KR20100069679A - ＨＢＶ 또는 ＨＣＶ의 유전자 발현을 하향 조절하는 ｓｉＲＮＡ의 혈청 안정성 향상 및 면역 반응 저감 방법 - Google Patents

ＨＢＶ 또는 ＨＣＶ의 유전자 발현을 하향 조절하는 ｓｉＲＮＡ의 혈청 안정성 향상 및 면역 반응 저감 방법 Download PDF

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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)의 바이러스 유전자 발현에 대한 RNA 간섭을 매개하는 작은 간섭 RNA(siRNA)의 혈청 안정성을 향상시키고 면역자극 특성을 저감시키는 방법이 제공된다.

Description

ＨＢＶ 또는 ＨＣＶ의 유전자 발현을 하향 조절하는 ｓｉＲＮＡ의 혈청 안정성 향상 및 면역 반응 저감 방법{Method for Enhancing Serum Stability and Lowering Immune Response of siRNA Down-Regulating Gene Expression of HBV or HCV}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)의 유전자 발현에 대한 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 작은 간섭 RNA(siRNA)의 혈청 안정성 향상 및 면역자극 특성 저감 방법에 관한 것으로, 이 방법은 siRNA 중 선별된 잔기를 변형시키는 것을 포함한다.
짧은 간섭 RNA로도 알려진 작은 간섭 RNA(siRNA)는 생물학에서 다양한 역할을 수행하는 약 19-29개 뉴클레오타이드 길이의 이중가닥 RNA(dsRNA)의 한 부류이다. 특히, siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 관여하는데, 여기서 siRNA는 siRNA와 서열 상동성(homology)을 갖는 메신저 RNA(mRNA)를 파괴하여 특정 유전자의 발현을 방해한다.
RNAi는 많은 진핵생물에서 보존되어 온 전사후(post-trancriptional) 유전자 조절 과정으로서, 최근에 mRNA 수준에서 유전자 발현을 침묵(silencing)시키는 이전 기술들의 매우 강력한 대안으로 부각되고 있다.
siRNA는 마치 다중 전환 효소(multiple turnover enzyme)처럼 재활용되는데, 하나의 siRNA 분자가 대략 1,000개의 mRNA 분자를 파괴할 수 있다. 그러므로, mRNA의 siRNA-매개 RNAi 분해가 현재 이용가능한 어떠한 기술보다도 표적 유전자의 발현을 억제하는데 훨씬 효과적이다.
siRNA-유도 RNAi 분해의 치료제로서의 가능성은 siRNA-유도에 의한 HIV-1 감염의 억제(Norvina et al., Nat. Med., 8: 681-686 (2002)) 및 신경독소 폴리글루타민 질병 단백질 발현 억제(Xia et al., Nat. Biotech., 20:1006-1010 (2002))를 포함하는 최근의 몇 가지 연구들에서 입증되었다.
siRNA는 또한 다양한 형질감염 방법에 의해 외인성으로(인공적으로) 세포로 도입되어 특정 유전자의 넉다운(knockdown)을 유도할 수 있다. 기본적으로 서열이 알려진 임의의 유전자도 서열 상보성에 기초하여 제작된 적절한 siRNA를 이용하여 이와 같이 표적화할 수 있다. 이로써 siRNA는 포스트-게놈 시대에 유전자 기능 및 약물 표적 검증 연구를 위한 중요한 수단이 되었다.
최근 많은 연구들은 (1) 선택적 및 효과적으로 siRNA의 세포내 흡수를 향상시키는 전신적 siRNA 전달 기술을 개발함으로써, 그리고 (2) 혈청 안정성 및 면역-안전성 모두를 개선하기 위해 siRNA에 화학적 변형을 도입함으로써, 임상 적용을 위해 RNAi의 특이성 및 안전성을 개선하는데 초점을 맞추고 있다(Davidson, Nat . Biotechnol., 24:951-952 (2006); Sioud and Furset, J. Biomed . Biotechnol ., 2006:23429 (2006)).
뉴클레아제에 대한 안정성 및 효능을 현저히 향상시키기 위해, 핵산 분자에 도입될 수 있는 당, 염기 및 인산 변형을 설명한 본 기술분야의 몇 가지 예들이 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오타이드는 이들의 안정성 및/또는 생물학적 활성을 향상시키기 위해, 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로 및 2'-O-메틸과 같은 뉴클레아제 저항성 기로 변형된다. 핵산분자의 당(sugar) 변형이 본 기술분야에서 광범위하게 설명되어 왔다(PCT 국제공개 WO 92/07065호, WO 93/15187호, WO 97/26270호 및 WO 98/13526호 참조; 상기 모든 간행물들은 참조에 의해 본 명세서에 온전히 통합됨).
뉴클레오타이드에 보호기를 부가하거나 폴리뉴클레오타이드 사슬의 백본을 바꿈으로써 변형된 RNA는 개선된 안정성을 얻을 수 있다. 하지만, 천연형 RNA보다 RNase 분해에 대한 저항성이 높은 몇 가지 형태의 변형된 RNA 분자들은 RNAi 능력이 감소하였다(Parrish et al ., Mol . Cell ., 5:1077-87 (2000)).
나아가, 몇몇 연구들은 양이온 전달 매체(vehicle)에 봉입된 siRNA가 TRL3, TLR7 및 TLR8과 같은 톨-유사(toll-like) 수용체(Hornung et al ., Nat . Med ., 11:263-270 (2005); Iwasaki and Medzhitov, Nat . Immunol ., 5:987-995 (2004); Judge et al ., Nat . Biotechnol ., 23:457-462 (2005)), dsRNA-의존성 단백질 키나아제(PKR) 및 레티노산 유도성 유전자-1(retinoic acid inducible gene-1; RIG-1)과 같은 세포질 RNA-결합 단백질(Marques et al ., Nat . Biotechnol ., 24:559-565 (2006); Sledz et al ., Nat . Cell . Biol ., 5:834-839 (2003))을 활성화시킴으로써 선천성 면역반응을 자극할 수 있음을 보여주었다. 또한, siRNA 내의 어떤 RNA 서열 모티프나 높은 GU- 또는 U-함량이 염증성 사이토카인과 인터페론(IFN)의 발현을 자극하는데 있어 중요한 결정요인이라는 것과, 그러한 부분(moiety)을 화학적으로 변형시키면 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)와 쥐에서의 비특이적인 면역 반응이 없어진다는 것이 밝혀졌다(Hornung et al., supra; Judge et al ., supra; Sioud, Eur. J. Immunol . 36:1222-1230 (2006)).
그러므로, RNAi 능력을 유지하면서도 증가된 안정성 및 감소된 면역 독성을 갖는 siRNA 분자를 세포내로 도입시키는 보다 강력한 방법을 개발할 필요가 있다.
그러므로, 본 발명자들은 광범위한 연구와 개발 노력을 통해 RNAi 능력을 유지하면서도, 증가된 안정성을 갖고 비변형 siRNA와 연관된 의도치 않은 면역 반응을 감소시키는 siRNA 분자를 세포 내로 도입시키는 방법을 성공적으로 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, siRNA의 안티센스 가닥 내의 어떠한 잔기도 변형시키지 않고 siRNA의 센스 가닥 내 우리딘(uridine) 잔기만을 변형시킴으로써, 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지며 HBV 또는 HCV의 바이러스 유전자 발현에 대한 RNAi를 매개하는 RNA 이중체(duplex)인 siRNA의 혈청 안정성을 향상시키고 면역자극 특성을 저감시키는 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명은 siRNA의 HBV나 HCV에 대한 RNAi 능력은 유지하면서도 혈청 안정성은 증가시키고 선천성 면역 반응은 낮추기 위해, 각 siRNA의 센스 가닥 중 우리딘 잔기를 그의 리보오스 고리의 2'-OH기를 2'-O-메틸기 또는 2'-플루오로기로 바꿈으로써 변형시킨, 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3 및 4로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 유효량의 상기 변형된 siRNA를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 B형 간염 또는 C형 간염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 기타 목적과 특징들은 첨부한 도면과 함께 하기의 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1a 및 1b는 비변형 siRNA 및 화학적으로 변형된 siRNA의 혈청 안정성을 나타내며;
도 2a는 생체 내에서 DTC-Apo-봉입된 비변형 siRNA에 의한 선천성 면역 반응의 IFN 자극을 나타내고;
도 2b는 생체 내에서 DTC-Apo-봉입된 비변형 siRNA에 의한 선천성 면역 반응의 사이토카인 자극을 나타내며;
도 3a는 생체 내에서 비변형 siHBx1과 비교하여 DTC-Apo 리포좀에 봉입된 화학적으로 변형된 siHBx1 분자에 의한 IFN 유도의 억제를 나타내고;
도 3b는 생체 내에서 비변형 siHBx3 및 siHCV와 비교하여 DTC-Apo 리포좀에 봉입된 화학적으로 변형된 siHBx3 및 siHCV 분자에 의한 IFN 유도의 억제를 각각 나타내며;
도 4a는 HBV 마우스 모델에서 DTC-Apo 리포좀에 봉입된 비변형 및 화학적으로 변형된 siHBx1 이중체의 생체 내 유전자 침묵 활성을 나타낸 그래프이고;
도 4b는 비변형 siHBx1 및 siHBx-OMe-U의 유전자 침묵 활성의 노던 블롯 분석 결과이며;
도 5a는 생체 내에서 DTC-Apo-봉입된 비변형 siHCV에 의한 코어 단백질 발현의 투여량-의존적 감소를 나타내고;
도 5b 및 5c는 간 조직에서 웨스턴 블롯(도 5b) 및 RT-PCR 분석(도 5c)을 이용하여 확인한 DTC-Apo 내에 봉입된 siHCV-OMe-U의 개선된 유전자 침묵 활성을 나타낸다.
본 발명은 siRNA의 안티센스 가닥 내의 어떠한 잔기도 변형시키지 않고 siRNA의 센스 가닥 내 우리딘(uridine) 잔기만을 변형시킴으로써, 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지며 HBV 또는 HCV의 바이러스 유전자 발현에 대한 RNAi를 매개하는 RNA 이중체(duplex)인 siRNA의 혈청 안정성을 향상시키고 면역자극 특성을 저감시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, HBV나 HCV의 바이러스 유전자 발현에 대한 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 한 어떠한 siRNA라도 사용될 수 있다.
본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적인 단일 가닥 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 이룬 단일 분자를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA의 하나 또는 양쪽 가닥은 3' 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "3' 오버행"은 이중체 RNA 가닥의 3'-말단으로부터 확장되는 적어도 하나의 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 의미한다.
siRNA 분자의 양쪽 가닥이 3' 오버행을 포함하는 일 실시예에 있어서, 상기 오버행의 길이는 각 가닥마다 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 3' 오버행은 siRNA의 양쪽 가닥에 존재하고, 길이는 2개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA의 각 가닥은 디티미딜산("TT") 또는 디우리딜산("uu")의 3' 오버행을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 siRNA는 19 내지 29개 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 21 내지 27개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 21개 또는 27개 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
본 발명의 siRNA는 본 기술분야의 당업자에게 알려진 수많은 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 siRNA는 본 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 siRNA는 적절히 보호된 리보뉴클레오타이드 포스포아미다이트(phosphoramidite) 및 일반적인 DNA/RNA 합성기(synthesizer)를 이용하여 화학적으로 합성된다. 상기 siRNA는 두 개의 개별적인 상보적 RNA 분자나 두 개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로 합성될 수 있다. 합성 RNA 분자 또는 합성 시약을 상업적으로 공급하는 업체에는 프로리고사(Proligo, Hamburg, Germany), 다르마콘 리서치사(Dharmacon Research, Lafayette, CO, USA), 피어스 케미칼사(Pierce Chemical, part of Perbio Science, Rockford, Ill., USA), 글렌 리서치사(Glen Research, Sterling, Va., USA), 켐진스사(ChemGenes, Ashland, Mass., USA) 및 크루아켐(Cruachem, Glasgow, UK)이 포함된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA("siHBx1"라 함) 또는 서열번호 3 및 4로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA("siHBx3"이라 함)가 HBV-특이적 siRNA로 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA("siHCV"라 함)가 HCV-특이적 siRNA로 사용될 수 있다.
siHBx1, siHBx3 및 siHCV의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 하기 표 1에 기재되어 있다. 본 발명의 siRNA들의 각 가닥은 디티미딜산("TT")의 3' 오버행을 가지며 21개 길이의 뉴클레오타이드를 형성한다.
siRNA 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 서열번호
siHBx1 5´-GAGGACUCUUGGACUCUCA-3´ 서열번호 1
siHBx3 5´-CGUCCGACCUUGAGGCAUA-3´ 서열번호 3
siHCV 5´-GGCGACAGCCUAUCCCCAA-3´ 서열번호 5
siCont 5´-ACUACCGUUGUUAUAGGUG-3´ 서열번호 7
* siCont는 비특이적 대조군 siRNA를 의미함
siHBx1 및 siHBx3는 HBV 게놈의 X 암호화 영역에서 각각 뉴클레오타이드 1653-1673 및 1682-1702를 표적으로 한다(Shin et al ., Virus Res., 119:146-153 (2006)). siHCV는 HCV 게놈의 코어 암호화 영역에서 뉴클레오타이드 521-541을 표적으로 한다(Kim et al ., Virus Res., 122:1-10 (2006)).
siRNA의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 변형은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, siHBx1, siHBx3 및 siHCV의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 리보오스 고리의 2'-OH 위치에서 2'-O-메틸(2'-OMe) 또는 2'-플루오로(2'-F)로 화학적으로 변형된다. 구체적으로, siRNA의 센스 가닥 내의 우리딘(U) 잔기가 그의 리보오스 고리의 2'-OH기를 2'-OMe 기로 바꿔줌으로써 변형된다.
본 발명에 사용된 다양한 화학적으로 변형된 siRNA들이 하기 표 2에 열거되어 있다.
siRNA 확인 화학적 변형
센스 가닥 안티센스 가닥
비변형 비변형 비변형
OMe-U U 잔기가 2'-OMe로 변형됨 비변형
OMe-UC U 및 C 잔기가 2'-OMe로 변형됨 비변형
OMe-UG U 및 G 잔기가 2'-OMe로 변형됨 비변형
OMe-UA U 및 A 잔기가 2'-OMe로 변형됨 비변형
F-UC U 및 C 잔기가 2'-F로 변형됨 비변형
OMe/OMe-UC/UC U 및 C 잔기가 2'-OMe로 변형됨 U 및 C 잔기가 2'-OMe로 변형됨
OMe/F-UC/UC U 및 C 잔기가 2'-OMe로 변형됨 U 및 C 잔기가 2'-F로 변형됨
예를 들어, "siHBx1-OMe-U"는 siHBx1의 센스 가닥 내 우리딘(U) 잔기가 2'-OMe로 변형되고, siHBx1의 안티센스 가닥 내 잔기는 변형되지 않은 siRNA를 의미한다. 또한, "siHBx1-OMe/OMe-UC/UC"는 센스 가닥 내 피리미딘 잔기, 즉 우리딘(U) 및 시티딘(C)이 2'-OMe로 변형되고, 안티센스 가닥 내 U 및 C 역시 2'-OMe로 변형된 siRNA를 의미한다.
또한, 본 발명은 siRNA의 HBV 또는 HCV에 대한 RNAi 능력은 유지하면서도 혈청 안정성은 증가시키고 선천성 면역반응은 낮추기 위해, 각 siRNA의 센스 가닥의 우리딘 잔기가 그의 리보오스 고리의 2'-OH를 2'-OMe기 또는 2'-플루오로기로 바꿔줌으로써 변형된, 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3 및 4로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 변형된 siRNA의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서의 B형 간염 또는 C형 간염을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 대상은 인간을 포함한 포유류일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, siRNA의 "유효량(effective amount)"은 대상에서 HBV나 HCV mRNA의 RNAi-매개 분해를 일으키기에 충분한 양을 의미한다. 본 기술분야의 당업자라면 대상의 신장 및 체중, 대상의 연령, 건강 및 성별, 투여 경로(국소 또는 전신 투여) 여부와 같은 인자들을 고려하여 주어진 대상에게 투여될 본 발명의 siRNA의 유효량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 본 발명의 siRNA의 유효량은 약 1 nM 내지 약 100 nM의 범위이며, 바람직하게는 약 2 nM 내지 약 50 nM, 보다 바람직하게는 약 2.5 nM 내지 약 10 nM의 범위이다. 더 많거나 더 적은 양의 siRNA도 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 siRNA는 전달 시약과 함께 대상에 투여될 수 있다. 본 발명의 siRNA와 함께 투여하기 위한 적절한 전달 시약에는 리포좀, 중합체, 리포좀과 단백질의 혼합물 및 중합체와 단백질의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 리포좀은 리포펙틴 또는 리포펙타민일 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 간을 특이적으로 표적화하는 아포지단백(apolipoprotein) A-I-데코레이티드(decorated) DTC 리포좀(DTC-Apo)이 바람직한 전달 시약으로 사용될 수 있다. DTC-Apo는 DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판)과 콜레스테롤을 혼합하여 수득될 수 있는 DTC를 아포지단백 A-I(apo A-I; GenBank Accession No. NM_000039)과 10:1(w/w)의 지질/단백질 비율로 4℃에서 하룻밤 동안 반응하여 제조할 수 있다. Apo A-I은 인간 혈장으로부터 분리 및 정제하여 수득하거나, 이를 생산하는 재조합 벡터를 사용하여 수득할 수 있다. DTC-Apo는 고효율 및 저독성으로 RNA를 간섭하기 위하여 siRNA를 간 세포나 조직으로 효과적으로 전달한다.
표적 mRNA의 RNA-매개 분해는 mRNA나 단백질을 분리하고 정량화하는 일반 기술을 이용하여 대상의 세포 내 표적 mRNA나 단백질 양을 측정함으로써 탐색할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 배양 세포로 전달될 수 있으며, 표적 mRNA의 양은 노던 블롯 기술 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정할 수 있다.
바람직한 일 실시예에 있어서, 화학적으로 변형된 siRNA의 혈청 안정성이 측정된다. 리보핵산을 피리미딘 위치에서 변형시키면 혈청 안정성을 현저히 증가시킬 수 있다. 흥미롭게도, 센스 가닥 U 잔기만이 2'-OMe로 치환된 siHBx1-OMe-U의 안정성은 siHBx1-OMe-UC 및 siHBx1-OMe-UA와 같이 이중으로 화학적 변형된 siRNA와 유사하였다. 이러한 데이터들은 화학적으로 변형된 siRNA 이중체들의 혈청 안정성이 변형된 뉴클레오타이드 서열의 수 뿐만 아니라 조성 및/또는 위치에 의해 결정된다는 것을 제시한다.
본 발명의 화학적으로 변형된 siRNA의 면역자극 및 RNAi 활성과 관련된 특정 실시예 중 하나는 DTC-Apo 리포좀에 봉입된 비변형 siRNA(예를 들어, siHBx1, siHBx3 및 siHCV)가 IFN 및 염증성 사이토카인 반응을 활성화한다는 것을 밝히고 있으며, 이는 상기 표적화 부분이 선천성 면역 반응에 의한 리포좀/siRNA 복합체의 흡수 또는 siRNA에 의한 TLR의 자극에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
몇몇 이전 보고들(예를 들어, Chiu and Rana, RNA , 9:1034-1048)과 일치하나, 다른 보고들(예를 들어, Morrissey et al ., Nat . Biotechnol., 23:1002-1007 (2005); Morrissey et al ., Hepatology, 41:1349-1356 (2005))과는 상반되게, 양쪽 가닥에 있는 모든 피리미딘의 2'-리보오스 위치를 전반적으로 2'-OMe나 2'-F 중 어느 하나로 화학적으로 변형시키면, 이런 방식으로 변형된 siRNA가 혈청 안정성이 증가하고 선천성 면역 반응 경로를 활성화시키지 않음에도 불구하고, 침묵 활성이 상당히 감소하였다. 하지만 siRNA 센스 가닥의 U만을 또는 U와 A 잔기들을 2'-OMe로 화학적으로 변형시키면 선천성 면역 활성을 효과적으로 감소시키고, 비변형 siRNA보다 바이러스 항원 발현을 억제하는데 더욱 강력한 효과를 나타내었다.
이러한 결과들은 치료제로서의 siRNA의 양쪽 가닥을 화학적으로 변형시킬 필요성이 일차 서열에 의해 결정되어야 함을 제시한다. 본 발명자들은 siHBx1의 센스 가닥 중 U 또는 UA 잔기들을 2'-OMe로 변형시키는 것이 그들의 항-HBV 특성을 향상시키는데 충분하다는 것을 증명하였는데, 이는 그들이 높은 수준의 RNAi 활성 및 면역안전성을 유지하고, 또한 혈청 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 저항성을 가지고 있었기 때문이다. 흥미롭게도, 면역자극과 관련하여, siHBx1의 U 및 C 잔기를 2'-OMe로 변형시키는 경우 전신 투여 이후 여전히 I형 및 II형 IFN 모두를 유도하였다.
또한, 본 발명자들은 센스 가닥의 U 잔기만을 2'-변형시키는 것이 siRNA에 대한 전반적 면역반응을 제거하는데 충분하다는 것도 역시 보여주었다. 이는 비-면역자극성 siRNA를 선별할 때, 합성 RNA의 뉴클레아제-저항성을 개선시키기 위해 일반적으로 허용되는 UC-변형의 방법이 재평가되어야 함을 나타낸다.
하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다. 동물 연구는 국립과학원에 의해 작성된 실험 동물들의 보호 및 이용에 관한 지침(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었고 목암 동물실험윤리위원회(Mogam's institutional animal care committee)에 의해 승인받았다.
실시예 1: 화학적으로 변형된 siRNA 의 제조
상기 표 1 및 2에서 정의된 바와 같이, 다양한 화학적으로 변형된 siRNA를 제조하였다. 구체적으로, 2'-F-변형 siRNA(siHBx1-F-UC)를 제외한 본 발명에 사용된 모든 siRNA들은 바이오니아(Bioneer Co. 대전, 대한민국)에서 화학적으로 합성하였고, siHBx-F-UC는 다마콘(Dhaemacon, Lafayette, CO)에서 구입하였다. 이들을 미리 어닐링된(pre-annealed) 이중체로 받아 비변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)으로 분석하였다.
실시예 2: 화학적으로 변형된 siRNA 의 혈청 안정성의 측정
상기 표 1 및 2에 열거된 비변형 siRNA 및 화학적으로 변형된 siRNA의 혈청 안정성을 조사하기 위하여, siRNA들을 10% 인간 혈청(Sigma)을 함유한 RNase가 없는 물에 10 μM의 최종 농도로 용해시켰다. 분취물(aliquot)을 37℃에서 0, 1, 3, 6, 24 및 48시간 동안 반응한 후 즉시 -72℃에서 보관하였다. siRNA를 15% 비변성 PAGE에 의해 분리하고 에티디움 브로마이드(EtBr) 염색에 의해 가시화하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 비변형 siHBx1은 10% 인간 혈청과 함께 6시간 반응한 후 거의 완전히 분해되었다(t1 /2=3.6 시간). 반면, 변형된 siHBx1 유도체들, 특히 센스 가닥 피리미딘 잔기(U 및 C)가 2'-OMe로 변형되고 안티센스 가닥 U 및 C가 2'-OMe 및 2'-F로 각각 변형된 siHBx1-OMe/OMe-UC/UC 및 siHBx1-OMe/F-UC/UC는 48시간 이후에도 그대로 유지되었다. 이 결과는 피리미딘 위치에 있는 리보핵산의 변형이 혈청 안정성을 급격히 향상시킬 수 있다는 것을 명확히 보여준다. 연속된 선택적 변형에서, 센스 가닥의 특정 서열에 2'-OMe 치환을 함유하는 siHBx1-OMe-UC, siHBx1-OMe-UG 및 siHBx1-OMe-UA는 인간 혈청에서 반감기가 각각 14.0, 45.2 및 10.2 시간이었다. 상기 세 가지 siRNA 중에서, siHBx1-OMe-UG가 가장 개선된 시험관 내 혈청 RNase-저항성을 가지고 있었다. 흥미롭게도, 센스 가닥 U 잔기만이 2'-OMe로 치환된 siHBx1-OMe-U(t1/2=11.3 시간)의 안정성은 siHBx1-OMe-UC 및 siHBx1-OMe-UA와 같이 이중적으로 화학적 변형된 siRNA와 유사하였다. 이러한 데이터는 화학적으로 변형된 siRNA의 혈청 안정성이 변형된 뉴클레오타이드 서열의 수 뿐만 아니라 조성 및/또는 위치에 의해 결정된다는 것을 제시한다.
또한, 도 1b에서 보는 바와 같이, 화학적으로 변형된 siHCV, 즉 siHCV-OMe-U는 비변형 siHCV에 비해 약간 높은 뉴클레아제 저항성을 나타내었다.
실시예 3: siRNA 의 캡슐화( encapsulation )
본 기술분야에 알려진 방법에서와 같이, DOTAP(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) 및 콜레스테롤(Sigma, St. Louis, MO)을 클로로포름(Sigma) 중에서 동일 몰비로 혼합하여 통상적인 양이온성 리포좀(DTC)을 제조하였다(Kim et al ., Cancer Res ., 63:6458-6462 (2003); Templeton et al ., Nat . Biotechnol . 15:647-652 (1997)). 혼합 후, 질소 가스 흐름 하에서 클로로포름을 증발시키고 지질 필름을 진공 데시케이터(desiccator)에 2시간 동안 놓아두었다. 얻어진 건조된 지질 필름을 5% 덱스트로스 용액으로 수화시킨 후, 수조 초음파파쇄기를 이용하여 초음파 파쇄시켰다. apo A-I-데코레이티드 DTC 리포좀(DTC-Apo)을 제조하기 위하여, DTC를 인간 혈장 유래의 apo A-I과 함께 10:1(w/w)의 지질/단백질 비율로 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다. 합성 siRNA의 생체 내 투여를 위해, 실시예 1에서 제조된, 표 1 및 2에 열거된 각각의 siRNA 40 μg을 5% 덱스트로스 중에서 400 μg의 DTC-Apo 리포좀에 첨가한 다음, 사용 직전에 30분간 상온에서 반응시켰다.
실시예 4: 비변형 siRNA 및 변형된 siRNA 의 면역반응 측정
암컷 C57BL/6 마우스를 찰스 리버 연구소(Wilmington, MA)에서 구입하였다. 마우스는 모두 7-8주령이었고, 약 18-20g이었다. 마우스를 4개의 그룹(한 그룹당 3마리씩)으로 나누고 각 그룹의 마우스에게, 비변형 siRNA, 빈 DTC-Apo 리포좀, DTC-Apo/비변형 siRNA 복합체, 및 DTC-Apo/Poly(I:C) 복합체를 각각 2 mg/kg(약 40 μg/마우스)의 siRNA 투여량으로 정맥주사하였다. Poly(I:C)는 폴리이노신산:폴리시티딜산을 나타낸다. Poly(I:C)는 면역자극제로서 바이러스 감염을 활성화하기 위해 사용된다(Fortier et al., Am . J. Physiol . Regul . Integr . Comp . Physiol ., 287:759-66(2004)). DTC-Apo/poly(I:C) 복합체는 외래 dsRNA 분자에 대한 일반적인 면역반응을 관찰하기 위한 내부 대조군으로 사용되었다.
화학적으로 변형된 siRNA와 함께 정맥 투여에 의해 동물에 주사하였을 때 DTC-Apo 입자가 면역반응에 미치는 효과를 살펴보기 위하여, DTC-Apo 입자로 제형화된 비변형 siHBx1을 마우스에 정맥 내로 투여하였다. 이들의 생체 내 효능을 결정하기 위해, 정맥 투여 6시간 후 IFN 및 염증성 사이토카인의 유도를 측정하였다.
혈청 사이토카인 양은 제조사의 지시에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 마우스 IFN-α, IFN-γ(Pierce, Rockford, IL), IL-6 및 TNF-α(BD Bioscience, San Diego, CA)를 측정하여 결정하였다. 2회 또는 3회의 독립실험을 수행하였고, 샘플은 3회 반복하여 측정하였다.
도 2a 및 2b에서 보는 바와 같이, 비변형(naked) siRNA나 DTC-Apo 리포좀 단독은 이전 보고와 마찬가지로 선천성 면역을 활성화시키지 못했다(Ma et al., Biochem. Biophys . Res . Commun ., 330:755-759(2005); Morrissey et al., Nat . Biotechnol., 23:1002-1007(2005)). 반면, DTC-Apo/비변형 siHBx1 복합체로 처리된 동물들에서는 혈청 인터페론 및 사이토카인 양이 현저하게 증가하였다.
다음으로, DTC-Apo 입자에 봉입된 화학적으로 변형된 siRNA의 면역자극 특성을 연구하였다. 비변형(naked) siRNA와 화학적으로 변형된 siRNA를 함유하는 DTC-Apo 입자, DTC-Apo 입자 단독 또는 비변형 siRNA 단독을 마우스에 정맥주사하고 6시간 후 I형 및 II형 IFN 양을 측정하였다(도 3a). 비변형 siHBx1과는 달리, DTC-Apo로 제형화된, RNA 양쪽 가닥의 피리미딘 잔기가 화학적으로 변형된 siHBx1(siHBx1-OMe/OMe-UC/UC 및 siHBx1-OMe/F-UC/UC)를 주사하였을 때 혈청 IFN-α 및 -γ 모두가 거의 정상 수준으로 감소되었다. IFN 활성화는 센스 가닥의 UG 또는 UA 서열의 이중-변형(siHBx1-OMe-UG 및 siHBx1-OMe-UA)에 의해 효과적으로 사라졌지만, UC 서열의 변형(siHBx1-OMe-UC)에 의해서는 사라지지 않았다. 피리미딘 서열에서의 2'-리보오스 변형의 이러한 면역자극 특성은 2'-F-치환된 siHBx1인 siHBx1-F-UC의 사용에 의해 재확인되었다. 특히, 센스 가닥 U 잔기가 최소로 변형된 siRNA(siHBx1-OMe-U)를 주사하였을 때 양이온성 지질/siRNA-매개된 면역반응이 감소하였다.
피리미딘의 2'-리보오스 변형의 면역자극 특성이 siRNA의 일차 서열에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, 센스 가닥의 U 단독, 또는 피리미딘(U 및 C)이 2'-OMe로 변형되거나 변형되지 않은, 이차 HBV X 부위(siHBx3) 또는 HCV 코어 영역(siHCV)을 표적으로 하는 부가적인 합성 siRNA를 제조하였다. 도 3b에서 보는 바와 같이, 변형된 모든 siHBx3, 즉 siHBx3-OMe-U와 siHBx3-OMe-UC, 및 siHCV, 즉 siHCV-OMe-UC와 siHCV-OMe-U는 IFN 반응을 정상 수준으로 감소시켰는데, 이는 피리미딘 뉴클레오타이드의 2'-OH 치환에 의한 선천성 면역반응 감소의 차이가 서열의존적이라는 것을 가리킨다. 이러한 결과들은 또한 센스 가닥의 U 잔기의 2'-변형만으로도 siRNA에 대한 전반적 면역반응을 제거하는데 충분하다는 것을 보여준다. 이들은 합성 RNA의 뉴클레아제-저항성을 개선시키기 위해 일반적으로 허용되는 방법인 UC-변형의 사용이 비-면역자극성 siRNA를 선별할 때 재평가되어야 한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: siRNA 의 RNAi 활성 측정
(5-1) siHBx1 및 siHBx3의 RNAi 활성
화학적으로 변형된 siHBx1 및 siHBx3의 생체 내 RNAi 활성을 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에 일차적으로 증식형(replication-competent) HBV를 주사한 다음, DTC-Apo 리포좀에 봉입된 siHBx1 및 siHBx3을 2 mg/kg siRNA의 투여량으로 처리하였다.
4마리의 C57BL/6 마우스 그룹들에 종래 언급된 복제형 HBV 벡터인 pHBV-MBRI 10 μg을 수동력학적(hydrodynamic)으로 주사하였다(Shin et al., Virus Res ., 119:146-153(2006)). 주사 48시간 후, DTC-Apo 리포좀에 봉입된, 대조군 siRNA(siCont), 비변형 siHBx1 및 화학적으로 변형된 siHBx1(40 μg/마우스)을 꼬리 정맥 내 주사에 의해 전신투여하였다. siRNA 처리 후 2일 및 4일째에 시판중인 HBsAg ELISA 키트(DiaSorin, Stillwater, OK)를 사용하여, 혈청에 분비된 바이러스 항원(HBsAg)의 양을 정량하였다. 정상 마우스에서의 혈청을 백그라운드로 사용하였다.
정맥 내 siRNA 처리 후 2일째에 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 마우스 간 용해물(lysate)로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA(50 μg)를 1% 아가로스-포름알데하이드 젤에 분리하고 Hybond-N+ 나일론 막(Amersham, Piscataway, NJ)으로 이전시켰다. 프로브(probe)는 서열번호 9(정방향 프라이머) 및 서열번호 10(역방향 프라이머)으로 표시되는 프라이머 한 쌍을 이용하여 [α-32P]dCTP(NEN-PerkinElmer, Waltham, MA)의 존재하에 HBx 유전자 서열 일부를 증폭시켜 얻었다.
도 4a에서 보는 바와 같이, 대조군 siRNA(DTC-Apo/siCont)로 처리한 그룹에 비해 DTC-Apo 리포좀에 봉입된 비변형 siHBx1으로 처리한 마우스 그룹에서, 혈청 HBsAg가 2일째에 51.1%(P<0.05) 감소하였고 4일째에 43.6% 감소하였다. 하지만, DTC-Apo 리포좀에 봉입된 siHBx1-OMe/OMe-UC/UC로 처리한 마우스 그룹에서는 바이러스 단백질 발현 억제 능력을 관찰하지 못했다. 이전 보고(Choung et al ., Biochem. Biophy . Res . Commun ., 342:919-927(2006))와는 달리, DTC-Apo 리포좀에 봉입된 siHBx1-OMe/F-UC/UC로 처리한 마우스 그룹에서도 뚜렷한 생체 내 유전자 침묵 활성이 나타나지 않았다. 센스 가닥에 2'-OMe- 또는 2'-F-변형된 잔기를 함유하는 일부 siRNA, 예를 들어 siHBx1-OMe-UC, siHBx1-OMe-UG 및 siHBx-1-F-UC는 비변형 siHBx1과 비교하여 볼 때 HBsAg 발현 억제효과가 감소하였다. 이 결과는, 센스 가닥은 가이드 가닥이 아니므로 표적 mRNA의 인식/절단에 직접적으로 관여하지는 않지만, 이 가닥의 변형은 생체 내 RNAi 기구(machinery)의 활성효율을 어느 정도 방해할 수 있다는 것을 의미한다. 주목할만하게도, 두 개의 비-면역자극성 siRNA, 예를 들어 siHBx1-OMe-U 및 siHBx1-OMe-UA를 전신투여하면, siCont 처리 그룹에 비해 HBsAg의 양이 2일째에 60.3%(P<0.01) 및 62.4%(P<0.01), 4일째에 62.9%(P<0.05) 및 56.8%(P<0.05) 각각 감소하였다.
2'-OMe-변형된 siHBx3 및 siHCV로 유사한 생체 내 실험을 수행하였고, 그 결과 U 잔기를 최소한으로 변형시킨 경우 siHBx와 마찬가지로 생체 내에서 비염증성 활성이 여전히 유지된다는 것을 확인하였다. 하지만, 2'-OMe-UC, 2'-OMe-UG 및 2'-OMe-UA 변형된 잔기를 함유하는 이중 변형된 siRNA들의 활성은 일차 서열들에 의존적이었다(데이터 미표시).
또한, 비변형 siHBx1 및 이의 2'-OMe-U-변형된 대응물의 전사후 유전자 침묵 활성을 노던 블롯 분석에 의해 분석하였다(도 4b). 비변형 siHBx1 및 화학적으로 변형된 siHBx1-OMe-U 모두는 단일 투여량에서 투여 2일째에 대조군 siRNA(siCont) 처리 동물과 비교하여 볼 때, 간조직 내 바이러스 RNA 전사체를 각각 평균 35.7% 및 43.2% 감소시켰다. 이러한 결과들은 센스 가닥 중 U 잔기의 2'-리보오스가 최소한으로 변형된 siRNA가 양이온 리포좀에 의해 매개되는 면역자극활성을 회피할 뿐만 아니라, 비변형 siRNA만큼 강력한 RNAi 활성을 가진다는 결론을 제시한다.
(5-2) siHCV의 RNAi 활성
화학적으로 변형된 siHCV의 생체 내 유전자 침묵 활성을 조사하기 위해, 3 μg의 pCEP4-HA-CE1E2를 수동력학적(hydrodynamic)으로 주사하여 HCV 마우스 모델을 구축하였다.
플라스미드 pCEP4-HA-CE1E2는 본 기술분야에 알려진 문헌에 개시된 바에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로, 김 등의 문헌(Kim et al ., Virus Res ., 122:1-10(2006))에서 제조된 pCEP4-CE1E2가 생체 내에서 간세포 특이적이고 보다 연장된 발현을 달성하기 위하여 변형되었다(Miao et al ., Hum . Gene Ther ., 14:1297-1305(2003)). 간략하게, HCR 서열(뉴클레오타이드 60 내지 325)(Dang et al ., J. Biol. Chem ., 270:22577-22585(1995)) 및 인간 AAT 프로모터 서열(Le et al ., Blood, 89:1254-1259(1997))로 pCEP4-CE1E2의 CE1E2 유전자의 상류 영역 내의 CMV 프로모터를 대체하여 pCEP4-HA-CE1E2를 생성하였다.
주사 8시간 후, DTC-Apo 리포좀에 봉입된 대조군 siRNA(siCont), 비변형 siHCV 및 화학적으로 변형된 siHCV-OMe-U(40 μg/마우스)를 정맥 내로 투여하였다. siHCV 처리 후 2일째에 마우스를 희생시키고 간 조직을 균질화하였다. 표적 단백질양 및 RNA 발현량은 각각 면역블롯팅(immunoblotting) 및 RT-PCR로 결정하였다.
총 세포 용해물(30-50 μg)을 12% SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 PVDF 막(Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA)으로 이전시켰다. HCV 코어와 E2 단백질, 및 세포 SR-BI와 β-액틴(로딩 대조군) 단백질은 특정 항체를 이용하여 검출하였다(Kim et al ., Mol . Ther . 15:1145-1152(2007); Kim et al., Virus Res., 122:1-10(2006)). DTC-조합된 apo A-I 단백질은 염소 항-인간 apo A-I 항체(Academy Bio-Medical Co., TX)로 확인하였다. 밴드 강도는 미국국립보건원(http://rsb.info.nih.gov/ij/)의 ImageJ 공공 도메인 소프트웨어로 측정하였다.
총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. 노던 블롯 분석은 종래 언급된 바와 같이, 서열번호 11(정방향 프라이머) 및 서열번호 12(역방향 프라이머)로 표시되는 한 쌍의 프라이머에 의해 증폭된 32P-라벨링된 HCV 코어 프로브를 이용하여 수행하였다(Shin et al ., Virus Res ., 119:146-153(2006)). 반정량적 RT-PCR의 경우, RNA(1μg)를 랜덤 헥사머(Invitrogen) 및 AMV-RT(Promega, Madison, WI)를 이용하여 역전사시켰다. 얻어진 cDNA를 서열번호 13(정방향 프라이머) 및 서열번호 14(역방향 프라이머)로 표시되는 한 쌍의 HCV E2-특이적 프라이머 및 서열번호 15(정방향 프라이머) 및 서열번호 16(역방향 프라이머)로 표시되는 한 쌍의 β-액틴-특이적 프라이머를 이용하여 각각 증폭시켰다. PCR 산물을 2% 아가로스 젤상에 전기영동하였다.
간 코어 단백질의 상대적 발현량은 정맥 투여 후 2일째에, DTC-Apo/siCont(2 mg/kg) 및 0.25, 0.5, 1 및 2 mg/kg(DTC-Apo/siCont 처리 그룹 대비 *P<0.05 및 **P<0.0005)의 siHCV 투여량에서의 DTC-Apo/비변형 siHCV의 웨스턴 블롯 분석으로부터 대응하는 밴드 강도를 측정함으로써 정량하였다. 도 5a에서 보는 바와 같이, DTC-Apo에 봉입된 비변형 siHCV는 투여량 의존적으로 표적 단백질을 억제하였고, 평균 코어 단백질량은 1 mg/kg 또는 2 mg/kg siHCV로 처리된 마우스에서 각각 45.5%(P<0.05) 또는 64.4%(P<0.0005) 감소하였다.
다음으로, 마우스에서 siHCV-OMe-U의 유전자 침묵 효능을 시험하였다(도 5b 및 5c). 단백질량에서 증명되듯이, 유전자 침묵 효과는 DTC-Apo/비변형 siHCV 및 DTC-Apo/siHCV-OMe-U-주사된 동물 모두에서 검출되었다. 특히, 비-면역자극성 siHCV-OMe-U는 바이러스 코어 단백질을 85.5%(P<0.001) 감소시킨 반면, 화학적으로 변형된 HBV siRNA인 siHBx1-OMe-U는 어떠한 활성도 나타내지 않았다(도 5b). 또한, 반-정량적 RT-PCR을 이용하여 E2 RNA량을 측정하였다. 측정 결과, 단일 투여량의 비변형 siHCV 또는 siHCV-OMe-U로 처리된 마우스에서 바이러스 RNA량은 44.8% 또는 69.2% 감소하였다(도 5c). 이러한 실험들은 2'-OMe로 변형된 siHCV가 비변형 siHCV보다 더욱 강력함을 보여준다.
화학적으로 변형된 siHCV, 예를 들어 siHCV의 센스 가닥에서 두 개의 U 잔기를 2'-OMe로 변형해 얻어진 siHCV-OMe-U를 함유하는 DTC-Apo 입자를 2 mg siHCV/kg의 단일 투여량으로 투여시 면역 독성 없이 개선된 표적 유전자 침묵 활성을 나타내었다(85% 넉다운).
본 발명은 상기 특정 실시예와 관련하여 설명되었지만, 당해 분야의 숙련자에 의해 다양한 변형과 변화가 이루어질 수 있으며, 이 역시 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범주에 속하는 것으로 인식되어야 한다.
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Claims (10)

  1. siRNA(small interfering ribonucleic acid)의 안티센스 가닥 내의 어떠한 잔기도 변형시키지 않고 siRNA의 센스 가닥 내 우리딘 잔기만을 변형시키는 것을 포함하는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지는 RNA 이중체이며 B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)의 유전자 발현에 대한 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 siRNA의 혈청 안정성 향상 및 면역자극 특성 저감 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 siRNA의 센스 가닥 내 우리딘 잔기가 그의 리보오스 고리의 2'-OH기를 2'-O-메틸기 또는 2'-플루오로기로 바꿔줌으로써 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 siRNA가 19 내지 29개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA가 21 내지 27개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 siRNA가 21 또는 27개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 siRNA가 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3 및 4로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 각 siRNA의 센스 가닥의 우리딘 잔기가 그의 리보오스 고리의 2'-OH기를 2'-O-메틸기 또는 2'-플루오로기로 바꿔줌으로써 변형된, 서열번호 1 및 2로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3 및 4로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA.
  8. 제7항의 siRNA의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 B형 간염 또는 C형 간염 질병을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 siRNA가 전달 시약과 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전달 시약이 리포좀, 중합체, 리포좀과 단백질의 혼합물 및 중합체와 단백질의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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