状或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0205]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中感染性疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体内靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止感染性疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与感染性疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与个体或生物体内感染性疾病、病症、性状或状况的维持或发展的细胞和组织)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中感染性疾病、病症、性状或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0206]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与本发明的siNA分子联合向该个体给予阿德福韦酯(Adefovir Dipivoxil)；其中阿德福韦酯和该siNA分子在适合于与未用阿德福韦酯和该siNA分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的，通过参考将它们都整体并入本文。这类siNA制剂通常被称为“脂核酸颗粒”(LNP)。

[0207]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与本发明的siNA分子联合向该个体给予拉米夫定(Lamivudine，3TC)；其中拉米夫定(3TC)和该siNA分子在适合于与未用拉米夫定(3TC)和该siNA分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0208]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与本发明的siNA分子联合向该个体给予阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)；其中阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该siNA分子在适合于与未用阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该siNA分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0209]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与本发明的化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；以及其中阿德福韦酯和该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0210]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；以及其中拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子在适合于与未用拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0211]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；以及其中阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0212]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有化学修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个化学修饰彼此不同；以及其中以阿德福韦酯和该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0213]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有化学修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个化学修饰彼此不同；以及其中以拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子在适合于与未用拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0214]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有化学修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个化学修饰彼此不同；以及其中以阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0215]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有糖修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个糖修饰彼此不同；以及其中以阿德福韦酯和该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0216]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有糖修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个糖修饰彼此不同；以及其中以拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子在适合于与未用拉米夫定(3TC)和该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0217]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，其包括与化学合成双链核酸分子联合向该个体给予阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)；其中(a)该双链核酸分子包括有义链和反义链；(b)该双链核酸分子的每条链为约15至28核苷酸长度；(c)有义链的至少15核苷酸互补于反义链；(d)该双链核酸分子的反义链与乙型肝炎病毒(HBV)靶RNA有互补性；(e)该双链核酸分子每条链至少20％的内部核苷酸为具有糖修饰的经修饰核苷；以及(f)至少两个糖修饰彼此不同；以及其中以阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子在适合于与未用阿德福韦酯和拉米夫定(3TC)以及该双链核酸分子治疗的个体相比减少或抑制该个体中乙型肝炎病毒(HBV)水平的条件下给药。在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、以及2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024(Vargeese等人)所描述的。

[0218]在一个实施方案中，本发明描述了在药用载体或稀释剂中包含阿德福韦酯和一种或多种本发明双链核酸分子或siNA分子的组合物。在另一实施方案中，本发明描述了在药用载体或稀释剂中包含阿德福韦酯、拉米夫定、和一种或多种本发明双链核酸分子或siNA分子的组合物。

[0219]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中与年龄相关的疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止与年龄相关的疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与年龄相关疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中年龄相关疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中年龄相关疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0220]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中神经学或神经变性疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止神经学或神经变性疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与神经学或神经变性疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中神经学或神经变性疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中神经学或神经变性疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0221]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中呼吸疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止呼吸疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与呼吸疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中呼吸疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中呼吸疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0222]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中眼科疾病、病症、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止眼科疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与眼科疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中眼科疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中眼科疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0223]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中皮肤学疾病、病症、性状或状况(a dermatological disease，disorder，traitor condition)的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止皮肤学疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与皮肤学疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中皮肤学疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中皮肤学疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0224]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中肝脏疾病、病症、性状或状况(例如，肝炎、HCV、HBV、糖尿病、硬化、肝细胞瘤等)的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止肝脏疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与肝脏疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中肝脏疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中肝脏疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0225]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中肾/肾脏疾病、病症、性状或状况(例如，多囊肾疾病等)的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止肾/肾脏疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与肾/肾脏疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中肾/肾脏疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中肾/肾脏疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0226]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中听觉疾病、病症、性状或状况(例如，听力丧失，聋等)的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止听觉疾病、病症、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(如参与听觉疾病、病症、性状或状况的细胞和组织)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中听觉疾病、病症、性状或状况的维持或发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内或皮下给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中听觉疾病、性状、病症或状况的治疗处理和用药方式联合。

[0227]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中一种或多种代谢疾病、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此实现治疗或防止该代谢疾病、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中代谢疾病、性状或状况的维持和发展的组织或细胞(例如肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞))系统给药(例如通过siNA的静脉内、肌内、皮下或GI给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞(例如肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞)。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中代谢疾病、性状或状况的治疗处理和用药方式联合。在一个实施方案中，该代谢疾病选自低胆固醇血症(hypecholesterolemia)、高脂血症、血脂障碍、糖尿病(例如I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗、肥胖症、或相关疾病，包括但不限于睡眠性呼吸暂停、食道裂孔疝、逆流性食道炎、骨关节炎、痛风、与体重增加相关的癌症、胆结石、肾结石、肺动脉高压、不育、心血管疾病、超过正常体重以及超过正常脂质水平、尿酸水平或草酸盐水平。

[0228]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中一种或多种代谢疾病、性状或状况的方法，包括在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体中基因表达抑制剂的表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，该基因表达抑制剂为miRNA。

[0229]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中一种或多种心血管疾病、性状或状况的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现治疗或防止该心血管疾病、性状或状况。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如参与个体或生物体中心血管疾病、性状或状况的维持和发展的组织或细胞)系统给药(例如通过siNA的静脉内、肌内、皮下或GI给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知的治疗或防止个体或生物体中心血管疾病、性状或状况的治疗处理和用药方式联合。在一个实施方案中，该心血管疾病选自高血压、冠状动脉血栓形成、中风、脂综合征、高血糖症、高甘油三酯血症、高脂血症、局部缺血、充血性心力衰竭、和心肌梗塞。

[0230]在一个实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体或生物体中一种或多种心血管疾病、性状或状况的方法，包括在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体中基因表达抑制剂的表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，该基因表达抑制剂为miRNA。

[0231]在一个实施方案中，本发明描述了用于个体或生物体体重减轻的方法，包括在适合于调节该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触，由此可实现体重减轻。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞(例如肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞)局部给药使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明描述了通过向相关组织或细胞系统给药(例如通过siNA的静脉内、肌内、皮下或GI给药)使该个体或生物体与本发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可如本文所述或现有技术中已知的被配制为或偶联为靶向个体或生物体内的合适组织或细胞。该siNA分子可与其它的现有技术中已知用于个体或生物体体重减轻的治疗处理和用药方式联合。

[0232]在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子被配制为组合物，如美国临时专利申请60/678,531和2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946、2005年11月15日提交美国临时专利申请60/737,024以及2006年2月14日提交的USSN11/353,630(Vargeese等人)所描述的。

[0233]在本文任何用于调节一个或多个靶的表达或用于治疗或防止细胞、个体或生物体中疾病、性状、状态或表型的方法中，本发明的siNA分子通过RNA干扰调节一个或多个靶的表达。在一个实施方案中，该RNA干扰为RISC介导的对靶的切割(例如，siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是对靶的翻译抑制(例如，miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，该RNA干扰为对靶的转录抑制(例如，siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，该RNA干扰发生在细胞质中。在一个实施方案中，该RNA干扰发生在细胞核中。

[0234]在本发明的任何治疗方法中，该siNA可以一疗程给予个体，例如以不同时间间隔给药，例如在整个疗程中每天一次、在整个疗程中每两天一次、整个疗程中每三天一次、在整个疗程中每四天一次、在整个疗程中每五天一次、在整个疗程中每六天一次、在整个疗程中每周一次、在整个疗程中每两周一次、在整个疗程中每月一次，等等。在一个实施方案中，该疗程为每1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10周一次。在一个实施方案中，该疗程为约1至约52周或更长时间(例如，无限期地)一次。在一个实施方案中，该疗程为约1至约48周或更长时间(例如，无限期地)一次。

[0235]在一个实施方案中，疗程(a course of treatment)涉及起始疗程，例如每1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10周或更多周一次，持续一固定期间(例如，1x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更长)，接着是维持疗程，例如每4，6，8，10，15，20，25，30，35，40或更多周一次，持续另一固定期间(例如，1x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x，10x或更长)。

[0236]在本发明的任何治疗方法中，siNA可如本文所述或现有技术中已知的被系统给予个体，或者作为单一疗法单独给药，或者与本文所述或现有技术中已知的其它疗法联合给药。系统给药可包括例如肺(吸入、喷雾等)、静脉内、皮下、肌内、导管插入、鼻咽、透皮或口腔/胃肠给药，这为现有技术中所公知。

[0237]在一个实施方案中，在本发明的任何治疗或防止方法中，如本文所述或现有技术中已知的，siNA可向个体局部给药或者被给予局部组织，或者作为单一疗法单独给药，或者与本文所述或现有技术中已知的其它疗法联合给药。局部给药可包括例如吸入、喷雾、导管插入、植入、直接注射、皮肤/透皮应用、支架、耳/眼滴剂、或门静脉给药至相关组织，或其它局部给药技术、方法或操作，这为现有技术中所公知。

[0238]在一个实施方案中，本发明描述了将本发明的siNA分子和组合物给予内耳的方法，包括在适合于给药的条件下使siNA与内耳细胞、组织或结构接触。在一个实施方案中，该给药包括如美国专利5,421,818,5,476,446，5,474,529，6,045,528，6,440,102，6,685,697，6,120,484；和5,572,594(通过参考将它们都并入本文)以及Silverstein，1999，Ear NoseThroat J.，78，595-8，600；和Jackson and Silverstein，2002，OtolaryngolClin North Am.，35，639-53中所描述的并经改变以用于本发明siNA分子的方法和装置。

[0239]在另一实施方案中，本发明描述了调节个体或生物体中一个以上靶基因表达的方法，其包括在适合于调节(例如，抑制)该个体或生物体中靶基因表达的条件下使该个体或生物体与一种或多种本发明的siNA分子接触。

[0240]本发明的siNA分子可被设计为通过不同核酸分子的RNAi靶向下调或抑制靶基因表达。在一个实施方案中，本发明的siNA分子被用于靶向对应于靶基因的各种DNA，例如通过异染色质沉默或转录抑制。在一个实施方案中，本发明的siNA分子被用于靶向对应于靶基因的各种RNA，例如通过RNA靶切割或翻译抑制。这类RNA的非限定性实例包括信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)或调节元件(参见，例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528和Claverie，2005，Science，309，1529-1530)，其包括miRNA和其它小RNA、靶基因的可变RNA剪接变体、靶基因转录后修饰的RNA、靶基因的前mRNA，和/或RNA模板。如果可变剪接产生了通过使用适当的外显子可区分的转录本族，则本发明可被用于通过适当的外显子抑制基因表达来特异抑制或区分基因家族成员之间的功能。例如，含有可变剪接的跨膜结构域的蛋白能以膜结合和分泌形式表达。使用本发明靶向含有跨膜结构域的外显子可被用于确定膜结合而不是分泌形式蛋白的药物靶向的功能结果。本发明涉及靶向这些RNA分子的应用的非限定性实例包括治疗药物应用、化妆品应用、兽医应用、药物发现应用、分子诊断和基因功能应用以及基因作图，例如采用单核苷酸多态性以本发明的siNA分子作图。这类应用可采用已知的基因序列实施或者从可来自表达序列标签(EST)的部分序列起实施。

[0241]在另一实施方案中，本发明的siNA分子被用于靶向保守序列，该保守序列对应于基因家族或多个基因家族，例如具有同源序列的基因家族。这样，靶向多个基因或RNA靶的siNA分子可提供增强的疗效。在一个实施方案中，本发明描述了采用单一siNA分子通过靶向所靶向的靶基因的保守序列而靶向(切割或抑制表达或功能)一个以上靶基因序列。

[0242]在一个实施方案中，siNA分子可用于在多种应用中表征基因功能途径。例如，本发明可用于抑制途径中靶基因的活性，以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中确定未表征基因的功能。本发明可用于确定参与各种疾病和状况的可能靶基因途径，以进行药物开发。本发明可用于了解参与例如本文所述或现有技术中已知的疾病、病症、性状和状况的基因表达途径。

[0243]在一个实施方案中，本发明的siNA分子和/或方法被用于下调由Genbank登录号指出的编码RNA的基因的表达，例如本文通过Genbank登录号指出的编码RNA序列的靶基因，Genbank登录号例如为在美国临时专利申请60/363,124、USSN 10/923,536和PCT/US03/05028中所描述的Genbank登录号，通过参考将它们都并入本文。

[0244]在一个实施方案中，本发明描述了一种方法，其包括：(a)生成具有预定复杂度的siNA构建体库；和(b)在适合于确定靶RNA序列内RNAi靶位点的条件下，测定以上(a)的siNA构建体。在一个实施方案中，(a)的siNA分子具有固定长度的链，例如约23核苷酸长度。在另一实施方案中，所述siNA分子为不同长度，例如具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸长度。在一个实施方案中，所述测定可包括本文所述的体外重建siNA测定。在另一实施方案中，所述测定可包括细胞培养系统，靶RNA在其中被表达。在另一实施方案中，例如通过电泳、northern印迹分析或RNAse保护测定来分析靶RNA片段的可检测水平的切割，以确定靶RNA序列内最适合的靶位点。例如，对于体外系统，可通过克隆和/或转录获得靶RNA序列，在体内系统中可通过细胞表达获得靶RNA序列，这在现有技术中是已知的。

[0245]在一个实施方案中，本发明描述了一种方法，其包括：(a)生成siNA构建体的随机库，其具有预定复杂度，例如4N，其中N代表每条siNA构建体链中碱基配对核苷酸的数目(例如，对于具有19碱基对的21核苷酸长有义和反义链的siNA构建体来说，该复杂度为419)；和(b)在适合于确定靶RNA序列内RNAi靶位点的条件下，测定以上(a)的siNA构建体。在另一实施方案中，(a)的siNA分子具有固定长度的链，例如约23核苷酸长度。在另一实施方案中，所述siNA分子为不同长度，例如具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸长度。在一个实施方案中，所述测定可包括本文实施例6所述的体外重建siNA测定。在另一实施方案中，所述测定可包括细胞培养系统，靶RNA在其中被表达。在另一实施方案中，例如通过凝胶电泳、northern印迹分析或RNAse保护测定来分析靶RNA片段的可检测水平的切割，以确定靶RNA序列内最适合的靶位点。例如，对于体外系统，可通过克隆和/或转录获得靶RNA序列，在体内系统中可通过细胞表达获得靶RNA序列，这在现有技术中是已知的。

[0246]在一个实施方案中，本发明描述了一种方法，其包括：(a)分析由靶基因编码的RNA靶的序列；(b)合成一套或多套与(a)的RNA的一个或多个区域有序列互补性的siNA分子；以及(c)在适合于确定靶RNA序列内RNAi靶的条件下，测定(b)的siNA分子。在一个实施方案中，(b)的siNA分子具有固定长度的链，例如约23核苷酸长度。在另一实施方案中，(b)的siNA分子为不同长度，例如具有约15至约30(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)核苷酸长度。在一个实施方案中，所述测定可包括本文所述的体外重建siNA测定。在另一实施方案中，所述测定可包括细胞培养系统，靶RNA在其中被表达。例如通过凝胶电泳、northern印迹分析或RNAse保护测定来分析靶RNA片段的可检测水平的切割，以确定靶RNA序列内最适合的靶位点。例如，对于体外系统，可通过克隆和/或转录获得靶RNA序列，在体内系统中可通过细胞表达获得靶RNA序列，这在现有技术中是已知的。

[0247]“靶位点”指靶RNA内的序列，其被“靶向”以用于通过siNA构建体介导的切割，该siNA构建体在其反义区含有互补于靶序列的序列。

[0248]“可检测水平的切割”指靶RNA的切割(和切割产物RNA的形成)达到足以在靶RNA随机降解产生的RNA背景上识别出切割产物的程度。对于大部分检测方法，产生来自约1-5％靶RNA的切割产物就足以在背景上检测。

[0249]在一个实施方案中，本发明描述了在药用载体或稀释剂中包含本发明siNA分子的组合物，该siNA分子可为化学修饰的。在另一实施方案中，本发明描述了在药用载体或稀释剂中包含本发明siNA分子的药物组合物，该siNA分子可为化学修饰的，靶向一个或多个基因。在另一实施方案中，本发明描述了诊断个体中疾病、性状或状况的方法，包括在适合于诊断该个体中疾病、性状或状况的条件下向该个体给予本发明的组合物。在另一实施方案中，本发明描述了治疗或防止个体中疾病、性状或状况(例如代谢和/或心血管疾病、性状、状况或病症)的方法，包括在适合于治疗或防止该个体中疾病、性状或状况的条件下向该个体给予本发明的组合物，单独给药或者与一种或多种其它治疗化合物联合。

[0250]在另一实施方案中，本发明描述了确认靶基因靶的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；(b)在适合于调节细胞、组织、个体或生物体内靶基因的表达的条件下将siNA分子引入细胞、组织、个体或生物体；以及(c)通过测定细胞、组织、个体或生物体中的任何表型变化来确定基因功能。

[0251]在另一实施方案中，本发明描述了确认靶的方法，包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可为化学修饰的，其中一条siNA链包括互补于靶基因的RNA的序列；(b)在适合于调节生物系统内靶基因的表达的条件下将siNA分子引入生物系统；以及(c)通过测定生物系统中的任何表型变化来确定基因功能。

[0252]“生物系统”指生物学来源(包括但不限于人或动物)的材料，为纯化的或未纯化的形式，其中该系统包含RNAi活性所需的组分。术语“生物系统”例如包括细胞、组织、个体或生物体或其提取物。术语生物系统还包括可用于体外环境的重建RNAi系统。

[0253]“表型变化”指细胞应答以本发明核酸分子(如，siNA)接触或治疗时所发生的任何可检测变化。这类可检测变化包括但不限于形状、大小、增殖、运动性、蛋白表达或RNA表达的变化或其它物理或化学变化，这些可通过现有技术中已知的方法测定。该可检测的变化还可包括报告基因/分子的表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)或各种标签，它们被用于鉴定表达的蛋白或任何其它可被测定的细胞组分。

[0254]在一个实施方案中，本发明描述了包含本发明siNA分子的试剂盒，该siNA分子可为化学修饰的，可被用于调节生物系统中(包括例如细胞、组织、个体或生物体中)靶基因的表达。在另一实施方案中，本发明描述了包含本发明一种以上siNA分子的试剂盒，该siNA分子可为化学修饰的，可被用于调节生物系统中(包括例如细胞、组织、个体或生物体中)一个以上靶基因的表达。

[0255]在一个实施方案中，本发明描述了含有一种或多种本发明siNA分子的细胞，该siNA分子可为化学修饰的。在另一实施方案中，含有本发明siNA分子的细胞为哺乳动物细胞。在又一实施方案中，含有本发明siNA分子的细胞为人细胞。

[0256]在一个实施方案中，可经化学修饰的本发明siNA分子的合成包括：(a)合成siNA分子的两条互补链；(b)在适合于获得双链siNA分子的条件下使两条链退火到一起。在另一实施方案中，通过固相寡核苷酸合成来合成siNA分子的两条互补链。在又一实施方案中，通过固相串联寡核苷酸合成来合成siNA分子的两条互补链。

[0257]在一个实施方案中，本发明描述了合成siNA双链体分子的方法，包括：(a)合成siNA分子的第一寡核苷酸序列链，其中该第一寡核苷酸序列链包含可切割接头分子，其可用作合成该siNA的第二寡核苷酸序列链的支架；(b)在第一寡核苷酸序列链的支架上合成该siNA的第二寡核苷酸序列链，其中第二寡核苷酸序列链还包含可用于纯化该siNA双链体的化学部分；(c)在适合于该两siNA寡核苷酸链杂交并形成稳定双链体的条件下切割(a)的接头分子；以及(d)采用第二寡核苷酸序列链的化学部分纯化siNA双链体。在一个实施方案中，以上(c)中切割接头分子发生在寡核苷酸脱保护期间，例如采用诸如甲基胺的烷基胺碱在水解条件下进行。在一个实施方案中，该合成方法包括在诸如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯的固体支持物上的固相合成，其中(a)的第一序列合成在可切割接头如琥珀酰基接头上，将固相支持物用作支架。用作合成第二链的支架的(a)中的可切割接头可包括与固相支持物衍生化接头类似的反应性，因而切割固相支持物衍生化接头和切割(a)的可切割接头同时发生。在另一实施方案中，可用于分离所结合的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包括三苯甲基(trityl)基团，例如二甲氧基三苯甲基基团，其可被用在带三苯甲基合成策略中，如本文所述。在又一实施方案中，该诸如二甲氧基三苯甲基基团的化学部分在纯化期间例如使用酸性条件被去除。

[0258]在另一实施方案中，siNA合成的方法为液相合成或混合相合成，其中siNA双链体的两条链串联合成，采用结合至第一序列的可切割接头用作合成第二序列的支架。在适合于分开的siNA序列链杂交的条件下的接头切割导致形成双链siNA分子。

[0259]在另一实施方案中，本发明描述了合成siNA双链体分子的方法，包括：(a)合成siNA分子的一条寡核苷酸序列链，其中该序列包含可切割接头分子，其可用作合成另一寡核苷酸序列的支架；(b)在(a)的支架上合成与第一序列链有互补性的第二寡核苷酸序列，其中第二序列包括该双链siNA分子的另一链，并且第二序列还包括可用于分离所结合的寡核苷酸序列的化学部分；(c)在适合于分离包括由可切割接头连接的两siNA寡核苷酸链的全长序列的条件以及适合于两核苷酸链杂交形成稳定双链体的条件下纯化(b)的产物。在一个实施方案中，以上(c)中切割接头分子发生在寡核苷酸脱保护期间，例如在水解条件下进行。在一个实施方案中，以上(c)中切割接头分子发生在寡核苷酸脱保护之后。在另一实施方案中，合成方法包括在诸如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯的固体支持物上的固相合成，其中(a)的第一序列合成在可切割接头如琥珀酰基接头上，将固相支持物用作支架。用作合成第二链的支架的(a)中的可切割接头可包括与固相支持物衍生化接头类似或不同的反应性，因而切割固相支持物衍生化接头和切割(a)的可切割接头同时或顺序发生。在一个实施方案中，可用于分离所结合的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包括三苯甲基基团，例如二甲氧基三苯甲基基团。

[0260]在另一实施方案中，本发明描述了在单一合成过程中制备双链siNA分子的方法，包括：(a)合成具有第一和第二序列的寡核苷酸，其中第一序列互补于第二序列，并且第一寡核苷酸序列通过可切割接头连接至第二序列，以及其中末端5′保护基团(例如，5′-O-二甲氧基三苯甲基基团，5′-O-DMT)保留在具有第二序列的寡核苷酸上；(b)使寡核苷酸脱保护，借由该脱保护导致对连接两寡核苷酸序列的接头的切割；以及(c)在适合于分离双链siNA分子的条件下纯化(b)的产物，例如使用本文所述的带三苯甲基合成策略。

[0261]在另一实施方案中，合成本发明siNA分子的方法包括Scaringeet al.，美国专利5,889,136；6,008,400；和6,111,086的指导，在此通过参考将它们整体并入本文。

[0262]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸(例如RNA或DNA靶)的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个化学修饰，例如，一个或多个具有任何式I-VII或其任何组合的化学修饰，其增加了该siNA构建体的核酸酶抗性。

[0263]在另一实施方案中，本发明描述了产生具有增强的核酸酶抗性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子中引入具有任何式I-VII或其任何组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有增强的核酸酶抗性的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0264]在另一实施方案中，本发明描述了产生具有改进的毒理学特性(例如，具有减弱的或不具有免疫刺激性质)的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子中引入具有任何式I-VII(例如，表I中指出的siNA基序)或其任何组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学特性的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0265]在另一实施方案中，本发明描述了产生具有改进的毒理学特性(例如，具有减弱的或不具有免疫刺激性质)的siNA制剂(formulations)的方法，包括(a)产生包含本发明siNA分子和本文所述或现有技术中已知的递送载体或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学特性的siNA制剂条件下测定步骤(a)的siNA制剂。

[0266]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激干扰素反应(例如，无干扰素反应或减弱的干扰素反应)的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子中引入具有任何式I-VII(例如，表I中指出的siNA基序)或其任何组合的核苷酸，和(b)在适合于分离不刺激干扰素反应的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0267]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激干扰素反应(例如，无干扰素反应或减弱的干扰素反应)的siNA的方法，包括(a)产生包含本发明siNA分子和本文所述或现有技术中已知的递送载体或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激干扰素反应的siNA制剂条件下测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，该干扰素包括干扰素α。

[0268]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激炎性或促炎细胞因子反应(例如，无细胞因子反应或减弱的细胞因子反应)的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子中引入具有任何式I-VII(例如，表I中指出的siNA基序)或其任何组合的核苷酸，和(b)在适合于分离不刺激细胞因子反应的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，该细胞因子包括白介素，如白介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

[0269]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激炎性或促炎细胞因子反应(例如，无细胞因子反应或减弱的细胞因子反应)的siNA制剂的方法，包括(a)产生包含本发明siNA分子和本文所述或现有技术中已知的递送载体或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激细胞因子反应的siNA制剂条件下测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，该细胞因子包括白介素，如白介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

[0270]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激Toll样受体(TLR)反应(例如，无TLR反应或减弱的TLR反应)的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子中引入具有任何式I-VII(例如，表I中指出的siNA基序)或其任何组合的核苷酸，和(b)在适合于分离不刺激TLR反应的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，该TLR包括TLR3，TLR7，TLR8和/或TLR9。

[0271]在另一实施方案中，本发明描述了产生不在细胞、个体或生物体中刺激Toll样受体(TLR)反应(例如，无TLR反应或减弱的TLR反应)的siNA制剂的方法，包括(a)产生包含本发明siNA分子和本文所述或现有技术中已知的递送载体或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激TLR反应的siNA制剂条件下测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，该TLR包括TLR3，TLR7，TLR8和/或TLR9。

[0272]在一个实施方案中，本发明描述了化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其通过RNA干扰(RNAi)指导对靶RNA的切割，其中：(a)所述siNA分子每条链为约18至约38核苷酸长度；(b)所述siNA分子的一条链包括与所述靶RNA有足够互补性的核苷酸序列，用于该siNA分子通过RNA干扰指导对靶RNA的切割；以及(c)其中所述siNA分子内的核苷酸位置被化学修饰，以将该siNA分子的免疫刺激性减低至低于相应未修饰siRNA分子的水平。这类siNA分子被认为相对于未经修饰或经最低限度修饰的siNA具有改善的毒理学特性。

[0273]“改善的毒理学特性”指，与未修饰的或未配制的siNA分子相比，或者与具有较少修饰或具有在赋予改善的毒理学方面有效性较低的修饰的siNA分子相比，该化学修饰的或配制的siNA构建体在细胞、个体或生物体中显示降低的毒性。这类siNA分子也被认为具有“改善的RNAi活性”。在非限定性实例中，具有改善的毒理学特性的siNA分子和制剂与减弱的免疫刺激性相关，例如与未修饰的或未配制的siNA相比，或者与具有较少修饰或具有在赋予改善的毒理学方面有效性较低的修饰的siNA分子相比，在细胞、个体或生物体中具有减小的、降低的或减弱的免疫刺激反应。这种改善的毒理学特性以消除或减弱的免疫刺激为特征，例如诱导干扰素(例如，干扰素α)、炎性细胞因子(例如，白介素，如IL-6，和/或TNF-α)、和/或toll样受体(例如TLR-3，TLR-7，TLR-8，和/或TLR-9)的降低或消除。在一个实施方案中，具有改善的毒理学特性的siNA分子或制剂不包含核糖核苷酸。在一个实施方案中，具有改善的毒理学特性的siNA分子或制剂包含少于5个核糖核苷酸(例如，1，2，3，或4核糖核苷酸)。在一个实施方案中，具有改善的毒理学特性的siNA分子或制剂包括Stab 7，Stab 8，Stab 11，Stab 12，Stab 13，Stab 16，Stab 17，Stab 18，Stab 19，Stab 20，Stab 23，Stab 24，Stab 25，Stab26，Stab 27，Stab 28，Stab 29，Stab 30，Stab 31，Stab 32，Stab 33，Stab 34，Stab 35，Stab 36或其任意组合(参见表I)。这里，数字Stab化学物包括显示于表I中化学物的2’-氟和2’-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。在一个实施方案中，具有改善的毒理学特性的siNA分子或制剂包括本发明的siNA分子和如美国专利申请20030077829中所描述的制剂，在此通过参考将其整体并入，包括附图。

[0274]在一个实施方案中，如本文所述或如现有技术中已知的，与给定siNA分子有关的免疫刺激反应的水平可被测定，例如通过在测定中确定PKR/干扰素反应、增殖、B细胞活化和/或细胞因子产生的水平来定量特定siNA分子的免疫刺激反应(参见，例如，Leifer et al.，2003，JImmunother.26，313-9；和U.S.Patent No.5,968,909，通过参考将它们整体并入本文)。在一个实施方案中，与未经修饰或经最低限度修饰的siNA分子相比，减弱的免疫刺激反应在约10％至约100％，例如约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％减弱的免疫刺激反应。在一个实施方案中，与siNA分子有关的免疫刺激反应可通过化学修饰程度被调节。例如，siNA分子中约10％至约100％，例如约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％，或至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％核苷酸位置被修饰的siNA分子可被选择，以具有相应程度的免疫刺激性，如本文所述。

[0275]在一个实施方案中，出于优化RNAi活性的目的而选择减弱免疫刺激反应的程度。例如，为了治疗病毒感染，保留一定程度的免疫刺激可以是优选的，其中对于最佳抗病毒活性来说，免疫刺激减弱小于100％可以是优选的(例如，免疫刺激减弱约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％)，而对于抑制内源基因靶的表达来说，具有最低限度免疫刺激性的siNA分子可以是优选的，以防止非特异性毒性或脱靶效应(例如免疫刺激减弱约90％至约100％)。

[0276]在一个实施方案中，本发明描述了化学合成的双链siNA分子，其通过RNA干扰(RNAi)指导对靶RNA的切割，其中：(a)所述siNA分子每条链为约18至约38核苷酸长度；(b)所述siNA分子的一条链包括与所述靶RNA有足够互补性的核苷酸序列，用于该siNA分子通过RNA干扰指导对靶RNA的切割；以及(c)其中所述siNA分子的一个或多个核苷酸被化学修饰，以将该siNA分子的免疫刺激性减低至低于相应未修饰siRNA分子的水平。在一个实施方案中，每条链包含至少约18互补于另一链核苷酸的核苷酸。

[0277]在另一实施方案中，包含经修饰核苷酸以减弱siNA分子免疫刺激性的siNA分子包括具有与靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的反义区，并且还包括有义区，其中所述有义区包括基本上类似于所述靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在其一个实施方案中，反义区和有义区包含约18至约38核苷酸，其中所述反义区包含至少约18互补于有义区核苷酸的核苷酸。在其一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸为2′-O-甲基嘧啶核苷酸。在其另一实施方案中，有义区中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在其又一实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其另一实施方案中，所述反义区中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其又一实施方案中，所述反义区的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在其又一实施方案中，存在于所述反义区中的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，反义区在所述反义区的3′端包含核苷酸间硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，反义区在所述反义区的3′端包含甘油基修饰。

[0278]在其它实施方案中，包含经修饰核苷酸以减弱siNA分子免疫刺激性的siNA分子可包括本文所描述的siNA分子的任何结构特征。在其它实施方案中，包含经修饰核苷酸以减弱siNA分子免疫刺激性的siNA分子可包括本文所描述的siNA分子的任何化学修饰。

[0279]在一个实施方案中，本发明描述了产生具有经修饰核苷酸以减弱siNA分子免疫刺激性的化学合成双链siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入一个或多个经修饰的核苷酸，以及(b)在适合于分离相对于不具有经修饰核苷酸的对应siNA分子有降低的免疫刺激性的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。该siNA分子的每条链为约18至约38核苷酸长度。该siNA分子的一条链包括与靶RNA有足够互补性的核苷酸序列，以通过RNA干扰指导对靶RNA的切割。在一个实施方案中，该减弱的免疫刺激性包括消除或减少应答被引入细胞、组织或生物体的siNA而对炎性或促炎细胞因子的诱导，例如白介素-6(IL-6)，或肿瘤坏死因子(TNF-α)。在另一实施方案中，该减弱的免疫刺激性包括消除或减少应答被引入细胞、组织或生物体的siNA而对Toll样受体(TLRs)如TLR3，TLR7，TLR8或TLR9的诱导。在另一实施方案中，该减弱的免疫刺激性包括消除或减少应答被引入细胞、组织或生物体的siNA而对干扰素如干扰素α的诱导。

[0280]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个本文所述的化学修饰，它们调节该siNA构建体有义和反义链之间的结合亲和性。

[0281]在另一实施方案中，本发明描述了产生在siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离在该siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0282]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个本文所述的化学修饰，其调节该siNA构建体的反义链和细胞内互补的靶RNA序列之间的结合亲和性。

[0283]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个本文所述的化学修饰，其调节该siNA构建体的反义链和细胞内互补的靶DNA序列之间的结合亲和性。

[0284]在另一实施方案中，本发明描述了产生在siNA分子的反义链和互补的靶RNA序列之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离在该siNA分子的反义链和互补的靶RNA序列之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0285]在另一实施方案中，本发明描述了产生在siNA分子的反义链和互补的靶DNA序列之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离在该siNA分子的反义链和互补的靶DNA序列之间具有增加的结合亲和性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子

[0286]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个本文所述的化学修饰，其调节细胞聚合酶的聚合酶活性，该聚合酶能够产生与该经化学修饰的siNA构建体有序列同源性的另外的内源siNA分子。

[0287]在另一实施方案中，本发明描述了产生能够介导细胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的方法，该聚合酶能够产生与经化学修饰的siNA分子有序列同源性的另外的内源siNA分子，该方法包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离能够介导细胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子，其中该聚合酶能够产生与该经化学修饰的siNA分子有序列同源性的另外的内源siNA分子。

[0288]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对细胞中靶多核苷酸的RNAi的化学修饰siNA构建体，其中化学修饰不显著影响siNA与靶RNA分子、DNA分子和/或蛋白或其它RNAi所必需因子之间的相互作用，其方式将降低由这类siNA构建体介导的RNAi的有效性。

[0289]在另一实施方案中，本发明描述了产生针对多核苷酸靶具有改善的RNAi特异性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi特异性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，改善的靶特异性包括与未经修饰的siNA分子相比具有减少的脱靶效应(off target effects)。例如，在本发明siNA分子的有义链或区的3’端、5’端或3’和5’端引入末端帽部分可使siNA通过防止有义链或有义区作为RNAi活性的模板而具有改善的特异性，该RNAi活性是针对与有义链或有义区有互补性的相应靶。

[0290]在另一实施方案中，本发明描述了产生针对靶多核苷酸具有改善的RNAi活性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi活性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0291]在另一实施方案中，本发明描述了产生针对靶RNA具有改善的RNAi活性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离针对靶RNA具有改善的RNAi活性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0292]在另一实施方案中，本发明描述了产生针对靶DNA具有改善的RNAi活性的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离针对靶DNA具有改善的RNAi活性的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0293]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个本文所述的化学修饰，如siNA的胆固醇偶联，其调节细胞对siNA构建体的摄取。

[0294]在另一实施方案中，本发明描述了产生针对靶多核苷酸的具有改善的细胞摄取的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有改善的细胞摄取的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0295]在一个实施方案中，本发明描述了介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中该siNA构建体包含一个或多个增加该siNA构建体的生物利用度的本文所述化学修饰，例如，通过结合聚合偶联物如聚乙二醇或等价偶联物，其改善siNA构建体的药物动力学，或者通过结合在体内靶向特异组织类型或细胞类型的偶联物。这类偶联物的非限定性实例描述在Vargeese et al.，U.S.Serial No.10/201,394中，通过参考将其并入本文。

[0296]在一个实施方案中，本发明描述了产生具有改善的生物利用度的本发明siNA分子，包括(a)向siNA分子结构中引入偶联物，和(b)在适合于分离具有改善的生物利用度的siNA分子条件下测定步骤(a)的siNA分子。这种偶联物可包括细胞受体的配体，如衍生自天然产生的蛋白配体的肽；蛋白定位序列，包括细胞ZIP码序列；抗体；核酸适体；维生素和其它辅因子，如叶酸和N-乙酰基半乳糖胺；聚合物，如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；胆固醇衍生物，多胺，如精胺或亚精胺，等等。

[0297]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列，以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中所述第二序列被化学修饰，以使其不再作为有效介导RNA干扰的引导序列和/或不被促进RNAi的细胞蛋白所识别。在一个实施方案中，该siNA的第一核苷酸序列如本文所述被化学修饰。在一个实施方案中，该siNA的第一核苷酸序列未被修饰(例如，为全RNA)。

[0298]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列，以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中第二序列被如此设计或修饰，以至于防止其作为引导序列或作为与靶核酸(如，RNA)序列有互补性的序列进入RNAi途径。在一个实施方案中，siNA的第一核苷酸序列如本文内所述被化学修饰。在一个实施方案中，该siNA的第一核苷酸序列未被修饰(例如，为全RNA)。这种设计或修饰预期会增强siNA的活性和/或改善本发明siNA分子的特异性。还预期这些修饰会使脱靶效应和/或相关毒性降至最低。

[0299]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列，以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中所述第二序列不能作为引导序列用于介导RNA干扰。在一个实施方案中，该siNA的第一核苷酸序列如本文所述被修饰。在一个实施方案中，该siNA的第一核苷酸序列未被修饰(例如，为全RNA)。

[0300]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中所述第二序列具有末端5’-羟基(5’-OH)或5’磷酸基团。

[0301]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中所述第二序列在所述第二序列的5’端包含末端帽部分。在一个实施方案中，该末端帽部分包含反向无碱基、反向脱氧无碱基、反向核苷酸部分、显示在图10中的基团、烷基或环烷基基团、杂环，或者任何其它阻止其中第二序列用作RNAi引导序列或模板的RNAi活性的基团。

[0302]在一个实施方案中，本发明描述了双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括互补于靶RNA序列或其部分的第一核苷酸序列以及与所述第一序列有互补性的第二序列，其中所述第二序列在所述第二序列的5’端和3’端包含末端帽部分。在一个实施方案中，每个末端帽部分独立地包含反向无碱基、反向脱氧无碱基、反向核苷酸部分、显示在图10中的基团、烷基或环烷基基团、杂环，或者任何其它阻止其中第二序列用作RNAi引导序列或模板的RNAi活性的基团。

[0303]在一个实施方案中，本发明描述了产生本发明具有改善特异性的用于下调或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，如基因或其对应的RNA)表达的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入一个或多个化学修饰，以及在适合于分离具有改善特异性的siNA分子的条件下测定步骤(a)中的siNA分子。在另一实施方案中，用于改善特异性的化学修饰包括在siNA分子的5’端、3’端或5’和3’端包含末端帽修饰。该末端帽修饰可例如包括显示在图10中的结构(例如反向脱氧无碱基部分)或者任何其它使得该siNA分子的一部分(例如有义链)不能介导针对脱靶核酸序列的RNA干扰。在非限定性实例中，siNA分子被如此设计，以使得只有该siNA分子的反义序列可用作RISC介导的对相应靶RNA序列的降解的引导序列。这可通过使siNA的有义序列无活性来实现，其中通过向有义链引入妨碍该有义链被RNAi机构(machinery)识别为引导序列的化学修饰来使siNA的有义链失活。在一个实施方案中，这类化学修饰包括在siNA的有义链的5’端的任何化学基团，或者任何其它用于使得有义链作为介导RNA干扰引导序列无活性的基团。这类修饰例如可产生这样的分子，其中有义链的5’端不再具有自由5’-羟基(5’-OH)或自由5’-磷酸基团(例如，磷酸、二磷酸、三磷酸、环状磷酸，等等)。这类siNA构建体的非限定性实例为本文中所描述的，例如“Stab 9/10”，“Stab 7/8”，“Stab 7/19”，“Stab17/22”，“Stab 23/24”，“Stab 24/25”，和“Stab 24/26”(例如，任何具有Stab 7，9，17，23，或24有义链的siNA)化学物及其变体(参见表I)，其中该siNA的有义链的5’端和3’端不含有羟基基团或磷酸基团。本文中，以数字表示的Stab化学物可包括显示在表I中化学物的2’-氟和2’-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。

[0304]在一个实施方案中，本发明描述了产生本发明具有改善特异性的用于下调或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，如基因或其对应的RNA)表达的siNA分子的方法，包括向siNA分子结构引入一个或多个化学修饰，其防止该siNA分子的链或部分作为RNAi活性的模板或引导链。在一个实施方案中，该siNA分子的失活链或有义区为该siNA分子的有义链或有义区，即该siNA的与靶核酸序列无互补性的链或区。在一个实施方案中，这类化学修饰可包括不包含5’-羟基(5’-OH)或5’-磷酸基团的siNA的有义链或区的5’端的任何化学基团，或者任何其它用于使得有义链或有义区作为介导RNA干扰引导序列无活性的基团。这类siNA构建体的非限定性实例为本文中所描述的，例如“Stab 9/10”，“Stab 7/8”，“Stab 7/19”，“Stab17/22”，“Stab 23/24”，“Stab 24/25”，和“Stab 24/26”(例如，任何具有Stab 7，9，17，23，或24有义链的siNA)化学物及其变体(参见表I)，其中该siNA的有义链的5’端和3’端不含有羟基基团或磷酸基团。本文中，以数字表示的Stab化学物可包括显示在表I中化学物的2’-氟和2’-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。

[0305]在一个实施方案中，本发明描述了筛选有活性介导针对靶核酸序列的RNA干扰的siNA分子的方法，包括(a)生成多种未经修饰的siNA分子，(b)在适合于分离有活性介导针对靶核酸序列的RNA干扰的siNA分子的条件下筛选步骤(a)的siNA分子，以及(c)向(b)的有活性siNA分子引入化学修饰(例如，本文所描述的或现有技术中已知的化学修饰)。在一个实施方案中，该方法还包括在适合于分离有活性介导针对靶核酸序列的RNA干扰的化学修饰siNA分子的条件下再筛选步骤(c)的化学修饰siNA分子。

[0306]在一个实施方案中，本发明描述了筛选有活性介导针对靶核酸序列的RNA干扰的化学修饰siNA分子的方法，包括(a)生成多种经化学修饰的siNA分子(例如，本文所描述的或现有技术中已知的siNA分子)，和(b)在在适合于分离有活性介导针对靶核酸序列的RNA干扰的化学修饰siNA分子的条件下筛选步骤(a)的siNA分子。

[0307]术语“配体”指能够与另一化合物如受体直接或间接相互作用的任何化合物或分子，如药物、肽、激素或神经递质。与配体相互作用的受体可存在于细胞表面或者可为细胞内受体。配体与受体的相互作用可引起生化反应，或者可简单地为物理相互作用或结合。

[0308]在另一实施方案中，本发明描述了产生本发明具有改善生物利用度的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入赋形剂，和(b)在适合于分离具有改善生物利用度的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。这类赋形剂包括诸如环糊精的聚合物、脂、阳离子脂、多胺、磷脂、纳米颗粒、受体、配体以及其它。

[0309]在另一实施方案中，本发明描述了产生本发明具有改善生物利用度的siNA分子的方法，包括(a)向siNA分子引入具有任何式I-VII或其任意组合的核苷酸，和(b)在适合于分离具有改善生物利用度的siNA分子的条件下测定步骤(a)的siNA分子。

[0310]在另一实施方案中，聚乙二醇(PEG)可被共价连接到本发明的siNA化合物。该结合的PEG可为任何分子量，优选约100至约50,000道尔顿(Da)。

[0311]本发明可单独使用或作为试剂盒的组分使用，其中该试剂盒具有至少一种将RNA体外或体内引入测试样品和/或个体中的试剂。例如，该试剂盒的优选组分包括本发明的siNA分子和促进将siNA引入本文所述目的细胞的载体(例如，采用现有技术中已知的脂质和其它转染方法，参见，例如Beigelman et al，US 6,395,713)。该试剂盒可用于例如在确定基因功能和/或活性，或者在药物优化，以及在药物发现方面的靶确认(参见，例如Usman et al.，USSN 60/402,996)。这种试剂盒还可包括使得试剂盒使用者能实施本发明的说明书。

[0312]用在本文时，术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指任何能够通过介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默以序列特异的方式抑制或下调基因表达或病毒复制的核酸分子。这些术语可指单个核酸分子、多个这类核酸分子、或这类核酸分子池。该siNA可为包含自身互补的有义和反义区的双链核酸分子，其中该反义区包括互补于靶核酸分子或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。该siNA可从两分开的寡核苷酸组装而来，其中一条链为有义链，另一条链为反义链，其中反义链和有义链为自身互补的(即，每条链包含互补于另一条链中核苷酸序列的核苷酸序列；例如当反义链和有义链形成双链体或双链结构时，例如，其中该双链区域是约15至约30，例如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30碱基对；反义链包含互补于靶核酸分子或其部分中核苷酸序列的核苷酸序列，且有义链包括对应于靶核酸序列或其部分中的核苷酸序列的核苷酸序列(例如，siNA分子的约15至约25或更多核苷酸与靶核酸或其部分互补)。或者，该siNA是从单一寡核苷酸组装而来，其中siNA的自身互补的有义和反义区通过基于核酸或非基于核酸的接头连接。该siNA可为具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含互补于分开的靶核酸分子或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。该siNA可为环状单链多核苷酸，具有两个或多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中该反义区包含互补于靶核酸分子或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，以及其中环状多核苷酸可在体内或体外被加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。该siNA还可包括单链多核苷酸，其具有互补于靶核酸分子或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列(例如，这中siNA分子不需要在该siNA分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列)，其中该单链多核苷酸还可包括末端帽基团，例如5’-磷酸(参见，例如Martinez et al.，2002，Cell.，110，563-574和Schwarz et al.，2002，Molecular Cell，10，537-568)，或5’，3’-二磷酸。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包括分开的有义和反义链或区，其中有义和反义区通过现有技术中已知的核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或者通过离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用、疏水相互作用和/或堆积相互作用非共价连接。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包括与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明的siNA分子与靶基因的核苷酸序列相互作用，其作用方式是引起对靶基因的表达的抑制。用在本文时，siNA分子不必限于仅含有RNA的分子，而是还包括化学修饰的核苷酸或非核苷酸。在某些实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺乏含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。申请人在一些实施方案中描述了短干扰核酸，它们不需要存在具有2′-羟基的核苷酸来介导RNAi，这样，本发明的短干扰核酸分子任选地不包括核糖核苷酸(例如具有2′-OH基团的核苷酸)。但是，这类不需要在siNA分子中存在核糖核苷酸来支持RNAi的siNA分子可具有结合的接头或多个接头或其它附着的或结合的基团、部分或含有一个或多个具有2’-OH基团的链。任选地，siNA分子可在约5，10，20，30，40，或50％的核苷酸位置包括核糖核苷酸。本发明经修饰的短干扰核酸分子还可被称为短干扰修饰寡核苷酸＂siMON＂。用在本文时，术语siNA与其它的用于描述能够介导序列特异的RNAi的核酸分子的术语等价，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小分子RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)，等等。本发明siNA分子的非限定性实例显示在图4-6中和表II中。这类siNA分子与现有技术中已知的介导基因表达抑制的其它核酸技术不同，这些核酸技术例如核酶、反义、三链体形成、适体、2，5-A嵌合或诱骗寡核苷酸。

[0313]“RNA干扰”或“RNAi”指抑制或下调细胞中基因表达的生物学过程，这是现有技术中所公知的，并且是通过短干扰核酸分子介导的，参见，例如Zamore and Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn andMartienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir et al.，2001，Nature，411，494-498；Kreutzer et al.，国际PCT公开WO 00/44895；Zernicka-Goetz etal.，国际PCT公开WO 01/36646；Fire，国际PCT公开WO 99/32619；Plaetinck et al.，国际PCT公开WO 00/01846；Mello and Fire，国际PCT公开WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开WO 99/07409；Liet al.，国际PCT公开WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe et al.，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；Hall et al.，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner and Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus et al.，2002，RNA，8，842-850；Reinhart et al.，2002，gene & Dev.，16，1616-1626；以及Reinhart & Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，用在本文时，术语RNAi与其它用于描述序列特异的RNA干扰的术语等价，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表遗传学(epigenetics)。例如，本发明的siNA分子可被用于在转录后水平或翻译前水平从表遗传学上沉默基因。在非限定性实例中，本发明siNA分子对基因表达的表遗传调节可源自siNA介导的对染色质结构或甲基化模式的修饰来改变基因表达(参见，例如Verdel et al.，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra et al.，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe etal.，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；以及Hall et al.，2002，Science，297，2232-2237)。在另一非限定性实例中，本发明siNA分子对基因表达的调节可源自siNA介导的通过RISC对RNA的切割(编码或非编码RNA)，或者翻译抑制，这为现有技术中已知的。在另一实施方案中，本发明siNA分子对基因表达的调节可源自转录抑制(参见，例如Janowski et al.，2005，Nature Chemical Biology，1，216-222)。

[0314]在一个实施方案中，本发明的siNA分子为双链体形成寡核苷酸“DFO”，(参见图14-15以及Vaish等人的于2003年12月3日提交的USSN10/727,780和于2004年5月24日提交的国际PCT申请US04/16390)。

[0315]在一个实施方案中，本发明的siNA分子为多功能siNA，(参见，例如图16-28以及Jadhav等人的于2004年2月19日提交的USSN60/543,480和于2004年5月24日提交的国际PCT申请US04/16390)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA可包括靶向例如靶RNA的两个或多个区的序列(参见，例如表II和III中的靶序列)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA可包括靶向一个或多个不同靶(包括SREBP1的编码和非编码区)的序列。

[0316]用在本文时，“不对称发夹”指包括反义区、可包含核苷酸或非核苷酸的环部分、以及与反义区比较包含较少核苷酸的有义区，其程度是有义区具有足够的互补核苷酸与反义区碱基配对并形成带有环的双链体。例如，本发明的不对称发夹siNA分子可包括长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如，约15至约30，或约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸)、包含约4至约12(例如，约4，5，6，7，8，9，10，11，或12)核苷酸的环区，以及具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)与反义区互补的核苷酸的有义区。该不对称发夹siNA分子还可包括可经化学修饰的5’末端磷酸基团。该不对称发夹siNA分子的环部分可包括核苷酸、非核苷酸、接头分子或偶联分子，如本文所述。

[0317]用在本文时，“不对称双链体”指具有两个包含有义区和反义区的分开链的siNA分子，其中与反义区相比有义区包含较少的核苷酸，其程度是该有义区具有足够的互补核苷酸与反义区碱基配对并形成双链体。例如，本发明的不对称双链体siNA分子可包括长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如，约15至约30，或约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸)，和具有约3至约25(例如，约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)与反义区互补的核苷酸的有义区。

[0318]“RNAi抑制剂”指任何可下调、减弱或抑制细胞或生物体内RNA干扰功能或活性的分子。RNAi抑制剂可通过与RNAi途径的任何组分相互作用或干扰其功能而下调、减弱或抑制RNAi(例如，RNAi介导的对靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默)，这些组分包括蛋白组分如RISC，或核酸组分如miRNA或siRNA。RNAi抑制剂可为在细胞或生物体中与RISC、miRNA或siRNA或任何其它RNAi途径组分相互作用或干扰其功能的siNA分子、反义分子、适体或小分子。通过抑制RNAi(例如，RNAi介导的对靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默)，本发明的RNAi抑制剂可用于调节(例如，上调或下调)靶基因的表达。在一个实施方案中，本发明的RNA抑制剂被用于通过干扰(例如，减弱或防止)基因表达的内源下调或抑制来上调基因表达，所述内源下调或抑制是通过翻译抑制、转录沉默或RISC介导的对多核苷酸(例如，mRNA)的切割进行的。通过干扰基因表达的内源遏制、沉默或抑制机制，本发明的RNAi抑制剂因而可用于上调基因表达，来治疗由于功能缺失而导致的疾病、性状或状况。在一个实施方案中，术语“RNAi抑制剂”在本文的不同实施方案中被用于替换术语“siNA”，例如具有增强基因表达的效果，用于治疗功能缺失疾病、性状和/或状况。

[0319]用在本文时，术语“适体”或“核酸适体”指特异结合靶分子的多核苷酸，其中该核酸分子的序列不同于在其天然情况下被靶分子识别的序列。或者，适体可为结合靶分子的核酸分子，其中该靶分子并非天然结合核酸。该靶分子可为任何目的分子。例如，该适体可用于结合至蛋白的配体结合结构域，从而防止天然发生的配体与蛋白的相互作用。这是一非限定性实例，本领域技术人员会意识到可采用现有技术中已知的技术容易地生成其它实施方案，参见，例如Gold et al.，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody and Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann and Patel，2000，Science，287，820；以及Jayasena，1999，ClinicalChemistry，45，1628。本发明的适体分子可为化学修饰的，如现有技术中所公知的或本文所描述的。

[0320]用在本文时，术语“反义核酸”指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸，Egholm et al.，1993 Nature 365，566)相互作用结合靶RNA并通过立体相互作用或通过RNase H介导的靶识别来改变靶RNA活性(综述参见Stein and Cheng，1993 Science 261，1004和Woolf et al.，US patent No.5,849,902)的核酸分子。通常，反义分子沿反义分子的单一连续序列互补于靶序列。但是，在某些实施方案中，反义分子可结合底物，使得该底物分子形成环，和/或反义分子可如此结合以致于反义分子形成环。因此，反义分子可互补于两个(或甚至更多)不连续底物序列，或反义分子的两个(或甚至更多)不连续序列部分可互补于靶序列，或这两种情况同时存在。关于当前反义策略的综述，参见Schmajuk et al.，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas et al.，1997，Nature，15，751-753，Stein et al.，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49。此外，反义DNA或带有2’-MOE和其它现有技术中已知的修饰的反义DNA可被用于通过DNA-RNA相互作用靶向RNA，由此激活RNase H，其消化双链体中的靶RNA。该反义寡核苷酸可包括一种或多种RNAse H激活区，其能够活化RNAse H切割靶RNA。反义DNA可被化学合成或通过使用单链DNA表达载体或其等价物而被表达。本发明的反义分子可被化学修饰，如现有技术中所公知的或本文所描述的。

[0321]“调节”指基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于不存在调节剂时所观测到的。例如，术语“调节”可指“抑制”，但是使用词语“调节”并不限于这个定义。

[0322]“抑制”、“下调”或“减弱”是指基因的表达、编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被降低至低于不存在本发明核酸分子(例如siNA)时所观察到的。在一个实施方案中，以siNA分子进行的抑制、下调或减弱使得低于在无活性或减弱分子存在下所观察到的水平。在另一实施方案中，以siNA分子进行的抑制、下调或减弱使得低于在具有杂乱序列(scrambled sequence)或具有错配的siNA分子存在下所观察到的水平。在另一实施方案中，以本发明核酸分子进行的抑制、下调或减弱在该核酸分子存在时比其不存在时要强。在一个实施方案中，基因表达的抑制、下调或减弱与转录后沉默相关，例如RNAi介导的对靶核酸分子(例如，RNA)的切割或者翻译抑制。在一个实施方案中，基因表达的抑制、下调或减弱与转录前沉默相关，例如通过DNA甲基化模式以及DNA染色质结构的改变。

[0323]“上调”或“促进”指基因的表达或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性增加至高于在不存在本发明核酸分子(例如siNA)时所观察到的。在一个实施方案中，以siNA分子进行的基因表达上调或促进高于在无活性或减弱分子存在下所观察到的水平。在另一实施方案中，以siNA分子进行的基因表达上调或促进高于例如在具有杂乱序列或具有错配的siNA分子存在下所观察到的水平。在另一实施方案中，以本发明核酸分子进行的基因表达上调或促进在该核酸分子存在时比其不存在时要强。在一个实施方案中，基因表达的上调或促进与抑制RNA介导的基因沉默相关，例如RNAi介导的对编码或非编码RNA靶的切割或抑制，该编码或非编码RNA靶下调、抑制或沉默了待上调目的基因的表达。基因表达的下调可例如由编码RNA或其编码蛋白诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可例如由对目的基因有调节控制的非编码RNA诱导，例如通过经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、RISC介导的RNA切割或翻译抑制来沉默基因表达来实现。这样，对下调、遏制或沉默目的基因的靶的抑制或下调可用于上调或促进朝向治疗用途的目的基因的表达。

[0324]在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂被用于通过抑制RNAi或基因沉默而上调基因表达。例如，本发明的RNAi抑制剂可被用于通过上调基因表达而治疗功能缺失疾病和状况(loss of functiondiseases and conditions)，例如单倍不足(haploinsufficiency)的情况，其中特定基因的一个等位基因携带有突变(例如，移码、错义或无义突变)，导致由突变等位基因编码的蛋白失去功能。这种情况下，RNAi抑制剂可被用于上调由野生型或功能性等位基因编码的蛋白的表达，由此通过补偿突变或无效等位基因而修正单倍不足。在另一实施方案中，例如在本文所述或现有技术中已知的疾病、性状或状况的治疗中，本发明的siNA分子被用于下调功能等位基因的毒性增加的表达，而本发明的RNAi抑制剂被伴随使用，以上调野生型或功能等位基因的表达(参见，例如Rhodeset al.，2004，PNAS USA，101：11147-11152和Meisler et al.2005，TheJ ournal of Clinical Investigation，115：2010-2017)。

[0325]“基因”、或“靶基因”或“靶DNA”指编码RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于编码多肽的结构基因。基因或靶基因还可编码功能RNA(fRNA)或非编码RNA(ncRNA)，如小短暂RNA(stRNA)、小分子RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)及其前体RNA。在调节参与功能性或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性方面，这些非编码RNA可用作siNA介导的RNA干扰的靶核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可被本发明的siNA分子调节。靶向fRNA和ncRNA的siNA分子还可被用于通过介入诸如遗传印记、转录、翻译或核酸加工(例如，转氨、甲基化等)的细胞过程来调节或改变个体、生物体或细胞的基因型或表型。靶基因可为来自细胞的基因、内源基因、转基因，或外源基因如病原体(如病毒)基因，在感染后其存在于细胞中。含有靶基因的细胞可来自或包含于任何生物体，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限定性实例包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限定性实例包括脊椎或无脊椎动物。真菌的非限定性实例包括霉菌或酵母。这方面的综述可例如参见Snyder andGerstein，2003，Science，300，258-260。

[0326]“非规范碱基配对(non-canonical base pair)”指任何非WatsonCrick碱基配对，例如错配和/或摆动碱基配对，包括翻转错配(flippedmismatch)、单氢键错配、跨型错配(trans-type mismatch)、三碱基相互作用以及四碱基相互作用。这类非规范碱基配对的非限定性实例包括但不限于AC反向Hoogsteen、AC摆动、AU反向Hoogsteen、GU摆动、AA N7氨基、CC2-羰基-氨基(H1)-N3-氨基(H2)、GA剪切的、UC4-羰基-氨基、UU亚氨基-羰基、AC反向摆动、AU Hoogsteen、AU反向Watson Crick、CG反向Watson Crick、GC N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基对称的、AA N7-氨基对称的、GA N7-N1氨基-羰基、GA+羰基-氨基N7-N1、GG N1-羰基对称的、GG N3-氨基对称的、CC羰基-氨基对称的、CC N3-氨基对称的、UU 2-羰基-亚氨基对称的、UU 4-羰基-亚氨基对称的、AA氨基-N3、AAN1-氨基、AC氨基2-羰基、AC N3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亚氨基、AU N3-亚氨基、AU N7-亚氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、GC氨基-N3、GC羰基-氨基、GC N3-氨基、GC N7-氨基、GG氨基-N7、GG羰基-亚氨基、GG N7-氨基、GU氨基-2-羰基、GU羰基-亚氨基、GU亚氨基-2-羰基、GUN7-亚氨基、psiU亚氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亚氨基-羰基、UU亚氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA羰基-C2-H、UU亚氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A)N3(C)-羰基、GC亚氨基氨基-羰基、Gpsi亚氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亚氨基氨基-2-羰基碱基配对。

[0327]用在本文时，“靶”指任何靶蛋白、肽或多肽，例如由本文和/或美国临时专利申请60/363,124，USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028所述的Genbank登录号所编码的，通过参考将它们并入本文。术语“靶”还指编码靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如由具有本文和/或美国临时专利申请60/363,124、USSN10/923,536和/或USSN PCT/US03/05028中所显示的Genbank登录号的序列所编码的蛋白、肽或多肽。目的靶可包括靶多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。术语“靶”还意味着包括其它序列，例如不同的亚型、突变体靶基因、靶多核苷酸的剪接变体、靶多态性以及非编码(例如，ncRNA、miRNA、stRNA)或其它调节性多核苷酸，如本文所述。因此，在本发明的不同实施方案中，本发明的与靶RNA有互补性的双链核酸分子(例如siNA)可被用于抑制或下调miRNA或其它ncRNA的活性。在一个实施方案中，对miRNA或ncRNA活性的抑制可被用于下调或抑制依赖于miRNA或ncRNA活性的基因表达(例如，本文所述或现有技术中已知的基因靶)。在另一实施方案中，本发明的与miRNA或ncRNA有互补性的双链核酸分子(例如，siNA)对miRNA或ncRNA活性的抑制可被用于上调或促进靶基因表达(例如，本文所述或现有技术中已知的基因靶)，其中该基因的表达被所述miRNA或ncRNA下调、遏制或沉默。这种基因表达上调可被用于治疗现有技术中公知的与功能缺失或单倍不足有关的疾病和状况(例如，肌营养不良、囊性纤维化、或本文所述的神经病学疾病和状况，如癫痫，包括婴儿严重肌阵挛性癫癎或Dravet综合征)。

[0328]“途径靶”指任何参与基因表达或活性的途径的靶。例如，任何给定的靶都可具有相关途径靶，其可包括生物学途径中的上游、下游或修饰基因。这些途径靶基因可在治疗本文所述疾病、状况和性状中提供额外或协同效应。

[0329]在一个实施方案中，所述靶为任何靶RNA或其部分。

[0330]在一个实施方案中，所述靶为任何靶DNA或其部分。

[0331]在一个实施方案中，所述靶为任何靶mRNA或其部分。

[0332]在一个实施方案中，所述靶为任何靶miRNA或其部分。

[0333]在一个实施方案中，所述靶为任何靶siRNA或其部分。

[0334]在一个实施方案中，所述靶为任何靶stRNA或其部分。

[0335]在一个实施方案中，所述靶为靶和或途径靶或其部分。

[0336]在一个实施方案中，所述靶为本文和/或美国临时专利申请60/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中所描述的任何(例如，一个或多个)靶序列或其部分。在一个实施方案中，所述靶为显示在表II中的任何(例如，一个或多个)靶序列或其部分。另一实施方案中，所述靶为对应于显示在表II中的任何(例如，一个或多个)靶、上链或下链序列或其部分的任何siRNA、miRNA或stRNA。在另一实施方案中，所述靶为对应于任何(例如，一个或多个)对应于本文序列或美国临时专利申请60/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中所描述序列的序列的任何siRNA、miRNA或stRNA。

[0337]“同源序列”指一种或多种多核苷酸序列(如基因、基因转录本和/或非编码多核苷酸)所共有的核苷酸序列。例如，同源序列可为两个或多个基因所共有的核苷酸序列，这些基因编码相关但不同的蛋白，例如基因家族的不同成员、不同的蛋白表位、不同的蛋白亚型，或为完全不同基因所共有的核苷酸序列，例如细胞因子和其相应受体。同源序列可为两种或多种非编码多核苷酸所共有的序列，这些非编码多核苷酸例如为非编码DNA或RNA、调节序列、内含子以及转录控制或调节位点。同源序列还可包括一种以上多核苷酸序列共有的保守序列区域。同源性并不需要完全同源(例如100％)，由于本发明也考虑到部分同源的序列(例如，99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％等)。

[0338]“保守序列区域”指多核苷酸内一个或多个区域的核苷酸序列在不同代之间或者从一个生物学系统、个体或生物体到另一生物学系统、个体或生物体没有显著变化。该多核苷酸可包括编码和非编码DNA和RNA。

[0339]“有义区”指与siNA分子的反义区有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可包括与靶核酸序列有同源性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的有义区被称为有义链或信使链。

[0340]“反义区”指与靶核酸序列有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可任选地包含与siNA分子的有义区有互补性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA的反义区被称为反义链或引导链。

[0341]术语“靶核酸”或“靶多核苷酸”指其表达或活性待调节的任何核酸序列(例如，任何靶和/或途径靶序列)。靶核酸可为DNA或RNA。在一个实施方案中，本发明的靶核酸为靶RNA或DNA。

[0342]“互补性”指核酸可与另一核酸序列通过传统Watson-Crick或其它非传统类型形成氢键，如本文所述。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子(其中一条链为15至30核苷酸长度)在该双链核酸分子的两条链之间具有约10％至约100％(例如约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％)的互补性。在另一实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子(其中一条链为有义链，另一条链为反义链，其中每条链为约15至约30核苷酸长度)在该双链核酸分子反义链中的核苷酸序列和其对应靶核酸序列分子(例如靶RNA或靶mRNA或病毒RNA)的核苷酸序列之间具有约10％至约100％(例如约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％)的互补性。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子(其中一条链包括被称为有义区的核苷酸序列，另一条链包括被称为反义区的核苷酸序列，其中每条链为约15至约30核苷酸长度)在该双链核酸分子的反义区和反义区之间具有约10％至约100％(例如约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％)的互补性。就本发明的核酸分子而言，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使得该核酸的相关功能能够进行，例如RNAi活性。现有技术中已知确定核酸分子结合自由能的方法(参见，例如Turneret al.，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier et al.，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner et al.，1987，J.Am.Chem.Soc.109：3783-3785)。互补性百分比指核酸分子中可与另一核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基百分比(例如，第一寡核苷酸总共10寡核苷酸中的5，6，7，8，9，或10个核苷酸与具有10核苷酸的另一序列碱基配对，分别代表50％，60％，70％，80％，90％，和100％互补性)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子在该siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个实施方案中，本发明的siNA分子与对应的靶核苷酸序列有完全的互补性。“完全互补性”指核酸序列的所有连续残基将与另一核酸序列中相同数目的连续残基氢键连接。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含约15至约30或更多(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30或更多)互补于一种或多种靶核酸分子或其部分的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siNA分子在该siNA分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该siNA分子的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％互补性)。例如，部分互补性可在该siNA结构内包括各种错配或非碱基配对核苷酸(例如，1，2，3，4，5或更多错配或非碱基配对核苷酸)，它们可在该siNA分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该siNA分子的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间导致鼓出、环或突出。

[0343]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子在该核酸分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子完全互补于对应的靶核酸分子。

[0344]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子如siNA分子在该双链核酸分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该核酸分子的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％互补性)。例如，部分互补性可在该双链核酸分子结构内包括各种错配或非碱基配对核苷酸(例如，1，2，3，4，5或更多错配或非碱基配对核苷酸)，它们可在该双链核酸分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该双链核酸分子的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间导致鼓出、环或突出。

[0345]在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子为小分子RNA(miRNA)。“小分子RNA”或“miRNA”指通过mRNA切割、翻译遏制/抑制或异染色质沉默调节靶信使RNA的小双链RNA(参见，例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He et al.，2004，Nat.Rev.genet.，5，522-531；Ying et al.，2004，gene，342，25-28；以及Sethupathy et al.，2006，RNA，12：192-197)。在一个实施方案中，本发明的小分子RNA在该miRNA分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该miRNA的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％互补性)。例如，部分互补性可在该双链核酸分子结构内包括各种错配或非碱基配对核苷酸(例如，1，2，3，4，5或更多错配或非碱基配对核苷酸)，它们可在该miRNA的有义链或有义区与反义链或反义区之间或者在该miRNA的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间导致鼓出、环或突出。

[0346]在一个实施方案中，本发明的下调或减弱靶基因表达的siNA分子被用于防止或治疗个体或生物体中本文所述或现有技术中已知的疾病、病症、状况或性状。

[0347]用在本文时，“增生性疾病”或“癌症”指任何现有技术中已知的以无控制的细胞生长或复制为特征的疾病、状况、性状、基因型或表型；包括白血病，如急性骨髓性粒细胞性白血病(AML)、慢性骨髓性粒细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、以及慢性淋巴细胞性白血病，AIDS相关癌症，如卡波西肉瘤；乳腺癌；骨癌，如骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、巨大细胞瘤、釉质细胞瘤以及脊索瘤；脑癌，如脑膜瘤、成胶质细胞瘤、轻度星形细胞瘤、Oligodendrocytomas、垂体瘤、神经鞘瘤以及转移性脑瘤；头颈癌，包括各种淋巴瘤，如外套细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、腺瘤、鳞状上皮细胞癌、喉癌、胆囊和胆管癌、视网膜癌如视网膜母细胞瘤、食道癌、胃癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、头颈癌、皮肤癌，、鼻咽癌、脂肉瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、腮腺癌、子宫内膜肉瘤、多重耐药癌；以及增生性疾病和状况，如与肿瘤血管发生相关的新血管形成、黄斑变性(例如，湿/干AMD)、角膜新生血管形成、糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、近视性以及其它增生性疾病和状况如再狭窄和多囊性肾病，以及任何其它可应答对细胞或组织中疾病相关基因表达的单独调节或与其它疗法联合的调节的癌症或增生性疾病、状况、性状、基因型或表型。

[0348]用在本文时，“炎性疾病”或“炎性状况”指任何现有技术中已知的以炎性或变应性过程为特征的疾病、状况、性状、基因型或表型，例如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸系统疾病、动脉粥样硬化、牛皮癣、皮炎、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、败血症性休克、类风湿性关节炎、炎症性肠病、盆腔炎症性疾病、疼痛、眼睛炎症性疾病、腹部疾病、亚急性坏死性脑病、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸细胞增多症(FE)、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉部炎性疾病；结核病、慢性胆囊炎、支气管扩张、硅肺病和其它尘肺病，以及任何其它应答对细胞或组织中疾病相关基因表达的单独调节或与其它疗法联合的调节的炎性疾病、状况、基因型或表型。

[0349]用在本文时，“自身免疫性疾病”或“自身免疫性状况”指任何以现有技术中已知的自身免疫性为特征的疾病、状态、性状、基因型或表型，例如多发性硬化症、糖尿病、狼疮、腹部疾病、克隆氏病、溃疡性结肠炎，Guillain-Barre综合征、硬皮病、古德帕斯丘综合征、韦格纳氏肉芽肿病、自身免疫性癫痫、拉斯马森脑炎、主胆管纤维硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪生氏病、桥本甲状腺炎、纤维肌痛、梅尼尔氏综合征；移植排斥(例如，防止同种异体移植排斥)、恶性贫血、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、修格连氏症、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、莱特尔氏综合征、Grave病，以及任何其它应答对细胞或组织中疾病相关基因表达的单独调节或与其它疗法联合的调节的自身免疫性疾病、状况、基因型或表型。

[0350]“传染性疾病”指任何与传染原相关的疾病、状况、性状、基因型或表型，该传染原例如为病毒、细菌、真菌、阮蛋白或寄生虫。可被采用本发明siNA分子靶向的各种病毒基因的非限定性实例包括丙型肝炎病毒(HCV，例如Genbank登录号：D11168、D50483.1、L38318和S82227)、乙型肝炎病毒(HBV，例如GenBank登录号AF100308.1)、1型人免疫缺陷病毒(HIV-1，例如GenBank登录号U51188)、2型人免疫缺陷病毒(HIV-2，例如GenBank登录号X60667)、西尼罗河病毒(WNV，例如GenBank登录号NC_001563)、巨细胞病毒(CMV，例如GenBank登录号NC_001347)、呼吸道合胞病毒(RSV，例如GenBank登录No.NC_001781)、流感病毒(例如GenBank登录号AF037412)、鼻病毒(例如，GenBank登录号：D00239，X02316，X01087，L24917，M16248，K02121，X01087)、乳头瘤病毒(例如GenBank登录号NC_001353)、单纯疱疹病毒(HSV，例如GenBank登录号NC_001345)、以及其它病毒如HTLV(例如，GenBank登录号AJ430458)。由于很多病毒基因组的高度序列可变性，为广泛治疗应用选择siNA分子将设计病毒基因组的保守区域。病毒基因组的保守区域的非限定性例子包括但不限于5’-非编码区(NCR)、3’-非编码区(NCR)和/或内部核糖体进入位点(IRES)。针对各种病毒基因组的保守区设计的siNA分子将使得能在不同患者群体中抑制病毒复制，并且可以确保该siNA分子对病毒准种(quasi species)的有效性，其中该病毒准种是由于病毒基因组非保守区中突变而进化。细菌感染的非限定性实例包括放线菌病、炭疽热、曲霉病、菌血症、细菌感染和霉菌病、巴尔通体感染、肉毒杆菌中毒、普鲁斯病、伯克霍尔德菌感染、弯曲杆菌感染、念珠菌病、猫抓病、衣原体感染、霍乱，、梭状芽胞杆菌感染、球孢子菌病、交叉感染、隐球菌病、皮肤真菌病、白喉、埃里希体病、大肠杆菌感染、筋膜炎、导致坏死、梭状杆菌感染、气性坏疽病、革兰氏阴性菌感染、革兰氏阳性菌感染、组织胞浆菌病、脓疱病、克雷白氏杆菌感染、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、李斯特菌感染、莱姆病、足分支菌病、类鼻疽、分枝杆菌感染、支原体感染、霉菌病、诺卡氏菌感染、甲癣、鹦鹉热、鼠疫、肺炎球菌感染、假单胞菌属感染、Q热、鼠咬热、回归热、风湿热，、立克次体感染、洛矶山斑疹热、沙门菌感染，、猩红热、丛林斑疹伤寒、脓毒症、性传播疾病-细菌、细菌性皮肤病、葡萄球菌感染、链球菌感染、破伤风、蜱传播性疾病、结核病、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒、流行性班疹伤寒、弧菌感染、雅司疹、耶尔森菌感染、动物传染病以及接合菌病。真菌感染的非限定性实例包括曲霉病、芽生菌病、球孢子菌病、隐球菌病、手指甲和脚趾甲霉菌感染、真菌性鼻窦炎、组织胞浆菌病、毛霉菌病、指甲霉菌感染、副球孢子菌病、孢子丝菌病、山谷热(、球孢子菌病)以及霉菌过敏症。

[0351]“神经学疾病”或“神经学上疾病”指任何影响中枢或外周神经系统的疾病、病症或状况，包括ADHD、AIDS-神经系统并发症、透明隔缺、获得性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、脑白质肾上腺萎缩症、胼胝体发育不全、失认症、艾卡迪综合征、亚力山大病、Alpers病、交叉性肢体瘫痪、阿耳茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、无脑畸形、动脉瘤、综合征、血管瘤病、缺氧症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形、动静脉型血管畸形、阿斯巴甜(aspartame)、阿斯佩各综合征、运动失调性毛细血管扩张症、共济失调、儿童多动症、孤独症、自主机能障碍、背痛、综合征、巴藤病、贝切特氏病、贝耳氏麻痹、良性自发性睑痉挛、良性病灶性肌萎缩、良性颅内高血压、伯-罗二氏综合征、宾斯旺氏病、睑痉挛、Bloch-Sulzberger综合征、臂丛产伤、臂丛损伤Bradbury-Eggleston综合征、脑动脉瘤、脑损伤、脑和脊髓肿瘤、布朗-塞卡尔氏综合征、脊髓延髓性肌肉萎缩症、卡纳万病、腕管综合征、灼性神经痛、海绵状血管瘤、勃起组织瘤、海绵状畸形、中央颈髓综合征、脊髓中央损伤综合征、中枢性痛、头部病症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩症、Wernicke-Korsakoff综合征、大脑性巨人症、脑缺氧、脑性麻痹、脑-眼-面-骨骼综合征、夏-马-图三氏肌萎缩、Chiari畸形、舞蹈病、舞蹈病棘红细胞增多症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性直立不耐受、慢性痛、II型科凯恩综合征、Coffin Lowry综合征、Coma昏迷、持续性生长状态、复杂性区域疼痛综合征、先天性面瘫、先天性肌无力症、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底核退化症、颅动脉炎、颅缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病、积性伤、柯兴氏综合征巨细胞包涵体体病(CIBD)、巨细胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈脚综合征、丹迪-沃克综合征、Dawson病、De Morsier综合征、Dejerine-Klumpke麻痹，多发梗塞痴呆症，痴呆-皮层下的、向心性多层的圆形小体性痴呆、皮肌炎、发育性运用障碍、Devic综合征、糖尿病神经病变弥漫性硬化、Dravet综合征、家族性自主神经异常、书写困难、诵读困难、吞咽困难、动用障碍、张力障碍、早期婴儿型癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、昏睡性脑炎、脑炎和脑膜炎、脑膨出、脑病、脑三叉神经血管瘤病、癫痫症、欧勃麻痹、埃尔布-杜兴麻痹和Dejerine-Klumpke氏麻痹、法布里氏病、法尔氏综合、家族性植物神经功能障碍症、家族性血管瘤、家族性原发性基底核钙化、家族性痉挛性麻痹、热性癫痫发作(例如，GEFS和GEFS plus)、菲希尔综合征、婴儿松弛综合征、弗里德赖希氏共济失调、高歇氏病、格斯特曼氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、舌咽神经痛、传染性神经元炎、HTLV-1相关的脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病、颅脑损伤、头痛、、持续性偏头痛、半侧颜面痉挛、偏瘫、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性运动失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、综合征、前脑无裂畸形、亨延顿氏舞蹈病、积水性无脑、、脑积水-常压、脑积水、脊髓积水、皮质醇增多症、睡眠过度、高渗压、张力过低、缺氧、、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿肌张力过低症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷夫叙姆病、婴儿性痉挛、炎性肌病、肠原性脂肪代谢障碍、颅内囊肿、颅内高压、Isaac综合征、、Joubert综合征、Kearns-Sayree综合征、Kennedy病、舞蹈眼综合征、克-列二氏综合征、克-费综合征、克-特二氏综合征(KTS)、Klüver-Bucy综合征、Korsakoff遗忘综合征、克拉伯病，、库-韦病、库鲁病、Lambert-Eaton肌无力综合征症、Landau-Kleffner综合征、股外侧皮神经卡压综合征、侧髓综合征、学习不能、Leigh病、Lennox-Gastaut综合征、莱-萘二氏综合征、脑白质营养不良、舞蹈-棘状细胞增多综合征、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合征、Lou Gehrig病、狼疮-神经后遗症、Lyme病-神经并发症、马-约病、巨脑、迈-罗二氏综合征、脑膜炎、门克斯病、感觉异常性股痛、异染性脑白质营养不良、小头畸型、偏头痛、Miller Fisher综合征、轻微中风、线粒体性肌病、默比厄斯氏综合征、单肢肌萎缩、运动神经元病、Moyamoya病、粘脂贮积病、粘多糖增多症、多发性脑梗死性痴呆、多病灶运动神经病、多发性硬化症、伴随体位性低血压的多系统萎缩症、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌无力-先天性的、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌阵挛脑病、肌阵挛、肌病-先天性脑病、肌病-甲状腺毒性、肌病、先天性肌强直病、肌强直、昏睡病、神经棘红细胞增多症、脑部铁积累的神经变性、多发性神经纤维瘤、抗精神病药的恶性综合征、AIDS的神经并发症、Pompe病的神经表现、眼脑脊髓病、神经性肌强直、神经元腊样脂褐质症、神经元迁移障碍、遗传性神经病、神经类肉瘤病、、神经毒性，、海绵状痣、尼-皮二氏病、O′Sullivan-McLeod综合征、枕骨神经痛、、隐藏性脊柱裂病、Ohtahara综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼球阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、慢性痛、瘤外综合征、感觉异常、帕金森病、先天性Parmyotonia、发作性舞蹈手足徐动症、发作性偏头痛、Parry-Romberg病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、佩娜-舒凯尔II型综合征、神经周围囊肿、周期性麻痹、周围神经病、脑室周围白质软化、持续性生长状态、综合性精神发育障碍、植烷酸贮积病，Pick′sDisease皮克氏病、梨状肌综合征、垂体瘤、多发性肌炎、Pompe病、、孔洞脑、小儿麻痹症后期综合征、带状疱疹后神经痛、传染病后脑脊髓炎、直立性低血压、直立性心动过速综合征、直立性心动过速综合征、原发性侧索硬化症、朊病毒病、进行性单侧面萎缩、进行性运动性共济失调、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性灰质萎缩、进行性核上性麻痹、脑假瘤、吡哆醇依赖和吡哆醇敏感癫、I型亨特综合征、II型亨特综合征、Rasmussen脑炎和其它自身免疫性癫痫、交感反射性营养不良综合征、婴儿雷夫叙姆病、雷夫叙姆病、重复性运动紊乱、重复性压力损伤、多动腿综合征、逆转录病毒相关脊髓病、Rett综合征、雷耶氏综合征、赖利-戴综合征、SUNCT头痛、骶神经根囊肿、Saint Vitus舞蹈病、唾腺病、桑德霍夫病、谢耳德氏病、脑裂、癫痫发作、视隔发育不良、婴儿严重肌阵挛型癫痫(SMEI)、惊吓婴儿综合征、带状疱疹、夏-德综合征、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、睡眠性呼吸暂停、昏睡病、综合征、痉挛状态、脊柱裂、脊髓梗塞、脊髓损伤、脊髓瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑萎缩、、斯-里-奥三氏综合征、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特奇-韦伯综合征、亚急性硬化性全脑炎、宾斯旺格氏病、舌咽障碍、西德纳姆舞蹈、晕厥、梅毒性脊柱硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、Tarlov囊肿、泰-萨克斯病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、甲状腺机能亢进性肌病、三叉神经痛、Todd麻痹、图雷特多综合征、一过性缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性下肢无力、结节性硬化、血管勃起组织瘤、血管炎包括颞动脉炎、Von Economo病、Von Hipple-Lindau病(VHL)、Von Recklinghausen病、瓦伦伯格氏综合征、Werdnig-Hoffman病、Wernicke-Korsakoff综合征、韦斯特综合征、惠普尔氏病、威廉斯综合征、威尔逊氏病、伴X染色体脊髓和延髓肌萎缩以及泽韦格综合征。

[0352]“呼吸疾病”指任何影响呼吸道的疾病或状况，例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病或“COPD”、过敏性鼻炎、鼻窦炎、肺血管收缩、炎症、变态反应、阻碍呼吸、呼吸窘迫综合征、纤维囊泡症、肺动脉高血压、肺血管收缩、肺气肿，以及任何其它应答对细胞或组织中疾病相关基因表达的单独调节或与其它疗法联合的调节的呼吸疾病、状况、基因型或表型。

[0353]用在本文时，“眼科疾病”指现有技术中已知的眼和相关结构的任何疾病、性状、基因型或表型，例如囊样黄斑水肿、星形玻璃体退变、病理性近视和眼后葡萄肿、弓蛔虫病(眼幼虫移行症)、视网膜静脉闭塞、玻璃体后部脱离、牵拉性视网膜撕裂、视网膜表面膜、糖尿病性视网膜病、有格子状变性、视网膜静脉闭塞、视网膜动脉阻断、黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性，如湿AMD或干AMD)、弓形虫病、脉络膜黑素瘤、获得性视网膜层分裂、斑、特发性中心浆液脉络膜视网膜病、黄斑裂洞、眼假组织胞浆菌病综合征、视网膜大动脉瘤、色素性视网膜炎、视网膜剥离、高血压性视网膜病、视网膜色素上皮细胞(RPE)脱离、乳头视网膜炎、眼睛局部缺血综合征、冠茨氏病、Leber粟粒状动脉瘤、结膜赘生物、变应性结膜炎、春季结膜炎、急性细菌性结膜炎、变应性结膜炎和春季角膜结膜炎、病毒性结膜炎、细菌性结膜炎、衣原体和淋菌性结膜炎、结膜撕裂、巩膜外层炎、巩膜炎、结膜黄斑、翼状胬肉、上缘角膜结膜炎(Theodore的SLK)、毒性结膜炎、伪膜性结膜、巨乳头性结膜炎、Terrien角膜边缘变性、棘阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、丝状角膜炎、细菌性角膜炎、角膜炎干眼综合征、细菌性角膜炎、单纯性疱疹角膜炎、无菌性角膜浸润、小水疱病、角膜上皮擦伤和复发性角膜糜烂、角膜异物、化学刺、上皮基底膜营养不良(EBMD)、浅层点状角膜病变、角膜撕裂伤、Salzmann结状变性、Fuchs内皮营养不良、晶状体半脱位、睫状体阻滞性青光眼、原发性开角型青光眼、色素播散综合征和色素性青光眼、假鳞片样脱皮综合征和剥脱性青光眼、前色素层炎、原发性开角型青光眼、葡萄膜炎性青光眼和青光眼睫状体炎危象、色素播散综合征和色素性青光眼、急性闭角型青光眼、前色素层炎、眼前房出血、房角退缩性青光眼、镜片诱导的青光眼、假鳞片样脱皮综合征和剥脱性青光眼、Axenfeld-Rieger综合征、新生血管性青光眼、扁平部睫状体炎、脉络膜破裂、Duane眼球后退综合征、毒性/营养视神经病、颅神经III的异常再生、颅内肿块损伤、颈内动脉海绵窦瘘、前部缺血性视神经病变、视神经乳头水肿和视乳头水肿、颅神经III麻痹、颅神经IV麻痹、颅神经VI麻痹、颅神经VII(面神经)麻痹、霍纳氏综合征、比-鲁-科三氏综合征、视神经乳头发育不全、视凹、强直性瞳孔、视神经乳头玻璃疣、脱髓鞘视神经病(视神经炎、球后视神经炎)、一时性黑矇和一过性缺血发作、脑假瘤、垂体腺瘤、传染性软疣、泪管炎、疣和乳头状瘤、虱病和阴虱、睑炎、睑腺炎、眶隔前蜂窝织炎、睑板腺囊肿基底细胞癌、眼部带状疱疹、虱病和阴虱病、粉碎性骨折、慢性泪溢、泪囊炎、单纯性疱疹性睑炎、眼眶蜂窝织炎、老年性睑内翻以及鳞状上皮细胞癌。

[0354]“皮肤疾病”指皮肤、真皮或其中诸如毛发、毛囊等的结构的任何疾病或状况。皮肤疾病、病症、状况和性状科包括牛皮癣、异位性皮炎、皮肤癌如黑素瘤和基底细胞癌、掉发、脱发、色素沉着改变以及与皮肤、真皮或其中结构有关的任何其它疾病、状况或性状。

[0355]“听觉疾病”指任何听觉系统(包括耳，如内耳、中耳、外耳、听觉神经以及其中的任何亚结构)的疾病或状况。听觉疾病、病症、状况和性状科包括听力丧失、耳聋、耳鸣、梅尼尔氏病、眩晕、平衡和运动紊乱以及与耳或其中结构有关的任何其它疾病、状况或性状。

[0356]“代谢疾病”指现有技术中已知的任何影响代谢途径的疾病或状况。代谢疾病可导致异常代谢过程，或者是先天性的，由遗传的酶异常导致(先天性代谢缺陷)，或者是获得性的，由内分泌器官的疾病或这代谢上重要的器官如肝的衰竭导致。在一个实施方案中，代谢疾病包括高脂血症、血胆固醇过多、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或肥胖。

[0357]“心血管疾病”指影响心脏和血管的任何疾病、状况，包括但不限于冠心病冠状动脉硬化性心脏病(CHD)、脑血管疾病(CVD)、主动脉瓣狭窄、心血管疾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、心肌梗塞(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、短暂性脑缺血发作(TIA)、心绞痛(稳定和不稳定的)、心房颤动、心律不整、心脏瓣膜症、充血性心力衰竭、高胆固醇血症、I型高脂蛋白血症、II型高脂蛋白血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症、V型高脂蛋白血症、继发性高三酸甘油酯血症以及家族性肾上腺脑白质营养不良。

[0358]在本发明的一个实施方案中，本发明siNA分子的每一序列独立地为约15至约30核苷酸长度，在特定实施方案中为约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30核苷酸长度。在另一实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15至约30碱基对(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)。在另一实施方案中，本发明siNA分子的一条或多条链独立地包含约15至约30互补于靶核酸分子的核苷酸(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30)。在另一实施方案中，本发明的包括发夹或环状结构的siNA分子为约35至约55(例如，约35，40，45，50或55)核苷酸长度或约38至约44(例如，约38，39，40，41，42，43，或44)核苷酸长度并包含约15至约25(例如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25)碱基对。本发明示例性的siNA分子显示在表II和/或图4-5中。

[0359]用在本文时，“细胞”以其通常的生物学意义使用，不指整个多细胞生物体，例如，尤其不指人。细胞可存在于生物体如鸟、植物和哺乳动物(如人、牛、绵羊、猿、猴、猪、狗和猫)中。细胞可为原核的(例如，细菌细胞)或真核的(如，哺乳动物或植物细胞中)。细胞可为体细胞系来源或生殖细胞系来源，全能的或多能的，分裂的或不分裂的。细胞也可以来自或可包括配子或胚胎细胞、干细胞、或完全分化的细胞。细胞可为分离的细胞、纯化的细胞、或基本纯化的细胞，这为现有技术中所公知的。

[0360]本发明的siNA分子可直接加入，或者与阳离子脂质复合、被包装进脂质体，或者以其他方式被输送至靶细胞或组织。通过局部输送至肺(被包含进或不被包含进生物聚合物中)，核酸或核酸复合物可被离体或活体局部给予相关组织。在特定实施方案中，本发明的核酸分子包括表II和/或图4-5中显示的序列。这类核酸分子的实例主要包括在这些表和图中定义的序列。此外，在表1中描述的经化学修饰的构建体以及显示在表IV中的脂质纳米颗粒(LNP)制剂可被应用到本发明任何siNA序列或siNA序列组。

[0361]另一方面，本发明提供了含有一种或多种本发明siNA分子的哺乳动物细胞。所述一种或多种siNA分子可独立地靶向本发明靶多核苷酸内的相同或不同位点。

[0362]“RNA”指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”指在β-D-呋喃核糖的2′位具有羟基基团的核苷酸。该术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本纯化的RNA，合成RNA，重组产生的RNA，以及通过添加、删除、置换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然产生的RNA不同的经改变的RNA。这些改变可包括例如向siNA的末端或这在内部如RNA的一个或多个核苷酸处加入非核苷酸材料。本发明RNA分子中的核苷酸还可包括非标准核苷酸，如非天然产生的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可被称为类似物或天然产生的RNA的类似物。

[0363]“个体(subject)”指生物体，其为移植细胞的供体或受体或这些细胞自身。“个体”还指要被给予本发明的核酸分子的生物体。个体可为哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。在一个实施方案中，个体为婴儿(例如小于1月龄，或1，2，3，4，5，6，7，8，910，11，或12月龄的个体)。在一个实施方案中，所述个体为儿童(例如1，2，3，4，5或6岁)。在一个实施方案中，所述个体为老人(例如，任何超过约65岁的人)。

[0364]用在本文时，“化学修饰”指对核苷酸化学结构的任何修饰，它们不同于天然siRNA或RNA的核苷酸。术语“化学修饰”包括以本文所述或现有技术中已知的经修饰的核苷和经修饰的核苷酸加入、置换或修饰天然siRNA或RNA核苷和核苷酸。这类化学修饰的非限定性实例非限定地包括以下组合：具有本文所述的式I，II，III，IV，V，VI，或VII、核苷酸键硫代磷酸酯键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4’-硫基核糖核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参见，例如2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，通过参考将其并入本文)、FANA、“通用碱基”核苷酸、“无碱基核苷酸”、5-C-甲基核苷酸、末端甘油基和/或反向脱氧无碱基残基并入，或者具有本文任何式I-VII的修饰。在一个实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA，siNA等)被化学修饰部分修饰(例如，约5％，10，％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％修饰)。在另一实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)被化学修饰完全修饰(例如，约100％修饰)。

[0365]用在本文时，术语“硫代磷酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含磷原子。因此，术语硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。

[0366]用在本文时，术语“膦酰基乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含乙酰基或保护的乙酰基基团。

[0367]用在本文时，术语“硫代膦酰基乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z包含乙酰基或保护的乙酰基基团且W包含硫原子，或者W包含乙酰基或保护的乙酰基基团且Z包含硫原子。

[0368]用在本文时，术语“通用碱基”指核苷酸碱基类似物，它们与天然DNA/RNA碱基的每一个形成碱基配对，对它们几乎不加区分。通用碱基的非限定性实例包括C-苯基、C-萘基和其它芳族衍生物、次黄嘌呤核苷、唑类羧酰胺以及硝基唑衍生物，如现有技术中已知的3-硝基吡咯、4-硝基吡咯、5-硝基吡咯和6-硝基吡咯(参见，例如Loakes，2001，NucleicAcids Research，29，2437-2447)。

[0369]用在本文时，术语“无环核苷酸”指具有无环状核糖的任何核苷酸，例如其中任何核糖碳(C1，C2，C3，C4，或C5)独立地或合起来不存在于该核苷酸中。

[0370]本发明的核酸分子单独地或这与其它药物组合或联合，可被用于防止或治疗个体或生物体中本文所述或现有技术中已知的疾病、病症、状况和性状。

[0371]在一个实施方案中，本发明的siNA分子可被给予(独立地，或者在适合于治疗的条件下与一种或多种药物组合)个体或者可被给予本领域技术人员显而易见的合适细胞。

[0372]在另一实施方案中，该siNA分子可与其它已知的疗法联合使用，以防止个体或生物体中的疾病、病症或状况。例如，所述分子可与一种或多种已知的化合物、疗法或操作联合使用以防止或治疗个体或生物体中本文所述的疾病、病症、状况和性状，这在现有技术中是已知的。

[0373]在一个实施方案中，本发明描述了表达载体，其包含编码至少一种本发明siNA分子的核酸序列，方式是允许该siNA分子的表达。例如，该载体可含有编码包含双链体的siNA分子的两条链的序列。该载体也可含有编码单一核酸分子的序列，该单一核酸分子为自身互补的，由此形成siNA分子。这类表达载体的非限定性实例描述在Paul et al.，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi and Taira，2002，NatureBiotechnology，19，497；Lee et al.，2002，Nature Biotechnology，19，500；以及Novina et al.，2002，Nature Medicine(提前的在线发表doi：10.1038/nm725)。

[0374]在另一实施方案中，本发明描述了包含本发明表达载体的哺乳动物细胞，例如人细胞。

[0375]在另一实施方案中，本发明的表达载体包含用于siNA分子的序列，其与通过Genbank登录号指出的RNA分子具有互补性，例如本文所描述的或在美国临时专利申请60/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中所描述的Genbank登录号。

[0376]在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码两个或多个siNA分子的核酸序列，这些siNA分子相同或不同。

[0377]在本发明另一方面，与靶RNA分子相互作用和下调编码靶RNA分子(例如，通过本文Genbank登录号指出的靶RNA分子)的基因的siNA分子从被插入DNA或RNA载体中的转录单元表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。表达病毒载体的siNA可基于但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或α病毒。能够表达siNA分子的重组载体可如本文所述被输送，并持续存在于靶细胞中。或者，病毒载体可被用于提供siNA分子的瞬时表达。这类载体可按需要重复施用。表达后，siNA分子结合并通过RNA干扰(RNAi)下调基因功能或表达。siNA表达载体的输送可为系统性的，例如通过静脉内或肌内给药，通过向从个体体内取出的靶细胞给药并回输该个体，或者通过其它使得能引入期望的靶细胞内的方式。

[0378]“载体”指用于输送所希望的核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。

[0379]本发明的其它特征和优点将由下文对其优选实施方案的说明和从权利要求书而显而易见。

附图简要说明

[0380]图1显示了合成siNA分子的方案的非限定性实例。互补的siNA序列链(链1和链2)被串联合成，并通过可切割键连接，该可切割键例如为核苷酸琥珀酸酯或无碱基琥珀酸酯，它们可与用于固相合成的固相支持物上的可切割接头相同或不同。该合成可以是固相的或液相的，在所显示的实例中，该合成为固相合成。该合成如此进行，以使诸如二甲氧基三苯甲基基团的保护基团在该串联寡核苷酸的末端核苷酸上保持完好。在寡核苷酸切割和脱保护之后，两siNA链自发杂交以形成siNA双链体，其使得能通过利用末端保护基团的性质来纯化双链体，例如，通过应用带三苯甲基(trityl-on)的纯化方法，其中仅带有末端保护基团的双链体/寡核苷酸被分离。

[0381]图2显示了通过本发明方法合成的纯化的siNA双链体的MALDI-TOF质谱。所显示的两个峰对应于分开的siNA序列链的质量。该结果证实可采用带三苯甲基的纯化方法将串联合成产生的siNA双链体作为单一实体纯化。

[0382]图3显示了非限定性地提议的与RNAi有关的靶RNA降解的的机制描述。通过RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)从外来单链RNA(例如病毒、转座子或其它外源RNA)产生的双链RNA(dsRNA)激活DICER酶，其又产生siNA双链体。或者，合成的或表达的siNA可通过适合的方法被直接引入到细胞中。形成识别靶RNA的活性siNA复合体，导致通过RISC内切核酸酶复合体对靶RNA的降解，或者导致RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)合成额外RNA，该RNA激活DICER，产生额外siNA分子，由此放大了RNAi反应。

[0383]图4A-F显示了本发明经化学修饰的siNA构建体的非限定性实例。图中，N表示任何核苷酸(腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷或任选胸苷，例如胸苷可在通过括号(N N)指出的突出区中被取代。为siNA构建体的有义和反义链显示了各种修饰。(N N)核苷酸位置可如本文所述被化学修饰(例如，2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟等)，并且可源于或者不源于对应的靶核酸序列(参见，例如图6C)。此外，显示在图4中的序列可任选地在从有义链的5’端起的9位或者基于引导链的5’端在11位(通过从引导链的5′末端起数11核苷酸位置)包括核糖核苷酸(参见图6C)。

[0384]图4A：有义链包含21核苷酸，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对以及其中除了(N N)核苷酸之外所有存在的核苷酸均为核糖核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有存在的核苷酸均为核糖核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在反义链中连接(NN)核苷酸。

[0385]图4B：有义链包含21核苷酸，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′-核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在有义和反义链中连接(N N)核苷酸。

[0386]图4C：有义链包含21核苷酸，具有5′和3′末端帽部分，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-O-甲基或2′脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′-核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在反义链中连接(N N)核苷酸。

[0387]图4D：有义链包含21核苷酸，具有5′和3′末端帽部分，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰，以及其中所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′脱氧核苷酸。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′-核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在反义链中连接(N N)核苷酸。

[0388]图4E：有义链包含21核苷酸，具有5′和3′末端帽部分，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰，以及其中所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′脱氧核苷酸。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′-核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在反义链中连接(N N)核苷酸。

[0389]图4F：有义链包含21核苷酸，具有5′和3′末端帽部分，其中两个末端3′核苷酸任选地碱基配对，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰，以及其中所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′脱氧核苷酸。反义链包含21核苷酸，任选地具有3′末端甘油基部分，其中两个末端3′-核苷酸任选地互补于靶RNA序列，以及其中除了(N N)核苷酸之外所有可能存在的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸，所有可能存在的嘌呤核苷酸为2′-O-甲基修饰的核苷酸，该(N N)核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、通用核苷酸或其它本文所述的化学修饰。显示为“s”的修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它本文所述的修饰的核苷酸间键，任选地在反义链中连接(N N)核苷酸。构建体A-F的反义链包括互补于任何本发明靶核酸的序列。此外，对于显示在图4A-F中的任何构建体来说，当甘油基部分(L)存在于反义链的3’端时，修饰的核苷酸间键为任选的。

[0390]图5A-F显示了本发明具体的化学修饰siNA序列的非限定性实例。A-F将描述在图4A-F中的化学修饰应用到示例性的siNA序列。这类化学修饰可被应用于用于任何靶的任何siNA序列。此外，显示在图5中的序列可任选地从有义链的5’端起的9位或者基于引导链的5’端在11位(通过从引导链的5′末端起数11核苷酸位置)包括核糖核苷酸(参见图6C)。此外，显示在图5中的序列可任选地在反义链5’端至多约4个位置包括末端核糖核苷酸(例如，在反义链5’端约1，2，3，或4个末端核糖核苷酸)。

[0391]图6A-C显示了本发明不同siNA构建体的非限定性实例。

[0392]显示在图6A中的实例(构建体1、2和3)具有19代表性碱基对；但是，本发明的不同实施方案包括任何数目的本文所述碱基配对。加括号的区域代表核苷酸突出，例如包含约1、2、3、或4核苷酸长度，优选约2核苷酸。构建体1和2可独立地用于RNAi活性。构建体2可包括多核苷酸或非核苷酸接头，其可任选地被设计为生物可降解的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可包含生物可降解接头，该接头导致在体内和/或体外形成构建体1。在另一实例中，构建体3可被用于以相同原理产生构建体2，其中接头被用于在体内和/或体外产生活性siNA构建体2，其可任选地利用其它可生物降解接头来在体内和/或体外产生活性siNA构建体1。这样，基于体内或体外和/或体外使用的siNA构建体的设计，siNA构建体的稳定性和/或活性可被调节。

[0393]显示在图6B中的实施例代表本发明双链核酸分子如小分子RNA的不同变体，其可包括由部分互补导致的突出、鼓起、环和茎环。这类具有鼓起、环和茎环的基序通常为miRNA特征性的。鼓起、环和茎环可源于任何程度的部分互补，例如在本发明双链核酸分子的一条或两条链中约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多核苷酸的错配或鼓起。

[0394]图6C中显示的实例代表了本发明的模型双链核酸分子，其包含两21核苷酸序列的19碱基对双链体，具有两核苷酸3’突出。上链(1)表示有义链(信使链)，中链(2)表示反义链(引导链)，以及下链(3)表示靶多核苷酸序列。二核苷酸突出(NN)可包含源于靶多核苷酸的序列。例如，引导链中的3’-(NN)序列可互补于靶多核苷酸的5’-[NN]序列。此外，信使链的5’-(NN)序列可包含与靶多核苷酸序列的5’-[NN]序列相同的序列。在其它实施方案中，突出(NN)不是源于靶多核苷酸序列，例如其中引导链中的3’-(NN)序列不互补于靶多核苷酸的5’-[NN]序列，以及信使链的5’-(NN)序列可包含与靶多核苷酸序列的5’-[NN]序列不同的序列。在其它的实施方案中，任何(NN)核苷酸为化学修饰的，例如2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟、和/或本文其它修饰。此外，信使链可在信使链的位置N包含包含核糖核苷酸。对于所显示的19碱基对21mer双链体，位置N可为从信使链的3′端起的9核苷酸。但是，在不同长度的双链体中，通过从引导链的5′末端起数11核苷酸位置，基于引导链的5′端确定位置N，并在信使链中选出相应的碱基配对核苷酸。通过Ago2的切割发生在位置10和11之间，如箭头所指。在其它的实施方案中，通过从引导链的5′末端起数10和11核苷酸位置，基于引导链的5′端的位置10和11有两核糖核苷酸NN，并在信使链中选出相应的碱基配对核苷酸。

[0395]图7A-C为用于生成产生siNA发夹构建体的表达盒的方案的示意图。

[0396]图7A：合成DNA寡聚物，带有5′限制性位点(R1)序列，接着是具有与预定的靶序列相同的序列的区域(siNA的有义区)，其中有义区包含例如约19、20、21或22核苷酸(N)长度，接着是确定序列(X)的环序列，包含例如约3至约10核苷酸。

[0397]图7B：然后，通过DNA聚合酶延伸合成的构建体，以产生具有自身互补序列的发夹结构，其会产生对靶序列有特异性并具有自身互补的有义和反义区域的siNA转录本。

[0398]图7C：加热(例如约95℃)构建体以使序列线性化，由此使得能采用针对第一链的3′限制性序列的引物延伸互补的第二DNA链。然后，双链DNA被插入用于在细胞中表达的适合载体中。可如此设计构建体，使从转录本可产生3′末端核苷酸，例如，通过设计限制性位点和/或采用聚U末端区，如Paul et al.，2002，Nature Biotechno logy，29，505-508中所描述的。

[0399]图8A-C为用于生成产生双链siNA构建体的表达盒的方案的示意图。

[0400]图8A：合成DNA寡聚物，带有5′限制性位点(R1)序列，接着是具有与预定的靶序列相同的序列的区域(siNA的有义区)，其中有义区包含例如约19、20、21或22核苷酸(N)长度，接着是3′限制性位点(R2)，其邻近于确定序列(X)的环序列。

[0401]图8B：然后，通过DNA聚合酶延伸合成的构建体，以产生具有自身互补序列的发夹结构。

[0402]图8C：通过特异于R1和R2的限制性酶加工构建体以产生双链DNA，然后将其插入合适的载体，用于在细胞中表达。转录盒被如此设计，以使得U6启动子区位于dsDNA的每一侧，其产生siNA的分开的有义和反义链。多聚T末端序列可被添加至构建体以在所得到的转录本中产生U突出。

[0403]图9A-E为用于确定特定靶核酸序列如信使RNA内用于siNA介导的RNAi靶位点的方法的示意图。

[0404]图9A：合成siNA寡核苷酸池，其中siNA构建体的反义区与沿靶核酸序列的靶位点有互补性，以及其中有义区包含互补于siNA反义区的序列。

[0405]图9B和C：(图9B)收集序列并将它们插入载体，以便(图9C)载体转染进细胞导致siNA的表达。

[0406]图9D：基于与靶核酸序列的调节有关的表型变化对细胞进行分选。

[0407]图9E：从分选的细胞分离siNA，并测序以鉴定靶核酸序列内有效的靶位点。

[0408]图10显示了不同稳定性化学物的非限定性实例(1-10)，它们可被用于例如稳定本发明siNA序列的3′端，包括(1)[3-3′]-反向脱氧核糖；(2)脱氧核糖核苷酸；(3)[5′-3′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(4)[5′-3′]-核糖核苷酸；(5)[5′-3′]-3′-O-甲基核糖核苷酸；(6)3′-甘油基；(7)[3′-5′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(8)[3′-3′]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5′-2′]-脱氧核糖核苷酸；以及(10)[5-3′]-脱氧核糖核苷酸。除了在图中指出的修饰的和未修饰的骨架化学以外，这些化学物可与本文所述的不同骨架修饰(例如具有式I的骨架修饰)联合。此外，末端修饰5′端显示的2′脱氧核苷酸可为另一本文所述的修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸，例如具有式任何式I-VII或其任何组合的修饰。

[0409]图11显示了用于鉴定本发明经化学修饰的siNA构建体的的策略的非限定性实例，其中该siNA构建体在保留了介导RNAi活性的同时具有核酸酶抗性。基于所教导的设计参数，将化学修饰引入siNA构建体(例如，引入2’修饰、碱基修饰、骨架修饰、末端帽修饰等)。在适合的系统中测试修饰的构建体(例如，所显示的人血清用于核酸酶抗性，或者动物模型用于PK/输送参数)。平行地，例如在细胞培养系统中测试siNA构建体的RNAi活性(例如荧光酶报告测定法)。然后鉴定具有特定性能并同时保留了RNAi活性的先导siNA构建体，并且可进一步修饰并再次测定。相同的方法可被用于鉴定具有改善的药物动力学性能、输送和RNAi活性的siNA-偶联物分子。

[0410]图12显示了本发明磷酸化的siNA分子的非限定性实例，包括其线性和双链体构建体以及其不对称衍生物。

[0411]图13显示了本发明经化学修饰的末端磷酸基团的非限定性实例。

[0412]图14A显示了用于设计自身互补的DFO构建体的方法的非限定性实例，其利用了在靶核酸序列中鉴定的回文和/或重复核酸序列。(i)在核酸靶序列中鉴定回文或重复序列。(ii)设计互补于靶核酸序列和回文序列的序列。(iii)互补序列的非回文/重复部分的反向重复序列被添加到互补序列的3’端，以生成包括互补于核酸靶的序列的自身互补DFO分子。(iv)DFO分子可自组装形成双链寡核苷酸。图14B显示了形成双链体的寡核苷酸序列的非限定性实例。图14C显示了代表性形成双链体的寡核苷酸序列的自组装原理非限定性实例。图14D显示了代表性形成双链体的寡核苷酸序列的自组装原理，并随后与靶核酸序列相互作用导致对靶基因的调节的非限定性实例。

[0413]图15显示了自身互补DFO构建体的设计的非限定性实例，其利用了被并入DFO构建体的与任何目的靶核酸有序列互补性的回文和/或重复核酸序列。这些回文/重复序列的并入使得形成双链体的DFO构建体每一条链能够例如通过RNAi介导对靶基因表达的调节。首先，鉴定靶序列。然后生成互补序列，其中核苷酸或非核苷酸(显示为X或Y)被引入互补序列，产生人造回文序列(在图中显示为XYXYXY)。非回文/重复互补序列的反向重复被添加至互补序列的3’端以产生自身互补的DFO，其包含互补于核酸靶的序列。DFO可自组装形成双链寡核苷酸。

[0414]图16显示了本发明的多功能siNA分子的非限定性实例，其包括两多核苷酸序列，每一个可介导对不同靶核酸序列的RNAi介导的切割。图16A显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一和第二互补区域位于多功能siNA中每一多核苷酸序列的3’端。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。图16B显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一和第二互补区域位于多功能siNA中每一多核苷酸序列的5’端。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。

[0415]图17显示了本发明多功能siNA分子的非限定性实例，其包含含有多个不同区域的单一多核苷酸序列，每一区域能够介导对不同靶核酸序列的RNAi介导的切割。图17A显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第二互补区域位于多功能siNA中多核苷酸序列的3’端。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。图17B显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一互补区域位于多功能siNA中多核苷酸序列的5’端。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外被加工以产生多功能siNA构建体，如图16所示。

[0416]图18显示了本发明多功能siNA分子的非限定性实例，其包括两分开的多核苷酸序列，它们每一个能够介导不同靶核酸序列的RNAi指导的切割，以及其中该多功能siNA构建体还包括自身互补的回文或重复区域，由此实现了较短双功能siNA构建体，其可介导针对不同靶核酸序列的RNA干扰。图18A显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一和第二互补区域位于多功能siNA中每一多核苷酸序列的3’端，以及其中第一和第二互补区域还包括自身互补的回文或重复区域。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。图18B显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一和第二互补区域位于多功能siNA中每一多核苷酸序列的5’端，以及其中第一和第二互补区域还包括自身互补的回文或重复区域。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。

[0417]图19显示了本发明多功能siNA分子的非限定性实例，其包含含有不同区域的单一多核苷酸序列，每一区域能够介导不同靶核酸序列的RNAi指导的切割，以及其中该多功能siNA构建体还包括自身互补的回文或重复区域，由此实现了较短双功能siNA构建体，其可介导针对不同靶核酸序列的RNA干扰。图19A显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第二互补区域位于多功能siNA中多核苷酸序列的3’端，以及其中第一和第二互补区域还包括自身互补的回文或重复区域。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。图19B显示了多功能siNA分子的非限定性实例，其具有第一区域和第二区域，其中第一区域互补于第一靶核酸序列(互补区域1)，第二区域互补于第二靶核酸序列(互补区域2)，其中第一互补区域位于多功能siNA中多核苷酸序列的5’端，以及其中第一和第二互补区域还包括自身互补的回文或重复区域。该多功能siNA构建体的每一多核苷酸序列的虚线部分与该siNA构建体的对应部分具有互补性，但是与靶核酸序列没有互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外被加工以产生多功能siNA构建体，如图18所示。

[0418]图20显示了本发明多功能siNA分子如何能够靶向两分开的靶核酸分子的非限定性实例，所述靶核酸分子例如为分开的RNA分子，其编码不同蛋白(例如，本文的任何靶)，例如细胞因子和其对应受体、不同病毒株、病毒和参与病毒感染或复制的细胞蛋白，或者参与共有或不同生物学途径(其参与了疾病进展的维持)的不同蛋白。多功能siNA构建体的每条链包括与分开的靶核酸分子具有互补性的区域。该多功能siNA分子被如此设计，以致于该siNA的每条链可被RISC复合体用于引发RNA干扰介导的对其相应靶的切割。这些设计参数可包括使siNA构建体的每一端不稳定(参见，例如Schwarz et al.，2003，Cell，115，199-208)。这种不稳定可例如通过使用鸟苷-胞苷碱基对、可变碱基对(例如摆动碱基)或者在末端核苷酸位置使化学修饰的核苷酸不稳定来实现，这在现有技术中是已知的。

[0419]图21显示了本发明多功能siNA分子如何能靶向相同靶核酸分子内两分开的靶核酸序列的非限定性实例，其中靶核酸分子例如为RNA的可变编码区、RNA的编码和非编码区或RNA的可变剪接变体区。该多功能siNA构建体的每条链包括与靶核酸分子的分开区域有互补性的区域。该多功能siNA分子被如此设计，以致于该siNA的每条链可被RISC复合体用于引发RNA干扰介导的对其相应靶区域的切割。这些设计参数可包括使siNA构建体的每一端不稳定(参见，例如Schwarz et al.，2003，Cell，115，199-208)。这种不稳定可例如通过使用鸟苷-胞苷碱基对、可变碱基对(例如摆动碱基)或者在末端核苷酸位置使化学修饰的核苷酸不稳定来实现，这在现有技术中是已知的。

[0420]图22(A-H)显示了本发明栓系多功能siNA构建体的非限定性实例。在该显示的实例中，接头(例如核苷酸或非核苷酸接头)将两siNA区域(例如两有义、两反义或者有义和反义区)连接在一起。对应于第一靶序列和第二靶序列的分开的有义(或有义和反义)序列杂交至该多功能diNA中它们对应的有义和/或反义区。此外，各种偶联物、配体、适体、聚合物或报告分子可被连接至接头区域用于筛选或改善输送和/或药物动力学性能。

[0421]图23显示了基于多功能siNA设计的各种树枝体的非限定性实例。

[0422]图24显示了各种超分子多功能siNA设计的非限定性实例。

[0423]图25显示了采用30核苷酸前体siNA构建体的激活dicer的多功能siNA设计的非限定性实例。30碱基对的双链体被Dicer从任一端切割为22和8碱基对的产物(8b.p.片段未示出)。为了便于说明，未显示通过dicer产生的突出，但是可补上。显示了三个靶序列。所需的交叠的序列一致性通过灰框指出。如果是在稳定化学方面测试，则母体30b.p.siNA的N为所建议的能实现Dicer切割的2’-OH位置的位点。值得注意的是，通过Dicer RNase III对30mer双链体的加工不给出精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产物(22+8为主要位点)。因此，通过Dicer的加工将产生一系列活性siNA。

[0424]图26显示了采用40核苷酸前体siNA构建体的激活dicer的多功能siNA设计的非限定性实例。40碱基对的双链体被Dicer从任一端切割为20碱基对的产物。为了便于说明，未显示通过dicer产生的突出，但是可补上。显示了四个靶序列。具有同源性的靶序列包在方框中。这种设计形式可扩展至更大的RNA。如果化学稳定的siNA被Dicer结合，则特意设置的核糖核苷酸键可使设计者得到切割产物，这为我们提供了更广泛的多功能设计空间。例如，不限于Dicer标准的约22核苷酸的切割产物可使得多功能siNA构建体具有靶序列一致性重叠，其范围为约3至约15核苷酸。

[0425]图27显示了本发明其它多功能siNA构建体设计的非限定性实例。在一个实例中，偶联物、配体、适体、标签或其它部分被连接至多功能siNA的区域，使得能够改善输送或药物动力学性能。

[0426]图28显示了本发明其它多功能siNA构建体设计的非限定性实例。在一个实例中，偶联物、配体、适体、标签或其它部分被连接至多功能siNA的区域，使得能够改善输送或药物动力学性能。

[0427]图29显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限定性实例，其可被用于合成本发明的胆固醇偶联的siNA分子。显示的实例带有连接至siNA分子有义链的5’端的胆固醇部分。

[0428]图30显示了采用不同siNA构建体在体外抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点262 RNA。

[0429]图31显示了采用不同siNA构建体在体外抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点263 RNA。

[0430]图32显示了采用不同siNA构建体在体外抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点1583 RNA。

[0431]图33显示了采用两不同siNA构建体在体外剂量依赖地抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中所述siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点1583 RNA。

[0432]图34显示了采用两不同siNA构建体在体外剂量依赖地抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中所述siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点1583 RNA。

[0433]图35显示了采用两不同siNA构建体在体外剂量依赖地抑制HBV S抗原(HBsAg)的非限定性实例，其中所述siNA构建体具有选择的修饰模式，其在选择的位置包括核糖核苷酸并靶向HBV位点262和263 RNA。

[0434]图36显示了采用靶向327、282和304 RNA的Stab 25和Stab29siNA构建体在体外剂量依赖地抑制HCV RNA表达的非限定性实例。

[0435]图37显示了采用LNP-086和LNP-061配制的带有不同突出化学的本发明siNA分子在小鼠中体内抑制HBV DNA的非限定性实例。相对于PBS对照评估活性LNP-086和LNP-061 siNA构建体。如图所示，带有2’-O-碱基突出的siNA构建体在该模型中提供了有效的抗HBV活性。

[0436]图38显示了在HBV复制小鼠体内HBV263M-LNP-086介导的血清HBV DNA水平降低的非限定性实例，其中所述小鼠被0.3、1或3mg/kg/天的剂量处理3天，并与对照siNA或PBS组比较。血清HBV DNA的水平在对照siNA和PBS处理组中相等，说明了抗HBV活性的序列特异性以及不存在非特异的脂质反应。

[0437]图39显示了在HBV复制小鼠体内HBV263M-LNP-086介导的血清HBV HBsAg水平降低的非限定性实例，其中所述小鼠被0.3、1或3mg/kg/天的剂量处理3天，并与对照siNA或PBS组比较。血清HBV HBsAg的水平在对照siNA和PBS处理组中相等，说明了抗HBV活性的序列特异性以及不存在非特异的脂质反应。

[0438]图40显示了小鼠HBV感染模型中siNA介导HBV水平下降的持续性的非限定性实例。HBV复制小鼠经HBV263M-LNP-086或HBV263Minv-LNP-086处理，剂量为3mg/kg/天，持续三天，然后在最后一次给药后第3、7和14天分析HBV血清滴度。如图所示，抗HBV活性是持久的，在第7天(2.0log10降低)和第14天(1.5log10降低)仍有显著活性。

[0439]图41显示了活性HBV263M-LNP-086制剂在小鼠HBV感染模型中介导的肝特异的HBV RNA切割的非限定性实例。复制HBV的小鼠经0.3、1、3、10mg/kg/天的剂量的HBV263M-LNP-086或者10mg/kg的HBV263invM-LNP对照处理，持续3天，在最后一次给药后的第三天确定肝HBV RNA的水平。与10mg/kg HBV263invM-LNP-086对照相比，观察到肝HBV RNA剂量依赖性减少，在10、3、1、和0.3mg/kg HBV263M-LNP处理组观察到90％、66.5％、18％和4％的减少。

[0440]图42显示了非限定性实例，其证实肝HBV RNA的减少是由于RNAi介导的对HBV RNA的切割。5’cDNA末端(RACE)快速扩增分析被用于检测预定位点的HBV RNA切割。HBV复制小鼠经HBV263M-LNP-086或HBV263Minv-LNP-086以3mg/kg/d的剂量处理3天。在最后一次剂量之后第3、7或14天处理动物，并分离总肝RNA。如果HBV RNA在预计的靶位点被切割，则衔接序列连接至RNA群的自由5’端以及随后用衔接序列和HBV特异的引物进行的RT-PCT被预期产生145bp的PCR产物。如图所示，在每个时间点在HBV263活性siNA处理的样品中都观察到预期的扩增产物，而在HBV263对照样品中不存在。然后将PCR产物亚克隆和测序，证实了衔接序列和HBV263siNA的预计切割位点的正确连接。该结果确认在肝脏中观察到的HBV RNA的减少是由于特异RNAi介导的对肝中HBV RNA的切割。此外，在第7和第14天时间点对特异HBV RNA切割产物的检测证实对HBV的持续siNA活性是由于对HBV RNA的持续切割。

[0441]图43显示了单一3mg/kg给药后在小鼠中确定的HBV263M-LNP-086的药物动力学性质的非限定性实例。杂交法被用于检测血浆和肝中HBV263M siNA随时间的变化。HBV263M在血浆中被快速清除，清除T_1/2为约1.7h。然而，在整个14天的取样期间在肝中都可检测到HBV263M，清除T_1/2为4天。在1小时时在肝中观察到最大的31.3±17.8ng/mg(均值±标准偏差)浓度，对应于siNA剂量的65±32％。在14天时，1.4±0.7％的剂量在肝中保持完好。小鼠模型中观察到的持久的siNA介导的抗HBV活性与肝中这种延长的驻留时间很好地相符。

本发明的详细说明

本发明核酸分子作用机制

[0442]以下的讨论论述了所提议的短干扰RNA介导的RNA干扰的机制，这是目前所已知的。这些讨论不意味着对本发明的限制，或者承认其为现有技术。申请人在本文经实，与siRNA分子相比，经化学修饰的短干扰核酸具有类似的或改善的介导RNAi的能力，并预期具有改善的体内稳定性和活性；因此，这种讨论不是仅限于siRNA，而是可应用于作为整体的siNA。“改善的介导RNAi的能力”或“改善的RNAi活性”指包括在体外和/或体内测量的RNAi活性，其中该RNAi活性反应了siNA介导RNAi的能力和本发明siNA的稳定性。在本发明中，与全RNA siRNA或含有多个核糖核苷酸的siNA相比，这些活性的产生在体外和/或体内可被增强。一些情况下，siNA分子的活性或稳定性可被降低(例如，少于10倍)，但是siNA分子的在体外和/或体内的总体活性被增强。

[0443]RNA干扰指动物中通过短干扰RNAs(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire et al.，1998，Nature，391，806)。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中也称为压制。转录后基因沉默的过程被认为是用于防止外来基因表达的进化上保守的细胞防御机制，为不同植物群和门所共有(Fire et al.，1999，Trendsgenet.，15，358)。这种防止外来基因表达可能是应答源自病毒感染或源自转座子元件随机整合进宿主基因组的双链RNAs(dsRNAs)生成而进化的，其通过特异破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应而实现。细胞中dsRNA的存在通过目前还未完全了解的机制触发RNAi反应。该机制看起来不同于干扰素反应，其源于dsRNA介导的蛋白激酶PKR和2′，5′-寡腺苷酸合成酶的活化导致核糖核酸酶L对mRNA的非特异性切割。

[0444]长dsRNAs在细胞中的存在刺激称为dicer的核糖核酸酶III的活化。dicer参与了将dsRNA加工为短片段的dsRNA，称为短干扰RNAs(siRNAs)(Berstein et al.，2001，Nature，409，363)。源于dicer活性的短干扰RNAs通常为约21至约23核苷酸长度，并包含约19碱基对双链体。dicer还参与了从参与翻译控制的结构保守的前体RNA切除21和22核苷酸的小暂时RNAs(stRNAs)(Hutvagner et al.，2001，Science，293，834)。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合体，通常称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其介导对具有序列互补于siRNA双链体反义链的单链RNA的切割。对靶RNA的切割发生在互补于siRNA双链体引导链的区域中间(Elbashir et al.，2001，genes Dev.，15，188)。此外，RNA干扰还可涉及小RNA(例如，小分子RNA或miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节细胞质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见，例如Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe et al.，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall et al.，2002，Science，297，2232-2237)。这样，本发明的siNA分子可被用于通过与RNA转录本相互作用或者通过与特定基因序列相互作用而介导基因沉默，其中这种相互作用在转录水平或者转录后水平上导致基因沉默。

[0445]已在各种系统中研究了RNAi。Fire et al.，1998，Nature，391，806首次在C.elegans中观察到RNAi。Wianny and Goetz，1999，Nature CellBiol.，2，70描述了小鼠胚胎中dsRNA介导的RNAi。Hammond et al.，2000，Nature，404，293描述了用dsRNA转染的Drosophila细胞中的RNAi。Elbashir et al.，2001，Nature，411，494描述了在包括人胚胎肾细胞和Hela细胞在内的培养哺乳动物细胞中通过引入合成的21核苷酸RNA双链体诱导的RNAi。最近在果蝇胚裂解物方面的工作揭示了对介导有效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列方面的要求。这些研究证实当含有3′-末端二核苷酸突出时21核苷酸siRNA双链体是最有活性的。此外，以2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全置换一条或两条siRNA消除了RNAi活性，然而以2′-脱氧核苷酸(2′-H)置换3′-末端siRNA突出核苷酸则被证实是可接受的。siRNA双链体中心内的错配序列也显示消除RNAi活性。此外，这些研究还表明，靶RNA中的切割位点由siRNA引导序列的5′-末端而不是引导序列的3′-末端确定(Elbashir et al.，2001，EMBOJ.，20，6877)。其它的研究已指出，siRNA双链体的靶互补链上的5′-磷酸为siRNA活性所需，以及ATP被用于维持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanenet al.，2001，Cell，107，309)；但是，当外源引入时，缺乏5′-磷酸的siNA分子是有活性的，提示siRNA构建体的5′-磷酸可以在体内产生。

本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)

[0446]在一个实施方案中，本发明描述了包括双链体形成寡核苷酸(DFO)的siNA分子，其可自组装为双链寡核苷酸。本发明的双链体形成寡核苷酸可被化学合成或从转录单元和/或载体表达。本发明DFO分子为各种治疗、诊断、农业、兽医、靶确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组学应用提供了有用试剂和方法。

[0447]在本文中，申请人证实某些寡核苷酸(为了方便，这里称为但不限于双链体形成寡核苷酸或DFO分子)为基因表达序列特异性调节的有效介导物。本发明的寡核苷酸与其它现有技术中已知的核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反义寡核苷酸等。)的区别在于，它们代表了一类线性多核苷酸序列，被设计为自组装成双链寡核苷酸，其中该双链寡核苷酸中的每条链包括互补于靶核酸分子的核苷酸序列。因此，本发明的核酸分子可自组装成功能性双链体，其中该双链体的每条链包括相同多核苷酸序列且每条链包括互补于靶核酸分子的核苷酸序列。

[0448]通常，通过组装两不同的寡核苷酸序列来形成双链寡核苷酸，其中一条链的寡核苷酸序列互补于另一链的寡核苷酸序列；这类双链寡核苷酸从两分开的寡核苷酸或者从单一分子组装而来，该单一分子自身折叠以形成双链结构，在该领域中通常称为发夹茎环结构(例如，shRNA或短发夹RNA)。这些现有技术中已知的双链寡核苷酸具有的共同特征在于双链体的每条链具有不同的核苷酸序列。

[0449]与现有技术中已知的双链核酸分子不同，本申请人已开发了新的可能在成本上有效的和简化的方法用于从单链或线性寡核苷酸起始形成双链核酸分子。根据本发明形成的双链寡核苷酸的两条链具有相同的核苷酸序列并且不彼此共价相连。这类双链寡核苷酸分子可通过现有技术中已知的方法和试剂容易地在合成后连接，并且处于本发明的范围内。在一个实施方案中，本发明的形成双链寡核苷酸的单链寡核苷酸(双链体形成寡核苷酸)包括第一区域和第二区域，其中第二区域包括第一区域中核苷酸序列的反向重复核苷酸序列，这样，该单链寡核苷酸自组装形成双链体寡核苷酸，其中该双链体的一条链的核苷酸序列与另一链的核苷酸序列相同。这类双链体形成寡核苷酸的非限定性实例显示在图14和15中。这些双链体形成寡核苷酸(DFOs)可任选地包括某些回文或重复序列，其中这类回文或重复序列存在于该DFO的第一区域和第二区域之间。

[0450]一个实施方案中，本发明描述了双链体形成寡核苷酸(DFO)分子，其中该DFO包括形成双链体的自身互补核酸序列，该核酸序列具有互补于靶核酸序列的核苷酸序列。该DFO分子可包括单一的自身互补序列或者来自这种自身互补序列的组装的双链体。

[0451]在一个实施方案中，本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)包括第一区域和第二区域，其中第二区域包括包含第一区域核苷酸序列的反向重复的核苷酸序列，这样，该DFO分子可组装形成双链体寡核苷酸。这类双链寡核苷酸可用作短干扰核酸(siNA)来调节基因表达。通过本发明DFO分子形成的双链寡核苷酸双链体的每条链可包括互补于靶核酸分子(例如，靶RNA)中相同核苷酸序列的核苷酸序列区域。

[0452]在一个实施方案中，本发明描述了单链DFO，其可组装成双链寡核苷酸。本申请人惊奇地发现带有自身互补的核苷酸区域的单链寡核苷酸可容易地组装成双链体寡核苷酸结构。这类DFO可组装成以序列特异的方式抑制基因表达的双链体。本发明的DFO分子可包括具有互补于第二区域核苷酸序列的核苷酸序列的第一区域，其中第一区域的序列互补于靶核酸(例如，RNA)。该DFO可形成双链寡核苷酸，其中该双链寡核苷酸的每一条链的一部分包括互补于靶核酸序列的序列。

[0453]在一个实施方案中，本发明描述了双链寡核苷酸，其中该双链寡核苷酸的两条链不彼此共价连接，以及其中该双链寡核苷酸的每条链包括互补于靶核酸分子或其部分(例如靶RNA靶)中的相同核苷酸序列。在另一实施方案中，该双链寡核苷酸的两条链共有至少约15、优选至少约16，17，18，19，20，或21核苷酸的相同核苷酸序列。

[0454]在一个实施方案中，本发明的DFO分子包括具有式DFO-I的结构：

5′-p-X Z X′-3′

其中Z包括回文或重复核酸序列，任选地具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)，长度例如为约2至约24的偶数个核苷酸(例如，约2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，或22或24核苷酸)，X代表长度例如为约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，X’代表与序列X或其部分有核苷酸序列互补性的长度例如为约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，p包含末端磷酸基团，可存在或不存在，以及其中序列X和Z独立地或合起来包含与靶核酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且其长度足以与靶核酸序列或其部分相互作用(例如碱基配对)。例如，X独立地包括约12至约21或更多(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)核苷酸长度的互补于靶RNA或其部分中的核苷酸序列的序列。在另一非限定性实例中，当X存在时，互补于靶或其部分(例如靶RNA靶)的核苷酸序列X和Z合起来的长度为约12至约21或更多(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)核苷酸。在另一非限定性实例中，当X不存在时，Z的互补于靶或其部分的核苷酸序列长度为约12至约24或更多核苷酸(例如，约12，14，16，18，20，22，24，或更多)。在一个实施方案中，X、Z和X’独立地为寡核苷酸，其中X和/或Z包括长度足以与靶或其部分(例如靶RNA靶)中的核苷酸序列相互作用(例如碱基配对)的核苷酸序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和Z、Z和X’、或X、Z和X’的长度相同或不同。

[0455]当本说明书中所描述的序列为“足够”长度以与另一序列相互作用，指该长度是这样的，两序列间形成的键(例如氢键)的数目足以使两序列在所关心的条件下形成双链体。这种条件可为体外(例如，用于诊断或测定目的)或体内(例如，用于治疗目的)。确定这种长度是简单和常规的事情。

[0456]在一个实施方案中，本发明描述了双链寡核苷酸构建体，其具有式DFO-I(a)：

5′-p-X Z X′-3′

3′-X′Z X-p-5′

其中Z包括回文或重复核酸序列，或具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复样核酸序列，长度例如为约2至约24的偶数个核苷酸(例如，约2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，或22或24核苷酸)，X代表长度例如为约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，X’代表与序列X或其部分有核苷酸序列互补性的长度例如为约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，p包含末端磷酸基团，可存在或不存在，以及其中每个X和Z独立地包含与靶核酸序列或其部分(例如，靶RNA靶)互补的核苷酸序列并且其长度足以与靶核酸序列或其部分相互作用(例如靶RNA靶)。例如，序列X可以独立地包括约12至约21或更多(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)核苷酸长度的互补于靶或其部分(例如，靶RNA靶)中的核苷酸序列的序列。在另一非限定性实例中，(当X存在时)互补于靶或其部分的核苷酸序列X和Z合起来的长度为约12至约21或更多(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)核苷酸。在另一非限定性实例中，当X不存在时，Z的互补于靶或其部分的核苷酸序列长度为约12至约24或更多核苷酸(例如，约12，14，16，18，20，22，24，或更多)。在一个实施方案中，X、Z和X’独立地为寡核苷酸，其中X和/或Z包括长度足以与靶或其部分(例如靶RNA靶)中的核苷酸序列相互作用(例如碱基配对)的核苷酸序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和Z、或Z和X’、或X、Z和X’的长度相同或不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，尤其是1，2，3或4个错配，其程度是这些错配不至于显著削弱双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0457]在一个实施方案中，本发明的DFO分子包括具有式DFO-II的结构：

5′-p-X X′-3′

其中每个X和X’独立地为约12核苷酸至约21核苷酸长度的寡核苷酸，其中X包含例如约12至约21核苷酸(例如，约12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度的核酸序列，X’包含与序列X或其部分有核苷酸序列互补性的长度例如为约12至约21核苷酸(例如，约12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，p包含末端磷酸基团，可存在或不存在，以及其中X包含与靶核酸序列(例如，靶RNA靶)或其部分互补的核苷酸序列并且其长度足以与靶核酸序列或其部分相互作用(例如碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定的双链寡核苷酸。

[0458]在一个实施方案中，本发明描述了双链寡核苷酸构建体，其具有式DFO-II(a)：

5′-p-X X′-3′

3′-X′X-p-5′

其中每个X和X’独立地为约12核苷酸至约21核苷酸长度的寡核苷酸，其中X包含例如约12至约21核苷酸(例如，约12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度的核酸序列，X’包含与序列X或其部分有核苷酸序列互补性的长度例如为约12至约21核苷酸(例如，约12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)的核酸序列，p包含末端磷酸基团，可存在或不存在，以及其中X包含与靶核酸序列或其部分(例如，靶RNA靶)互补的核苷酸序列并且其长度足以与靶核酸序列(例如，靶RNA靶)或其部分相互作用(例如碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定的双链寡核苷酸。在一个实施方案中，式II(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，尤其是1，2，3或4个错配，其程度是这些错配不至于显著削弱双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0459]在一个实施方案中，本发明描述了具有式DFO-I(b)的DFO分子：

5′-p-Z-3′

其中Z包含任选地包括一个或多个非标准的或经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复核酸序列，其有助于与其它核苷酸的碱基配对。Z的长度可例如足以与靶核酸(如靶RNA)分子的核苷酸序列相互作用(如碱基配对)，优选为至少12核苷酸，具体地约12至约24核苷酸(例如，约12，14，16，18，20，22或24核苷酸)。p代表末端磷酸基团，可存在或不存在。

[0460]在一个实施方案中，具有任何式DFO-I、DFO-I(a)、DFO-I(b)、DFO-II(a)或DFO-II的DFO分子可包含本文所述的化学修饰，没有限制，例如具有任何式I-VII的核苷酸、如表I中所描述的稳定化学物，或者在本文各个实施方案中所描述的任何其它经修饰的核苷酸和非核苷酸的组合。

[0461]在一个实施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)和DFO-I(b)的Z的DFO构建体中回文或重复序列或经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰碱基如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)包含化学修饰的核苷酸，它们能够与靶核酸序列的一部分相互作用(例如，可形成Watson Crick碱基配对或非Watson Crick碱基配对的经修饰碱基类似物)。

[0462]在一个实施方案中，本发明的DFO分子，例如具有式DFO-I或DFO-II的DFO，包含约15至约40核苷酸(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或40核苷酸)。在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含一个或多个化学修饰。在非限定性实例中，向本发明核酸分子引入经化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸提供了强大的工具，用于克服外源输送的未修饰RNA分子所固有的体内稳定性和生物利用度的潜在局限性。例如，经化学修饰的核酸分子的使用使得较低剂量的特定核酸分子能够达到预定的疗效，由于经化学修饰的核酸分子趋于具有更长的血清或细胞或组织半衰期。此外，不仅通过增加半衰期，还通过促进核酸分子靶向特定器官、细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可改善生物利用度和/或核酸分子效力。此外，即使在体外与天然/未经修饰的核酸分子相比(例如与未经修饰的RNA分子相比时)，经化学修饰的核酸分子的活性降低了，该经修饰的核酸分子的总体活性还可大于天然或未经修饰的核酸分子，这是由于该分子改善的稳定性、效力、作用持续时间、生物利用度和/或输送。

本发明多功能或多靶向的siNA分子

[0463]在一个实施方案中，本发明描述了包括多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子的siNA分子，其调节生物系统如细胞、组织或生物体中一个或多个靶基因的表达。本发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子可靶向一个以上不同的靶核酸分子(例如，靶和/或途径靶RNA和/或DNA序列)。本发明的多功能siNA分子可被化学合成或从转录单元和/或载体表达。本发明多功能siNA分子为各种人体应用、治疗、诊断、农业、兽医、靶确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组学应用提供了有用试剂和方法。

[0464]在本文中，申请人证实某些寡核苷酸(为了方便，这里称为但不限于多功能短干扰核酸或多功能siNA分子)为基因表达序列特异性调节的有效介导物。本发明的多功能siNA分子与其它现有技术中已知的核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的区别在于，它们代表了一类多核苷酸序列，被设计为该多功能siNA构建体中每条链包括互补于一个或多个靶核酸分子中不同核酸序列的核苷酸序列。因此，本发明的单一多功能siNA分子(通常双链分子)可靶向一个以上(例如2，3，4，5，或更多)不同的靶核酸靶分子。本发明的核酸分子还可靶向同一靶核酸序列的一个以上(例如2，3，4，5，或更多)的区域。这样，本发明的siNA分子可用于下调或抑制一个或多个靶核酸分子的表达。通过用一个多功能siNA构建体减弱或抑制一个以上靶核酸分子的表达，本发明的多功能siNA分子代表了一个潜在治疗剂，它们提供了对疾病(例如，血管生成)相关途径内的多个靶的同时抑制。这种同时抑制可提供协同治疗策略，无需分开的临床前和临床开发努力或复杂的管理机构批准程序。

[0465]采用靶向靶核酸分子(例如，靶RNA或DNA)的一个以上区域的多功能siNA分子预期可提供对基因表达的有力抑制。例如，本发明单一多功能siNA构建体可靶向靶核酸分子(例如，靶RNA或DNA)的保守和可变区，由此使得能下调或抑制例如不同的靶亚型或变体，以优化治疗效果和使毒性最小化，或者使得能靶向靶核酸分子的编码和非编码区。

[0466]通常，通过组装两不同的寡核苷酸形成双链寡核苷酸，其中一条链的寡核苷酸序列互补于另一链的寡核苷酸序列；这类双链寡核苷酸通常从两分开的寡核苷酸(如siRNA)组装而来。或者，可从自身折叠的单一分子(例如，shRNA或短发夹RNA)形成双链体。现有技术中已知这些双链寡核苷酸介导RNA干扰并且都具有通过特征，其中仅一个核苷酸区域(引导序列或反义序列)与靶核酸序列有互补性，另一链(有义序列)包含与靶核酸序列同源的核苷酸序列。通常，反义序列被保留在活性RISC复合体中并通过反义序列与靶序列的互补碱基配对引导靶RISC至靶核酸序列，用于介导序列特异的RNA干扰。现有技术中已知，在一些细胞培养系统中，某些类型的未经修饰siRNA可表现出“脱靶”效应。据推测，这种脱靶效应涉及siRNA的有义序列替代反义序列参与RISC复合体(参见，例如Schwarz et al.，2003，Cell，115，199-208)。这种情况下，有义序列被认为指导RISC复合体至不同于期望靶序列的序列(脱靶序列)，导致对脱靶序列的抑制。这些双链核酸分子中，每条链互补于不同的靶核酸序列。但是，受这些dsRNA影响的脱靶不是可完全预测的并且是非特异的。

[0467]与现有技术中已知的双链核酸分子不同，本申请人已开发了新的可能在成本上有效的和简化的方法，用于采用单一多功能siNA构建体下调或抑制一个以上靶核酸序列的表达。本发明的多功能siNA分子被设计为双链的或部分双链的，以便该多功能siNA的每条链或区的一部分互补于所选的靶核酸序列。这样，本发明的多功能siNA分子不限于靶向彼此互补的靶序列，而是靶向任何两不同的靶核酸序列。本发明的多功能siNA分子被如此设计，以致于该多功能siNA分子的每条链或区(互补于给定的靶核酸序列)为合适的长度(例如，例如约16至约28核苷酸长度，优选约18至约28核苷酸长度)以介导针对靶核酸序列的RNA干扰。靶核酸序列和该多功能siNA的链或区之间的互补性必需足以(至少约8碱基对)用于通过RNA干扰进行的对靶核酸序列的切割。本发明多功能siNA区域会使在某些siRNA序列(例如上文Schwarz等人中所描述的那些)中看到的脱靶效应最小化。

[0468]已报道，长度29碱基对和36碱基对之间的dsRNA(Tuschl et al.，国际PCT公开WO 02/44321)不介导RNAi。这些dsRNA无活性的一个原因可能是缺乏与靶RNA序列相互作用的链的周转或解离，以致于RISC复合体不能有效地与多拷贝的靶RNA相互作用，导致RNAi过程效力和有效性的显著降低。申请人惊奇地发现，本发明的多功能siNA可克服这个困难，能够增强RNAi过程的有效性和效力。这样，在本发明的一些实施方案中，可设计长度约29至约36碱基对的多功能siNA，使得该多功能siNA分子的每条链的一部分包括互补于靶核酸的核苷酸序列区，其长度足以有效介导RNAi(例如，约15至约23碱基对)，以及不互补于靶核酸的核酸序列区。通过在该多功能siNA的每条链中具有互补和非互补部分，该多功能siNA可介导针对靶核酸序列的RNA干扰，而不抑制周转或解离(例如，其中每条链太长而不能介导针对各自靶核酸序列的RNAi)。此外，本发明具有内部交叠区域的多功能siNA分子的设计使得多功能siNA分子的(减小的)大小有利于介导RNA干扰和很好地适合于用作治疗剂(例如，其中每条链独立地为约18至约28核苷酸长度)。非限定性实例显示在图16-28中。

[0469]在一个实施方案中，本发明多功能siNA分子包括第一和第二区域，其中该多功能siNA的第一区域包括互补于第一靶核酸分子的核酸序列的核苷酸序列，该多功能siNA分子的第二区域包括互补于第二靶核酸分子的核酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明多功能siNA分子包括第一和第二区域，其中该多功能siNA的第一区域包括互补于靶核酸分子第一区域的核酸序列的核苷酸序列，该多功能siNA分子的第二区域包括互补于该靶核酸分子第二区域的核酸序列的核苷酸序列。在另一实施方案中，该多功能siNA的第一区域和第二区域可包括分开的核酸序列，它们共有某种程度的互补性(例如约1至约10互补核苷酸)。在某些实施方案中，包括分开的核酸序列的多功能siNA构建体可通过现有技术中已知的方法和试剂在合成后容易地连接，这种连接的构建体位于本发明的范围内。或者，该多功能siNA的第一和第二区域可构成具有某种程度的自身互补的单一核酸序列，例如为发夹或茎环结构。这种双链和发夹多功能短干扰核酸的非限定性实例分别显示在图16和17中。这些多功能短干扰核酸(多功能siNAs)可任选地包括某些重叠核苷酸序列，其中这种重叠核苷酸序列存在于该多功能siNA的第一区域和第二区域之间(参见，例如图18和19)。

[0470]在一个实施方案中，本发明描述了多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中该多功能siNA的每条链独立地包括第一区域和第二区域，其中第一区域的核苷酸序列互补于不同靶核酸序列，第二区域的核酸序列不互补于靶序列。每条链的靶核酸序列位于相同靶核酸序列内或不同靶核酸序列内。

[0471]在另一实施方案中，多功能siNA包括两条链，其中：(a)第一条链包括与靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域1)和与靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域1)；(b)该多功能siNA的第二条链包括与靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域2)，其中该靶核酸序列不同于与第一链核苷酸序列有互补性的靶核苷酸序列，以及与互补性区域2的靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域2)；(c)第一链的互补性区域1包括互补于第二链的非互补性区域2中的核苷酸序列的核苷酸序列，以及第二链的互补性区域2包括互补于第一链的非互补性区域1中的核苷酸序列的核苷酸序列。互补性区域1和互补性区域2的靶核酸序列位于相同靶核酸分子中或位于不同靶核酸分子中。

[0472]在另一实施方案中，该多功能siNA包括两条链，其中：(a)第一条链包括与源于基因(例如第一基因)的靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域1)和与互补性区域1的靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域1)；(b)该多功能siNA的第二条链包括与源于基因(例如第一基因)的靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域2)，其中该基因不同于互补性区域1的基因，以及与互补性区域2的靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域2)；(c)第一链的互补性区域1包括互补于第二链的非互补性区域2中的核苷酸序列的核苷酸序列，以及第二链的互补性区域2包括互补于第一链的非互补性区域1中的核苷酸序列的核苷酸序列。

[0473]在另一实施方案中，该多功能siNA包括两条链，其中：(a)第一条链包括与源于基因(例如基因)的靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域1)和与互补性区域1的靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域1)；(b)该多功能siNA的第二条链包括与靶核酸序列有序列互补性的区域(互补性区域2)，其中该靶核酸序列不用于互补性区域1的靶核酸序列，但前提是互补性区域1的靶核酸序列和互补性区域2的靶核酸序列源于相同基因，以及与互补性区域2的靶核苷酸序列无序列互补性的区域(非互补性区域2)；(c)第一链的互补性区域1包括互补于第二链的非互补性区域2中的核苷酸序列的核苷酸序列，以及第二链的互补性区域2包括互补于第一链的非互补性区域1中的核苷酸序列的核苷酸序列。

[0474]在一个实施方案中，本发明描述了多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中该多功能siNA包括两互补性核酸序列，其中第一序列包括与第一靶核酸分子内核苷酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域，以及其中第二序列包括与相同靶核酸分子内不同核苷酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域。优选地，第一序列的第一区域还互补于第二序列的第二区域的核苷酸序列，以及第二序列的第一区域互补于第一序列的第二区域的核苷酸序列。

[0475]在一个实施方案中，本发明描述了多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中该多功能siNA包括两互补核酸序列，其中第一序列包括与第一靶核酸分子内核苷酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域，以及其中第二序列包括与第二靶核酸分子内不同核苷酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域。优选地，第一序列的第一区域还互补于第二序列的第二区域的核苷酸序列，以及第二序列的第一区域互补于第一序列的第二区域的核苷酸序列。

[0476]在一个实施方案中，本发明描述了包含第一区域和第二区域的多功能siNA分子，其中第一区域包含具有约18至约28核苷酸的互补于第一靶核酸分子内核酸序列的核酸序列，第二区域包含具有约18至约28核苷酸的互补于第二靶核酸分子内不同核酸序列的核苷酸序列。

[0477]在一个实施方案中，本发明描述了包含第一和第二区域的多功能siNA分子，其中第一区域包含具有约18至约28核苷酸的互补于靶核酸分子内核酸序列的核酸序列，第二区域包含具有约18至约28核苷酸的互补于相同靶核酸分子内不同核酸序列的核苷酸序列。

[0478]在一个实施方案中，本发明描述了双链多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中该多功能siNA的一条链包括与第一靶核酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域，以及另一条链包括与与第二靶核酸序列有核苷酸序列互补性的第一区域。第一和第二靶核酸序列可存在于分开的靶核酸分子中或者可为相同靶核酸分子内的不同区域。这样，本发明的多功能siNA分子可被用于靶向不同基因、相同基因的剪接变体、一个或多个基因转录本的突变和保守区或者相同或不同基因或基因转录本的编码和非编码区域。

[0479]在一个实施方案中，本发明的靶核酸分子编码单一蛋白。在另一实施方案中，靶核酸分子编码一种以上的蛋白(例如，1，2，3，4，5或更多的蛋白)。这样，本发明的多功能siNA构建体可被用于下调或抑制几种蛋白的表达。例如，多功能siNA分子在一条链中包含一区域，其与源于靶的第一靶核酸序列有核苷酸序列互补性，另一链包含一区域，其与存在于源于编码两蛋白(例如，两种不同蛋白)的基因的靶核酸分子中第二靶核酸序列有核苷酸序列互补性，该靶核酸分子可通过靶向多个途径靶基因而被用于下调、抑制或关闭特定生物学途径。

[0480]在一个实施方案中，本发明利用了存在于不同基因变体中的保守核苷酸序列。通过以这种方式设计多功能siNA，其中一条链包括互补于在各个靶基因家族成员之间保守的一个或多个靶核酸序列的序列，另一条链任选地包括互补于途径靶核酸序列的序列，就可能采用单一多功能siNA选择性地和有效地抑制疾病相关生物学途径中的靶基因。

[0481]在一个实施方案中，本发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子包括第一区域和第二区域，其中第一区域与第一靶的第一靶RNA有核苷酸序列互补性，第二区域与第二靶的第二靶RNA有核苷酸序列互补性。在一个实施方案中，第一区域和第二区域可包括互补于相同靶序列内不同靶位点的共有或保守RNA序列或者不同靶序列之间共有的RNA序列的核苷酸序列。

[0482]在一个实施方案中，本发明的双链多功能siNA分子包括具有式MF-I的结构：

5′-p-X Z X′-3′

3′-Y′Z Y-p-5′

其中每个5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’独立地为长度约20至约300核苷酸的寡核苷酸，优选约20至约200核苷酸、约20至约100核苷酸、约20至约40核苷酸、约24至约38核苷酸、或约26至约38核苷酸的长度；XZ包括互补于第一靶核酸序列的核酸序列；YZ为包含互补于第二靶核酸序列的核酸序列的寡核苷酸；Z包含自身互补的长度约1至约24核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，或24核苷酸)的核苷酸序列；X包含互补于区域Y’中存在的核苷酸序列的长度约1至约100核苷酸的核苷酸序列，优选约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度；Y包含互补于区域X’中存在的核苷酸序列的长度约1至约100核苷酸的核苷酸序列，优选约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度；每个p包含末端磷酸基团，其独立地存在或不存在；每个XZ和YZ的长度独立地为足以分别稳定地与第一和第二靶核酸序列或其部分相互作用(即碱基配对)。例如，每个X和Y可独立地包含约12至约21或更多核苷酸长度(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)的序列，其互补于不同靶核酸分子(如靶RNA)中的靶核苷酸序列或其部分。在另一非限定性实例中，互补于第一靶核酸序列或其部分的X和Z合起来的核苷酸序列长度为约12至约21或更多核苷酸(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)。在另一非限定性实例中，互补于第二靶核酸序列或其部分的Y和Z合起来的核苷酸序列长度为约12至约21或更多核苷酸(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)。在一个实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在另一实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在一个实施方案中，Z包含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，尤其是1，2，3或4个错配，其程度是不至于显著削弱双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0483]在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包括具有式MF-II的结构：

5′-p-X X′-3′

3′-Y′Y-p-5′

其中每个5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’独立地为长度约20至约300核苷酸的寡核苷酸，优选约20至约200核苷酸、约20至约100核苷酸、约20至约40核苷酸、约24至约38核苷酸、或约26至约38核苷酸的长度；X包括互补于第一靶核酸序列的核酸序列；Y为包含互补于第二靶核酸序列的核酸序列的寡核苷酸；X包含互补于区域Y’中存在的核苷酸序列的长度约1至约100核苷酸的核苷酸序列，优选约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度；Y包含互补于区域X’中存在的核苷酸序列的长度约1至约100核苷酸的核苷酸序列，优选约1至约21核苷酸(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21核苷酸)长度；每个p包含末端磷酸基团，其独立地存在或不存在；每个X和Y的长度独立地为足以分别稳定地与第一和第二靶核酸序列或其部分相互作用(即碱基配对)。例如，每个序列X和Y可独立地包含约12至约21或更多核苷酸长度(例如约12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或更多)的序列，其互补于不同靶核酸分子(如靶RNA)中的靶核苷酸序列或其部分。在一个实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在另一实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在一个实施方案中，Z包含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度相同。在另一实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，尤其是1，2，3或4个错配，其程度是不至于显著削弱双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0484]在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包括具有式MF-III的结构：

X X′

Y′-W-Y

其中每个X、X’、Y和Y’独立地为长度约15至约50核苷酸的寡核苷酸，优选约18至约40核苷酸，或约19至约23核苷酸；X包括互补于存在于区域Y’中的核苷酸序列的核苷酸序列；X’包括互补于存在于区域Y中的核苷酸序列的核苷酸序列；每个X和X’的长度独立地为足以分别稳定地与第一和第二靶核酸序列或其部分相互作用(即碱基配对)；W代表连接序列Y’和Y的核苷酸或非核苷酸接头；以及该多功能siNA指导通过RNAi对第一和第二靶序列的切割。在一个实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在另一实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在一个实施方案中，区域W连接Y’的3’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的3’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的5’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的5’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X’的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X’的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y’的5’端。在一个实施方案中，W通过生物可降解接头连接序列Y和Y’。在一个实施方案中，W还包括偶联物、标签、适体、配体、脂质或聚合物。

[0485]在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包括具有式MF-IV的结构：

X X′

Y′-W-Y

其中每个X、X’、Y和Y’独立地为长度约15至约50核苷酸的寡核苷酸，优选约18至约40核苷酸，或约19至约23核苷酸；X包括互补于存在于区域Y’中的核苷酸序列的核苷酸序列；X’包括互补于存在于区域Y中的核苷酸序列的核苷酸序列；每个Y和Y’的长度独立地为足以分别稳定地与第一和第二靶核酸序列或其部分相互作用(即碱基配对)；W代表连接序列Y’和Y的核苷酸或非核苷酸接头；以及该多功能siNA指导通过RNAi对第一和第二靶序列的切割。在一个实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于相同靶核酸分子中。在另一实施方案中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列存在于不同靶核酸分子中。在一个实施方案中，区域W连接序列Y’的3’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，区域W连接序列Y’的3’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接序列Y’的5’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接序列Y’的5’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X’的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y’的5’端。在一个实施方案中，W通过生物可降解接头连接序列Y和Y’。在一个实施方案中，W还包括偶联物、标签、适体、配体、脂质或聚合物。

[0486]在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包括具有式MF-V的结构：

X X′

Y′-W-Y

其中X、X’、Y和Y’独立地为长度约15至约50核苷酸的寡核苷酸，优选约18至约40核苷酸，或约19至约23核苷酸；X包括互补于存在于区域Y’中的核苷酸序列的核苷酸序列；X’包括互补于存在于区域Y中的核苷酸序列的核苷酸序列；每个X、X’、Y和Y’的长度独立地为足以分别稳定地与第一、第二、第三或第四靶核酸序列或其部分相互作用(即碱基配对)；W代表连接序列Y’和Y的核苷酸或非核苷酸接头；以及该多功能siNA指导通过RNAi对第一、第二、第三和/或第四靶序列的切割。在一个实施方案中，第一、第二、第三和第四靶核酸序列都存在于相同靶核酸分子中。在另一实施方案中，第一、第二、第三和第四靶核酸序列独立地存在于不同靶核酸分子(例如靶RNA或途径靶RNA)中。在一个实施方案中，区域W连接Y’的3’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的3’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的5’端和序列Y的5’端。在一个实施方案中，区域W连接Y’的5’端和序列Y的3’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列X’的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y的5’端。在一个实施方案中，末端磷酸基团存在于序列Y’的5’端。在一个实施方案中，W通过生物可降解接头连接序列Y和Y’。在一个实施方案中，W还包括偶联物、标签、适体、配体、脂质或聚合物。

[0487]在一个实施方案中，本发明多功能siNA分子(例如具有任何式MF-I至MF-V)的区域X和Y互补于不同的靶核酸序列，该不同靶核酸序列为相同靶核酸分子的各部分。在一个实施方案中，这类靶核酸序列位于RNA转录本编码区域内的不同位置。在一个实施方案中，这类靶核酸序列包括相同RNA转录本的编码和非编码区。在一个实施方案中，这类靶核酸序列包括可变剪接转录本的或这类可变剪接转录本前体的区域。

[0488]在一个实施方案中，具有任何式MF-I至MF-V的多功能siNA分子可包括本文所述的化学修饰而没有限制，例如具有本文所描述的任何式I-VII的核苷酸、如表1中所描述的稳定化学物，以及在本文各实施方案中所描述的任何其它经修饰的核苷酸和非核苷酸的组合。

[0489]在一个实施方案中，具有式MF-I或MF-II的多功能siNA构建体的Z中回文或重复序列或经修饰核苷酸(例如，具有经修饰碱基如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)包括能够与靶核酸序列的一部分相互作用的经化学修饰核苷酸(例如，可形成Watson Crick碱基配对或非WatsonCrick碱基配对的经修饰碱基类似物)。

[0490]在一个实施方案中，本发明多功能siNA分子，例如具有MF-I至MF-V的多功能siNA的每条链包含约15至约40核苷酸(例如，约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或40核苷酸)。在一个实施方案中，本发明多功能siNA分子包括一个或多个化学修饰。在非限定性实例中，向本发明核酸分子引入经化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸提供了强大的工具，用于克服外源输送的未修饰RNA分子所固有的体内稳定性和生物利用度的潜在局限性。例如，经化学修饰的核酸分子的使用使得较低剂量的特定核酸分子能够达到预定的疗效，由于经化学修饰的核酸分子趋于具有更长的血清或细胞或组织半衰期。此外，不仅通过增加半衰期，还通过促进核酸分子靶向特定器官、细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可改善生物利用度和/或核酸分子效力。此外，即使在体外与天然/未经修饰的核酸分子相比(例如与未经修饰的RNA分子相比时)，经化学修饰的核酸分子的活性降低了，但该经修饰的核酸分子的总体活性还可大于天然或未经修饰的核酸分子，这是由于该分子改善的稳定性、效力、作用持续时间、生物利用度和/或输送。

[0491]在另一实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中每条有义链的一个末端被栓系至另一siNA分子有义链的末端，这样，两反义siNA链退火至它们对应的在一末端彼此栓系的有义链(参见图22)。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0492]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一有义链的5’端被栓系至另一siNA分子有义链的5’端，使得退火至它们对应有义链(在一端彼此栓系)的两反义siNA链的5’端彼此背离(在相对方向)(参见图22(A))。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0493]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一有义链的3’端被栓系至另一siNA分子有义链的3’端，使得退火至它们对应有义链(在一端彼此栓系)的两反义siNA链的5’端彼此相向(参见图22(B))。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0494]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一有义链的5’端被栓系至另一siNA分子有义链的3’端，使得退火至它们对应有义链(在一端彼此栓系)的反义siNA链之一的5’端面向另一反义链的3’端(参见图22(C-D))。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0495]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一反义链的5’端被栓系至另一siNA分子反义链的3’端，使得退火至它们对应反义链(在一端彼此栓系)的有义siNA链之一的5’端面向另一有义链的3’端(参见图22(G-H))。在一个实施方案中，第一反义链的5’端和第二反义链的3’端被如此设计，使得可容易地切割(例如可生物降解接头)，这样该多功能siNA的每一反义链的5’端具有自由5’端，适合于介导基于RNA干扰的对靶RNA的切割。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0496]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一反义链的5’端被栓系至另一siNA分子反义链的5’端，使得退火至它们对应反义链(在一端彼此栓系)的有义siNA链之一的3’端面向另一有义链的3’端(参见图22(E))。在一个实施方案中，第一反义链的5’端和第二反义链的5’端被如此设计，使得可容易地切割(例如可生物降解接头)，这样该多功能siNA的每一反义链的5’端具有自由5’端，适合于介导基于RNA干扰的对靶RNA的切割。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0497]在一个实施方案中，本发明描述了多功能siNA，其中该多功能siNA是从两分开的双链siNA组装而来，其中该siNA的一反义链的3’端被栓系至另一siNA分子反义链的3’端，使得退火至它们对应反义链(在一端彼此栓系)的有义siNA链之一的5’端面向另一有义链的3’端(参见图22(F))。在一个实施方案中，第一反义链的5’端和第二反义链的5’端被如此设计，使得可容易地切割(例如可生物降解接头)，这样该多功能siNA的每一反义链的5’端具有自由5’端，适合于介导基于RNA干扰的对靶RNA的切割。栓系物或接头可为基于核苷酸的接头或基于非核苷酸的接头，这为现有技术中所公知的，并且在本文中有描述。

[0498]在任何上述实施方案中，第一靶核酸序列或第二靶核酸序列可独立地包括靶RNA、DNA或其部分。在一个实施方案中，第一靶核酸序列为靶RNA、DNA或其部分，第一靶核酸序列为靶RNA、DNA或其部分。在一个实施方案中，第一靶核酸序列为靶RNA、DNA或其部分，第一靶核酸序列为另一靶RNA、DNA或其部分。

核酸分子的合成

[0499]采用自动方法难以合成长度大于100核苷酸的核酸，因而这类分子的治疗成本过高。本发明中，小核酸基序(“小”指核酸基序不大于100核苷酸长度，优选不大于80核苷酸长度，最优选不大于50核苷酸长度；例如串联合成的单个siNA寡核苷酸序列或siNA序列)被优选用于外源输送。这些分子的简单结构增加了该核酸进入蛋白和/或RNA结构的靶向区域的能力。本发明示例性分子为化学合成的，其它的可类似合成。

[0500]采用现有技术中已知的方法合成寡核苷酸(例如，某些经修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸部分)，这些方法例如为在Caruthers et al.，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson et al.，国际PCT公开WO 99/54459，Wincott et al.，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott et al.，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan et al.，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，U.S.Pat.No.6,001,311中所描述的。通过参考将这些文献都并入本文。寡核苷酸的合成利用了常用的核酸保护和偶联基团，例如在5′端的二甲氧基三苯甲基和在3′端的亚磷酰胺。在非限定性实例中，在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行小规模的合成，采用0.2μmol规模的方法，对于2′-O-甲基化的核苷酸为2.5min的偶联步骤，对于2′-脱氧核苷酸或2′-脱氧-2′-氟核苷酸为45秒的偶联步骤。表III概述了用于该合成循环中的试剂量和接触时间。或者，可在96孔板合成仪(例如Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器)上进行0.2μmol规模的合成，对该循环有最低限度的修改。在每个2′-O-甲基残基的偶联循环中，相对于聚合物结合的5′-羟基可使用33倍过量(60μL的0.11M＝6.6μmol)的2′-O-甲基亚磷酰胺和105倍过量的S-乙基四唑(60μL的0.25M＝15μmol)。在每个脱氧残基的偶联循环中，相对于聚合物结合的5′-羟基可使用22倍过量(40μL的0.11M＝4.4μmol)的脱氧亚磷酰胺和70倍过量的S-乙基四唑(40μL的0.25M＝10μmol)。通过对三苯甲基部分的比色定量，在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上平均偶联产率确定为通常97.5-99％。用于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其它寡核苷酸合成试剂包括以下物质：脱三苯甲基溶液为二氯甲烷中的3％ TCA(ABI)；以THF中16％ N-甲基咪唑(ABI)和THF中10％乙酸酐/10％2，6-卢剔啶(ABI)进行加帽；以及氧化溶液为THF中16.9mM I₂、49mM吡啶、9％水(PerSeptive Biosystems，Inc.)。Burdick & Jackson合成级乙腈直接从试剂瓶使用。S-乙基四唑溶液(乙腈中0.25M)从得自American InternationalChemical，Inc.的固体制备。或者，对于引入硫代磷酸酯键，使用Beaucage试剂(乙腈中3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，乙腈中0.05M)。

[0501]基于DNA的寡核苷酸的脱保护如下进行：将聚合物结合的带三苯甲基寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶中，并在65℃悬浮在40％甲胺水溶液(1mL)中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持物去除上清。用1.0mL的EtOH:MeCN:H2O/3:1:1洗涤支持物三次、振荡，并将上清液加至第一上清中。含有寡核糖核苷酸的合并上清被干燥成白色粉末。在一个实施方案中，根据描述在US 6,995,259，US 6,686,463，US6,673,918，US 6,649,751，US 6,989,442，和USSN 10/190,359中的方法使本发明的核酸分子被合成、脱保护和分析，通过参考将这些文献都整体并入本文。

[0502]用于包括本发明某些siNA分子在内的RNA的合成方法按照在Usman et al.，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe et al.，1990，NucleicAcids Res.，18，5433；和Wincott et al.，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684 Wincott et al.，1997，Methods Mol.Bio.，74，59中描述的操作进行，并利用常用的核酸保护和偶联试剂，如5′端的二甲氧基和3′端的亚磷酰胺。在非限定性实例中，在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行小规模的合成，采用0.2μmol规模的方法，对于烷基甲硅烷基保护的核苷酸为2.5min的偶联步骤，对于2′-氧甲基化的核苷酸为2.5min的偶联步骤。表III概述了用于该合成循环中的试剂量和接触时间。或者，可在96孔板合成仪(例如Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器)上进行0.2μmol规模的合成，对该循环有最低限度的修改。在每个2′-O-甲基残基的偶联循环中，相对于聚合物结合的5′-羟基可使用33倍过量(60μL的0.11M＝6.6μmol)的2′-O-甲基亚磷酰胺和75倍过量的S-乙基四唑(60μL的0.25M＝15μmol)。在每个核糖残基的偶联循环中，相对于聚合物结合的5′-羟基可使用66倍过量(120μL的0.11M＝13.2μmol)的烷基甲硅烷基(核糖)保护的亚磷酰胺和150倍过量的S-乙基四唑(120μL的0.25M＝30μmol)。通过对三苯甲基部分的比色定量，在394Applied Biosystems，Inc.合成仪上平均偶联产率确定为通常97.5-99％。用于394AppliedBiosystems，Inc.合成仪的其它寡核苷酸合成试剂包括以下物质：脱三苯甲基溶液为二氯甲烷中的3％ TCA(ABI)；以THF中16％ N-甲基咪唑(ABI)和THF中10％乙酸酐/10％2，6-卢剔啶(ABI)进行加帽；以及氧化溶液为THF中16.9mM I₂、49mM吡啶、9％水(PerSeptive Biosystems，Inc.)。Burdick & Jackson合成级乙腈直接从试剂瓶使用。S-乙基四唑溶液(乙腈中0.25M)从得自American International Chemical，Inc.的固体制备。或者，对于引入硫代磷酸酯键，使用Beaucage试剂(乙腈中3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，乙腈中0.05M)。

[0503]RNA的脱保护采用两锅或一锅方法进行。对于两锅方法，聚合物结合的带三苯甲基寡核糖核苷酸被转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶中，并在65℃悬浮在40％甲胺水溶液(1mL)中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持物去除上清。用1.0mL的EtOH:MeCN:H2O/3:1:1洗涤支持物三次、振荡，并将上清液加至第一上清中。含有寡核糖核苷酸的合并上清被干燥成白色粉末。将碱基脱保护的寡核糖核苷酸重悬浮在无水TEA/HF/NMP溶液(1.5mL N-甲基吡咯烷酮、750μL TEA以及1mLTEA·3HF的溶液300μL，以提供1.4M HF的浓度)中并加热至65℃。1.5h后，用1.5M NH₄HCO₃淬灭寡聚体。在一个实施方案中，根据描述在US 6,995,259，US 6,686,463，US 6,673,918，US 6,649,751，US 6,989,442，和USSN 10/190,359中的方法使本发明的核酸分子被合成、脱保护和分析，通过参考将这些文献都整体并入本文。

[0504]或者，对于一锅方法，聚合物结合的带三苯甲基寡核糖核苷酸被转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶中，并在65℃悬浮在33％乙醇甲胺/DMSO：1/1(0.8mL)中15分钟。让小瓶冷却至室温，加入TEA·3HF(0.1mL)，将小瓶加热至65℃ 15分钟。在-20℃冷却样品，然后用1.5M NH₄HCO₃淬灭。

[0505]为了纯化带三苯甲基的寡聚体(trityl-on oligomers)，将淬灭的NH₄HCO₃溶液上样至经乙腈和随后的50mM TEAA预洗涤的含C-18柱子。在用水洗涤上样柱子后，RNA被0.5％TFA脱三苯甲基13分钟。然后再次用水洗涤柱子，与1M NaCl盐交换，并再次用水洗涤。接着用30％乙腈洗脱寡核苷酸。

[0506]平均的分步偶联产率通常>98％(Wincott et al.，1995 NucleicAcids Res.23，2677-2684)。本领域技术人员会意识到，合成规模可适合于比上述实例更大或更小，包括但不限于96孔板。

[0507]或者，本发明的核酸分子可分别合成并在合成后例如通过连接(Moore et al.，1992，Science 256，9923；Draper et al.，国际PCT公开号WO93/23569；Shabarova et al.，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellonet al.，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon et al.，1997，Bioconjugate Chem.8，204)或在合成和/或脱保护后通过杂交而结合在一起。

[0508]本发明的siNA分子还可通过本文实施例1中所描述的串联合成方法合成，其中两siNA链被合成为通过可切割接头分开的单一连续寡核苷酸片段或链，该接头随后被切割以提供杂交和允许siNA双链体的纯化的分开的siNA片段或链。该接头可为多核苷酸接头或非核苷酸接头。本文所述的siNA的这种串联合成可容易地改变为多孔/或多板合成平台，例如96孔或类似的较大的多孔平台。本文所描述的siNA的串联合成还可容易地适合于采用分批反应器、合成柱等的大规模合成平台。

[0509]siNA分子还可从两不同的核酸链或片段组装而来，其中一个片段包括有义区，另一片段包括RNA分子的反义区。

[0510]本发明的核酸分子可通过以核酸酶抗性基团修饰而被广泛修饰来增强稳定性，例如采用2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H修饰(关于综述，参见Usman and Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman etal.，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。siNA构建体可采用常用方法通过凝胶电泳纯化，或者通过高压液相色谱纯化(HPLC；参见Wincott等人，上文，通过参考将其整体并入本文)并在水中重悬浮。

[0511]在本发明的另一方面，本发明的siNA分子从插入DNA或RNA载体的转录单元表达。该重组载体可为DNA质粒或病毒质粒。表达siNA的病毒载体可基于但不限于腺相关病毒、反转录病毒、腺病毒或α病毒。能表达siNA分子的重组载体可按本文所述输送并保留在靶细胞中。或者，可使用瞬时表达siNA分子的病毒载体。

优化本发明核酸分子的活性

[0512]带有修饰(碱基、糖和/或磷酸)的化学合成核酸分子可防止它们被血清核糖核苷酸降解，可增加它们的效力(参见，例如Eckstein et al.，International Publication No.WO 92/07065；Perrault et al.，1990 Nature344，565；Pieken et al.，1991，Science 253，314；Usman and Cedergren，1992，Trends in Biochem.Sci.17，334；Usman et al.，国际公开号WO93/15187；and Rossi et al.，国际公开号WO 91/03162；Sproat，U.S.Pat.No.5,334,711；Gold et al.，U.S.Pat.No.6,300,074；以及Burgin等人，上文，通过参考将它们都并入本文)。所有上述文献都描述了可对本文核酸分子的碱基、磷酸和/或糖部分做出的各种化学修饰。希望这样的化学修饰，其增加它们在细胞中的有效性、从核酸分子除去碱基以缩短寡核苷酸合成时间并减少对化学制剂的要求。

[0513]现有技术中有一些实例描述了糖、碱基和磷酸修饰，它们可被引入到核酸分子中，限制增强它们的核酸酶稳定性和有效性。例如，通过采用核酸酶抗性基团的修饰，寡核苷酸被修饰以增强稳定性和/或增强生物学活性，例如采用2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H核苷酸碱基修饰(关于综述，参见Usman and Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman et al.，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin et al.，1996，Biochemtstry，35，14090)。现有技术中核酸分子的糖修饰被广泛描述(参见Eckstein et al.，International Publication PCT No.WO 92/07065；Perrault et al.Nature，1990，344，565-568；Pieken et al.Science，1991，253，314-317；Usman and Cedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman et al.International Publication PCT No.WO 93/15187；Sproat，U.S.Pat.No.5,334,711and Beigelman et al.，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman et al.，国际PCT公开WO 97/26270；Beigelman et al.，U.S.Pat.No.5,716,824；Usman et al.，U.S.Pat.No.5,627,053；Woolf et al.，国际PCT公开WO 98/13526；Thompson et al.，USSN 60/082,404 which was filed on April 20，1998；Karpeisky et al.，1998，Tetrahedron Lett.，39，1131；Earnshaw and Gait，1998，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)，48，39-55；Verma and Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；以及Burlina et al.，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010；在此通过参考将所有这些文献都整体并入本文)。这些出版物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等引入核酸分子的位置而不调节催化作用的常用方法和策略，通过参考将它们并入本文。鉴于这方面的指导，可使用本文所描述的类似修饰来修饰本发明的siNA核酸分子，只要siNA在细胞中促进RNAi的能力不被显著抑制。

[0514]在一个实施方案中，本发明的核酸分子被化学修饰，如US20050020521中所描述的，通过参考将其整体并入本文。

[0515]尽管寡核苷酸的核苷酸间键(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基磷酸酯键)的化学修饰改善了稳定性，但是过度的修饰可导致毒性或活性减弱。因此，当设计核酸分子时，这些核苷酸间键的量应最小化。这些键浓度的降低应减低毒性，导致这些分子增加的有效应和更高的特异性。

[0516]提供了维持或增强活性的具有化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。这种核酸还通常比未修饰核酸对核酸酶更有抗性。相应地，体外和/或体内活性应不显著降低。对于以调节为目的的情况，外源输送的治疗性核酸分子最好应该在细胞内稳定，直至靶RNA的翻译被调节足够长的时间来降低不希望蛋白的水平。取决于疾病状态，这段时间在数小时至数天范围内。RNA和DNA化学修饰的改进(Wincott et al.，1995，NucleicAcids Res.23，2677；Caruthers et al.，1992，Methods in Enzymology 211，3-19(通过参考并入本文))扩展了修饰核酸分子的能力，其通过引入核苷酸修饰来增强它们的核酸酶稳定性，如上所述。

[0517]在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括一个或多个G-clamp核苷酸。G-clamp核苷酸为被修饰的胞苷类似物，其中该修饰赋予双链体中互补性鸟苷的Watson-Crick和Hoogsteen面氢键结合的能力，例如参见Lin and Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc.，120，8531-8532。当与互补性寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内单个G-clamp类似物置换可导致显著增强的螺旋热稳定性和错配区分。在本发明核酸分子中包含这类核苷酸导致对核酸靶、互补序列或模板链增强的亲和力和特异性。在另一实施方案中，本发明的核酸分子包括一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)LNA“锁核酸”核苷酸，例如2′，4′-C亚甲基双环核苷酸(参见例如Wengel et al.，国际PCT公开WO 00/66604和WO 99/14226)。

[0518]在另一实施方案中，本发明描述了本发明siNA分子的偶联物和/或复合物。这类偶联物和/或复合物可被用于促进siNA分子输送进生物学系统，如细胞。本发明提供的偶联物和复合物可通过将治疗性化合物转移跨越细胞膜而赋予治疗活性，改变药物动力学，和/或调整本发明核酸分子的定位。本发明包括设计和合成新的偶联物和复合物，用于输送分子跨过细胞膜，包括但不限于小分子、脂质、胆固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、带负电荷的聚合物以及其它聚合物，如蛋白、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺。通常，所描述的运载体被设计为单独使用或者作为多组分系统的一部分使用，带有或不带有可降解接头。预期这些化合物会改善本发明核酸分子向源自不同组织的多种细胞类型的输送和/或定位，无论是存在或不存在血清(参见Sullengerand Cech，U.S.Pat.No.5,854,038)。本文描述的分子的偶联物可通过可降解接头(例如可生物降解核酸接头分子)被结合至生物学活性分子。

[0519]用在本文时，术语“可生物降解接头”指核酸或非核酸接头分子，其被设计为可生物降解接头以将一分子连接至另一分子，例如生物学活性分子至本发明siNA分子或本发明siNA分子的有义和反义链。该可生物降解接头被如此设计，使得其稳定性可出于特定目的而被调节，例如为了输送至特定组织或细胞类型。可采用多种化学物调节基于核酸的可生物降解接头的稳定性，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰核苷酸如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基、和其它2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸的组合。该可生物降解核酸接头分子可为二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸分子，例如约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20核苷酸长的寡核苷酸，或者可包含单个带有诸如亚磷酰胺或磷酸二酯键的基于磷的键的核苷酸。该可生物降解接头分子还可包括核酸骨架、核酸糖、或核酸碱基修饰。

[0520]用在本文时，术语“可生物降解的”指在生物学系统中的降解，例如酶学降解或化学降解。

[0521]用在本文时，术语“生物学活性分子”指能够在系统中引起或调节生物学反应的化合物或分子。本发明所关注的单独的或者与其它分子联合的生物学活性siNA分子的非限定性实例包括治疗性活性分子如抗体，胆固醇，激素，抗病毒剂，肽，蛋白，化疗剂，小分子，维生素，辅因子，核苷，核苷酸，寡核苷酸，酶核酸，反义核酸，三链体形成寡核苷酸，2，5-A嵌合体，siNA，dsRNA，同种异型酶，适体，诱骗剂以及它们的类似物。本发明的生物学活性分子还包括能够调节其它生物学活性分子的药物动力学和/或药效动力学的分子，例如脂质和聚合物，如聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其它聚醚。

[0522]用在本文时，术语“磷脂”指包含至少一个磷基团的疏水分子。例如，磷脂可包括含有磷的基团和饱和或不饱和烷基基团，任选地被OH、COOH、氧(oxo)、胺或者取代的或未取代的芳基基团所取代。

[0523]外源输送的治疗性核酸分子(例如，siNA分子)任选地在细胞内稳定，直至RNA的反转录被调节足够长的时间以降低RNA转录本的水平。核酸分子抗核酸酶以用作有效的细胞内治疗剂。本发明以及现有技术中所描述的核酸分子化学合成的改进扩展了核酸分子的能力，其通过引入核苷酸修饰来增强它们的核酸酶稳定性，如上所述的。

[0524]在另一实施方案中，提供了具有化学修饰并维持或增强参与RNAi的蛋白的酶学活性的siNA分子。这类核酸分子还通常比未修饰核酸分子对核酸酶更有抗性。因此，体内和/或体外活性不应显著降低。

[0525]通过提供组合治疗的可能性，使用本发明的基于核酸的分子会导致更好的治疗(例如，靶向不同基因的多siNA分子；与已知小分子调节剂偶联的核酸分子；或者用分子组合同时处理，包括不同基序和/或其它化学或生物学分子)。用siNA分子治疗个体还包括不同类型核酸分子的组合，例如酶学核酸分子(核酶)、同种异型酶、反义、2，5-A寡聚腺苷酸、诱骗剂和适体的组合。

[0526]在另一方面，本发明的siNA分子例如仅在有义siNA链、反义siNA链或两siNA链上包含一个或多个5′和/或3′-帽结构。

[0527]“帽结构”指化学修饰，其在寡核苷酸的任一端并入(参见，例如Adamic et al.，U.S.Pat.No.5,998,203，通过参考将其并入本文)。这些末端修饰防止外切核酸酶降解，可以帮助输送和/或在细胞内的定位。所述帽可以存在于5′末端(5′-帽)或者3′末端(3′-帽)，或者可以存在于两个末端。在非限定性实例中，5′-帽包括但不限于甘油基，反向脱氧无碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤藓呋喃糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-异戊烯呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸，3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向无碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向无碱基部分；磷酸1，4-丁二酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；磷酸氨基己酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或者桥接或非桥接甲基磷酸酯部分。帽部分的非限定性实例显示在图10中。

[0528]3′-帽的非限定性实例包括，但不限于，甘油基，反向脱氧无碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤藓呋喃糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；磷酸羟基丙酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-异戊烯呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；磷酸1，4-丁二酯；5′-氨基；桥接或非桥接5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥接或非桥接甲基磷酸酯和5′-巯基部分(对于更详细的细节，参见Beaucage and Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；通过参考将其并入本文)。

[0529]术语“非核苷酸”指可被并入核酸链取代一个或多个核苷酸单元的任何基团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，并允许剩余的碱基显示它们的酶学活性。该基团或化合物是无碱基的，因为即不含有通常认为的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，因此在1′位缺乏碱基。

[0530]“烷基”基团指饱和的脂族烃，包括直链、支链和环烷基基团。优选地，烷基基团具有1至12碳。更优选地，其为1至7碳、更优选1至4碳的低级烷基。烷基基团可被取代或未被取代。当被取代时，被取代的基团优选为羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂或N(CH₃)₂、氨基或SH。该术语还包括为不饱和烃基的烯基基团，含有至少一个碳碳双键，包括直链、支链和环状基团。优选地，烯基基团具有1至12碳。更优选地，其为1至7碳、更优选1至4碳的低级烯基。烯基基团可以为取代的或者未取代的。当被取代时，被取代的基团优选为羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂或N(CH₃)₂、氨基或SH。术语“烷基”还包括具有不饱和烃基的炔基基团，含有至少一个碳碳三键，包括直链、支链和环状基团。优选地，炔基基团具有1至12碳，更优选地，其为其为1至7碳、更优选1至4碳的低级炔基。炔基基团可以为取代的或者未取代的。当被取代时，被取代的基团优选为羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂或N(CH₃)₂、氨基或SH。

[0531]这类烷基基团还可以包括芳基、烷基芳基、碳环芳基、杂环芳基、酰胺和酯基团。“芳基”指芳香基团，其具有至少一个具有共轭π电子系统的环，可包括碳环芳基、杂环芳基和双芳基基团，它们都可以为任选取代的。芳基基团的优选取代基为卤素、三卤代甲基、羟基、SH、OH、氰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基和氨基基团。“烷基芳基”基团指共价连接至芳基(如上所述)的烷基基团。碳环芳基基团为这样的基团，其中芳香环的环原子都是碳原子。该碳原子任选地被取代。杂环芳基基团为具有1至3个杂原子作为芳香环中环原子且剩余环原子为碳原子的基团。适合的杂原子包括氧、硫、氮，并包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，都可任选地被取代。“酰胺”指-C(O)-NH-R，其中R为烷基、芳基、烷基芳基或氢。“酯”指-C(O)-OR′，其中R为烷基、芳基、烷基芳基或氢。

[0532]用在本文时，“核苷酸”为现有技术中所公认的，包括天然碱基(标准的)和现有技术中已知的经修饰碱基。这类碱基通常通常位于核苷酸糖部分的1′位。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸基团。核苷酸可在糖、磷酸和/或碱基部分经修饰或未经修饰(也可互换地称为核苷酸类似物、经修饰核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见，例如Usmanand McSwiggen，supra；Eckstein et al.，国际PCT公开WO 92/07065；Usman et al.，国际PCT公开WO 93/15187；Uhlman & Peyman，上文，通过参考将它们都并入本文)。现有技术中已知几种经修饰核酸碱基的实例，如Limbach et al.，1994，Nucleic Acids Res.22，2183所总结的。可被引入核酸分子的一些非限定性碱基修饰的实例包括次黄嘌呤核苷、嘧啶-4-酮、嘧啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin et al.，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，supra)。在这方面，“经修饰碱基”指不同于在1′位的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶或它们的等价物。

[0533]在一个实施方案中，本发明描述了经修饰的siNA分子，具有包含一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸脂、羧甲基、乙酰胺、聚酰胺、磺酸脂、磺胺、氨基磺酸脂、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代。关于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker and Leumann，1995，Modern Synthetic Methods，VCH，331-417中Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties，和Mesmaeker et al.，1994，CarbohydrateModifications in Antisense Research，ACS，24-39中Novel BackboneReplacements for Oligonucleotides。

[0534]“无碱基”指缺乏核苷酸碱基或在糖部分的1′位有氢原子(H)或其它非核苷酸碱基化学基团的糖部分，参见例如Adamic et al.，U.S.Pat.No.5,998,203。在一个实施方案中，本发明的无碱基部分为核糖、脱氧核糖或二脱氧核糖。

[0535]“未经修饰的核苷”指连接至β-D-核糖-呋喃糖1′碳的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿苷。

[0536]“经修饰的核苷”指在未经修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸的化学结构中含有修饰的任何核苷酸碱基。经修饰的核苷酸碱基的非限定性实例通过式I-VII示出和/或为本文描述的其它修饰。

[0537]关于为本发明而描述的2′-修饰核苷酸，“氨基”指2′-NH₂或2′-O-NH₂，其可为修饰的或未修饰的。这种经修饰的基团例如描述在Eckstein et al.，U.S.Pat.No.5,672,695和Matulic-Adamic et al.，U.S.Pat.No.6,248,878中，在此通过参考将它们整体并入本文。

[0538]可对核酸siNA结构进行各种修饰以增强这些分子的作用。这些修饰将增强包藏时间、体内半衰期、稳定性以及易于将这些寡核苷酸引入靶位点，例如增强对细胞膜的穿透，以及赋予识别并结合靶细胞的能力。

核酸分子的给药

[0539]本发明siNA分子可适合于单独或与其它治疗联合用于防止或治疗本文所述或现有技术中已知的与靶基因或靶途径基因表达有关的疾病、性状、病症和/或状况，和/或任何其它与细胞或组织中靶多核苷酸或由其表达的蛋白的水平有关或应答该水平的性状、疾病、病症和/或状况。在一个实施方案中，本发明的siNA分子和制剂或其组合物被给予细胞、个体或生物体，如本文所述或现有技术中已知的。

[0540]在一个实施方案中，本发明的siNA组合物可包含用于向个体给药的输送介质(包括脂质体)，载体和稀释剂和它们的盐，和/或可以药用制剂存在。在Akhtar et al.，1992，Trends Cell Bio.，2，139；DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer et al.，1999，Mol.Membr.Biol.，16，129-140；Hofland and Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；以及Lee et al.，2000，ACSSymp.Ser.，752，184-192中描述了输送核酸分子的方法，通过参考将它们都并入本文。Beigelman et al.，U.S.Pat.No.6,395,713和Sullivan et al.，PCT WO 94/02595还描述了输送核酸分子的一般方法。这些方法可被用于输送实际上任何核酸分子。可通过本领域技术人员已知的多种方法将核酸分子给予细胞，包括但不限于包囊进脂质体，通过例子电渗法，或通过包入其它载体如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如Gonzalez et al.，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang et al.，国际PCT公开WO 03/47518和WO 03/46185)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见，例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开US2002130430)中，可生物降解纳米胶囊和生物粘附微球，或者通过蛋白质性载体(O′Hare and Normand，国际PCT公开WO 00/53722)。在另一实施方案中，本发明的核酸分子还可与聚乙烯亚胺及其衍生物一起配制或者与其复合，该衍生物例如为聚乙烯亚胺-聚乙烯二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙烯二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一个实施方案中，本发明的核酸分子按美国专利申请公开20030077829中所述进行配制，在此将其整体并入本文。

[0541]在一个实施方案中，根据美国临时专利申请60/678,531和于2005年7月29日提交的相关的美国临时专利申请60/703,946、2005年11月15日提交的美国临时专利申请60/737,024和2006年2月14日提交的USSN11/353,630(Vargeese等人)，本发明的siNA分子被配制为组合物，在此通过参考将这些文献都整体并入本文。这类siNA制剂通常被称为“脂质核酸颗粒”(LNP)。在一个实施方案中，本发明的siNA与一种或多种本文表IV中描述的LNP组合物一起配制(参见上文USSN 11/353,630)。

[0542]在一个实施方案中，本发明的siNA分子和制剂或其组合物被给予肺组织和细胞，如在US 2006/0062758；US 2006/0014289；和US2004/0077540中所描述的。

[0543]在一个实施方案中，本发明的siNA分子与膜破坏剂复合，如美国专利申请公开20010007666所描述的膜破坏剂，在此通过参考将其整体并入本文，包括附图。在另一实施方案中，一种或多种膜破坏剂和siNA分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子复合，这些脂质例如为美国专利6,235,310中所描述的，在此通过参考将其整体并入本文，包括附图。

[0544]在一个实施方案中，本发明的siNA分子与美国专利申请公开2003077829和国际PCT公开WO 00/03683和WO 02/087541中所描述的输送系统复合，在此通过参考将它们整体并入本文，包括附图。

[0545]在一个实施方案中，如美国专利申请公开US-20050287551；US-20050164220；US-20050191627；US-20050118594；US-20050153919；US-20050085486；和US-20030158133中所描述的，本发明的siNA分子与输送系统复合，在此通过参考将这些文献都并入本文，包括附图。

[0546]在一个实施方案中，本发明的核酸分子通过端胶原(atelocollagen)复合或偶联(参见例如Takeshita et al.，2005，PNAS，102，12177-12182)被给予骨骼组织(例如，骨、软骨、腱、韧带)或骨转移瘤。因此，在一个实施方案中，本发明描述了一种或多种与端胶原复合为组合物的dsiNA分子。在另一实施方案中，本发明描述了通过本文或现有技术中已知的接头偶联至端胶原的siNA分子。

[0547]在一个实施方案中，本发明的核酸分子及其制剂(例如，本发明双链核酸分子的LNP制剂)通过肺部输送给药，例如通过吸入由吸入装置或喷雾器给予的气溶胶或喷雾干燥制剂，使核酸分子能快速局部吸收进相关肺组织。含有微粒化核酸组合物的可吸入干颗粒的固体颗粒组合物可通过研磨干或冻干核酸组合物然后穿过例如400目筛网来打碎或分离大团块而制备。包含本发明核酸组合物的固体颗粒组合物可任选地含有分散剂(其用于促进气溶胶的形成)以及其它治疗性化合物。适合的分散剂为乳糖，其可与核酸化合物以任何适合的比例如1比1重量比混合。

[0548]包含本发明核酸组合物的液体颗粒气溶胶可通过适合的方法产生，例如通过喷雾器(参见例如US 4,501,729)。喷雾器为可购得的装置，其将活性成分的溶液或悬浮液转化为治疗性气溶胶物，或者是通过压缩气体如空气或氧气的加速穿过窄文丘里孔，或者是通过超声振动。用在喷雾器中的合适制剂包括液体载体中的活性成分，其含量至多为40％w/w，优选小于制剂的20％ w/w。载体通常为水或稀释的水醇溶液，优选通过添加例如氯化钠或其它合适的盐而与体液等渗。如果制剂不是无菌制备的，则任选的添加剂包括防腐剂，例如羟基苯甲酸乙酯、抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和乳化剂以及其它配制表面活性剂。包含活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶也可用任何固体颗粒气溶胶发生器产生。如以上所阐明的，用于向个体给予固体颗粒治疗剂的气溶胶发生器产生可吸入颗粒，并以适合于人给药的速率产生一定体积的含有预定剂量治疗性组合物的气溶胶。

[0549]在一个实施方案中，本发明的固体颗粒气溶胶发生器为吸入器。适合于通过吸入器给药的制剂包括可通过吸入器输送的细粉的粉末。在吸入器中，有效进行本文所述治疗的粉末(例如，其一定剂量)被包含在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，它们在原位被刺穿或打开，粉末在吸气时通过穿过装置的空气被输送，或者通过手动操作泵输送。吸入器中采用的粉末仅由活性成分构成或者由包含活性成分、适合的粉末稀释剂如乳糖以及任选的表面活性剂的粉末混合物构成。活性成分通常构成制剂的0.1至100w/w。另一类型的例证性气溶胶发生器包括剂量计量吸入器。剂量计量吸入器为加压的气溶胶分散器，通常含有活性成分在液化的推进剂中的悬浮液或溶液制剂。使用中，这些装置通过适合于输送计量量的阀释放制剂，以产生含有活性成分的细颗粒喷雾。适合的推进剂包括某些含氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和它们的混合物。所述制剂可任选地包含一种或多种共溶剂如乙醇，乳化剂和其它制剂表面活性剂如油酸或去水山梨糖醇三油酸酯，抗氧化剂和适合的调味剂。其它的用于肺输送的方法例如描述在美国专利申请20040037780和美国专利6,592,904；6,582,728；6,565,885中，通过参考将它们都并入本文。

[0550]在一个实施方案中，本文提供的用于肺输送的siNA和LNP组合物和制剂还包括一种或多种表面活性剂。合适的用于增强本发明组合物摄取的表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及全长和截短形式的表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B、表面活性剂蛋白C、表面活性剂蛋白D和表面活性剂蛋白E、二饱和的磷脂酰胆碱(不同于二棕榈酰的)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱、脱氢表雄酮、多萜醇、硫脂酸、甘油-3-磷酸、磷酸二羟丙酮、甘油、甘油-3-磷酸胆碱、二羟基丙酮、棕榈酸酯、胞苷二磷酸(CDP)二酰基甘油、CDP胆碱、胆碱、磷酸胆碱；以及为表面活性剂组分ω-3脂肪酸、多烯酸(polyenic acid)、多烯酸(polyenoic acid)、卵磷脂、棕榈酸、乙烯或丙烯氧化物的非离子嵌段共聚物、单节或多节聚氧丙烯、单节或多节聚氧乙烯、带有葡聚糖和/或烷醇基侧链的聚(乙烯胺)、Brij 35、Triton X-100和合成表面活性剂ALEC、Exosurf、Survan和Atovaquone等天然载体介质的天然和人造片层体(lamelar body)。这些表面活性剂可以单独使用，或者作为制剂中多组分表面活性剂的一部分使用，或者作为本发明药物组合物的核酸组分5′和/或3′端的共价结合添加物使用。

[0551]本发明的组合物可以作为包含可吸入大小的颗粒的制剂被给药至呼吸系统，例如颗粒大小足够小以在吸入时穿过鼻、口和喉以及穿过肺的支气管和肺泡。通常，可吸入颗粒大小在约0.5至10微米。包括在气溶胶中的不可吸入大小的颗粒趋于沉积在喉中并咽下，因而气溶胶中的不可吸入颗粒的量应最小化。对于鼻内给药，10-500um范围的颗粒大小是优选的，以确保在鼻腔内保留。

[0552]在一个实施方案中，按现有技术中所公知的方法，本发明的siNA分子和制剂或其组合物被给予至肝脏(参见，例如Wen et al.，2004，World J.Gastroenterol.，10，244-9；Murao et al.，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu et al.，2003，gene Ther.，10，180-7；Hong et al.，2003，JPharmPharmacol.，54，51-8；Herrmann et al.，2004，Arch Virol.，149，1611-7；以及Matsuno et al.，2003，gene Ther.，10，1559-66)。

[0553]在一个实施方案中，本发明描述了使用将本发明核酸分子输送至中枢神经系统和/或外周神经系统的方法。试验已经证实神经元对核酸的有效体内摄取。作为局部给予核酸至神经细胞的实例，Sommer etal.，1998，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，8，75描述了一项研究，其中针对c-fos的15mer硫代磷酸酯反义核酸分子通过微注射进脑而向大鼠给药。以四甲基若丹明异硫氢酸盐(TRITC)或异硫氢酸荧光素(FITC)标记的反义分子在注射后30分钟被神经元专门摄取。在这些细胞中观察到散布的细胞质染色和细胞核染色。作为核酸系统给药至神经细胞，Epa etal.，2000，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，10，469描述了活体小鼠研究，其中β-环糊精-金刚烷胺-寡核苷酸偶联物被用于靶向神经分化的PC12细胞中p75神经营养因子受体。在两周IP给药后，在背根神经节(DRG)细胞中观察到对p75神经营养因子受体反义核酸的显著摄取。此外，在DRG神经元中观察到显著的和持续的p75下调。其它的将核酸靶向神经元的方法描述在Broaddus et al.，1998，J.Neurosurg.，88(4)，734；Karle et al.，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannai et al.，1998，Brain Research，784(1，2)，304；Rajakumar et al.，1997，Synapse，26(3)，199；Wu-pong et al.，1999，BioPharm，12(1)，32；Bannai et al.，1998，Brain Res.Protoc.，3(1)，83；Simantov et al.，1996，Neuroscience，74(1)，39中。因此，本发明的核酸分子适合于输送至表达重复膨胀等位基因变体(repeat expansion allelicvariants)的细胞并由其摄取，以调节RE基因表达。通过各种不同的策略使本发明的核酸分子的输送靶向RE。可使用的向CNS输送的传统方法包括但不限于鞘内和脑室内给药、导管和泵的植入、在损伤或损害位点的直接注射或灌注、注射进脑动脉系统、或者通过血脑屏障的化学或渗透开放。其它的方法可包括使用各种运输和载体系统，例如通过使用偶联物和可生物降解聚合物。此外，例如在Kaplitt et al.，US 6,180,613和Davidson，WO 04/013280中描述的基因治疗方法可被用于在CNS中表达核酸分子。

[0554]通过各种不同的策略使本发明的核酸分子的输送靶向CNS。可使用的向CNS输送的传统方法包括但不限于鞘内和脑室内给药、导管和泵的植入、在损伤或损害位点的直接注射或灌注、注射进脑动脉系统、或者通过血脑屏障的化学或渗透开放。其它的方法可包括使用各种运输和载体系统，例如通过使用偶联物和可生物降解聚合物。此外，例如在Kaplitt et al.，US 6,180,613和Davidson，WO 04/013280中描述的基因治疗方法可被用于在CNS中表达核酸分子。

[0555]在一个实施方案中，用于治疗眼科状况(例如，黄斑变性、糖尿病性视网膜病等)化合物、分子或组合物被眼内给予个体或者通过眼内手段给予个体。在其它实施方案中，用于治疗眼科状况(例如，黄斑变性、糖尿病性视网膜病等)化合物、分子或组合物被眼周给予个体或通过眼周手段给予个体(参见，例如Ahlheim et al.，国际PCT公开WO 03/24420)。在一个实施方案中，siNA分子和/或制剂或其组合物被眼内给予个体或通过眼内手段给予个体。在另一实施方案中，siNA分子和/或制剂或其组合物被眼周给予个体或通过眼周手段给予个体。眼周给药通常提供了较小侵入性的向个体给予siNA分子和制剂或其组合物的方法(参见，例如Ahlheim et al.，国际PCT公开WO 03/24420)。眼周给药的使用还最大限度降低了视网膜剥离的风险，使得能够更频繁的给药，提供了对黄斑变性和其它眼科状况给药的临床适用途径，并且还提供了使用储库(例如，植入物、泵或其它手段)输送药物的可能性。在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物被局部给药，例如通过眼内或眼周手段，如注射、离子电渗法(参见，例如WO 03/043689和WO 03/030989)、植入法约每1-50周一次(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50周一次)，其单独使用或者与本文所述其它化合物和/或疗法联合。在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物被系统给药(例如，通过静脉内、皮下、肌内、灌注、泵、植入物等)，约每1-50周一次(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50周一次)，其单独使用或者与本文所述和/或现有技术中已知的其它化合物和/或疗法联合。

[0556]在一个实施方案中，本发明描述了使用将本发明核酸分子输送至包括单核细胞和淋巴细胞在内的造血细胞的方法。这些方法在Hartmann et al.，1998，J.Phamacol.Exp.Ther.，285(2)，920-928；Kronenwett et al.，1998，Blood，91(3)，852-862；Filion and Phillips，1997，Biochim.Biophys.Acta.，1329(2)，345-356；Ma and Wei，1996，Leuk.Res.，20(11/12)，925-930；和Bongartz et al.，1994，Nucleic Acids Research，22(22)，4681-8中有详细描述。上述的这类方法包括使用自由寡核苷酸、阳离子脂质制剂、包括pH敏感脂质体和免疫脂质体在内的脂质体制剂以及包括偶联至基因融合肽(fusogenic peptide)的核苷酸在内的生物偶联物来以寡核苷酸转染造血细胞。

[0557]在一个实施方案中，在适合于给药的情况下，通过siNA分子与内耳细胞、组织或诸如耳蜗的结构接触，将本发明的siNA分子和组合物向内耳给药。在一个实施方案中，所述给药包括US Patent Nos.5,421,818，5,476,446，5,474,529，6,045,528，6,440,102，6,685,697，6,120,484；和5,572,594(通过参考将它们都并入本文)中描述的方法和装置，以及Silverstein，1999，Ear Nose Throat J.，78，595-8，600；和Jacksonand Silverstein，2002，Otolaryngol Clin North Am.，35，639-53中的指导，并加以改变来使用本发明的siNA分子。

[0558]在一个实施方案中，本发明的siNA分子和制剂或其组合物因而被直接或局部(例如，局部地)向真皮或滤泡给药，如现有技术中所公知的(参见，例如Brand，2001，Curr.Opin.Mol.Ther.，3，244-8；Regnier etal.，1998，J.Drug Target，5，275-89；Kanikkannan，2002，BioDrugs，16，339-47；Wraight et al.，2001，Pharmacol.Ther.，90，89-104；和Preat andDujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子和制剂或其组合物采用包含醇(例如，乙醇或异丙醇)、水并任选地包括其它诸如豆蔻酸异丙酯和卡波母980的水醇凝胶制剂而被直接或局部给药

[0559]在一个实施方案中，本发明的siNA通过离子渗入法被例如给予特定器官或区室(例如，眼、眼后部、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等)。离子渗入输送的非限定性实例例如描述在WO 03/043689和WO 03/030989中，在此通过参考将它们整体并入本文。

[0560]在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物被系统或局部给药，约每1-50周一次(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50周一次)，其单独使用或者与本文所述其它化合物和/或疗法联合。在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物被系统(例如，通过静脉内、皮下、肌内、灌注、泵、植入物等)给药，约每1-50周一次(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50周一次)，其单独使用或者与本文所述和/或现有技术中已知的其它化合物和/或疗法联合。

[0561]在一个实施方案中，本发明的输送系统包括例如含水和无水凝胶、乳剂、多层乳剂、微乳剂、脂质体、软膏、含水和无水溶液、洗剂、气溶胶、碳氢化合物基质和粉末，并且可含有辅剂如增溶剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)以及亲水聚合物(例如，聚卡波菲和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用载体为脂质体或透皮增强剂。可用在本发明中的脂质体的实例包括：(1)CellFectin，阳离子脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈酰精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1.5(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE的2:1(M/M)脂质体制剂(GlenResearch)；(3)DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三甲基-铵甲基硫酸盐)(Boehringer Manheim)；以及(4)Lipofectamine，具阳离子脂质和中性脂质DOPE的3:1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)。

[0562]在一个实施方案中，本发明的输送系统包括贴剂、片剂、栓剂、引导栓剂、凝胶和乳剂，并且可含有辅剂，例如稳定剂和增强剂(例如，聚乙二醇、胆汁盐和氨基酸)以及其它载体(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及亲水聚合物，如羟丙甲基纤维素和透明质酸)。

[0563]在一个实施方案中，本发明的siNA分子与聚乙烯亚胺(例如线性或分枝PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物(包括接枝PEI如半乳糖PEI，胆固醇PEI，抗体衍生的PEI，以及其聚乙二醇(PEG-PEI)衍生物PEI)一起配制或复合(参见，例如Ogris et al.，2001，AAPA PharmSci，3，1-11；Furgeson etal.，2003，Bioconjugate Chem.，14，840-847；Kunath et al.，2002，Phramaceutical Research，19，810-817；Choi et al.，2001，Bull.KoreanChem.Soc.，22，46-52；Bettinger et al.，1999，Bioconjugate Chem.，10，558-561；Peterson et al.，2002，Bioconjugate Chem.，13，845-854；Erbacheret al.，1999，Journal of gene Medicine Preprint，1，1-18；Godbey et al.，1999.，PNAS USA，96，5177-5181；Godbey et al.，1999，Journal ofControlled Release，60，149-160；Diebold et al.，1999，Journal of BiologicalChemistry，274，19087-19094；Thomas and Klibanov，2002，PNAS USA，99，14640-14645；和Sagara，US 6,586,524，通过参考将它们并入本文)。

[0564]在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括生物偶联物，例如Vargeese等人于2003年4月30日提交的USSN 10/427,160；US 6,528,631；US 6,335,434；US 6,235,886；US 6,153,737；US 5,214,136；US 5,138,045中所描述的核酸偶联物，通过参考将这些文献都并入本文。

[0565]因此，本发明描述了在可接受载体如稳定剂、缓冲剂等中包含一种或多种本发明核酸的药物组合物。本发明的多核苷酸可被给予(例如，RNA、DNA或蛋白)并通过任何标准手段引入个体中，带有或不带有稳定剂、缓冲剂等以形成药物组合物。当希望使用脂质体输送机制时，可按照标准方法形成脂质体。本发明的组合物还可被配制为并用作乳剂、凝胶、喷雾剂、油和其它适合的组合物，用于局部、皮肤或透皮给药，如现有技术中所已知的。

[0566]本发明还包括所述化合物的药用制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸加合盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。

[0567]药物组合物或制剂指适合于给药(例如系统或局部地)至细胞或个体(包括例如人)形式的组合物或制剂。适合的形式部分地取决于进入途径，例如口服、透皮或通过注射。这类形式应不妨碍所述组合物或制剂到达靶细胞(即，希望带负电荷核酸向其输送的细胞)。例如，注射进血流的药物组合物应该是可溶的。其它因素为现有技术中已知，包括对诸如毒性和妨碍组合物或制剂发挥它们作用的形式的考虑。

[0568]在一个实施方案中，本发明的siNA分子通过在药物可接收的组合物或制剂中系统给药而给予个体。“系统给药”指活体内药物在血流中系统吸收或积累，然后分布至整个身体。引起系统吸收的给药途径包括但不限于：静脉内、皮下、门静脉、腹膜内、吸入、口腔、肺内和肌内。这些给药途径中的每一个都使本发明的siNA分子暴露于可接触的疾病组织(如肺)。药物进入循环的速率已被证实为分子量或大小的函数。包含本发明化合物的脂质体或其它药物载体的使用可潜在地例如在某些组织类型(例如网状内皮系统，RES)中定位药物。可促进药物与细胞表面结合的脂质体制剂也是有益的。通过利用巨噬细胞和淋巴免疫细胞识别异常细胞的特异性，这种方法可增强药物向靶细胞的输送。

[0569]“药物可接收的制剂”或“药物可接收的组合物”指能使本发明的核酸分子有效分布在最适合于它们活性的身体位置的组合物或制剂。适合于配制本发明核酸分子的试剂的非限定性实例包括：P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)；可生物降解聚合物，如用于缓释输送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球(Emerich，DF et al，1999，Cell Transplant，8，47-58)；以及荷载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。用于本发明核酸分子的输送策略的其它非限定性实例包括Boado et al.，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler et al.，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge et al.，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada et al.，1998，NucleicAcids Res.，26，4910-4916；和Tyler et al.，1999，PNAS USA.，96，7053-7058中描述的材料。

[0570]本发明还描述了使用包含表面修饰的脂质体和本发明核酸分子的组合物，其中所述脂质体含有聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰的，或持久循环脂质体或隐性脂质体)。这些制剂提供了增强药物(例如siNA)在靶组织中积累的方法。这类药物载体抗调理作用以及单核系统(MPS或RES)的清除，由此使得被包囊的药物能有更长的血液循环时间和增加的组织接触(Lasic et al.Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata et al.，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。这类脂质体已被证实选择性地在肿瘤中聚集，推测是由于在心血管生成靶组织中外渗和捕获(Lasic etal.，Science 1995，267，1275-1276；Oku et al.，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。持久循环的脂质体增强了DNA和RNA的药物动力学和药效动力学，尤其是与已知在MPS的组织中积累的传统阳离子脂质体相比(Liu et al.，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870；Choi et al.，国际PCT公开WO 96/10391；Ansell et al.，国际PCT公开WO 96/10390；Holland et al.，国际PCT公开WO 96/10392)。基于它们能够避免在代谢活跃组织如肝和脾中积累，持久循环脂质体还很可能保护药物免于核酸酶降解，与阳离子脂质体相比其保护程度更高。

[0571]在一个实施方案中，本发明的脂质体制剂包含与US 6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；US6,586,001；6,120,798；US 6,977,223；US 6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；US 2006/0019912；US 2006/0019258；US 2006/0008909；US2005/0255153；US 2005/0079212；US 2005/0008689；US 2003/0077829，US 2005/0064595，US 2005/0175682，US 2005/0118253；US2004/0071654；US 2005/0244504；US 2005/0265961以及US2003/0077829中描述的化合物和组合物一起配制或复合的本发明的双链核酸分子(如，siNA)，在此通过参考将这些文献都整体并入本文。

[0572]本发明还包括为储存或给药制备的组合物，其在药物可接收的载体或稀释剂中包括治疗有效量的期望化合物。治疗应用可接收的载体或稀释剂在制药学领域中是已知的，并且例如在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中有说明，在此通过参考将其并入本文。例如，可提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。

[0573]药学上有效剂量是防止、抑制疾病状态发生或治疗(减轻症状至某种程度，优选所有症状)疾病状态所需的剂量。药学上有效剂量取决于疾病类型、所用的组合物、给药途径、治疗的动物类型、所关心的特定动物的身体特征、同期的治疗以及药学领域技术人员了解的其它因素。通常，活性成分以0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的量给药，这取决于带负电荷聚合物的效力。

[0574]本发明的核酸分子和其制剂可以以含有常规无毒性的药物可接收的载体、佐剂和/或介质的单位剂量制剂通过口腔、局部、胃肠外、通过吸入或喷雾、或者直肠给药。用在本文时，术语胃肠外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内或鞘内注射或灌注技术等。此外，提供了包含本发明的核酸分子和药物可接收的载体的药物制剂。本发明的一种或多种核酸分子可与一种或多种无毒性的药物可接收的载体和/或稀释剂和/或佐剂结合而存在，并且如果需要，还有其它活性成分。含有本发明核酸分子的药物组合物可为适合于口服的形式，例如作为片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。

[0575]计划用于口服的组合物可根据现有技术中已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，这类组合物可含有一种或多种甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以便提供药学上精致的和适口的制剂。片剂含有与无毒性的药物可接收的辅剂(其适合于制备片剂)混合的活性成分。这些辅剂可例如为惰性稀释剂；例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或膦酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可为不加包衣的或它们可通过已知技术加有包衣。一些情况下，这些包括可通过已知技术制备，以延缓崩解和在胃肠道内的吸收，由此在更长时间提供持续的作用。例如，可采用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。

[0576]用于口服的制剂还可作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油性介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

[0577]水混悬液含有与适合于制备水混悬液的辅剂混合的活性材料。这类辅剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可为天然产生的磷脂，例如卵磷脂或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸脂，或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七碳乙烯氧十六醇，或环氧乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸脂。水混悬液还可包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。

[0578]可通过将活性成分混悬在诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油的植物油中，或诸如液体石蜡的矿物油中而配制油混悬液。油混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂和调味剂以提供适口的制剂。这些组合物可通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂来保存。

[0579]适合于通过添加水制备水混悬剂的可分散粉末和颗粒在与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物中提供活性成分。适合的的分散或湿润剂或混悬剂通过以上已经提及的那些举例说明。也可存在其它的辅剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

[0580]本发明的药物组合物还可为水包油的形式。油相可为植物油或矿物油或它们的混合物。适合的乳化剂可为天然产生的树胶如阿拉伯胶或西黄蓍胶，天然产生的磷脂如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸脂。乳液还可以含有甜味剂和调味剂。

[0581]糖浆剂和酏剂可与诸如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖的甜味剂一起配制。这类制剂还可含有湿润剂、防腐剂以及调味和着色剂。药物组合物可为无菌可注射的水性或油状混悬液。可根据现有技术，采用以上已经提及的适合的分散或湿润剂以及混悬剂来配制这种混悬液。无菌可注射制剂还可为在无毒的胃肠外可接收的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。可采用的这些可接收的介质和溶剂包括水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常被用作溶剂或混悬介质。为此，可采用任何温和的不挥发油，包括合成的单或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸也可用于制备注射剂。

[0582]本发明的核酸分子还可以栓剂的形式给药，例如用于药物的直肠给药。可通过与适合的无刺激辅剂混合来配制这些组合物，这些辅剂在通常温度下为固体，但在直肠温度下为液体，因而在直肠中融化以释放药物。这类材料包括可可脂和聚乙二醇。

[0583]本发明的核酸分子可在无菌介质中胃肠外给药。取决于所用的介质和浓度，药物在介质中可为悬浮的或溶解的。有利的是，诸如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂的佐剂可在介质中溶解。

[0584]每千克体重每天约0.1mg至约140mg数量级的剂量水平可用于治疗上述状况(每个体每天约0.5mg至约7g)。可与载体材料混合以产生单一剂量形式的活性成分的量随治疗的宿主和特定的给药模式而变化。单位剂量形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分。

[0585]应理解的是，对于任何特定个体来说，特定剂量水平依赖于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、日常饮食、给药时间、给药途径以及排泄速率、药物组合以及所治疗的特定疾病的严重性。

[0586]对于向非人动物给药，组合物也可被加至动物饲料或饮用水中。可方便地配制动物饲料和饮用水组合物，使得动物在其饮食的同时摄入治疗上合适量的组合物。还可方便地使组合物为与混合物存在，以加入到饲料或引用水中。

[0587]本发明的核酸分子还可与其它治疗化合物联合给予个体以增强总体疗效。使用多种化合物来治疗适应症可增加有益效果，同时降低副作用的存在。

[0588]在一个实施方案中，本发明包括适合于将本发明核酸分子给予特定细胞类型的组合物。例如，唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262，4429-4432)为干细胞所特有的，其结合分枝的半乳糖末端糖蛋白，例如非唾液血清类粘蛋白(ASOR)。在另一实施方案中，叶酸盐受体在很多癌细胞中表达。这类糖蛋白、合成的糖偶联物或叶酸盐与受体的结合的亲和力很大程度上依赖于寡糖链的支化，例如三分枝结构(triatennary structure)以比二分枝或单分枝链更大的亲和力结合(Baenziger and Fiete，1980，Cell，22，611-620；Connolly et al.，1982，J.Biol.Chem.，257，939-945)。Lee and Lee，1987，Glycoconjugate J.，4，317-328通过将N-乙酰基-D-g半乳糖胺用作碳水化合物部分获得这种高亲和力，其与半乳糖相比对受体有更高的亲和力。已描述了这种“集群效应(clustering effect)”，用于结合和摄取末端甘露糖的糖蛋白或糖偶联物(Ponpipom et al.，1981，J.Med.Chem.，24，1388-1395)。使用基于半乳糖、半乳糖胺或叶酸盐的偶联物来输送外源化合物跨过细胞膜可提供靶向输送方法，来例如治疗肝脏疾病、肝癌或其它癌症。生物偶联物的使用还可使治疗所需的治疗性化合物的剂量减少。此外，可通过使用本发明核酸生物偶联物来调节治疗剂的生物利用度、药物动力学和药效动力学。在Vargeese等人于2001年8月13日提交的USSN 10/201,394和Matulic-Adamic等人于2002年3月6日提交的USSN 60/362,016中描述了这类生物偶联物的非限定性实例。

[0589]或者，本发明的某些siNA分子可在细胞中从真核启动子表达(e.g.，Izant and Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry and Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet et al.，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic et al.，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasingheet al.，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen et al.，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver et al.，1990Science，247，1222-1225；Thompson et al.，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good et al.，1997，gene Therapy，4，45)。本领域技术人员知道任何核酸分子都可在真核细胞内从合适的DNA/RNA载体表达。通过酶核酸将它们从初级转录本释放，这类核酸分子的活性可被增强(Draper et al.，PCT WO 93/23569，and Sullivan et al.，PCT WO 94/02595；Ohkawa et al.，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira et al.，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura et al.，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira et al.，1994，J.Biol.Chem.，269，25856)。

[0590]在本发明另一方面，本发明的RNA分子可从插入DNA或RNA载体的转录单位(参见例如Couture et al.，1996，TIG.，12，510)表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。可基于但不限于腺相关病毒、反转录病毒、腺病毒或α病毒来构建siNA表达病毒载体。在另一实施方案中，基于pol III的构建体被用于表达本发明的核酸分子(参见，例如Thompson，U.S.Pats.Nos.5,902,880和6,146,886)。能够表达siNA分子的重组载体可按上文所述输送，并保留在细胞中。或者，可使用瞬时表达核酸分子的病毒载体。这类载体可按需要重复施用。表达后，siNA分子于靶mRNA相互作用并引起RNAi反应。siNA分子表达载体的输送可为系统性的，例如通过静脉内或肌内给药，通过向从个体体内取出的靶细胞给药并回输该个体，或者通过其它使得能引入期望的靶细胞内的方式(关于综述，参见Couture et al.，1996，TIG.，12，510)。

[0591]一方面，本发明描述了包含编码至少一个本发明siNA分子的核酸序列的表达载体。在表达载体可编码siNA双链体的一条或两条链，或者可自身杂交成siNA双链体的单一自身互补链。编码本方面siNA分子的核酸序列以使得能够表达siNA分子的方式可操作的连接(参见，例如Paul et al.，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi and Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee et al.，2002，Nature Biotechnology，19，500；以及Novina et al.，2002，Nature Medicine，在先的在先发表doi：10.1038/nm725)。

[0592]在另一方面，本发明描述了表达载体，其包含：a)转录起始区域(例如，真核pol I，II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核pol I，II或III终止区)；以及c)编码至少一个本发明siNA分子的核酸序列，其中所述序列以使得所述siNA分子能够表达的方式可操作地连接至所述起始区和所述终止区。所述载体可任选地包括用于蛋白的开放阅读框(ORF)，其可操作地连接在编码本发明siNA的序列的5′侧或3′侧；和/或内含子(间隔序列)。

[0593]siNA分子序列的转录可由用于真核RNA聚合酶I(polI)、RNA聚合酶II(polII)、或RNA聚合酶III(polIII)的启动子驱动。从pol II或polIII启动子的转录以高水平在细胞中表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默子等)的性质。如果原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达，则也可使用原核RNA聚合酶启动子(Elroy-Stein and Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7；Gao and Huang 1993，Nuc leic Acids Res.，21，2867-72；Lieber etal.，1993，Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou et al.，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。几位研究人员已证实，从这类启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中起作用(e.g.Kashani-Sabet et al.，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen et al.，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier etal.，1992，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson et al.，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science，262，1566)。更具体地，诸如源于编码U6小核(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单元可用于在细胞中产生高浓度的期望RNA分子，如siNA(Thompsonet al.，supra；Couture and Stinchcomb，1996，supra；Noonberg et al.，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg et al.，U.S.Pat.No.5,624,803；Good et al.，1997，gene Ther.，4，45；Beigelman et al.，国际PCT公开WO96/18736)。上述siNA转录单元可被并入多种载体以引入哺乳动物细胞，这些载体包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒)、或病毒RNA载体(例如反转录或α病毒载体)(关于综述，参见Couture and Stinchcomb，1996，上文)。

[0594]在另一方面，本发明描述了表达载体，其以使得本发明siNA分子能表达的方式包含编码至少一个本发明siNA分子的核酸序列。在一个实施方案中，该表达载体包括：a)转录起始区；b)转录终止区；和c)编码siNA分子至少一条链的核酸序列，其中所述序列以使得该siNA分子能表达和/或输送的方式可操作地连接至起始区和终止区。

[0595]在另一实施方案中，所述表达载体包括：a)转录起始区；b)转录终止区；c)开放阅读框；以及d)编码siNA分子至少一条链的核酸序列，其中所述序列可操作地连接至开放阅读框的3′端，以及其中所述序列以使得siNA分子能表达和/或输送的方式可操作地连接至起始区、开放阅读框和终止区。在另一实施方案中，所述表达载体包括：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；以及d)编码至少一个siNA分子的核酸序列，其中所述序列以使得核酸分子能表达和/或输送的方式可操作地连接至起始区、内含子和终止区。

[0596]在另一实施方案中，所述表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)开放阅读框；以及e)编码siNA分子至少一条链的核酸序列，其中所述序列可操作地连接至开放阅读框的3′端，以及其中所述序列以使得siNA分子能表达和/或输送的方式可操作地连接至起始区、内含子、开放阅读框和终止区。

实施例

[0597]下文为非限定性实施例，其显示了本发明核酸的选择、分离、合成和活性。

实施例1：siNA构建体的串联合成

[0598]采用可切割接头(如基于琥珀酰基的接头)串联合成本发明的示例性siNA分子。本文所描述的串联合成跟随有一步纯化过程，其以高产率提供RNAi分子。这种方法高度适合于支持高通量RNAi筛选的siNA合成，并可容易地适应多柱或多孔合成平台。

[0599]在完成siNA寡核苷酸的串联合成及其互补后(其中5′末端二甲氧基三苯甲基(5′-O-DMT)基团保持完好(trityl on合成))，该寡核苷酸如上所述被脱保护。脱保护后，让siNA序列链自发杂交。该杂交产生双链体，其中一条链保留了5′-O-DMT基团，而互补链包含末端5′羟基。新形成的双链体在常规固相提取纯化期间作为单个分子行动(带三苯甲基纯化)，即使只有一个分子具有二甲氧基三苯甲基基团。因为所述链形成稳定双链体，该二甲氧基三苯甲基基团(或等价基团，如其它三苯甲基基团或其它的疏水部分)是例如通过C18柱纯化寡核苷酸对所需的全部。

[0600]使用标准的亚磷酰胺化学，直至引入串联接头时，该串联接头例如为反向脱氧无碱基琥珀酸脂或琥珀酸甘油酯接头(参见图1)或等价的可切割接头。可使用的接头偶联条件的非限定性实例包括活化剂(例如溴代三吡咯烷基磷代六氟磷酸酯，PyBrOP)存在下的受阻碱，例如二异丙基乙二胺(DIPA)和/或DMAP。偶联了接头后，利用标准的合成化学完成第二序列的合成，让末端5′-O-DMT完好。合成之后，根据本文所述的操作使得到的寡核苷酸去保护，并用合适的缓冲剂停止反应，例如用50mM NaOAc或1.5M NH₄H₂CO₃。

[0601]可容易地采用固相提取法纯化siNA双链体，例如采用经1柱体积(CV)的乙腈、2CV H2O和2CV50mM NaOAc处理的Waters C18SepPak 1g柱。将样品上样，然后用1CV H2O或50mM NaOAc洗涤。不合格的序列用1CV 14％ CAN(含有50mM NaOAc和50mM NaCl的水溶液)洗脱。接着例如用1CV H2O洗涤柱，然后是柱上的脱三苯甲基，例如通过使1CV 1％的三氟乙酸(TFA)水溶液通过柱子，然后加入另一CV的1％ TFA水溶液并让其静置约10分钟。除去残留的TFA溶液并相继用H20、1CV 1M NaCl和另外的H20洗涤柱。然后例如用1CV 20％ CAN水溶液洗脱siNA双链体产物。

[0602]图2提供了纯化的siNA构建体的MALDI-TOF质谱分析实例，其中每个峰对应于siNA双链体的单个siNA链的计算质量。当通过毛细管凝胶电泳(CGE)分析该相同的经纯化siNA时，提供了三个峰，一个峰可能对应双链体siNA，两个峰可能对应于分开的siNA序列链。离子交换HPLC分析该相同siNA构建体仅显示了单一峰。采用荧光酶报告测定法测试该经纯化的siNA构建体证实了与从分开合成的核苷酸序列链产生的siNA构建体相比有相同RNAi活性。

实施例2：在任何RNA序列中鉴定可能的siNA靶位点

[0603]例如通过使用计算机折叠算法，筛选目的RNA靶的序列，例如人mRNA转录本(例如，本文通过GenBank登录号指出的任何序列)的靶位点。在非限定性实例中，来自数据库如Genbank的基因或RNA基因转录本的序列被用于生成与靶有互补性的siNA靶。这些序列可从数据库获得，或者通过实验确定，如现有技术中已知的。可使用已知的靶位点来设计靶向这些位点的siNA分子，所述靶位点例如为基于用其它核酸分子(例如核酶或反义核酸)进行的研究被确定是有效靶点的那些，或者已知与疾病、性状或状况有关的靶，如含有突变或缺失的位点。多种参数可用于确定那些位点是靶RNA序列内最合适的靶位点。这些参数包括但不限于二级或三级RNA结构、靶序列的核苷酸碱基组成、靶序列的不同区域的同源程度或者RNA转录本内靶序列的相对位置。基于这些测定，RNA转录本内任意数目的靶位点可被选择用于例如通过体外RNA切割测定、细胞培养或动物模型来筛选siNA分子的有效性。在非限定性实例中，基于所使用的siNA构建体的大小，选择转录本内从1至1000靶位点的任何位置。可采用现有技术中已知的方法开发高通量筛选测定法用于筛选siNA分子，例如采用多孔或多板测定法来确定靶基因表达的有效减少。

实施例3：在RNA内选择siNA分子靶位点

[0604]以下的非限定性步骤可被用于筛选靶向给定序列或转录本的siNA。

[0605]1.靶序列通过计算机被分解为包含在靶序列内的全部为特定长度的一组片段或亚序列，例如23核苷酸的片段。这个步骤通常采用定制的Perl script进行，但也可采用商品化序列分析程序，如Oligo、MacVector或GCG Wisconsin软件包。

[0606]2.在一些情况下，siNA对应于一种以上的靶序列；这可以是例如靶向相同基因的不同转录本、靶向一个以上基因的不同转录本或靶向人基因和动物同源基因的情况。这种情况下，为每个靶生成特定长度的亚序列组，然后比较这些组以发现每一组中的匹配序列。接着根据包含给定亚序列的靶序列的数目来对亚序列分级；其目的是发现存在于大多数或所有靶序列内的亚序列。或者，该分级可鉴定靶序列特有的亚序列，例如突变体靶序列。这种方法使得能使用siNA特异靶向突变序列而不影响正常序列的表达。

[0607]3.在一些情况下，siNA亚序列不存在于一个或多个序列中，而是存在于所期望的靶序列中；如果siNA靶向具有平行家族成员的基因，而平行家族成员要保持不被靶向，就是这种情况。如同以上2的情况，为每个靶生成特定长度的亚序列组，然后比较这些组，以发现存在于靶基因中但不存在于非靶向平行基因中的序列。

[0608]4.分级的siNA亚序列可根据GC含量被进一步分析和分级。优选含有30-70％ GC的位点，进一步优选含有40-60％ GC的位点。

[0609]5.分级的siNA亚序列可根据自折叠和内部发夹被进一步分子和分级。优选较弱的内部折叠；避免较强的发夹结构。

[0610]6.分级的siNA亚序列可根据序列中是否具有GGG或CCC串被进一步分析和分级。任一链中的GGG(或甚至更多的G)可使寡核苷酸合成成问题，并且可能干扰RNAi活性，所以在可得到更好序列的时对其加以避免。在靶链中搜索CCC，由于其会使GGG置于反义链中。

[0611]7.分级的siNA亚序列可根据它们在序列的3′端是否具有二核苷酸UU(尿苷二核苷酸)和/或在序列的5′端是否具有AA(在反义序列中产生3′UU)被进一步分析和分级。这些序列使得可设计带有末端TT胸苷二核苷酸的siNA分子。

[0612]8.从如上所述分级的亚序列组中选择四个或五个靶位点。例如，在具有23核苷酸的亚序列中，随后为siNA双链体的上(有义)链设计和合成每个所选择的23-mer亚序列的右侧21核苷酸，同时为siNA双链体的下(反义)链设计和合成每个所选择的23-mer亚序列的反向互补的左侧21核苷酸(参见表II)。如果序列需要末端TT残基(如段落7所述)，则在合成寡核苷酸之前将有义和反义链的两个3′末端核苷酸用TT替换。

[0613]9.在体外、细胞培养物或动物模型中筛选siNA分子，以鉴别最有活性的siNA分子或靶RNA序列内最优选的靶位点。

[0614]10.在选择靶核酸序列时可考虑其它的设计问题，参见，例如Reynolds et al.，2004，Nature Biotechnology Advanced Online Publication，1 February 2004，doi：10.1038/nbt936和Ui-Tei et al.，2004，Nucleic AcidsResearch，32，doi：10.1093/nar/gkh247。

[0615]在另一方法中，特异于靶序列的siNA构建体池被用于在表达靶RNA的细胞中筛选靶位点，该细胞例如为培养的Jurkat、HeLa、A549或293T细胞。用在该方法中的一般策略显示在图9中。表达该靶RNA的细胞被siNA构建体池转染，并筛选表现出与靶抑制有关的表型的细胞。siNA构建体池可从插入合适载体内的转录盒表达(参见图7和图8)。来自表现出阳性表型变化(例如，减弱的增殖性、降低的靶mRNA水平或降低的靶蛋白表达)的细胞的siNA被测序，以确定靶RNA序列内最合适的靶位点。

[0616]在一个实施方案中，采用以下的方法学选择本发明的siNA分子。以下的指导被汇集起来预测含有本文所述化学修饰的高活性siNA。这些规则来自对针对几个不同靶的高活性(靶mRNA水平减弱>75％)和无活性(靶mRNA水平减弱<75％)的siNA比较分析。总共分析了242个siNA序列。242siNA中的35siNA被分为高活性组，剩余的siNA被分为无活性组。高活性siNA清楚地显示出在该siNA序列内的特定核苷酸位置对某些碱基的偏好。例如，在高活性siNA的有义链的19为主要存在A或U核苷酸碱基，对于无活性siNA正好相反。也存在这种模式，在高活性siNA的有义链的15-19位为富含A/U(5个碱基中的3个为A或U)区以及在1-5为为富含G/C(5个碱基中的3个为G或C)区。如表V所示，鉴定出高活性siNA的特征性的12个这类模式。应注意的是，不是每个模式都存在于每个高活性siNA中。因此，为了设计预测高活性siNA的算法，为每个模式指定了不同的分值。根据这些模式在高活性siNA和无活性siNA中出现的频率的比较，设计参数被指定一分值，最高为10。如果在一位置某些核苷酸碱基不是优选的，则指定负分值。例如，在有义链的9和13位，G核苷酸在高活性siNA中不是优选的，因此对它们给予分值-3(负3)。每个模式的不同分值在表V中给出。模式#4被指定了最大的分值-100。这主要是为了除去任何含有4G或4C串的序列。由于它们很不适合合成并且允许序列自身集聚，由此是siNA无活性。采用这种算法，对任何siNA来说最高可能的分值为66。由于针对任何合理大小(～1000核苷酸)的指定靶可能有很多siNA序列，该算法可用于产生高活性siNA。

[0617]在一个实施方案中，显示在表V中的规则1-11被用于产生本发明的活性siNA分子。在另一实施方案中，显示在表V中的规则1-12被用于产生本发明的活性siNA分子。

实施例4：siNA的设计

[0618]通过分析靶的序列并任选地根据以上实施例3中指出的规则按优先次序排列靶位点，和或者基于折叠(分析任何给定序列的结构以确定siNA与靶的可接触性)，或通过使用实施例3中所描述的siNA分子库，或者通过使用本文实施例6中所描述的体外siNA系统，对siNA靶位点进行选择。设计可结合每个靶位点的siNA分子，采用上述算法进行选择，以及任选地通过计算机折叠单个分析，以评估该siNA分子是否可与靶序列相互作用。可选择不同长度的siNA分子以优化活性。通常，选择足够数量的互补核苷酸碱基以结合靶RNA或与其相互作用，但是互补程度可被调节以适应siNA双链体或不同长度或碱基组成。通过使用这些方法，可设计靶向任何已知RNA序列(例如对应于任何基因转录本的RNA序列)内位点的siNA分子。

[0619]对靶序列进行分析以生成靶，从该靶来设计双链siNA(表II)。为了生成合成的siNA构建体，将描述在实施例3中的算法用于选择活性双链构建体和其化学修饰形式。例如，在表II中显示了靶序列，以及siNA双链体的上(有义)和下(反义)链。通过搜索不同靶序列(例如，约5至约15核苷酸区的共有同源性)之间的同源位点并允许非规范碱基配对(例如，G:U摆动碱基配对)或错配碱基对来设计多功能siNA。

[0620]如本文所述设计经化学修饰的siNA构建体(例如参见表I)，以提供用于体内系统给药的核酸酶稳定性和/或改善的药物动力学、定位、和疏水性质，同时保持介导RNAi活性的能力。采用本文描述的合成方法和那些现有技术中公知的方法通过合成将本文所述的化学修饰引入。然后在血清和/或细胞/组织提取物(例如肝提取物)中测定合成的siNA构建体的核酸酶稳定性。还采用适合的测定法，如本文所描述的荧光素酶报告测定法或其它适合的可定量RNAi活性的测定法，平行测试合成的siNA构建体的RNAi活性。具有核酸酶稳定性和RNAi活性的合成siNA构建体可被进一步修饰并在稳定性和活性测定中再评估。然后可将稳定有活性的siNA构建体的化学修饰应用到靶向任何选择的RNA的任何siNA序列，并例如用在靶筛选测定中来选择用于治疗开发的先导siNA化合物(参见例如图11)。

实施例5：siNA的化学合成和纯化

[0621]siNA分子可被设计为与RNA信息中的各个位点相互作用，例如与本文所述RNA序列中的靶序列相互作用。siNA中的一条链的序列与上述靶位点序列互补。该siNA分子可采用本文所述方法化学合成。用作对照序列的无活性siNA分子可通过扰乱siNA分子的序列以便不与靶序列互补而合成。通常，可采用本文所述的固相寡核苷酸合成法合成siNA构建体(参见，例如Usman et al.，US Patent Nos.5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；Scaringe et al.，US Patent Nos.6,111,086；6,008,400；6,111,086，通过参考将它们都整体并入本文)。

[0622]在非限定性实例中，RNA寡核苷酸以分步方式合成，采用现有技术中已知的亚磷酰胺化学。标准的亚磷酰胺化学涉及采用包含任何5’-O-二甲氧基三苯甲基、2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、3’-O-2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺基因和环外胺保护基团(例如，N6-苯甲酰腺嘌呤、N4乙酰基胞苷和N2-异丁酰基鸟苷)的核苷。或者，2′-O-甲硅烷基醚可与对酸不稳定的2′-O-原酸酯联合用在RNA的合成中，如上文Scaringe所描述的。不同的2’化学可要求不同的保护基团，例如2’-脱氧-2’-氨基核苷可利用N-邻苯二酰基保护，如Usman et al.，US Patent 5,631,360中所述的，通过参考将其整体并入本文。

[0623]在固相合成过程中，每个核苷酸被顺序添加至(3′-至5′-方向)固体支持物结合的寡核苷酸。链3′端的第一个核苷酸采用各种接头共价结合到固相支持物(例如，可控孔度玻璃或聚苯乙烯)。使核苷酸前体核糖核苷亚磷酰胺和活化剂混合，导致将第二核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷的5′端。洗涤支持物，任何未反应的5′-羟基基团用诸如乙酸酐的加帽剂加帽，以产生无活性的5′-乙酰基部分。然后将三价的磷键氧化至更稳定的磷酸键。在核苷酸添加循环的最后，在适当的条件下(例如，用于基于三苯甲基的基团的酸性条件和用于基于甲硅烷基的氟化物)切割5′-O-保护基团。对每个随后的核苷酸重复该循环。

[0624]合成条件的改变可用于优化偶联效率，例如通过根据待合成的siNA的特定化学组成采用不同的偶联时间、不同的试剂/亚磷酰胺浓度、不同的接触时间、不同的固相支持物或固相支持物接头化学。可进行siNA的脱保护和纯化，如在Usman et al.，US 5,831,071，US 6,353,098，US6,437,117，和Bellon et al.，US 6,054,576，US 6,162,909，US 6,303,773，或上文Scaringe中概述的，通过参考将它们整体并入本文。另外，脱保护条件可被改变以提供siNA构建体最佳可能的产率和纯度。例如，申请人已观察到在不合适的脱保护条件下包含2’-脱氧-2’-氟核苷酸的寡核苷酸可降解。采用甲胺水溶液在约35℃下持续30分钟使这些寡核苷酸脱保护。如果含有2’-脱氧-2’-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，则在用甲胺水溶液在约35℃下持续30分钟脱保护后，加入TEA-HF并将反应物在约65℃再维持15分钟。通过阴离子交换来纯化脱保护的siNA单链，以在维持高产率时达到高纯度。为了形成siNA双链体分子，将单链在盐水溶液中等摩尔比混合，以形成双链体。在冻干之前将该双链体siNA通过切向过滤浓缩并脱盐。

实施例6：RNAi体外测定以评估siNA活性

[0625]将在无细胞系统中重现RNAi的体外测定用于评估靶向靶RNA靶的siNA构建体。该测定包括由Tuschl et al.，1999，genes andDevelopment，13，3191-3197和Zamore et al.，2000，Cell，101，25-33描述的系统，其被加以改变以用于靶RNA。来自合胞体胚盘的果蝇提取物被用于在体外重建RNAi活性。采用T7RNA合成酶从合适的靶表达质粒通过体外转录产生靶RNA，或者通过本文所述的化学合成产生靶RNA。通过在缓冲液(例如100mM醋酸钾、30mM HEPES-KOH，pH 7.4，2mM醋酸酶)中90℃孵育1分钟，接着是37℃孵育1小时来让有义和反义siNA链(例如各20uM)退火，然后在溶解缓冲液(例如，100mM醋酸钾，30mMHEPES-KOH，pH 7.4，2mM醋酸酶)中稀释。可通过在TBE缓冲液中琼脂糖凝胶上的凝胶电泳以及溴化乙锭的染色来监测退火。采用来自在酵母糖蜜琼脂上收集的Oregon R蝇的零至两小时胚胎，并dechorionated和裂解，来制备果蝇裂解物。该测定包括含有50％裂解物[vol/vol]、RNA(10-50pM的最终浓度)和含有siNA(10nM的最终浓度)的10％[vol/vol]裂解缓冲液的混合物中进行。该反应混合物还含有10mM磷酸肌酸、10ug/ml磷酸肌酸激酶、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uMATP、5mM DTT、0.1U/uL RNasin(Promega)、以及100uM各氨基酸。最终的醋酸钾浓度被调整为100mM。反应物在冰上混合，在25℃预孵育10分钟，之后加入RNA，然后在25℃再孵育60分钟。用4体积的1.25xPassive Lysis Buffer(Promega)终止反应。通过RT-PCR分析或其它现有技术中已知的方法来测定靶RNA切割，并与将siNA从反应中省略的对照反应进行比较。

[0626]或者，通过在[α-³²P]CTP存在下体外转录来制备用于测定的内部标记的靶RNA，通过旋转层析使其通过G50Sephadex柱，并用作靶DNA而不进一步纯化。任选地，靶RNA为采用T4多核苷酸激酶5′-³²P端标记的。如上所述进行测定，并在凝胶放射自显影照片上观察通过RNAi产生的特异RNA切割产物。通过PHOSPHOR

(放射自显影照片)定量代表完整对照RNA或来自无siNA的对照反应的RNA的带以及由该测定产生的切割产物的带，以确定切割百分比。

[0627]在一个实施方案中，该测定被用于确定靶RNA靶中的靶位点，以用于siNA介导的RNAi切割，其中例如通过电泳标记的靶RNA或者通过northern印迹来分析以及通过现有技术中已知的方法来测定反应，以筛选多个siNA构建体用于用于siNA介导的对靶RNAi靶的切割。

实施例7：靶RNA的核酸抑制

[0628]如上所述设计并合成靶向靶RNA的siNA分子。这些核酸可在体内测试切割活性，例如采用以下的操作。靶核酸序列和核苷酸在靶RNA内的定位在表II中给出。

[0629]使用两种方式来测试siNA靶向任何靶序列的有效性。首先，采用HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T细胞在细胞培养物中测试反应物，以确定RNA和蛋白抑制的程度。如上所述选择针对靶的siNA试剂。在将这些试剂通过合适的传染剂输送至例如HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T细胞后，测量RNA抑制。采用实时PCR监测扩增(例如，ABI 7700TAQMAN

)，测量靶RNA相对于肌动蛋白的量。与为无关靶制备的寡核苷酸序列的混合物进行比较或者与相同总长和化学但在每个位置随机取代的随机siNA对照进行比较。为靶选择第一和第二先导试剂，并进行优化。在选择最佳的转染剂浓度后，用先导siNA分子进行RNA时程抑制。此外，细胞接种方式(cell-plating format)可用于确定RNA抑制。siNA输送至细胞

[0630]转染前一天将细胞(例如，HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T细胞)例如以1 x 10⁵细胞每孔接种到中的6孔培养皿的EGM-2(BioWhittaker)中。在37℃下，将siNA(终浓度例如20nM)和阳离子脂(例如，本文的LNP制剂，或另一适合的脂，如Lipofectamine，终浓度为2μg/ml)在聚苯乙烯管中的EGM基础培养基中混合30分钟。振荡后，将混合的siNA添加至每孔并孵育指定时间。对于起始优化实验，将细胞例如以1 x 10³接种至96孔板，并如上所述加入siNA混合物。采用与脂复合的荧光siNA来确定向细胞输送siNA的有效性。将6孔板中的细胞与siNA孵育24小时，以PBS洗涤并在室温下在2％多聚甲醛中固定15分钟。采用荧光显微镜来观察siNA摄取。

mRNA的

(扩增的实时PCR监测)和Lightcycler定量

[0631]在输送siNA后，从细胞制备总RNA，例如采用Qiagen RNA纯化试剂盒用于6孔测定，或者采用Rneasy提取试剂盒用于96孔测定。对于

分析(实时PCR监测扩增)，合成双标记的探针，其中报告染料FAM或JOE被共价连接在5′端，淬灭染料TAMRA被偶联在3′端。例如在ABI PRISM 7700 Sequence Detector上采用50μl的反应物进行一步RT-PCR扩增，该50μl的反应物由10μl总RNA，100nM正向引物，900nM反向引物，100nM探针，1X TaqMan PCR反应缓冲液(PE-AppliedBiosystems)，5.5mM MgCl₂，300μM各dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，10U RNase抑制剂(Promega)，1.25U AMPLITAQ

(DNA聚合酶)(PE-Applied Biosystems)以及10U M-MLV逆转录酶(Promega)组成。热循环条件可由48℃ 30分钟，95℃ 10分钟，接着是40个循环的95℃ 15秒和60℃ 1分钟。相对于从序列稀释的总细胞RNA(300，100，33，11ng/反应)产生的标准品确定mRNA水平，并标准化至β肌动蛋白或在平行反应中(实时PCR监测扩增)的GAPDH mRNA。为每个目的基因设计上引物和下引物以及荧光标记的探针。SYBR Green I染料向特异PCR产物的实时并入可使用lightcyler在玻璃毛细管中测量。采用对照cRNA为每对引物生成标准曲线。每个样品中的值以相对GAPDH的表达表示。

Western印迹

[0632]可采用标准的微量制备技术(参见，例如Andrews and Faller，1991，Nucleic Acids Research，19，2499)制备核提取物。例如，采用TCA沉淀从上清液制备蛋白提取物。将等体积的20％ TCA加至细胞上清液中，在冰上孵育1小时，通过离心5分钟让其沉淀。在丙酮中洗涤沉淀，干燥并在水中重悬浮。将细胞蛋白提取物在10％ Bis-Tris NuPage(核提取物)或4-12％ Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳并转移至硝酸纤维素膜。可通过例如用5％脱脂乳孵育1小时来封闭非特异结合，接着是初级抗体在4℃ 16小时。洗涤后，例如在室温下应用次级抗体(1:10,000稀释)1，小时，并采用SuperSignal试剂(Pierce)检测信号。

实施例8：可用于评估靶基因下调的模型

[0633]在动物模型中评估本发明的siNA分子的有效性是人临床实验的重要前体条件。现有技术中已知的多种癌症、增生性、炎性、自身免疫性、神经病学、眼科、呼吸、代谢、听觉、皮肤病学等疾病、状况或病症的动物模型可被用于临床前评估本发明的核酸组合物在出于治疗、美容或研究目的方面调节靶基因表达的有效性。

实施例9：RNAi介导的对靶基因表达的抑制

体外siNA介导的对靶RNA的抑制

[0634]在细胞(例如，HEKn/HEKa、HeLa、A549、A375细胞)中测试siNA构建体减弱靶RNA表达的有效性。在转染之前约24小时将细胞接种在96孔板中，5,000-7,500细胞/孔，100μl/孔，以致于在转染时细胞为70-90％融合。为了转染，将退火的siNA与转染剂(Lipofectamine 2000，Invitrogen)以50μl/孔的体积混合，并在室温下孵育20分钟。将siNA转染混合物加至细胞，在150μl的体积中得到最终25nM的siNA浓度。每种siNA转染混合物被加入3个孔，进行三次重复处理。细胞在持续存在siNA转染混合物下在37°孵育24小时。在24小时，从每孔经处理的细胞制备RNA。首先取出并弃去含有转染混合物的上清液，接着裂解细胞并从每孔制备RNA。处理后通过针对靶基因和用于标准化的对照基因(36B4，RNA聚合酶亚基)的RT-PCR评估靶基因表达。取三次重复数据的平均值，并为每次处理确定标准偏差。以经标准化的数据作图，并确定由于活性siNA而相对于它们各自反向的对照siNA靶mRNA减少的百分比。

实施例10：在选择位置具有一个或多个核糖核苷酸的稳定siNA构建体的有效性

[0635]生成嵌合siNA构建体(参见表II)，其在有义链(信使链)或反义(引导)链含有6核糖核苷酸段，同时保持所以其它核苷酸被化学修饰。通过测量蛋白(HBsAg)水平而不是mRNA水平来观察靶HBV信息减弱。在siNA的有义链或引导链的5’或3’端核糖核苷酸段的存在显示强烈的沉默活性，siNA构建体也是如此，其中在端部的核糖核苷酸段也在相反链具有核糖核苷酸对应物。HBV位点262siNA构建体的数据显示在图30中，位点263siNA构建体的数据显示在图31中，位点1583siNA构建体的数据显示在图32中。

[0636]在组织培养中确定的IC50值揭示用于HBV位点262、263和1583(参见图33和34)的在siNA末端位置含有6核糖核苷酸段的嵌合siNA保留了活性。评估了其它构建体介导RNAi的能力，这些构建体中核糖核苷酸含量减少至单个核糖核苷酸残基，其位于互补于HBV位点263的引导链序列的5’末端位置。体外实验揭示，在引导链5’末端位置的单个核糖核苷酸残基保留了化学修饰siNA双链体(7/23、7/24和/或7/28化学物，参见图35)的活性。因为在反义链的5’末端核苷酸位置含有单个核糖核苷酸残基的siNA双链体可以催化方式切割靶RNA，可进一步推断siNA分子内2’-OH基团不直接参与靶RNA的催化切割。评估了其它的指明为Stab7/23，7/24，7/25，7/26，7/27和7/28稳定化学物(参见表I)的siNA构建体介导RNAi的能力。7/25siNA构建体的体外血清稳定性揭示该构建体具有>24h的人血清半衰期。

[0637]申请人将HeLa细胞裂解物用作RISC蛋白源进行体外RNAi切割，以评估各种siNA构建体诱导靶RNA切割的能力。靶向stab7/8siNA结构中位点304的抗HCV构建体在体外RNAi切割测定中被评估(参见表II)。从引导链序列的5’端起10nt处靶RNA的位点特异切割被认为是RISC介导的切割。事实上，用靶向stab7/8siNA结构中位点304的抗HCV siNA观察到在预期位置的该靶RNA的位点特异切割。这显示，完全修饰的siRNA通过RNAi机制起作用，siNA内2’-OH的存在不是RNAi介导的对靶RNA的切割所必需的，以及siNA内2’-OH基团不参与靶RNA切割。

[0638]如上所述，在引导链的5’末端核苷酸位置核糖核苷酸残基的存在会产生具有强活性的siRNA。评估了siRNA构建体的活性，其中引导链第一个三核苷酸包含2’-脱氧-2’-氟嘧啶和嘌呤核糖核苷酸。该稳定化学物被称为Stab 29(表I)。该siNA在Stab 7/25以及Stab 7/29化学物(参见图36)中同样工作良好。因此，当存在于5’末端核苷酸位置时嘌呤残基可在引导链中保持为核糖核苷酸，引导链中的嘧啶核苷酸可被化学修饰，但同时保留强的RNAi活性。为了确定这些siNA也通过RISC介导的特异RNA降解起作用，使用了采用HeLa细胞裂解物的体外RNAi测定。从引导链5’端起10nt处靶RNA的位点特异切割被认为是RISC介导的切割。事实上，对于Stab 7/25以及7/25结构内所有三siNA，在预期位置观察到靶RNA的位点特异切割。这提示这些siNA构建体通过RNAi机制起作用。

材料和方法

寡核苷酸合成和表征

[0639]如本文所述合成siNA寡核苷酸，对其脱保护并纯化。通过标准HPLC、CE和MALDI-TOF MS方法来证实最终化合物的完整性和纯度。siRNA退火

[0640]在100mM醋酸钾，30mM HEPES-KOH(pH 7.4)，2mM醋酸镁中让siNA链(每条链20μM)退火。将退火混合物首先加热至90℃1分钟，然后转移至90℃ 60分钟。通过非变性PAGE和在150mM NaCl中的TM评估来确认退火。

血清稳定性测定

[0641]寡核苷酸被如此设计，以使得标准连接方法可产生全长有义或反义链。在连接之前，利用[γ-32P]ATP采用标准激酶方法产生内部32P标记。采用变性PAGE凝胶纯化经连接的材料。将痕量的经内部标记的有义(或反义)加至未标记的材料中，以达到20μM的最终浓度。未标记的互补链以35μM存在。如上所述进行退火。通过未改变的PAGE和随后在Molecular Dynamics(Sunnyvale，CA)Phosphoimager上的观察，证实了双链体形成。

[0642]将经内部标记的双链体或单链siRNA加入至人血清以获得最终90％浓度的血清(Sigma，St.Louis，MO)和2μM siRNA双链体以及1.5μM过量的未经标记的单链siRNA。将样品在37℃孵育。在特异时间点取出等份样品，采用5秒的50mM Tris-HCl pH 7.8，2.5mM EDTA，2.5％SDS中蛋白激酶K(20ug)消化(Amersham，Piscataway，NJ)来终止反应，接着是加入6x体积的上样缓冲液(90％甲酰胺、50mM EDTA、0.015％二甲苯青和溴酚蓝、与放射标记的链有相同序列的20μM未经标记的chase寡核苷酸)。通过变性PAGE分离样品并在Molecular Dynamics

Phosphoimager上观察。将ImageQuant(Molecular Dynamics)软件用于定量。

细胞培养研究

[0643]将人肝胚细胞瘤细胞系Hep G2培养在最低必需Eagle培养基中，该培养基补加有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和25nMHepes。通过从psHBV-1载体切割并再连接HBV基因组序列产生有复制能力的cDNA。将Hep G2细胞接种(3 x 104细胞/孔)在96孔微量滴定板中并孵育过夜。在生长培养基中形成含有(终浓度)阳离子脂(11-15μg/mL)、再连接的psHBV-1(4.5μg/mL)和siRNA(25nM)的阳离子脂/DNA/siRNA混合物。37℃ 15分钟孵育之后，将20μL的混合物加至接种在80μL无抗生素生长培养基中的Hep G2细胞。转染后72小时时从细胞取出培养基，用于HBsAg分析。所有的转染都重复三次。

HBsAg ELISA测定

[0644]采用Genetic Systems/Bio-Rad(Richmond，VA)HBsAg ELISA试剂盒，按制造商的指导确定HBsAg水平。未用HBV载体转染的细胞的吸收用作测定的背景，因此被从实验样品值减去。

实施例12：配制的带有不同突出化学的siNA构建体在慢性HBV感染模型中的有效性

[0645]为了评估化学稳定的siNA纳米颗粒(参见Vargeese等人，美国临时专利申请60/678,531和于2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请60/703,946以及2005年11月15日提交的美国临时专利申请60/737,024，通过参考将它们都并入本文)组合物对HBV的活性，在向小鼠株系NOD.CB17-Prkdcscid/J(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)水力注射(HDI)HBV载体后将配制的siNA组合物(配方L-086和L-061，参见表IV和2005年11月15日提交的美国临时专利申请60/737,024)系统给药。雌性小鼠在研究时为5-6周龄，约20克。所使用的HBV载体pWTD为完整HBV基因组的头-尾二聚体。对于20克的小鼠，在5秒钟内将总共1.6ml的含有pWTD的盐水注射进尾静脉。每只小鼠注射总共0.3μg的HBV载体。为了让HDI引起的肝脏破坏吸附，配制的siNA组合物的给药在HDI后6天开始。包囊的活性或阴性对照siRNA通过标准IV注射以3mg/kg/天给药，持续3天。在最后一次给药后的第10天杀死动物，并测定血清HBVDNA的水平。通过定量实时PCR测定HBV DNA的滴度，表示为均值log10拷贝数/ml(±SEM)。与PBS和阴性对照组相比，配制的活性siNA组合物处理组在10天时间点时观察到明显的血清HBV DNA降低(图37)。

寡核苷酸合成和表征

[0646]如上所述合成所有的RNA。在PBS中让互补链退火，脱盐和冻干。活性位点263HBV siNA的序列显示如下，并由显示在图37中的Sirna化合物号指出。体内使用的经修饰的siNA根据它们的LNP制剂被称为L-086或L-061(参见表IV和2005年11月15日提交的美国临时专利申请60/737,024)

用于活性HBVsiNA的siNA序列为：

有义链：5′B GGAcuucucucAAuuuucuTT B 3′(SEQ ID NO：60)化合物号33214

反义链：5′AGAAAAuuGAGAGAAGuccUU 3′(SEQ ID NO：61)化合物号38749

反义链：5′AGAAAAuuGAGAGAAGuccAC 3′(SEQ ID NO：62)化合物号47675

反义链：5′AGAAAAuuGAGAGAAGuccTT 3′(SEQ ID NO：63)化合物号37793

反义链：5′AGAAAAuuGAGAGAAGuccTsT 3′(SEQ ID NO：64)化合物号35092

用于HBV反向对照的siNA序列为：

有义链：5′B ucuuuuAAcucucuucAGGTT B 3′(SEQ ID NO：65)化合物号33578

反义链：5′ccuGAAGAGAGuuAAAAGATsT 3′(SEQ ID NO：66)化合物号46419

(其中小写字母＝2’-脱氧-2’-氟；大写斜体字母＝2’-脱氧；大写下划线字母＝2’-O-甲基；大写黑体字母＝核糖核苷酸；T＝胸苷；B＝反向脱氧无碱基；s＝硫代磷酸酯)

HBV DNA分析

[0647]采用QIAmp 96 DNA Blood试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的说明从50μL小鼠血清提取病毒DNA。采用ABI Prism 7000序列检测器(Applied Biosystems，Foster City，CA)分析HBV DNA水平。采用以下引物和探针序列进行定量实时PCR：正向引物5’-CCTGTATTCCCATCCCATCGT(SEQ ID NO：69，HBV核苷酸2006-2026)，反向引物5’-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG(SEQ ID NO：70，HBV核苷酸2063-2083)，以及探针FAM5’-TTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCC(SEQ ID NO：71，HBV核苷酸2035-2062)。含有全长HBV基因组的psHBV-1载体用作标准曲线来计算每mL血清的HBV拷贝数。

实施例13：LNP配制的HBV siNA在HBV感染小鼠模型中的活性

[0648]开发通过系统途径给药的治疗性siRNA(siNA)依赖于改善体内稳定性的RNA化学修饰和促进充分组织靶向和细胞摄取的制剂。本实施例中，靶向人乙型肝炎病毒(HBV)的经化学修饰的siNA被封装进趋肝脏的基于脂质的纳米颗粒中，并被证实小鼠复制性HBV中循环HBVDNA的2.5-3.0log10减少。此外，作为通过RACE分析确定的RISC介导的靶切割的结果，肝脏中病毒RNA水平减低了>90％。这证明抗HBV siNA的化学修饰对于非细胞因子介导的病毒RNA减少是重要的，即使是采用纳米颗粒介导的输送。该纳米颗粒制剂输送了65％的siNA剂量到肝脏，在单一剂量后的14天在肝脏中克检测到siNA。通过静脉注射将这些配制的siNA给药被很好的耐受，如通过临床化学所测定的，包括AST和ALT水平。这些结果支持了针对重要的人肝脏病毒病原体如HBV和HCB的基于siNA的治疗剂开发。

[0649]如以上实施例所述，在细胞培养物研究中HBV基因组中的多个活性siNA靶位点被鉴定，一特别有效的siNA从HBV RNA的S区中的5′核苷酸263(HBV263M)开始。在以上实施例12中描述了该HBV263siNA分子，其具有由SEQ ID NO：60组成的有义链和由SEQ ID NO：64组成的反义链。

有义链：5′B GGAcuucucucAAuuuucuTT B 3′(SEQ ID NO：60)化合物号33214

反义链：5′AGAAAAuuGAGAGAAGuccTsT3′(SEQ ID NO：64)化合物号35092

[0650]本项研究中描述的工作提供了新脂质纳米颗粒(LNP)siNA输送技术的用途，它们导致siNA向肝脏的增强的输送，并显著改善了体内siNA效力和抗HBV活性的持续时间，包括显著降低肝脏中HBV RNA。此外，病毒RNA的减少被证实是siNA介导的靶切割的直接结果。

siNA配制

[0651]用于本项研究的LNP制剂为LNP-086(参见表IV)。通过将缓冲液中的siNA混合进脂混合物的醇溶液，以高封装效率将siNA包含进脂质颗粒中，接着是分步的渗滤过程。通过采用HPLC(阴离子交换和体积排阻层析)的正交法和RiboGreen测定法(有和无去垢剂时测量荧光变化)确定封装效率。采用Brookhaven(Holtsville，NY)ZetaPal粒度分析仪测量粒度和电荷密度。

HBsAg ELISA测定

[0652]采用Genetic Systems/Bio-Rad(Richmond，VA)HBsAg ELISA试剂盒，按制造商的说明测定HBsAg的水平。未用HBV载体转染的细胞的吸收用作测定的背景，因此被从实验样品值减去。

基于HBV载体的小鼠模型

[0653]为了评估化学稳定的siNA对HBV的活性，在向小鼠株系NOD.CB17-Prkdc^scid/J(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)水力注射(HDI)HBV载体后完成siNA的系统给药。雌性小鼠在研究时为5-6周龄，约20克。所使用的HBV载体pWTD为完整HBV基因组的头-尾二聚体。对于20克的小鼠，在5秒钟内将总共1.6ml的含有pWTD的盐水注射进尾静脉。每只小鼠注射总共0.3μg的HBV载体。siNA的标准系统给药为0.3至10mg/kg/天。为了让HDI引起的肝脏破坏吸附，系统给药在HDI后6天开始。HBV DNA分析

[0654]采用QIAmp 96 DNA Blood试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的说明从50μL小鼠血清提取病毒DNA。采用ABI Prism 7000序列检测器(Applied Biosystems，Foster City，CA)分析HBV DNA水平。采用以下引物和探针序列进行定量实时PCR：正向引物5’-CCTGTATTCCCATCCCATCGT(SEQ ID NO：69，HBV核苷酸2006-2026)，反向引物5’-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG(SEQ ID NO：70，HBV核苷酸2063-2083)，以及探针FAM5’-TTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCC(SEQ ID NO：71，HBV核苷酸2035-2062)。含有全长HBV基因组的psHBV-1载体用作标准曲线来计算每mL血清的HBV拷贝数。

HBV RNA分析

[0655]采用Tri-Reagent(Sigma，St.Louis MO)，按照制造商的说明从约100mg小鼠肝组织分离总系吧RNA。采用实时反转录(RT)-PCR在多种反应中定量HBV RNA水平，并将其标准化至小鼠GAPDH RNA。从来自HBV注射小鼠的总肝脏RNA的标准曲线计算HBV和GAPDH RNA的相对量(3倍系列稀释，每反应为300至1ng RNA)。HBV引物和探针如上所述。小鼠GAPDH引物和探针序列如下：正向引物5’-GCATCTTGGGCTACAC TGAGG(SEQ ID NO：72，mGAPDH核苷酸855-875)，反向引物5’-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG(SEQ ID NO：73，mGAPDH核苷酸903-925)以及探针VIC5’-ACCAGGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAG(SEQ ID NO：74，mGAPDH核苷酸876-913)。肝脏HBV RNA水平表示为HBV相对于GAPDH RNA的比例。

靶RNA切割的5’RACE测定

[0656]除了不对总RNA进行在先处理之外，根据GeneRacer Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)方法进行RACE分析。将来自经活性和对照siNA处理的动物的总肝脏RNA(5μg)连接到GeneRacer衔接分子。采用HBV特异的引物(VSP1：5’-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG，SEQ IDNO：75)逆转录经连接的RNA。然后是采用互补于衔接分子(GR5’-5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA，SEQ ID NO：76)和HBV(VSP2：5’-GCATGGTCCCGTACTGGTTGT，SEQ ID NO：77)的引物进行PCR扩增。采用引物(GR5’巢式5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA，SEQ ID NO：78)和(VSP3：5’CAGACACATCCAGCGATAACCAG，SEQID NO：79)通过巢式PCR和在天然PAGE上的电泳进一步证实切割产物的大小(145bp)。～145bp的经扩增产物被凝胶纯化、克隆和测序，以揭示siNA切割位点。

免疫刺激分析

[0657]通过侧面尾静脉中的标准静脉注射将单一3mg/kg剂量的HBV263M-LNP或PBS对照注射进5至6周龄的CD-1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。在给药后2.5和8小时通过CO₂吸入使动物安乐死，并立即放血(每时间点n＝5)。通过腔静脉收集血液，并加工为血清用于分析。采用夹心ELISA试剂盒，根据制造商的说明对所有细胞因子定量。这些细胞因子为IL-6、TNF-α、IFN-γ和IFN-γ(都来自R&D Systems，Minneapolis，MN)。

药物动力学

[0658]从Charles River(Wilmington，MA)获得雄性CD-1小鼠，在研究时为约30g重。HBV263M-LNP作为标准IV药团(100-120μL)以约3mg/kg的剂量给药至侧面尾静脉。在选择的时间点(给药后2和15分钟；1、3和6小时；以及1、5、10和14天)通过CO₂吸入使动物安乐死，并立即放血。通过心脏穿刺收集血液，收集在含有EDTA的牌管中，并收集血浆。放血后，以无菌兽医级盐水通过心脏对动物再灌注。对心脏称重，将样品(～100mg)置于预称重的匀浆管中，在干冰上冷冻。

[0659]采用夹心杂交测定法进行血浆和肝样品中siNA的定量，对于信使链工作浓度为范围为0.026-6.815ng/mL，对于引导链为0.027-6.945ng/mL。将肝脏样品以100mg/mL的浓度制备在组织匀浆缓冲液(3M异硫氰酸胍、0.5M NaCl、0.1M Tris pH 7.5、10mM EDTA)中。将该混合物在Bio-101匀浆器(Savant，Carlsbad，CA)中以6.0的速度设置和10秒的运行时间匀浆一次。经匀浆的肝溶液在1M GITC缓冲液(1M异硫氰酸胍、0.5M NaCl、0.1M Tris pH 7.5、10mM EDTA)中被稀释为10mg/ml，然后以进一步的稀释(1:2至1:10)用在测定中。血浆样品在1M GITC缓冲液中被稀释≥25倍。把信使链和引导链浓度相加得到总的siNA浓度。WinNonLin Professional(ver 3.3)被用于对得到的浓度时间数据进行无房室药物动力学分析。

毒性评估

[0660]通过单次IV药团注射，以3mg/kg(n＝10)或PBS(n＝10)的剂量以HBV263M-LNP向20只CD-1雄性小鼠给药。研究前以及给药1或14天后在样品收集前测量体重。在合适的时间点，通过CO2吸入让小鼠安乐死，之后立即放血(n＝5/时间点)，血液被收集用于血清化学分析。此外，收集肝和肾重量，并计算器官相对于体重的比例。

结果

LNP配制的HBV siNA

[0661]将LNP-086制剂(参见表IV)用于封装活性HBV263M siNA和对应的HBV263invM反向对照制剂，该HBV263M siNA具有由SEQ ID NO：60组成的有义链和由SEQ ID NO：64组成的反义链，该HBV263invM具有有SEQ ID NO：65组成的有义链和由SEQ ID NO：66组成的反义链。

有义链：5′B ucuuuuAAcucucuucA GGTT B 3′(SEQ ID NO：65)化合物号33578

反义链：5′ccuGAAGAGAGuuAAAAGATsT 3′(SEQ ID NO：66)化合物号46419

[0662]通过同时混合脂质和siNA溶液，接着是分步渗滤，开发了一种方法来以高效率将siNA包含进脂质纳米颗粒中。采用这种方法，HBV263M和对照HBV263Minv siNA被封装进LNP-086制剂中。发现平均siNA封装效率为84±2％，如通过HPLC和RiboGreen测定法所确定的。平均粒径为167±10nm，多分散度为0.15±0.05。该LNP具有稍正性的表面电荷密度30±2mV。

[0663]起初在HBV细胞培养系统中评估以LNP制剂封装的化学修饰的HBV263M siNA的活性。用HBV263M-LNP单次处理复制HBV的HepG2细胞导致剂量依赖的HBsAg水平降低，IC50为1nM(数据未示出)。LNP封装的HBV263M的体内活性

[0664]为了评价LNP封装的siNA的体内活性，使用了HBV复制的小鼠模型，其中水力注射(HDI)有复制能力的HBV载体导致干细胞内的病毒复制。该模型中，HBV在免疫低下小鼠的肝脏中复制多至80天，引起肝脏中可检测水平的HBV RNA和抗原，以及血清中HBV DNA和抗原的滴度，它们类似于在慢性感染患者中的水平。

[0665]为了评估HBV263M-LNP-086的体内效力和特异性，将其活性与对照siNA HBV263invM-LNP-086进行比较。用0.3、1、或3mg/kg/的剂量处理HBV复制小鼠，持续三天，在最后一次给药后3天确定血清HBVDNA和HBsAg水平。观察到HBV DNA和HBsAg血清滴度的剂量依赖性减少。与对照siNA或PBS组相比，在3、1和0.3mg/kg处理组中分别观察到HBV DNA(图38A)血清滴度3.0，2.3和1.1log10(p<0.0001)的减少以及血清HBsAg(图38B)水平2.4、2.2和1.5log10(p<0.0001)的减少。血清HBVDNA或HBsAg水平在对照siNA和PBS处理组中相同，证实了抗HBV活性的序列特异性以及无非特异性脂质效应。

[0666]在小鼠模型中研究了siNA介导的HBV水平降低的持续时间。用HBV263M-LNP-086或HBV263Minv-LNP-086以3mg/kg/天的剂量处理HBV复制小鼠，持续3天，接着在最后给药后3、7和14天分析HBV血清滴度。抗HBV活性是持续的，最显著的活性在第7天(2.0log 10减少)和第14天(1.5log10减少)被观察到(图39)。对HBV的长期持续siNA活性提示不经常给予该化合物可以是有效的。将HBV小鼠模型用于评价每周给药的效果。用HBV263M-LNP-086或HBV263Minv-LNP-086以3mg/kg/天在第一周的第1和第4天处理小鼠，持续3天，接着每周一次，再持续三周。在第7、14、21、和28天测定血清HBV DNA滴度。与PBS处理组相比，HBV263M-LNP-086处理组在第7、14、21、和28天分别具有1.7、1.7、1.8和1.3log10的HBV血清滴度下降(图40)。这些结果提示，以HBV263M-LNP-086每周给药可维持HBV滴度的降低。

特异siNA介导的对肝HBV RNA的切割

[0667]为了研究由活性HBV263M-LNP-086制剂介导的肝特异HBVRNA切割，用HBV263M-LNP-086以0.3、1、3、10mg/kg/天的剂量或用HBV263invM-LNP对照以10mg/kg的剂量处理HBV复制小鼠，持续三天，并在最后一次给药之后3天测定肝脏HBV RNA的水平。观察到肝脏HBVRNA的剂量依赖性减少(图41)，与10mg/kg剂量的HBV263invM-LNP-086对照相比，在10、3、1和0.3mg/kg HBV263M-LNP处理组分别看到90％、66.5％、18％和4％的减少。

[0668]为了直接证实在小鼠模型中观察到的脏HBV RNA的减少是由于RNAi介导的对HBV RNA的切割引起，5’cDNA末端快速扩增(RACE)分析被用于检测HBV RNA在推测位点的切割。用HBV263M-LNP-086或HBV263Minv-LNP-086以3mg/kg/d的剂量处理HBV复制小鼠。在最后一次给药后的第3、7或14天处死动物，并分离总肝RNA。如果HBV RNA已在预期的靶位点被切割，则衔接序列连接至RNA群的自由5’端以及随后用衔接物和HBV特异的引物进行的RT-PCR被预期会产生145bp的PCR产物。如图42所示，在每个时间点在HBV263活性siNA处理样品中都观察到预期的扩增产物，在没有在HBV263对照样品中观察到。然后对PCR产物亚克隆和测序，证实了衔接序列和HBV263siNA的预期切割位点之间的正确连接。这种结果表明，在肝脏中观察到的HBV RNA减少是由于特异RNAi介导的对肝脏中HBV RNA的切割。此外，在第7和14天时间点检测的特异HBV RNA切割产物证实针对HBV的持续siNA活性是由于对HBV RNA的连续切割。

对siNA诱导的免疫刺激的分析

[0669]配制为用于体内递送的未修饰合成siNA已显示以序列特异的方式诱导炎性细胞因子和干扰素的合成，不论是在人外周血单核细胞(PBMC)中还是在活体小鼠中。研究了与未修饰形式(HBV263R-LNP-086)向比，经化学修饰的HBV263M-LNP-086siNA引起这类免疫应答的可能性。

有义链：5′B GGACUUCUCUCAAUUUUCUTT B 3′(SEQ ID NO：67)化合物号34526

反义链：5′AGAAAAUUGAGAGAAGUCCTT 3′(SEQ ID NO：68)化合物号34527

[0670]CD-1小鼠被注射单一3mg/kg剂量的HBV263M-LNP-086或HBV263R-LNP-086。给药后2.5或8小时将动物处死，收集血液。为了检测峰值血液水平，在2.5小时时间点测量IL-6和TNF-α，同时在注射后8小时分析IFN-γ和IFN-α水平。在HBV263M-LNP-086处理组，平均IL-6水平为33±21pg/ml，该水平与对照组13±4无显著差异(表VII)。此外，在HBV263M-LNP-086处理组，没有观察到对TNF-α IFN-α或IFN-γ的诱导。相反，在HBV263R-LNP-086处理动物中观察到对全部四种细胞因子的显著诱导(表VI)。这些结果证实，与未修饰HBV263R-LNP-086siNA引起的非常强的反应相比，经修饰的HBV263M-LNP-086siNA不在小鼠中诱导细胞因子。HBV263M-LNP-086不诱导细胞因子还表明在小鼠模型中观察到的抗HBV活性是由于特异siNA介导的HBV基因表达沉默。

LNP配制的siNA的药物动力学

[0671]单一3mg/kg给药后，在小鼠中测定HBV263M-LNP-086的药物动力学性能。将杂交法用于检测HBV263M siNA在血浆和肝脏中随时间的变化(图43)。HBV263M在血浆中被快速清除，清除T_1/2为约1.7h。但是，在14d的取样期间在肝脏中检测到HBV263M，清除T_1/2为4天。在1小时时在肝脏中观察到最大浓度31.3±17.8ng/mg(均值±标准偏差)，对应于65±32％的siNA剂量。在14天时，剂量的1.4±0.7％在肝脏中保持完好。在小鼠模型中观察到的长期的siNA介导的抗HBV活性与这种siNA在肝脏中的长期保留很好地相符。

评估HBV263M-LNP毒性

[0672]进行单一剂量研究来确定HBV263M-LNP-086的可能毒性作用。HBV263M-LNP-086给药被动物很好地耐受，没有发病或者死亡。在给予3mg/kg HBV263M-LNP后的第1或14天未观察到体重或肝脏和脾的器官体重比的变化(表VII)。在肝脏或脾中未观察到肉眼可见的形态学变化。此外，没有观察到由于给予HBV263M-LNP-086导致的血清化学变化(表VIII)。总而言之，对于在HBV小鼠模型中显示病毒滴度显著减少所使用的剂量水平，LNP-086封装的HBV263siNA被很好地耐受。

[0673]在这项研究中，描述了新的脂制剂用于siNA输送，证实显著改善了siNA向肝脏的输送，在小鼠HBV感染模型中导致了增加的效力和HBV滴度长时间的降低。在LNP配制的siNA的药物动力学特征和体内siNA活性的效力和持续性之间观察到极好的相关性。与对照siNA相比，三次3mg/kg/天的HBV263M-LNP-086剂量将血清HBV DNA降低2.5至3.0log10。用HBV263M-LNP-086处理导致抗HBV活性的显著持续，在第7天观察到血清HBV DNA 2.0 log10的降低，在第14天观察到1.3 log10的降低。

[0674]这项研究还证实，使用封装在LNP制剂中经化学修饰的siRNA消除了体内siRNA介导的对细胞因子的诱导。综合起来，HBV263M-LNP-086siRNA的有利的药物动力学和效力特性产生了潜在的治疗上相关的抗病毒化合物。这种制剂有效地输送siRNA至肝脏，可被用于破坏内源的疾病相关肝脏靶点。

实施例14：适应症

[0675]与基因表达调节有关的特定状况和疾病状态包括但不限于本文所述的或现有技术中已知的癌症、增殖性、炎性、自身免疫性、神经病性、眼科、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾、感染等疾病、状况或病症，以及涉及或应答细胞或组织中靶(例如，靶蛋白或靶多核苷酸)的水平的其它疾病、状况或病症，单独地或与其它治疗联合。

实施例15：多功能siNA抑制靶RNA表达

多功能siNA设计

[0676]一旦鉴定了用于多功能siNA构建体的靶位点，siNA的每条链被设计为具有例如约18至约28核苷酸长的互补区，其互补于不同的靶核酸序列。每个互补区被设计为具有约4至约22核苷酸的邻近侧翼区，其不互补于靶序列，但是其包括与另一序列的互补区的互补性(参见，例如图16)。还可设计发夹结构(参见，例如图17)。对在不同靶核酸序列间共有的互补的、回文的或重复序列的鉴定可被用于缩短多功能siNA构建体的总长度(参见，例如图18和19)。

[0677]在非限定性实例中，提供了三个其它种类的另外的多功能siNA设计，其使得单个siNA分子能够沉默多个靶。第一种方法采用接头以直接的方式连接siNA(或多功能siNA)。这可使得大部分的有效siNA被连接，无需产生长的连续伸展的RNA，该RNA可能触发干扰素反应。第二种方法是突出部分或连接的多功能设计的树枝状延伸；或者在超分子形式中组织siNA。第三种方法是使用超过30碱基对的螺旋长度。Dicer对这些siNA的加工将显露出新的活性5’反义端。因此，长的siNA可靶向由原始5’端确定的位点以及由Dicer加工所产生的新末端确定的位点。当与常规的多功能siNA(其中有义和反义链各确定一靶)联合使用时，该方法可用于例如靶向4个或更多位点。

I.栓系的多功能siNA(Tethered Bifunctional siNAs)

[0678]基本思想是设计多功能siNA的新方法，其中两反义siNA链退火到单一有义链。该有义链寡核苷酸含有接头(例如，本文所述的非核苷酸接头)和两个退火至反义siNA链的片段(参见图22)。该接头还可任选地包含基于核苷酸的接头。这种方法的可能优点和变化包括，但不限于：

1.该两反义链为独立的。因此，对靶位点的选择不会受到要求两位点之间序列保守的限制。任何两高活性siNA可被组合形成多功能siNA。

2.当与具有同源性的靶位点联合使用，siNA靶向存在于两基因(例如，不同亚型)中的序列，该设计可用于靶向两个以上位点。单个多功能siNA可例如用于靶向两种不同的靶RNA。

3.使用有义和反义链靶向基因的多功能siNA还可加入到栓系多功能设计中。这为靶向单个复合体内6个或更多位点提供了可能性。

4.还可能将两种以上反义链siNA退火至单一栓系有义链。

5.该设计避免了dsRNA的长连续伸展。因此，较不可能引起干扰素反应。

6.所述接头(或与其结合的修饰物，例如本文所述的偶联物)可改善复合物的药物动力学性能或改善其包含进脂质体。引入接头的修饰物影响siNA活性的程度不应达到如果它们直接结合到siNA那样(参见，例如图27和28)。

7.有义链可延伸超出退火的反义链，以提供用于偶联物结合的额外位点。

8.复合物的极性可被改变，使得两个反义3’端均邻近接头，而5’端远离接头，或其组合。

树枝体和超分子siNA

[0679]在树枝体siNA方法中，通过首先合成树枝体模板开始siNA的合成，接着是连接不同功能的siNA。各种构建体绘制在图23中。可被结合的功能siNA的数目仅有所使用的树枝体的尺寸所限制。

达到多功能siNA的超分子方法

[0680]超分子形式简化了树枝体合成的挑战。在该形式中，通过标准RNA化学合成siNA链，接着是让各种互补链退火。单个链合成在5’端含有一siNA的反义有义序列，接着是核酸或合成接头，如己二醇，其又以5’至3’方向跟随有另一siNA的有义链。因此，siNA链的合成可以标准的3’至5’方向进行。三功能和四功能siNA的代表性实例绘制在图24中。基于类似的原则，可设计更多功能的siNA构建体，只要可以实现不同链的有效退火。

Dicer激活的多功能siNA

[0681]采用多靶的生物信息学分析，不同靶序列之间共有的相同序列段可被鉴定出来，从约2至约14核苷酸长。这些相同区可被设计进延长的siNA螺旋(例如，>30碱基对)，以致于通过Dicer的加工可让第二功能性的5’反义位点显露出来(参见，例如图25)。例如，当siNA反义链(例如，双链体中的21核苷酸链，带有3’-TT突出)的第一17核苷酸与靶RNA互补时，在25nM时观察到强的沉默。在相同形式下，仅16核苷酸互补，则观察到80％沉默。

[0682]将这种性质引入到约30至40或更多碱基对的siNA的设计中，产生了另外的多功能siNA构建体。图25中的实例显示了30碱基对的双链体如何能够在Dicer-RNaseIII加工后靶向三个不同的序列；这些序列可以在相同mRNA或分开的RNA上，例如病毒和宿主因子信息或沿给定途径(例如炎性级联)的多点。此外，40碱基对双链体可串联组合多功能设计，以提供靶向四个靶序列的单一双链体。甚至更广泛的方法可包括使用同源序列，以使5个或6个靶被一个多功能双链体所沉默。图25中的实例显示了这如何实现。30碱基对的双链体被Dicer从任一端(未显示8碱基对的片段)切割为22和8碱基对的产物。为了易于呈现，通过dicer产生的突出部分未显示-但可以补上。显示了三个靶序列。通过灰色框指出所需的重叠的序列一致性。如果这是在稳定化学中测试，则母体30b.p.siNA的N为所建议的2’-OH位置位点以允许Dicer切割。注意，通过Dicer RNase III加工30mer双链体不会给出精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产物(其中22+8为主要位点)。因此，通过Dicer的加工将产生一系列活性siNA。另一非限定性实例被显示在如26中。40碱基对的双链体被Dicer从任一端切割为20碱基对的产物。为了易于呈现，通过dicer产生的突出部分未显示-但可以补上。以四种颜色蓝、浅蓝以及红和桔色显示了4种靶序列。通过灰色框指出所需的重叠的序列一致性。这种设计方式可被扩展至较大的RNA。如果化学稳定的siNA被Dicer结合，则策略上定位的核苷酸键使得设计者可切割产物，其为我们多功能设计提供了更广泛的空间。例如，切割产物不限于Dicer标准的约22核苷酸使得多功能siNA构建体能具有例如约3至约15核苷酸的靶序列一致性重叠。

实施例14：诊断用途

[0683]本发明的siNA分子可被用于多种诊断应用，例如在诸如临床、工业、环境、农业和/或研究方面的多种应用中鉴定分子靶(例如，RNA)。siNA分子的这种诊断用途包括利用重建的RNAi系统，例如使用细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物。本发明的siNA分子可被用作诊断工具来研究遗传漂移和患病细胞内的突变，或者检测细胞内源或外源如病毒的RNA的存在。siNA活性和靶RNA的结构之间的紧密关系使得能够在分子的任何区域检测改变了靶RNA的碱基配对和三维结构的突变。通过使用本发明所述的多种siNA分子，可对核苷酸变化作图，这种核苷酸变化对于RNA结构和体内以及细胞和组织内功能都是重要的。以siNA分子对靶RNA的切割可被用于抑制基因表达并确定特定基因产物在疾病进展或感染中的作用。以此方式，其它的遗传靶点可被确定为疾病的重要介导者。通过提供联合治疗的可能性(例如，靶向不同基因的多种siNA分子，与已知小分子抑制剂偶联的siNA分子，或者以组合siNA分子和/或其它化学或生物学分子进行的间歇治疗)，这些实验将导致对疾病进展更好地治疗。本发明siNA分子的其它体外用途在现有技术中是已知的，包括检测是否存在与疾病、感染或相关状况的mRNA。通过采用标准方法(如，荧光共振发射转移)确定在用siNA处理后是否存在切割产物来检测这种RNA。

[0684]在特定的实施例中，仅切割野生型或突变体形式的靶RNA被用于测定。第一siNA分子(即，仅切割野生型形式的靶RNA的那些)被用于鉴定样品中存在的野生型RNA，第二siNA分子(即，仅切割突变体形式的靶RNA的那些)被用于鉴定样品中的突变体RNA。作为反应对照，野生型和突变体RNA的合成底物被两siNA分子切割，用于显示反应中的相对siNA效率以及没有对“非靶向”RNA种类的切割。来自合成底物的切割产物也用来产生大小标志物，用于分析样品群中的野生型和突变体RNA。因而，每个分析都需要两种siNA分子、两种底物和一个未知样品，它们被组合进6个反应。采用RNase保护测定法来确定切割产物的存在，以便每种RNA的全长和切割片段可在聚丙烯酰胺凝胶的一个泳道中被分析。并非绝对需要对结果定量才能了解突变体RNA的表达和靶细胞中所期望的表型变化的推测风险。其蛋白产物参与表型(即，疾病相关的或感染相关的)产生的mRNA的表达足以确定风险。如果为两转录本使用类似特异活性的探针，则RNA水平的定性比较就足够了，降低了初始诊断的成本。无论RNA水平被定性比较还是定量比较，较高的突变体形式与野生型类型比例都与较高的风险相关。

[0685]说明书中提到的所有专利和出版物都指明了本发明所属领域技术人员的技术水平。本公开中引用的所有文献都通过参考并入本文，其程度如同每篇文献都通过参考以其整体独自并入。

[0686]本领域技术人员可容易地意识到，本发明很适合于完成这些任务并实现所提及的和其固有的目的和优点。作为当前优选实施方案代表的本文所述方法和组合物为示例性的，不意味着对本发明范围的限制。本领域技术人员会发现其变化和其它用途，这些也包括在本发明精神范围内，由权利要求的范围所限定。

[0687]对本领域人员来说显而易见的是，在不脱离本发明范围和精神情况下，可对本文公开的发明进行各种替换和修改。因而，这些其它的实施方案位于本发明以及所附权利要求的范围内。本发明指导了本领域技术人员测试本文所描述的化学修饰的各种组合和/或替换，以生成具有改善的介导RNAi活性的活性的构建体。这种改善的活性可包括改善的稳定性、改善的生物利用度和/或改善的对介导RNAi的细胞反应的活化。因此，本文所述的具体实施方案不是限制性的，本领域技术人员可容易地意识到，无需过度实验就可测试本文所述修饰的特定组合，以鉴定具有改善的RNAi活性的siNA分子。

[0688]在此示例性描述的本发明可适合于在缺少本文未明确公开的任何元素或限制下实施。因此，例如在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本由...组成”以及“由...组成”的任一个可以用另两个术语之一替换。所采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制，使用这些术语和表达无意排除所显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是应意识到在本发明范围内各种变化是可能的。因此，应理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案被明确公开，但本领域技术人员可诉诸于本文所述概念的任选的特征、修饰和变化，以及这些修饰和变化被认为是位于本说明书和所附权利要求所确定的本发明范围内。

[0689]此外，当本发明的特征或方面以Markush组或其它备选组的方式描述时，本领域技术人员会意识到，本发明还以该Markush组或其它组的任何单一成员或亚组成员的方式被描述。

表1

经化学修饰siNA构建体的稳定化学物的非限定性实例

CAP＝任何末端帽，参见例如图10

所有Stab 00-34化学物可包括3’-末端胸苷(TT)残基

所有Stab 00-34化学物通常包含约21核苷酸，但可如本为所述有变化

所有Stab 00-36化学物也可在有义或信使链中从反义链或引导链5’端起确定的双链核酸双链体第11碱基配对位置处包括单核糖核苷酸(参见图6C)

S＝有义链

AS＝反义链

^*Stab 23具有邻近3’-CAP的单核糖核苷酸

^*Stab 24和Stab 28在5’-末端具有单核糖核苷酸

^*Stab 25，Stab 26，Stab 27，Stab 35和Stab 36在5’-末端具有三核糖核苷酸

^*Stab 29，Stab 30，Stab 31，Stab 33，和Stab 34从5’-末端起的前三个核苷酸位置的任何嘌呤为核糖核苷酸

p＝硫代磷酸酯键

Stab 35在3’-突出具有2’-O-甲基U和在5’-末端具有三个核糖核苷酸

Stab 36具有互补于靶序列的2’-O-甲基突出(天然产生的突出)和在5’-末端具有三个核糖核苷酸

表III

A.25μmol合成循环ABI 394仪器

试剂	当量	量	等候时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊RNA
试剂	当量	量	等候时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊RNA	亚磷酰胺	6.5	163μL	45sec	2.5min	7.5min
S-乙基四唑	23.8	238μL	45sec	2.5min	7.5min	亚磷酰胺	6.5	163μL	45sec	2.5min	7.5min
S-乙基四唑	23.8	238μL	45sec	2.5min	7.5min	醋酸酐	100	233μL	5sec	5sec	5sec
N-甲基咪唑	186	233μL	5sec	5sec	5sec	醋酸酐	100	233μL	5sec	5sec	5sec
N-甲基咪唑	186	233μL	5sec	5sec	5sec	TCA	176	2.3mL	21sec	21sec	21sec
碘	11.2	1.7mL	45sec	45sec	45sec	TCA	176	2.3mL	21sec	21sec	21sec
碘	11.2	1.7mL	45sec	45sec	45sec	Beaucage	129	645μL	100sec	300sec	300sec
乙腈	NA	6.67mL	NA	NA	NA	Beaucage	129	645μL	100sec	300sec	300sec

B.0.2μmol合成循环ABI 394仪器

试剂t	当量	量	等侯时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊RNA
试剂t	当量	量	等侯时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊RNA	亚磷酰胺	15	31μL	45sec	233sec	465sec
S-乙基四唑	38.7	31μL	45sec	233min	465sec	亚磷酰胺	15	31μL	45sec	233sec	465sec
S-乙基四唑	38.7	31μL	45sec	233min	465sec	醋酸酐	655	124μL	5sec	5sec	5sec
N-甲基咪唑	1245	124μL	5sec	5sec	5sec	醋酸酐	655	124μL	5sec	5sec	5sec
N-甲基咪唑	1245	124μL	5sec	5sec	5sec	TCA	700	732μL	10sec	10sec	10sec
碘	20.6	244μL	15sec	15sec	15sec	TCA	700	732μL	10sec	10sec	10sec
碘	20.6	244μL	15sec	15sec	15sec	Beaucage	7.7	232μL	100sec	300sec	300sec
乙腈	NA	264mL	NA	NA	NA	Beaucage	7.7	232μL	100sec	300sec	300sec

C.0.2μmol合成循环96孔仪器

试剂	当量：DNA/2′-O-甲基/核糖	量：DNA/2′-O-甲基/核糖	等侯时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊核糖
试剂	当量：DNA/2′-O-甲基/核糖	量：DNA/2′-O-甲基/核糖	等侯时间^＊DNA	等侯时间^＊2′-O-甲基	等侯时间^＊核糖	亚磷酰胺	22/33/66	40/60/120μL	60sec	180sec	360sec
S-乙基四唑	70/105/210	40/60/120μL	60sec	180min	360sec	亚磷酰胺	22/33/66	40/60/120μL	60sec	180sec	360sec
S-乙基四唑	70/105/210	40/60/120μL	60sec	180min	360sec	醋酸酐	265/265/265	50/50/50μL	10sec	10sec	10sec
N-甲基咪唑	502/502/502	50/50/50μL	10sec	10sec	10sec	醋酸酐	265/265/265	50/50/50μL	10sec	10sec	10sec
N-甲基咪唑	502/502/502	50/50/50μL	10sec	10sec	10sec	TCA	238/475/475	250/500/500μL	15sec	15sec	15sec
碘	6.8/6.8/6.8	80/80/80μL	30sec	30sec	30sec	TCA	238/475/475	250/500/500μL	15sec	15sec	15sec
碘	6.8/6.8/6.8	80/80/80μL	30sec	30sec	30sec	Beaucage	34/51/51	80/120/120	100sec	200sec	200sec
乙腈	NA	1150/1150/1150μL	NA	NA	NA	Beaucage	34/51/51	80/120/120	100sec	200sec	200sec

·等侯时间不包括输送时的接触时间

·串联合成利用了连接分子的双偶联

表IV

脂质纳米颗粒(LNP)制剂

制剂#	组成	摩尔比
制剂#	组成	摩尔比	L051	CLinDMA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	48/40/10/2
L053	DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	30/20/48/2	L051	CLinDMA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	48/40/10/2
L053	DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	30/20/48/2	L054	DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	50/20/28/2
L069	CLinDMA/DSPC/胆固醇/PEG-胆固醇	48/40/10/2	L054	DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	50/20/28/2
L069	CLinDMA/DSPC/胆固醇/PEG-胆固醇	48/40/10/2	L073	pCLinDMA或CLin DMA/DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	25/25/20/28/2
L077	eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol	48/40/10/2	L073	pCLinDMA或CLin DMA/DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG	25/25/20/28/2
L077	eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol	48/40/10/2	L080	eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	48/40/10/2
L082	pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	48/40/10/2	L080	eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	48/40/10/2
L082	pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	48/40/10/2	L083	pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol	48/40/10/2
L086	CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG/亚麻醇	43/38/10/2/7	L083	pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol	48/40/10/2
L086	CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG/亚麻醇	43/38/10/2/7	L061	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG	52/45/3
L060	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG N/P比例为5	52/45/3	L061	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG	52/45/3
L060	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG N/P比例为5	52/45/3	L097	DMLBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	50/20/28
L098	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为3	52/45/3	L097	DMLBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG	50/20/28
L098	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为3	52/45/3	L099	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为4	52/45/3
L100	DMOBA/DOBA/3％PEG-DMG，N/P比例为3	52/45/3	L099	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为4	52/45/3

L101	DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇	52/45/3
L101	DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇	52/45/3	L102	DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇，N/P比例为5	52/45/3
L103	DMLBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇	52/45/3	L102	DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇，N/P比例为5	52/45/3
L103	DMLBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇	52/45/3	L104	CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-胆固醇/亚麻醇	43/38/10/2/7
L105	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	52/45/3	L104	CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG-胆固醇/亚麻醇	43/38/10/2/7
L105	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	52/45/3	L106	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为3	67/30/3
L107	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为1.5	52/45/3	L106	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为3	67/30/3
L107	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为1.5	52/45/3	L108	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	67/30/3
L109	DMOBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	50/20/28/2	L108	DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	67/30/3
L109	DMOBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P比例为2	50/20/28/2	L110	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	52/45/3
L111	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	67/30/3	L110	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	52/45/3
L111	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	67/30/3	L112	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	52/45/3
L113	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	67/30/3	L112	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	52/45/3
L113	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为1.5	67/30/3	L114	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	52/45/3
L115	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	67/30/3	L114	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	52/45/3
L115	DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	67/30/3	L116	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	52/45/3
L117	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	52/45/3	L116	DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P比例为2	52/45/3

N/P比例＝脂质和核酸之间的氮:磷比例

CLinDMA结构

pCLinDMA结构

eCLinDMA结构

PEG-n-DMG结构

DMOBA结构

DMLBA结构

DOBA结构

DSPC

胆固醇

2KPEG-胆固醇

2KPEG-DMG

表V

模式描述	模式#	分数
模式描述	模式#	分数	位置1的G或C	1	5
位置19的A或U	2	10	位置1的G或C	1	5
位置19的A或U	2	10	位置15-19之间富含A/U	3	10
4Gs或4Cs串(不优选)	4	-100	位置15-19之间富含A/U	3	10
4Gs或4Cs串(不优选)	4	-100	位置1-5之间富含G/C	5	10
位置18的A或U	6	5	位置1-5之间富含G/C	5	10
位置18的A或U	6	5	位置10的A或U	7	10
位置13的G(不优选)	8	-3	位置10的A或U	7	10
位置13的G(不优选)	8	-3	位置13的A	9	3
位置9的G(不优选)	10	-3	位置13的A	9	3
位置9的G(不优选)	10	-3	位置9的A	11	3
位置14的A或U	12	10	位置9的A	11	3

表V：Sirna算法，描述了多种模式以及它们预测高活性siNA的分数。给出的所有位置针对19-mer siNA的有义链。

表VI.用3mg/kg LNP配制的siRNA单次注射处理的CD-1小鼠中的免疫刺激。IL-6和TNF-α水平在注射后2.5小时测定，而IFN-γ和IFN-α水平在处理后8小时测定。数值以平均值±标准偏差显示，n＝5。

^aBLOD-低于检测极限

^bBLOQ-低于定量极限

表VII.给予小鼠3mg/kgHBV263-LNP-086或PBS后1天和14天的体重和器官重量。在每个时间点，每个剂量组的五只动物被处死。处死前收集体重。数值以平均值±标准偏差显示。

^an＝10，对于给药后1天的体重

Claims

1.一种包括有义链和反义链的双链核酸分子，其具有结构SIX：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SIX

其中上链为所述双链核酸分子的有义链，下链为反义链；所述反义链包含互补于乙型肝炎病毒(HBV)RNA的序列；每个N独立地为核苷酸；每个B为末端帽部分，它可存在或不存在；(N)表示非碱基配对的或突出核苷酸，其可为未经修饰的或经化学修饰的；[N]表示为核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地为约0至约4的整数；X3为约9至约30的整数；X4为约11至约30的整数，前提是X4和X5的总和在约17-36之间；X5为约1至约6的整数；以及

(a)任何存在于所述反义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于所述反义链中的嘌呤核苷酸独立地为2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；

(b)任何存在于所述有义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于所述有义链中的嘌呤核苷酸独立地为2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、或2’-脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸的组合；以及

2.一种包括有义链和反义链的双链核酸分子，其具有结构SX：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SX

(a)任何存在于所述反义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于所述反义链中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；

(b)任何存在于所述有义链中的嘧啶核苷酸为核糖核苷酸；任何存在于所述有义链中的嘌呤核苷酸为核糖核苷酸；以及

3.一种包括有义链和反义链的双链核酸分子，其具有结构SXI：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SXI

(b)任何存在于所述有义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于所述有义链中的嘌呤核苷酸为核糖核苷酸；以及

4.一种包括有义链和反义链的双链核酸分子，其具有结构SXII：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SXII

(b)任何存在于所述有义链中的嘧啶核苷酸为2’-脱氧-2’-氟核苷酸；任何存在于所述有义链中的嘌呤核苷酸为脱氧核糖核苷酸；以及

5.一种包括有义链和反义链的双链核酸分子，其具有结构SXIII：

B————————N_X3————————(N)_X2 B-3′

B(N)_X1————————N_X4————————[N]_X5-5′

SXIII

(a)任何存在于所述反义链中的嘧啶核苷酸为具有核糖样、Northern或A型螺旋构型的核苷酸；除了[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸之外，任何存在于所述反义链中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；

(b)任何存在于所述有义链中的嘧啶核苷酸为具有核糖样、Northern或A型螺旋构型的核苷酸；任何存在于所述有义链中的嘌呤核苷酸为2’-O-甲基核苷酸；以及

6.根据权利要求1的双链核酸分子，其中X5＝1、2、或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30，以及X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

7.根据权利要求2的双链核酸分子，其中X5＝1、2、或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30，以及X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

8.根据权利要求3的双链核酸分子，其中X5＝1、2、或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30，以及X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

9.根据权利要求4的双链核酸分子，其中X5＝1、2、或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30，以及X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

10.根据权利要求5的双链核酸分子，其中X5＝1、2、或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30，以及X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

11.根据权利要求1的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3’和5’端和所述反义链的3’端。

12.根据权利要求2的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3’和5’端和所述反义链的3’端。

13.根据权利要求3的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3’和5’端和所述反义链的3’端。

14.根据权利要求4的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3’和5’端和所述反义链的3’端。

15.根据权利要求5的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3’和5’端和所述反义链的3’端。

16.根据权利要求1的双链核酸分子，在所述siNA分子的有义链、反义链或有义链和反义链的3’端在第一末端(N)处包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。

17.根据权利要求2的双链核酸分子，在所述siNA分子的有义链、反义链或有义链和反义链的3’端在第一末端(N)处包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。

18.根据权利要求3的双链核酸分子，在所述siNA分子的有义链、反义链或有义链和反义链的3’端在第一末端(N)处包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。

19.根据权利要求4的双链核酸分子，在所述siNA分子的有义链、反义链或有义链和反义链的3’端在第一末端(N)处包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。

20.根据权利要求5的双链核酸分子，在所述siNA分子的有义链、反义链或有义链和反义链的3’端在第一末端(N)处包含一个或多个核苷酸间硫代磷酸酯键。

21.一种包含在药学可接受的载体或稀释剂中的权利要求1的双链核酸分子的组合物。