KR101668954B1 - ＨＣＶ ＩＲＥＳ를 표적으로 하는 Ｃ형 간염 바이러스 치료제 siRNA - Google Patents

Abstract

본 발명은 HCV IRES를 표적으로 하는 C형 간염 바이러스 치료제 siRNA 에 관한 것으로, HCV IRES 유전자를 표적으로 하는 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA 또는 이의 지질 제형을 통해 생체내 특히 간세포로의 전신 전달이 가능하여 효과적으로 C형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

Description

ＨＣＶ ＩＲＥＳ를 표적으로 하는 Ｃ형 간염 바이러스 치료제 siRNA{Therapeutic HCV IRES-silencing siRNA for the treatment of hepatitis C virus infection}

본 발명은 HCV IRES를 표적으로 하는 새로운 siRNA를 이용하여 C형 간염을 치료하는 조성물에 관한 것이다.

약 20여 년 전 비-A형, 비-B형 간염의 원인이 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus)임이 밝혀진 이후 지속적인 항바이러스 치료제 개발을 위한 노력이 진행되어 오고 있다. 특히 C형 간염 바이러스에 대한 백신은 바이러스 유전자의 지속적인 변이와 세포배양에 의한 효율적인 바이러스의 증식방법이 개발되어 있지 않은 이유로 늦어지고 있는 상황이다.

C형 간염 바이러스는 RNA 바이러스로서, 6개의 유전자형과 100개 이상의 아형이 있으며, 유전자형 간에는 34% 그리고 아형 간에는 23% 이상의 유전자 염기서열이 다른 양상을 보인다. C형 간염 바이러스는 숙주 세포의 면역반응을 회피하고 만성감염을 유지시키기 위해서 복제 과정에서 유전자의 변이가 자주 발생되고 다양한 유사종을 생성한다는 점이 가장 큰 특징이다. 따라서 백신 및 치료제 개발에 있어 가장 큰 어려움도 이러한 잦은 변이체 발생에 있다. 또한 C형 간염 바이러스의 단백질인 Core, NS3, NS5A 등이 숙주세포의 대사 작용이나 세포의 생존, 사멸과 관련한 신호전달 경로 등을 조절하여 간암을 유발하는 것으로 잘 알려져 있는데, 이러한 단백질들조차 유전자형과 아형에 따라 유전자 염기서열이 큰 차이를 보이고 있고 아직까지 그 기능이 완벽히 밝혀지지 않아 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 우리나라의 경우 유전자형 1b 및 2a에 감염된 환자가 주종을 이루고 있으며, 유전자형 1b에 감염될 경우 만성감염으로 진행될 확률이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 실제로 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 인터페론/리바비린 병합치료에 대한 치료율도 유전자형 1에 감염된 환자들에서 가장 낮으며, 치료 후 재발 확률도 매우 높아 만성감염을 통한 간경화 및 간암을 유발하는 주요 C형 간염 바이러스 유전자형으로 잘 알려져 있다.

따라서, 6개의 주요 유전자형(genotype)과 아형(subtype)에서 서열이 잘 보존되어 있고, 유전자 변이가 잘 일어나지 않는 C형 간염 바이러스 IRES 부분은 RNA간섭현상을 이용한 siRNA 치료제 개발의 좋은 타겟팅 부위라고 할 수 있다. 이러한 이유로, siRNA를 이용한 항바이러스 치료법은 기존의 치료법(페길화된 IFN-α와 IMP 디하이드로게나아제 활성억제제인 뉴클레오사이드 아날로그, 리바비린과의 병행치료법 또는 바이러스 단백질 저해제)이 듣지 않거나 HCV 복제효소(NS5B), 단백질분해효소 NS3, NS5A 등을 표적으로 하는 최근 승인된 치료제들에 내성이 생긴 환자들에게 좋은 치료법이 될 것으로 보인다.

WO2010-061881 (2010.06.03) KR2009-0003147 (2009.01.09) US2012-0308642 (2012.12.06)

본 발명의 목적은 HCV IRES 유전자의 사일런싱(silencing)을 통해 생체 내에서 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 HCV IRES mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며, SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥의 이중가닥으로 이루어지고, 상기 가이드 가닥과 패신저 가닥은 3'-UU 오버행을 포함하는, siRNA(small interfering RNA)을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA를 포함하는 C형 간염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 C형 간염 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 siRNA의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 약제학적 유효량의 상기 siRNA를 C형 간염을 필요로 하는 대상체(subject)에 투여하는 것을 포함하는 C형 간염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 HCV IRES 유전자를 표적으로 하는 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA의 지질 제형을 통해 생체내 특히 간세포로의 전신 전달이 가능하여 효과적으로 C형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 HCV IRES를 타겟팅하는 siRNA를 선별 과정을 보여주는 것으로, (A)는 HCV IRES 구조 및 염기서열을 보여주고, 하단에는 HCV 유전자형 2a 및 1b에서 모두 염기서열이 보존이 되어 있는 부분을 나타내며, (B)는 HCV 염기서열이 가장 잘 보존되어 있는 부위에 대한 HCV IRES 타겟팅 siRNA 라이브러리 구축하고, 디자인한 siRNA 및 표적 부위를 나타낸 것이며, (C)는 HCV 리포터 RNA를 Huh7 세포에 트랜스펙션 시킨 후 상기 (B)에 표시한 siRNA를 ND98 리피도이드를 사용해 도입한 후 루시퍼라아제 리포터 활성을 분석 비교한 것으로, siRNA들의 사일런싱 효과를 나타낸 것이고, (D)는 HCV 서브게놈 레플리콘을 안정적으로 발현하고 있는 R-1 세포주에 IRES를 타겟팅 하는 siRNAs를 10 nM 농도로 처리한 후 48시간 뒤에 실시간 정량 RT-PCR로 siRNA들의 사일런싱 효과를 분석한 결과이며, (E,F)는 상기 (D)와 같은 방법으로 siIE22의 농도를 높여가며 처리하여 농도 의존적으로 항바이러스 효능이 있는지 분석한 결과로, HCV 게놈 카피수를 분석한 결과(E)와 웨스턴 블랏을 통해 HCV의 단백질인 NS5A와 NS5B의 발현을 분석한 결과이다(F). 상기 (C-E)는 각각 반복으로 3회 독립 실험한 측정값이고, *p<0.05; **p<0.01을 나타낸다.
도 2는 선별된 IRES 타겟팅 siRNA들의 표적 절단능과 혈장에서의 안정성을 분석한 것으로, (A)는 siRNA(Sc)를 20 nM로 트렌스펙션 한 HeLa 세포에서 면역침강을 통해 얻은 Ago2 복합체를 이용하여 siRNA의 표적 절단능을 분석한 결과이며, 표적은 5'-말단에 ³²p가 표지된 30개의 뉴클레오타이드이고(HCV IRES 314-343 부분), (B)는 재조합 인간 Ago2를 사용하여 siRNA의 절단능을 분석한 결과로, 표적은 ³²p-αUTP를 사용하여 인 비트로 전사를 통해 합성한 HCV IRES 전체가 포함되는(1-487 뉴클레오타이드) 것을 사용하며, (C)는 45% 인간 혈장에서 변형되지 않은 siIE22(2μM)의 혈청 안정성 평가 결과로, 일정 시간 동안 siRNA를 인큐베이션한 후, 각 시료에서 추출된 RNA를 변성 15% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하고, 노던 블랏 분석을 통해 siRNA의 가이드 가닥을 측정하며, 시그널의 상대 강도는 SigmaPlot을 이용하여 siRNA 가이드 가닥의 반감기를 측정하였다.
도 3은 LNP로 캡슐화된 siIE22에 의해 HCV IRES를 매개로 한 번역을 억제함을 나타내는 결과로, (A)는 siIE22를 캡슐화한 LNP의 구조를 나타낸 것이고, (B)는 DLS 분석법으로 LNP가 평균 직경이 약 100 nm 크기의 나노입자 형태를 유지하고 있음을 확인한 결과이며, (C)는 BALB/c 마우스(1 그룹당 4마리)에 리포터 20 ㎍을 하이드로다이나믹 주사(hydrodynamic injection)한 뒤 1시간 뒤에 siIE22 LNP를 1 mg/kg의 용량으로 i.v. 주사하여 간으로 전달하고, 16시간 뒤 듀얼 루시퍼라아제 분석을 수행하여 siIE22에 의한 HCV IRES-의존성 전사가 억제된 정도를 평가한 결과이고, (D)는 Balb/c 마우스에 siIE22 LNP를 1 mg/kg의 용량으로 꼬리를 통해 정맥주사한 후 2시간 뒤에 마우스 혈청에서의 IFN-α를 분석해 siIE22 LNP가 IFN-α를 유도하지 않음을 나타내는 결과이며, (E)는 hPBMC에서 siIE22/리피도이드 또는 siIE22 LNP는 IFN-α의 생산을 유도하지 않음을 나타내는 결과로 hPBMCs에 리피도이드 ND98 또는 리피도이드 나노입자(LNP)를 이용하여 10 nM siIE22 또는 스크램블드 siRNA(Sc) 또는 1 ㎍/well의 poly(I:C)를 트랜스펙션 시키고, 선택적으로, 배지에 50 ㎍/ml의 poly(I:C)를 직접적으로 부가하여 세포를 자극한 후 자극을 받은 세포에서 분비된 IFN-α의 ELISAs 측정값을 나타낸 것이며(상기 결과는 유사한 결과를 갖는 2개의 독립 실험 중 하나에서 얻은 데이터를 보여줌), (F)는 루시퍼라아제 분석 시스템을 통해 HEK293 세포주에서 IFN-β 리포터 분석을 수행한 결과 ND98로 전달된 siIE22가 선천성 면역반응을 유도하지 않음을 나타내는 결과이다(Mock-처리된 세포의 표준화된 루시퍼라아제 활성(Fluc/Rluc)을 100으로 정하고, 데이터는 2회 독립 실험에서 얻은 6개 측정값의 평균±SD로 나타냄; Rluc, 바다팬지의 루시퍼라아제; Fluc, 반딧불이의 루시퍼라아제).
도 4는 HCV-감염된 세포에서 화학적으로 변형된 siIE22 유도체의 항-HCV 활성을 나타낸 것으로, (A)는 45% 인간 혈장에서 변형되지 않은 siIE22(2μM)의 혈청 안정성 평가 결과로, 일정 시간 동안 siRNA를 인큐베이션한 후, 각 시료에서 추출된 RNA를 변성 15% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하고, 노던 블랏 분석을 통해 siIE22 가이드 가닥을 측정하며, 시그널의 상대 강도는 SigmaPlot를 이용하여 siIE22 가이드 가닥의 반감기를 측정한 것이며(유사한 결과를 갖는 2개 독립 실험의 대표 실험 중 하나의 결과를 보여준 것임), (B)는 본 발명에서 이용된 siIE22 유도체의 변형된 가이드 가닥 및 패신저 가닥의 서열을 나타낸 것이고, (C)는 화학적으로 변형된 siIE22 siRNAs의 안정성을 상기 (A)에서와 같이 인간 혈장에서 평가한 결과이며, (D)는 HCV 서브게놈 레플리콘을 안정적으로 발현하고 있는 R-1 세포주에서 안정성 평가에서 선택된 변형 siIE22의 항바이러스 효능을 나타낸 것이며(lipofectamine RNAiMAX를 이용하여 IRES를 표적으로 하는 siRNAs 또는 스크램블드 siRNA(Sc)(1 nM)를 트랜스펙션시키고, 4시간 후 세포를 세척하고, 신선한 완전 배지에서 48시간 동안 추가로 인큐베이션하며 평가하였다. 3반복 측정으로 3개의 독립 실험을 수행하였다(*p < 0.01)), (E)는 (A)와 같은 방법으로 ga_PS1 siIE22 가이드 가닥의 반감기를 측정한 것이다.
도 5는 HCV 복제 마우스(전기천공법으로 HCV 게놈(유전자형 2a)이 도입된 세포를 이식한 후 2-3주째에 혈청 HCV 타이터는 10⁶-10⁷ copies/ml만큼 높게 검출됨)에서 gs_PS1 siIE22 LNP의 항-HCV 활성을 평가한 결과로, (A)는 이종이식 후 4주째에 마우스로부터 발견된 이종이식 조직에서, HCV 플러스- 및 마이너스-가닥 RNAs 둘 다 검출됨을 나타낸 것이고, (B)는 이종이식 후 면역조직학적 분석 결과, HCV E2와 NS5B 항원이 이종이식 조직에서 발현된 것을 나타낸 것이며, (C)는 HCV 복제 마우스모델(xenograft model)에 gs_PS1 siIE22 LNP를 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg의 농도로 주입하고 3일, 7일 후 혈청내 HCV 유전자 카피수를 분석한 결과이고, (D)는 HCV 복제 마우스모델(xenograft model)에 gs_PS1 siIE22 LNP를 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg 농도로 3일 간격으로 주입한 후 2일 뒤에 혈청 내 HCV 유전자 카피수를 분석한 결과이다.
도 6은 HCV IRES의 서브도메인 IIIf를 타겟팅하는 타 특허 서열과 siIE22와의 항바이러스 효능분석 결과로, (A)는 미국 특허 제8426380호에 개시된 서열들을 shRNA와 이를 선형 형태로 나타낸 것이고, (B)는 siIE22를 포함하여 기존에 보고된 특허 서열들의 패신저 가닥을 HCV IRES에 나타낸 것이며, (C)는 루시퍼라아제 리포터가 달린 J6/JFH1(2a chimeric)가 안정적으로 복제되고 있는 세포주에 미국 특허 8426380 B2에 보고된 서열들과 스크램블드(Sc)를 100 pM 농도로 처리하고 48시간 뒤에 항바이러스 효능를 분석한 결과이고, (D)는 gs_PS1 siIE22와 미국 특허 제8426380호에 개시된 서열 중 가장 항바이러스 효과가 좋은 HCVc-wt의 항바이러스 효능을 HCV 서브게놈 복제 세포주인 R-1 세포주에 5 nM로 처리하고 48시간 뒤에 항바이러스 효능을 분석한 결과이며, (E)는 발현 벡터 pcDNA3.1/hAgo2를 사용하여 인간 Ago2를 과발현 시킨 HeLa 세포주에 이중가닥 gs_PS1 siIE22와 Somagenics사의 siRNA등을 각각 20 nM의 농도로 처리한 후 면역침강법을 통해 얻어진 Ago2 복합체를 분리하고, 분리된 Ago2 복합체로 표적 RNA 절단능을 비교 평가한 결과이며(표적은 5'-말단에 ³²p가 표지된 30개의 뉴클레오타이드 임(HCV IRES 314-343 부분)), (F)는 gs_PS1 siIE22와 일본, 미국(Xavier University)에서 출원한 특허에 보고된 서열들의 항바이러스 효능을 HCV 서브게놈 복제 세포주인 R-1 세포주에 1 nM로 처리하고 48시간 뒤에 항바이러스 효능을 분석한 결과로, siRNAs Xi_316-334 및 Xi_si321 2개의 서열은 미국 공개특허 제2012-0308642호의 서열이고, TK_9.10 siRNA 서열은 WO2010-061881의 서열이다. (C), (D) 그리고 (F)의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 통해 SD 값을 구하였으며, p 값은 *p <0.05; **p<0.01을 의미한다.

HCV IRES는 자체적으로 pseudoknot 구조(스템-루프 IIIf와 IV)을 포함한 복잡한 RNA 구조를 이루고 있으며, 나아가 여러 단백질(La 단백질, PTB와 같은 RNA-결합단백질 및 라이보좀 40 서브유닛 등)이 붙어 상호작용을 하고 있어 HCV 치료제로 사용할 수 있는 높은 항바이러스 효능을 선별하는 것은 어려운 작업이다. 특히 RNA-결합단백질의 부착에 따른 역동적인 IRES의 구조변화는 염기서열에 기반한 일반적인 생물정보학적 분석 방법으로 siRNA의 타겟을 선정하는 것이 어려울 수 있음으로 말해주고 있다.

이에, 본 발명자들은 1개 또는 2개의 서열의 간격을 두고 siRNA를 IRES에 타일링(tiling)하여 디자인하고 이들의 항바이러스 효능을 분석하여 기존의 HCV IRES 타겟 siRNA보다 항바이러스 효능이 우수한 siRNA를 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 HCV IRES mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며, SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥의 이중가닥으로 이루어지고, 상기 가이드 가닥과 패신저 가닥은 3'-UU 오버행을 포함하는, siRNA(small interfering RNA)에 관한 것이다.

본 발명은 HCV IRES 유전자 카피수를 낮추는 기술과 관련된 것이며, 이는 본 발명에서 제공되는 siRNA의 특정 용량을 환자에게 투여했을 때 표적인 HCV IRES 부위가 절단되어 HCV 유전자 카피수가 감소함으로써 성취되는 것일 수 있다.

상기 HCV IRES 유전자는 RNA 게놈 일부 서열일 수 있다. 더 구체적으로, HCV IRES 내부의 319-337 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하며, 이 부위는 SEQ ID NO: 1로 기재할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 표적 부위를 5' 방향 또는 3' 방향으로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드 이동한 경우 siRNA의 가이드 가닥 서열이 바뀌게 되는데, 가이드 가닥 서열이 바뀌더라도 표적 절단 능력은 크게 변화하지 않는다. 그럼에도 이러한 siRNA의 항바이러스 효능은 상당한 차이를 나타낸다. 따라서, 인 비트로에서의 표적 절단능력의 차이나 혈장 안정성이 항바이러스 효능에 큰 영향을 주지는 않는다. 그럼에도 불구하고, 유사한 표적 부위를 갖더라도 타겟팅되는 특정 위치에 따라 세포내에서 siRNA가 타겟에 접근할 수 있는 능력이 상이해 siRNA의 항바이러스 효능이 상당히 달라짐을 알 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '표적 mRNA'라 함은 HCV IRES mRNA와 이의 돌연변이체를 지칭한다.

본 명세서에서, 'mRNA 영역을 표적으로 한다'고 함은 siRNA가 상기 mRNA 영역 염기서열 중의 전부 또는 일부, 예컨대 염기서열의 85-100%와 상보적인 염기서열을 가져서, 상기 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서, '상보적'이라 함은 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥이 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥은 왓슨-크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중가닥을 형성한다. 본 발명에서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 dT로 치환가능하다.

본 발명의 siRNA는 RNAi 메카니즘에 의해 HCV IRES 부위의 절단을 일으켜, 복제 및 HCV IRES를 통한 바이러스 단백질 합성이 가능한 온전한 크기의 HCV 게놈에 손상을 주고, 이에 따라 바이러스 유전자 카피수를 감소시키는 기능을 한다. siRNA는 RNA interference(RNAi) 경로를 유발하는 작은 저해 RNA 이중가닥(small inhibitory RNA duplexes)을 의미한다. 구체적으로, siRNA는 센스 RNA 가닥과 그에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며, 양 가닥이 15-30 bp, 구체적으로는 19-25 bp, 더 구체적으로는 19-21 bp를 포함하는 RNA 이중가닥이다. siRNA는 이중가닥 영역을 포함하며 단일 가닥이 헤어핀(hairpin) 또는 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성하는 구조이거나, 2개의 분리된 가닥의 이중가닥일 수 있다. 패신저 가닥은 표적 유전자의 mRNA 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 서열을 가지며, 패신저 가닥과 이에 상보적인 가이드 가닥이 서로 왓슨과 크릭의 상보적인 염기서열 결합에 의해서 이중 가닥을 이루고 있다. siRNA의 가이드 가닥은 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)에 포집되어 RISC가 가이드 가닥과 상보적인 목표 mRNA를 확인한 후 절단 또는 번역(translational) 저해를 유도하게 한다.

일 구현예에서, siRNA는 패신저 가닥과 가이드 가닥을 포함하며, 바람직하게는 3'-UU 오버행을 포함하고 있는 21bp 길이의 이중가닥일 수 있다. 돌출부가 없는 평활 말단(blunt end)을 갖는 대칭 구조, 또는 적어도 하나 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지는 비대칭 구조일 수 있다. 돌출부 뉴클레오타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘) 2개를 붙일 수 있다.

상기 가이드 가닥은 생리학적 조건에서 SEQ ID NO: 1의 mRNA의 표적 영역에 혼성화한다. 상기 '생리학적 조건에서의 혼성화'라 함은 siRNA의 가이드 가닥이 인 비보에서 mRNA의 특정 표적 영역과 혼성화하는 것을 의미한다.

바람직한 구체예에서, 상기 siRNA는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥으로 이루어진 것일 수 있다.

상기 siRNA는 변형되지 않고 자연에 존재하는 리보핵산 단위구조를 가지고 있는 것이거나, 또는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조나 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.

또한, siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.

상기 화학적 변형을 통해, RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 예컨대 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화 향상, 안정성 증가, 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 표적 이외의(off-target) 효과 감소 등, siRNA의 다양한 특성을 변형되지 않은 siRNA 보다 향상시킬 수 있다. siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120).

siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 패신저 및 가이드 가닥의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 치환하는 방법이 있으며, 이를 통해 뉴클레아제(nuclease)의 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 패신저와 가이드 양쪽 가닥의 3'-말단 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변경할 수 있다. 다른 일례로, siRNA 패신저와 가이드 가닥의 5'-말단, 3'-말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 또는 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있다. 또 다른 일례로, 라이보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH₂(아미노기), -C-allyl(알릴기), -F(플루오로기), 또는 -O-Me(또는 CH₃, 메틸기)로 치환하는 화학적 변형을 가할 수 있다. 예컨대, 패신저 가닥의 1번 및 2번 핵산의 라이보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환하거나, 가이드 가닥의 2번 핵산의 라이보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환, 또는 구아닌(G) 또는 유리딘(U)을 포함하는 일부 뉴클레오타이드에서 라이보스 환의 2'-OH를 2'-O-Me(메틸기) 또는 2'-F(플루오로기)로 치환할 수 있다.

상술한 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며, 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.

다만 상기 변형에 있어서, siRNA 이중가닥 구조를 안정화시키는 동시에 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않도록, 바람직하게는 최소한의 변형이 이루어지도록 하는 것이 좋다.

바람직한 구현예에서, 상기 화학적으로 변형된 siRNA는,

SEQ ID NO: 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나의 가이드 가닥; 및

SEQ ID NO: 3 및 7 내지 9로 표시되는 염기서열 중 어느 하나의 패신저 가닥으로 이루어진 siRNA일 수 있다.

일 구현예에 따르면, siRNA의 안정성 개선을 위해 플루오로 잔기 및 PS로 siRNA를 수식한 경우 변형이 가해지지 않는 siRNA 대비 혈장 내 안정성이 향상되었다. 변형이 가해지지 않는 siRNA 경우 혈청 내 반감기는 30분인 것으로 나타났으나, PS로 수식한 siRNA는 205분으로 6.8배 정도 안정성이 향상되었다. 이러한 안정성 향상은 높은 RNAi 효력을 보여 siRNA와 RISC 복합체와의 상호작용이 siRNA의 전체 길이에 따라 달라질 수 있음을 알 수 있다. 또한, 화학적으로 수식된 siRNA의 항바이러스 효능 평가 시, 혈청 내 HCV 유전자 카피수가 현저히 감소되어 HCV의 복제가 감소됨을 알 수 있다. 그러나, 어떤 종류의 화학적 수식은 siRNA의 안정성은 개선하나 siRNA의 항바이러스 효능을 감소시킬 수도 있어 적절한 화학적 수식법의 채택이 요구될 수도 있다.

한편, 본 발명의 siRNA의 가이드 가닥과 패신저 가닥에 포함된 3'-UU 오버행은 siRNA 안정성과 C형 간염 치료적 효과를 개선하는 것을 특징으로 한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 siRNA와 표적이 유사한 TK_9.10 (IRES 319-339 부분을 표적으로 함)은 패신저 가닥에서는 CA, 가이드 가닥에서는 CG로 되어 있어 본 발명의 siRNA의 3'-오버행이 UU라는 점에서 차이가 있는데, 이들의 항바이러스 효능 평가 시 본 발명의 siRNA의 항바이러스 효능이 현저히 우수하였다(도 6 참조).

또한, siRNA에 콜레스테롤, 비오틴, 세포 침투 성질을 가지는 펩타이드(cell penetrating peptide)와 같은 리간드(ligand)를 패신저 가닥의 5'- 또는 3'- 말단에 붙이는 것도 가능하다.

본 발명의 siRNA는 화학적 합성, 인 비트로 전사 또는 다이서(Dicer)나 기타 유사한 활성을 가지는 뉴클라아제로 긴 이중 가닥 RNA를 절단하여 제조할 수 있다. 또는, siRNA를 플라즈미드나 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아바이러스, 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 등의 바이러스성 발현 벡터 등을 통하여 발현시켜 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 벡터(발현 벡터) 형태를 모두 포함하는 개념이다.

siRNA 특정 서열이 인터페론을 유도하는지 여부를 수지상 세포를 포함하는 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에서 실험적으로 확인한 후 면역반응을 유발하지 않는 서열을 선별하여 후보 siRNA 서열로 선정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, siRNA의 리포좀 제형을 인 비보 주입 시 표적 유전자의 발현 즉, HCV IRES-의존적 발현이 현저히 억제되나, 마우스 혈청에서 IFN-α는 유도되지 않아 본 발명의 siRNA가 선천성 면역반응을 유도하지 않음을 알 수 있다. 따라서, HCV 유전자의 5'-미번역 영역에 있는 IRES에 타겟팅되는 siRNA의 항바이러스 효능은 인터페론 같은 선천성 면역반응 없이 나타날 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA는 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)이 활용될 수 있다. 세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체에는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등이 있다. 상기 바이러스성 벡터(viral vector)는 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있다. 상기 바이러스성 벡터에는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함된다. 비바이러스성 벡터(nonviral vector)는 플라즈미드를 포함할 수 있다. 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI(polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온(cyclodextrin-based polycation), 덴드리머(dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함된다.

상기 지질 나노입자는 siRNA와 함께 핵산-지질 입자를 형성한다. 핵산-지질 입자는 보통 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예컨대, PEG-지질 콘쥬게이트)을 포함한다. 핵산-지질 입자는 이들이 i.v. 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위(예컨대 투여 부위와 물리적으로 떨어진 부위)에 축적되므로, 전신 적용에 있어 극히 유용하다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 중에 존재하는 경우 이들은 수용액 중에서 핵산 분해효소로의 분해에 내성을 띈다. 핵산-지질 입자 및 이들의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 및 WO 96/40964에 개시되어 있다.

핵산-지질 입자는 또한 하나 이상의 추가 지질 및/또는 기타 성분, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 기타 지질은 다양한 목적, 예컨대 지질 산화를 방지하거나 또는 리포좀 표면 상에 리간드를 부착하기 위해 리포좀 조성물 중에 포함될 수 있다. 양친매성, 중성, 양이온성, 및 음이온성 지질을 포함하여 임의 수의 지질이 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

핵산-지질 입자 중에 존재할 수 있는 추가 성분에는 이중층 안정화 성분, 예컨대 폴리아미드 올리고머(예컨대 미국 특허 제6,320,017호 참고), 펩타이드, 단백질, 세제, 지질-유도체, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 콘쥬게이트된 PEG 및 세라마이드에 콘쥬게이트된 PEG(미국 특허 제5,885,613호 참고)가 포함된다. 핵산-지질 입자는 하나 이상의 제 2 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 형성 동안 하전 유도 응집을 방지하는 입자의 구조적 안정화에서 기여할 수 있는, 형성 동안 지질 입자의 응집을 감소시키기 위해 선택되는 지질을 포함할 수 있다.

상기 핵산-지질 입자는 압출 방법 또는 인-라인 혼합 방법을 통하여 만들 수 있다. 압출 방법(또는 배취(batch) 공정이라고도 함)은 비어있는 리포좀(가령, 핵산이 없는)을 먼저 만들고, 빈 리포좀에 핵산을 추가하는 방법으로 미국 특허 제5,008,050호; 제4,927,637호; 제4,737,323호; Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19; 557(1):9-23; Biochim Biophys Acta. 1980 Oct 2; 601(3):559-7; Biochim Biophys Acta. 1986 Jun 13; 858(1):161-8; 및 Biochim . Biophys . Acta 1985 812, 55-65에 설명되어 있으며, 이들의 전문을 참조할 수 있다.

인라인(in-line) 혼합 방법은 지질 및 핵산을 나란하게 혼합 쳄버에 추가하는 방법이다. 혼합 쳄버는 단순한 T-커넥터이거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 기타 혼합 쳄버일 수 있다. 이러한 방법들은 미국 특허 제6,534,018호 및 미국 특허 제6,855,277호; US 공개특허 제2007-0042031호 및 Pharmaceuticals Research, Vol. 22, No. 3, Mar. 2005, pp. 362-372에 공개되어 있으며, 이들의 전문을 참조할 수 있다.

본 발명의 제형은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법으로 제조할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 핵산-지질 입자들은 지방성물질(리피도이드) ND98(MW 1487), 콜레스테롤 및 PEG-ceramide C16를 이용하여 합성될 수 있다. 지질-siRNA 나노입자들은 일반적으로 혼합시 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들면, Lipex Extruder (Northern Lipid, Inc)와 같은 열통(thermobarrel) 압출기를 이용하여 폴리카르보네이트 막(가령, 100 nm 컷-오프)을 통하여 압출될 수 있다. 일부 경우에, 압출 단계가 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시 완충액 교환은 투석 또는 접선 흐름 여과 방식(tangential flow filtration)에 의해 이루어질 수 있다. 완충액은 약 pH 7, 가령, 약 pH 6.9, 약 pH, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서 인산염 완충된 염(PBS)으로 교체될 수 있다.

상기 siRNA가 핵산 전달체와의 복합체 형태로 인 비보 또는 인 비트로 상에서 세포 내로 도입될 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA에 의한 HCV IRES의 사일런싱은 HCV를 복제하는 세포에서 HCV 게놈 타이터를 현저히 감소시키고, 항 바이러스 효과는 사용한 siRNA의 선천성 면역반응 유도에 의한 IFN-α 생성에 기인하지 않았다. 또한 siRNA의 간 특이적 전달은 간세포 내에서 HCV IRES 기능과 HCV 게놈 카피수를 현저히 감소시키는 효과를 보여주었다.

따라서, 본 발명의 siRNA는 C형 간염 치료제로 사용할 수 있어 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 C형 간염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 C형 간염 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 siRNA의 용도를 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 병용투여를 위한,

1) NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 비구조 단백질 저해제;

2) 캡시드 단백질 C, 외피 당단백질 E1 또는 E2, 및 p7 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 구조 단백질 저해제;

3) IFN-α 및 리바비린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 범용성 항바이러스제;

4) HCV internal ribosome entry site(IRES), 캡시드 단백질 C 코딩 유전자, HCV 3'-미번역 영역(3'-UTR), 또는 HCV의 다양한 유전자형에서 공통으로 서열이 보존된 영역(HCV 유전자 및 상보유전자 상의 서열이 보존된 부분) 등의 HCV 유전자 저해제; 또는

5) PRK2 전장, PRK2의 기능을 조절하는 숙주인자 Hsp90 및 PDK1, CD81을 포함하는 HCV 엔트리에 관여하는 인자, 또는 HCV 구조 단백질 또는 비구조 단백질에 결합하여 복제를 조절하거나, HCV 구조 단백질간의 상호작용을 조절하거나, HCV 구조 단백질에 결합하여 기능을 조절하는 숙주 인자 등 HCV 복제 또는 증식 조절 숙주 표적 유전자 저해제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 유전자 저해제는, 유전자의 발현을 저해하는 저해제로, 상기 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있다. 예컨대, 상기 저해제는 유전자에 대한 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.

상기 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 표적 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 표적 유전자 또는 그의 단편의 발현을 억제할 수 있다.

상기 단백질 저해제는 표적 특이적인 항체일 수 있다. 상기 항체로 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체, 인간화 항체, 또는 항체 단편을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함한다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.

또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 질병 상태의 치료 및/또는 예방에 관련하여 본 발명의 siRNA를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 전술한 C형 간염을 들 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 약제학적 유효량의 상기 siRNA를 C형 간염의 치료를 필요로 하는 대상체(subject)에 투여하는 것을 포함하는 C형 간염을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, siRNA의 투여는 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해, 중지 또는 지연시키거나, 예방할 수 있다.

상기 대상체는 사람, 개, 원숭이, 고양이, 설치류, 예컨대 마우스, 흰쥐 등 제한 없이 사용될 수 있다.

'유효량'은 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료되어야 할 대상체의 건강과 물리적 상태, 치료되어야 할 대상체의 분류적 군, 목적하는 보호의 정도, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자, 예컨대, siRNA의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 병용투여제 등에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것이다. 예컨대, HCV IRES 억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반응 등의 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도, 또는 사용 또는 처리 농도는, 0.001 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.01 내지 100 nM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 nM로 할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> siRNA 제조 및 실험방법

(세포주 및 배양)

사람 간세포성 암종 세포주 Huh7는 표준 배양 조건(5% CO₂, 37℃)하에서 10% 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 0.1 mM 비-필수 아미노산이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. HCV 서브게놈 레플리콘 RNA가 탑재된 Huh7 세포(R-1 세포주)는 1 mg/ml의 G418이 첨가된 완전 DMEM에서 배양하였다. 인간 말초혈액단핵세포(Human peripheral mononuclear cells (hPBMCs))는 Ficoll-Hypaque(GE healthcare, Uppsala, Sweden)을 사용하여 원심분리를 통해 분리하였고, 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 DMED에서 hPBMCs를 배양하였다.

(플라스미드)

바다팬지(Renilla)의 루시퍼라아제(RLuc) 리포터의 HCV IRES-매개로 한 HCV 전체 게놈(2a 타입의 키메릭 HCV 게놈 J6/JFH1) 번역이 가능한 발현 벡터는 D.M. Tscherne 등의 문헌(J Virol, 2006, vol. 80, pp. 1734-1741)에 개시되어 있다. 인간 Ago2 단백질을 과발현 시키는 벡터는 RT-PCR을 통해 다음의 프라이머를 사용하여 제작하였다:

Ago2-EcoRI-F: 5'-gactGAATTCgATGTACTCGGGAGCCGGCCCCGCACT-3'

Ago2-NotI-R: 5'-gactGCGGCCGCTCAAGCAAAGTACATGGTG-3'

위의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 후 제한효소 EcoRI과 NotI을 사용하여 pcDNA3.1 벡터에 클로닝 하였다.

(항체 및 시약)

사용된 항체는 다음과 같다: 토끼 다클론성 항-HCV NS5A 항체(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 항-α-튜불린 항체(Calbiochem, La Jolla, CA, USA), 염소 다클론성 항-HCV E2 항체(Acris Antibodies, GmbH, Hideenhausen, Germany), Alex fluor 488이 달린 항-토끼 IgG 항체와 Alex fluor 647이 달린 항-염소 IgG 항체(Invitrogen).

토끼 다클론성 항-NS5B 항체는 본 발명자의 실험실에서 생산하였다. 이중가닥 RNA 유사체인, 폴리이노신산:폴리시티딜산(Polyinosinic:polycytidylic acid[poly(I:C)])은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 얻었다. HCV 5'-UTR RNA는 인 비트로 전사에 의해 제조하였다.

(siRNA)

1b 타입의 HCV IRES를 표적으로 하는 siRNAs는 GenBank(AJ238799)에서 얻은 서열에 따라 설계하고, ST Pharm(Seoul, Korea)에서 얻었다. HCV IRES를 표적으로 하는 siRNA 영역은 도 1B에 도시하였다. 라이보스 당 백본에 있는 2'-OH기를 2'-O-메틸기(2'O-Me) 또는 2'-플루오로기(2'F)로 치환하여 siIE22를 변형하였다. 또한 2개의 리보뉴클레오타이드 사이 백본 인산에 있는 1개의 비-가교성 산소 원자를 황원자로 대체하여 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS) 연결을 생성하도록 변형하였다. 화학적으로 변형된 siIE22 유도체들은 도 4B에 도시하였다.

본 실험에 사용된 siRNA 리스트 및 표적 부위는 표 1에 나타내었다. 또한, 모든 유전자형과 아형에 대하여 HCV IRES(301-341) 서열 비교는 표 2 및 3에 나타내었다.

^a Los Alamos National Security에 의해 제공된 HCV 데이터베이스 웹 서버(http://hcv.lanl.gov/content/index)에서 468개의 여러 아형을 포함하는 유전자형의 IRES 부분(염기서열 301-341)을 ALIGN0 and QuickAlign v1programs를 사용하여 비교하였다. 5개의 클론(1.02%)에서 하나의 뉴클레오타이드의 차이가 있었다. siIE22가 타겟팅 하는 부분은 파란색으로 표시하였으며, 비교결과 서열차이가 있는 부분은 적색으로 표시하였다.

(정량적 실시간 PCR)

C형 간염 바이러스의 5' 말단에 존재하는 UTR(untranslated region)에 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)하여 C형 간염 바이러스 게놈의 카피수를 측정하였다. siIE22의 가이드 가닥의 카피수도 위와 같은 회사에서 디자인한 특이적인 프라이머를 이용하여 측정하였다.

(웨스턴 블랏 및 노던 블랏 분석)

HCV 바이러스성 단백질을 측정하기 위한 웨스턴 블랏은 J.M. Sun 등의 문헌(J Antimicrob Chemother, 2012, vol. 67, pp. 49-58)에 기재된 대로 수행하였다. HCV 게놈을 측정하기 위한 노던 블랏은 전체 RNA의 5 ㎍을 변성 포름알데히드 아가로스 젤(denaturing formaldehyde agarose gel)에 내려 블랏 후 ³²P가 표지된 DNA 프로브[HCV NS3 (3446 nt)-NS5B (9265 nt)]를 사용하여 수행하였다. DNA 프로브는 Ready-To-Go DNA labeling kit(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 제작하였다.

(MTS 분석 및 세포주기 분석)

siRNA의 세포 독성은 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide] 시약을 이용하여 측정하였다. siRNA(50 nM)로 트랜스펙션되거나, 48시간 동안 LY294002(50μM)로 처리된 Huh7 세포의 세포주기는 FACSCalibur flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

(듀얼 루시퍼라아제 리포터 분석)

바다 팬지(Renilla) 루시퍼라아제 리포터의 cap-의존적 번역 및 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제의 HCV IRES를 매개로 한 번역을 하도록 하는 비시스트로닉 듀얼 루시퍼라아제 벡터(bicistronic dual luciferase vector)를 siRNA(50 nM) 처리된 Huh7 세포에 트랜스펙션 시켰다. 리포터 플라스미드의 트랜스펙션 48시간째에 Dual-Glo luciferase assay system(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 정량하였다.

(IFN-β 리포터 분석)

IFN-β 프로모터 및 pRL-TK 리포터(Promega)의 조절 하에서 FLuc를 발현하고, 내부 대조군으로 RLuc를 발현하는 IFN-β-pGL3를 사용하여 HEK293 세포를 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 6시간 후 세포를 세척하고, Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)를 이용하여 siRNA(100 nM) 또는 poly(I:C)(1 ㎍/ml)로 트랜스펙션 시키기 전에 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 8시간 후에 세포를 회수하고, 듀얼 루시퍼라아제 분석을 수행하였다.

(siRNA 안정성 테스트)

본 실험은 연세대학교 임상시험심사위원회의 승인을 얻었다. 사람 혈액은 한국 적십자 서부 혈액 센터, 혈액원에서 얻었다. 만일 다른 명기가 없다면 건강한 기증자에게서 얻은 45% 사람 혈장에서 siRNA(2μM)를 37℃에서 일정 시간 동안 인큐베이션 하였다. 총 RNA는 Trizol LS reagent(Invitrogen)로 추출하고, 15% 폴리아크릴아마이드/7 M 우레아 젤 전기영동으로 분리하며, 노던 블랏 분석을 위해 양하전된 나일론 멤브레인(Roche, Basel, Switzerland)으로 전기적 트랜스퍼를 수행하였다. 상기 멤브레인은 자외선 가교결합되고, siRNA의 가이드 가닥에 상보적인 [γ-³²P] ATP 및 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara)를 이용하여 5'-말단이 표지된 합성 리보올리고뉴클레오타이드를 프로브로 하여 조사하였다. 포스포이미지 분석(Phosphorimage analysis) 및 정량분석은 Fuji BAS-2500 Phorphorimager를 사용하여 수행하였다.

(이식된 세포의 면역조직학적 분석)

이종이식된 조직을 PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드에서 고정하고, Frozen Section Compound(Surgipath FSC22, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)에 끼워 넣고, 표준 조직학적 기술을 이용하여 상기 조직의 5-㎛ 슬라이스를 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin(H&E))으로 염색하거나, 염소 다클론성 항-HCV E2 항체(Acris Antibodies; GmbH, Hideenhausen, Germany)와 실험실에서 제작한 토끼 다클론성 항-HCV NS5B(Sun 등, J Antimicrob Chrmother , 2012, vol. 67, pp. 49-58)과 이에 대응하는 검출용 이차항체인 Alex fluor 647-결합 당나귀 항-염소 IgG 항체및 Alex fluor 488-결합 염소 항-토끼 IgG 항체를 Invitrogen사로부터 구입하여 면역염색하였다. DAPI(4',6'-diaamidino-2-phenylindole)로 염색하여 핵을 관찰하였고, LSM 510 META 공초점 레이저 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 영상을 얻었다.

(ELISA에 의한 사이토카인 측정)

사람 말초혈액단핵세포(hPBMCs)를 사용한 실험은 연세대학교 임상시험심사위원회의 승인을 얻었다. hPBMCs는 건강한 지원자(한국적십자 서부 혈액 센터 혈액원에서 얻음)로부터 받은 혈액에서 피콜(ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하였다. 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 씨딩된 hPBMCs(1×10⁶ cells/well)에 리피도이드(lipidoid) ND98를 이용하여 10 nM siIE22 또는 1 ㎍의 poly(I:C)를 트랜스펙션시키거나, 배양배지(200 ㎕)에 직접 부가하여 50 ㎍/ml의 poly(I:C)를 처리하였다. hPBMCs 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 DMED에서 hPBMCs를 배양하였다. 16시간 자극 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다. 자극받은 세포에서 분비된 IFN-α 함량은 VeriKine human IFN-α(PBL Interferon Source, Piscataway, NJ, USA) ELISA 키트를 사용하여 평가하였다. 사람 IFN-α의 ELISAs 검출 한계는 각각 15 pg/ml이었다.

(마우스 간세포 분리)

마우스 간세포는 2-단계 관류 방법을 사용하여 분리하고, 콜라겐-코팅된 배양 플레이트에서 배양하였다.

(LNP 제조와 나노입자의 크기 분석)

전달체인 LNP로 siRNA를 캡슐화하기 위하여 ND98, 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 2000-ceramide C16(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) 그리고 siRNA를 가지고 A. Akinc의 문헌에 따라(Nat Biotechnol, 2008, vol. 28, pp. 561-569) 제조하였다. 제조된 siRNA LNP의 캡슐화 효율과 정량은 Quant-iT RiboGreen RNA assay 키트를 이용하여 매뉴얼에 따라 진행하여 분석하였다. 나노입자의 크기는 NanoSight LM10 instrument(NanoSight, Amesbury, UK)를 이용하여 분석하였다. siIE22 LNP를 PBS에 10,000배로 희석시킨 후 405 nm의 파장이 나오는 모노크로마틱 레이저 빔(monochromatic laser beam)을 조사하면, 나노입자의 추적 분석 소프트웨어를 통해 LNP의 브라운 운동이 추적된다. 얻어진 파티클의 운동값은 2D Stokes-Einstein equation를 통해 나노입자의 크기로 계산된다.

(동물실험)

모든 동물 실험은 한국 식약처 가이드라인에 따라 수행하였다. 프로토콜은 연세실험동물연구센터(Yonsei Laboratory Animal Research Center(YLARC))(Permit No: 2012-0076)의 검토 및 승인을 얻었다.

(통계분석)

특별히 지적하지 않는다면, 데이터는 적어도 3반복 실험에 대해 평균±표준편차로 나타냈다. 유의성은 unpaired Student's t-test를 이용하여 분석하였다. 0.05보다 작은 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

(siRNAs의 전달)

siRNAs는 제조업체의 설명서에 따라 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 리피도이드 ND98을 이용하여 세포에 트랜스펙션 시켰다. siRNA-lipidoid ND98 복합체는 Akinc A 등의 논문(Nat Biotechnol, 2008, vol. 26, pp. 561-569)에 기재된 방법에 따라 제조하였다.

siRNA의 인 비보 전달을 위해, ND98, 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), PEG 2000-ceramide C16(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) 및 siRNA로 구성된 siRNA 리피도이드 나노입자(LNPs)를 제조하였고(Akinc A 등, Nat Biotechnol, 2008, vol. 26, pp. 561-569; Akinc A 등, Mol Ther, 2009, vol. 17, pp. 872-879), 꼬리-정맥 주사로 종양내에 또는 i.v. 주사로 투여하였다.

(siIE22의 인 비보 항-HCV 활성 평가)

HCV(JFH1) RNA를 전기천공한 Huh7 세포(2×10⁶ cells)를 100 ㎕ PBS에서 재현탁하고, 마취시킨 면역결핍 NOD-SCID 수컷 마우스(5주령, 20-25g 체중)의 플랭크 부위에 피하주사하기 전에 100 ㎕의 Matrigel(BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA, USA)과 혼합하였다. 이식 후 3주째에, 확립된 이종이식 마우스에 siIE22 LNPs(1 mg의 siRNA/kg)를 종양내 또는 꼬리-정맥 주사로 투여하였다. 마우스 혈청 내 HCV 타이터(titer)는 실시간 qRT-PCR법으로 측정하였다. 동물실험에 대한 프로토콜은 Local Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 얻었다.

(면역침강법을 이용한 Ago2 복합체 준비)

HeLa 세포주에 lipofectamine 2000을 이용하여 인간 Ago2를 발현하는 벡터인 pcDNA3.1/hAgo2를 트렌스팩션하고 24시간 뒤에 siRNA를 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 전달하였다. siRNA 전달 후 8시간 뒤 세포를 얻어 면역침강법을 이용한 Ago2 복합체를 Perron등이 보고한 방법에 따라 준비하였다(Methods Mol Biol, vol. 725, pp. 121-141).

Ago2 IP 라이시스 버퍼를 얼음 위에서 20분 동안 처리하여 세포에서 단백질을 용해시킨 후 10,000×g, 4℃에서 10분 동안의 원심분리를 통해 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질을 1 mg/ml의 농도로 맞추고, Anti-Ago2(Cell Signaling Technology, C34C6 단일항체)와 4℃에서 1시간 동안 로테이터에서 결합시겼다. 그 뒤 20 ㎕의 protein G Dynabeads(Dynal, Oslo, Norway)를 넣고 4℃에서 3시간 동안 로테이터에서 결합시켰다. 결합시킨 후 얻어진 비드를 Ago2 IP 세척 버퍼로 여섯 번 세척하였다.

Ago2 IP 라이시스 버퍼는 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.25% NP-40, 1 mM PMSF 및 1×protease cocktail inhibitor without EDTA의 조성으로 구성되어 있다. Ago2 IP 세척 버퍼는 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ 및 0.1% NP-40의 조성으로 구성하였다.

(Ago2 복합체를 이용한 표적 RNA 절단능력 평가)

총 20 ㎕ 반응에 면역침강에 따라 얻어진 Ago2 복합체 10 ㎕와 ³²P-말단 표지된 표적 프로브를 10,000 cpm/㎕, 1 mM ATP, 0.2 mM GTP, 10 U/ml RNasin(Promega)를 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 200 ㎕의 proteinase K 버퍼와 proteinase K를 넣고 단백질들을 분해시킨 후 Trizol LS(Invitrogen)으로 RNA를 얻었다. 얻어진 RNA는 8M 우레아, 12% 아크릴아마이드 젤에 내려 BAS Fuji BAS-2500 phosphorimager로 RNA 밴드를 분석하였다.

(재조합단백질 Ago2를 사용한 표적 RNA 절단능력 평가)

단일가닥(가이드 서열)의 표적 RNA 절단능력을 평가하기 위하여 Sino Biological Inc.에서 재조합 hAgo2-His 단백질(제품번호 11079-H07B, Sino Biological Inc., Beijing, China)를 구매하였고, Lima 등의 논문을 참고하여 평가실험을 진행하였다(Cell, vol. 150, pp. 883-894).

총 20 ㎕ 반응에 5×절단 버퍼와 100 nM Ago2, 25 nM 단일가닥의 가이드 서열을 넣고 30℃에서 20분간 반응시켜 Ago2 단백질에 단일가닥의 가이드 서열이 결합하도록 한 후, 10,000 cpm/㎕의 표적 RNA를 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 200 ㎕의 proteinase K 버퍼와 proteinase K를 넣고 단백질들을 분해시킨 후 Trizol LS(Invitrogen)으로 RNA를 얻었다. 얻어진 RNA는 8M 우레아, 5% 아크릴아마이드 젤에 내려 BAS Fuji BAS-2500 Phosphorimager로 RNA 밴드를 분석하였다.

사용한 5×절단 버퍼는 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 500 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5×protease cocktail inhibitor without EDTA(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 2.5 mM DTT의 조성을 가지고 있다.

(³²P가 표지된 표적 RNA 준비)

30개 뉴클레오타이드로 합성된 표적 서열(5'-ccccgggaggucucguagaccgugcaccau-3', HCV의 IRES 314-343 부분)을 T4 polynucleotide kinase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 [γ-³²P]ATP를 넣고 제품 매뉴얼에 따라(30 nt 표적서열 10 pmol, [γ-³²P]ATP 50μCi, T4 polynucleotide kinase 2 ㎕를 사용함) 37℃에서 30분간 반응시켜 ³²P를 5'말단에 표지하였다. 반응하지 않고 남은 [γ-³²P]ATP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)는 Illustra MicroSpin G-25 Column(GE Healthcare, Bukinghamshire, UK) 컬럼을 사용하여 3.000 rpm으로 1분간의 원심분리를 통해 제거하였다.

HCV의 IRES를 표적으로 하는 siRNA의 절단능력을 평가하기 위해, IRES와 Core 코딩 부분의 앞부분까지, 즉 게놈 서열 1-487 부분에 해당하는 RNA를 동위원소[α-³²P]UTP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 넣고 MEGAscript T7 kit(Ambion, Austin, TX, USA)의 매뉴얼에 따라 37℃에서 2시간 동안 인 비트로 합성을 통해 얻었다(3.75 mM ATP, CTP, GTP와 150 μM UTP, 30 μCi [α-³²P]UTP, 1 ㎍의 주형을 사용함). 다음으로, DNase I(2U/㎕)를 1 ㎕ 첨가한 후 30분 동안 37℃에서 더 반응시겼다. 5% 아크릴아마이드/8 M 우레아 젤에서 한 시간 동안 1×TBE 버퍼에서 200V 전압으로 합성된 RNA를 내린 후, 젤을 EtBr로 염색하여 RNA 밴드부분의 젤을 잘라냈다. 아크릴아마이드 젤 용출 버퍼(0.5 M 암모늄 아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트, 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.1%(w/v) SDS)로 상온에서 12시간 동안 반응 후, 페놀/클로로포름 법으로 합성된 RNA를 얻었다. 얻어진 동위원소로 표지된 RNA 프로브는 인 비트로 전사를 위해 사용한 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 뒤에 전사 효율을 높이기 위해 인위적으로 추가한 G를 포함하여 총 488개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 전사 주형을 만들기 위해 사용한 프라이머 서열은 아래와 같다.

T7 프로모터 서열: 5'-TAATACGACACTATAG-3'

정방향 프라이머 서열: 5'-TAATACGACACTATAG-3'

역방향 프라이머 서열: 5'-AGGTTGGGTGTGCGCACGAC-3'

< 실험예 1> HCV IRES 타겟팅 siRNA 의 항바이러스 효능분석

HCV의 여러 유전자형(현재 HCV 주요 유전자형으로 6개가 알려져 있으며 이 중 유전자형 1과 2가 국내외서 가장 많이 퍼져 있어 문제가 되고 있음)에 유전자 서열이 가장 보존되어 있고 서열의 변화 시 HCV의 증식에 영향을 주어 변이가 잘 일어나지 않는 부위를 HCV 유전자분석을 통해 선정하였다. 선별된 보존된 염기서열은 5'-UTR(HCV 유전자형 1과 2에서 적어도 92% 이상 서열이 일치)과 HCV 복제효소에 의해 인식되어 RNA 합성이 개시되는 3'-말단의 X-RNA(모든 유전자형에서 98% 이상 염기서열 일치)에서 발견되었다. 이중 염기서열이 보존된 부위인 5'-UTR 중 HCV IRES를 통한 바이러스 유전자 발현에 중요한 부위에 위치한 HCV 염기서열(염기서열 277-343, 스템-루프 IIIf 및 IV 부분)에서 서열이 높게 보존(98%)되어 있는 부위를 선별하여 siRNA 라이브러리를 디자인 하였다(siIE1-siIE25, 총 25개의 siRNA; 도 1A 및 B, 표 2 및 3 참고).

HCV 리포터 RNA를 Huh7에 트랜스펙션 시킨 후 도 1B에 표시한 siRNA를 ND98 리피도이드를 사용해 도입한 후 루시퍼라아제 리포터 활성을 비교한 결과, 별표로 표시한 siRNA가 탁월한 HCV 복제 억제능을 지님을 볼 수 있었다(도 1C). 도 1C에서 선별된 siRNA를 10 nM 농도로 처리 시 siIE22가 가장 우수한 항-HCV 효능을 보여주었다(도 1D).

HCV 서브게놈 레플리콘을 지닌 Huh7 세포주(R-1)에 최종 선별한 siIE22를 농도를 증가하면서 처리한 후 48시간 뒤 잔존 HCV 유전자 카피수를 RT-PCR로 분석하여 50% 억제 효과 농도를 결정하였다.

선별된 siRNA는 0.4 nM 농도에서 HCV 복제를 50% 억제함을 알 수 있었다(도 1E 및 F).

< 실험예 2> HCV IRES 를 타겟팅하는 선별된 siRNA 들의 표적 절단능과 혈청에서의 안정성 분석

도 1D의 결과에서 보면 siIE22의 표적을 5' 혹은 3' 방향으로 1개 혹은 2개 뉴클레오타이드 이동시 항바이러스 효능이 감소하는 것을 볼 수 있다. 이러한 결과가 siIE22 가이드 가닥 서열이 바뀜에 따라 표적 절단능이 변화해 얻어졌는지를 분석하기 위해 표적 절단능을 비교 분석하였다.

도 2A에서 보듯이, siIE22 표적으로부터 각각 5' (siIE21.5) 및 3' (siIE22.5) 방향으로 1개 뉴클레오타이드씩 가이드 가닥의 표적을 이동하여도 인 비트로에서는 표적 절단능력이 크게 변화하지 않음을 볼 수 있었다. 마찬가지로, 재조합 Ago2를 사용한 실험에서도 siIE22 표적으로부터 좌우로 1개 혹은 2개 뉴클레오타이드를 이동하더라도 인 비트로에서는 표적 절단효력에는 큰 변화가 없음을 볼 수 있었다(도 2B). 이상의 결과를 근거로 siIE22가 다른 가까운 주변을 표적으로 하는 siRNA보다 항바이러스 효능이 좋은 것이 siRNA의 단순한 인 비트로에서의 표적 절단능력의 차이에 기인하지 않음을 알 수 있었다.

이에, 이들 간의 안정성의 차이가 있는지를 siIE21.5 및 siIE22.5를 siIE22와 같이 혈장에서의 안정성을 분석하였다.

도 2C에서 볼 수 있듯이 이들 3종 siRNA들은 혈장에서의 안정성에도 큰 차이를 보여주고 있지 않았다.

< 실험예 3> LNP 내에 캡슐화된 siIE22 의 효능 평가

생체 내로 보다 효율적으로 siRNA를 운반할 수 있는 리피도이드 기반 siRNA 전달 제형을 제조하였다. 리피도이드, 콜레스테콜 및 PEG-ceramide를 이용하여 리포좀 제형을 만들고 siRNA를 리포좀 내로 유입시켜 제조하였다(도 3A). 평균 직경 약 100 nm 크기의 나노입자 형태를 유지하고 있음이 DLS 분석법으로 확인되었다(도 3B).

HCV IRES에 타겟팅하는 siIE22 siRNA의 인 비보 유전자 발현 억제능을 평가하기 위해 도 3C에 기술한 리포터를 사용하여 Balb/c 마우스(n=4)를 사용해 인 비보 효능평가 실험을 수행하였다. 마우스에 리포터를 하이드로다이나믹 주사(hydrodynamic injection)한 뒤 1시간 뒤에 siIE22 LNP를 1 mg/kg의 용량으로 i.v. 주사하여 간으로 전달하였다. 16시간 뒤 듀얼 루시퍼라아제 분석을 수행해 siIE22에 의한 HCV IRES-의존적 번역이 얼마나 억제되었는지를 평가하였다.

도 3C에서 보듯이 siIE22에 의한 표적 유전자 발현이 현저히(평균 1.5 log 감소) 억제되고 있음을 볼 수 있었다.

Balb/c 마우스에 siIE22 LNP를 1 mg/kg의 용량으로 꼬리를 통해 정맥주사한 후 2시간 뒤에 마우스 혈청에서의 IFN-α를 분석해본 결과, siIE22 LNP를 주입한 그룹에서는 IFN-α가 유도되지 않음을 확인하였다(도 3D). 반면 양성대조물질인 합성 이중가닥 RNA, polyI:C는 LNP 혹은 ND98로 복합체를 만들어 정맥주입 시 모두 IFN-α 생성을 유도하고 있다.

siIE22 LNP의 선천성 면역반응 및 염증반응 유도 여부를 분석하였다. ELISA 분석법을 통해 인간 PBMC에 도입 시(처리 후 16시간 뒤 분석)에도 IFN-α 발현이 유도되지 않음을 볼 수 있었다(도 3E: ELISA 분석 결과). 루시퍼라아제 분석 시스템을 통해 HEK293 세포주에서 IFN-β 리포터 분석을 수행한 결과 ND98로 전달된 siIE22가 선천성 면역반응을 유도하지 않음을 알 수 있었다(도 3F). 이는 HCV 유전자의 5'-미번역 영역에 있는 IRES에 타겟팅되는 siIE22의 항바이러스 효능이 인터페론과 같은 선천성 면역 반응 없이 나타날 수 있음을 보여주는 결과이다.

< 실험예 4> 화학적으로 수식화 된 siIE22 의 항바이러스 효능평가

siIE22의 안정성을 높이기 위해 다양한 수식을 도입한 siRNA를 디자인하고(도 4B) 혈청내에서의 안정성을 평가하였다. 최근 뉴클레오타이드를 변형하는 것과 2' 당을 변형하는 것 그 외 여러 종류의 siRNAs 수식이 도입되고 있다. 이러한 수식들은 혈청 내의 핵산분해 효소에 대한 저항성을 높여 siRNA의 분해에 대한 안정성을 높인다고 보고되어 있다. 도 4A에서 보듯이 siIE22는 45% 혈청에서의 반감기(half life)가 30분으로 분석되었다. 다양한 수식 siRNA의 안정성을 비교 분석한 결과 플루오로 잔기로 수식된 siRNA와 PS로 수식된 siRNA의 안정성이 향상됨을 노던 블랏 분석을 통해 볼 수 있었으며 siRNA의 두가닥 중 안티센스 가닥 즉 가이드 가닥에만 수식하더라도 안정성이 향상됨을 볼 수 있었다(도 4C). 수식한 siIE22의 항 바이러스 효능을 R-1 세포주에서 분석한 결과 도 4D에서 보듯이 PS 잔기로 수식된 siIE22는 항 바이러스 기능이 유지되나 플루오로 잔기로 수식한 siIE22는 항 바이러스 기능이 현저히 떨어짐을 알 수 있었다. 또한 최종적으로 선별한 gs_PS1 siIE22의 혈청내에서의 안정성을 평가한 결과, 반감기가 205분으로 6.8배 가량 안정성이 향상됨을 알 수 있었다(도 4E).

< 실험예 5> HCV 복제 마우스 모델에서의 gs _ PS1 siIE22 의 항 바이러스 효능평가

전기천공에 의해 HCV(유전자형 2a) RNA로 트랜스펙션된 Huh7 세포를 레어 플랭크(rear flank)로 경피적으로 이종이식한 면역-결핍 마우스에서 gs_PS1 siIE22 LNP의 항-HCV 활성을 평가하였다. 트랜스펙션된 세포를 이식한 후 2-3주째에 혈청 HCV 타이터는 10⁶-10⁷ copies/ml만큼 높게 검출되었다. 이종이식 후 4주째에 마우스로부터 발견된 이종이식 조직에서, HCV 플러스- 및 마이너스-가닥 RNAs 둘 다 검출되었다(도 5A). 따라서, 이종이식체에서 HCV가 복제되었음을 알 수 있었다. 또한, 면역조직학적 분석 결과, HCV E2와 NS5B 항원이 이종이식 조직에서 발현되었다(도 5B).

수식화된 siIE22를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft 모델)에 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg의 농도로 주입한 후 3일, 7일 후 혈청내 HCV 유전자 카피수를 분석한 결과 최대 1log 이상 바이러스 타이터가 감소되며 분석한 3마리 마우스 모두에서 7일까지 약 50%까지 항바이러스 효능이 지속될 수 있음을 볼 수 있었다(도 5C).

PS 수식된 siIE22를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft 모델)에 꼬리 정맥을 통해 3일 간격으로 1 mg/kg의 농도로 주입하였다. 주입 후 2일 뒤에 혈청 내 HCV 유전자 카피수를 분석한 결과 첫 주입 시 평균 1log, 많게는 2log 바이러스 타이터가 감소되며 그 이후 주입할 때마다 약 1log씩 바이러스 타이터가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 마지막 주입 후 혈청 내 바이러스 타이터를 분석한 결과 초기 타이터에서 약 4log까지 떨어짐이 확인 되었다(도 5D). 따라서 사용한 서열이 효과적으로 바이러스의 복제를 감소시키고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 6> HCV IRES 의 서브도메인 IIIf 를 타겟킹하는 타 특허 서열과 siIE22와의 항바이러스 효능분석 결과

도 6A는 미국 특허 제8426380호에 개시된 서열들의 shRNA와 선형 형태로 나타낸 것이고, 도 6B는 siIE22를 포함하여 기존에 보고되어 있던 특허 서열들의 패신저 가닥을 HCV IRES에 나타낸 것이다. 루시퍼라아제 리포터가 달린 J6/JFH1(2a)가 안정적으로 복제되고 있는 세포주에 선별된 미국 특허 제8426380호에 보고된 siRNA(Sc)를 100 pM의 농도로 처리하고 48시간 뒤에 항바이러스 효능을 분석하였다.

분석 결과 세 가지 서열 중 HCVc-wt(표적: 318-342 부분)이 가장 항바이러스 효능이 좋음을 알 수 있었다(도 6C). gs_PS1 siIE22와 미국 특허 제8426380호에 개시된 서열 중 가장 항바이러스 효과가 좋은 HCVc-wt의 항바이러스 효능을 HCV 서브게놈 복제 세포주인 R-1 세포주에 5 nM로 처리하고 48시간 뒤에 분석한 결과 gs_PS1 siIE22가 HCVc-wt에 비해 통계적 유의성이 있게 약 2배 효능(상대적 HCV 게놈 타이터, 11% 대 21%)이 더 좋았다(도 6D).

발현 벡터 pcDNA3.1/hAgo2를 사용하여 인간 Ago2를 과발현 시킨 HeLa 세포주에 이중가닥 gs_PS1 siIE22와 Somagenics사의 siRNA 등을 각각 20 nM의 농도로 처리한 후 면역침강법을 통해 얻어진 Ago2 복합체를 분리하였다. 분리된 Ago2 복합체로 표적 RNA 절단효과를 비교 평가하였으며 사용한 siRNA의 표적을 지닌 RNA 프로브는 30개 뉴클레오타이드(HCV 게놈 서열 314-343) 크기의 방사선 동위원소로 표식된 RNA이다.

도 6E는 siRNA가 실제로 표적을 절단할 수 있는 효력을 가지고 있음을 보여주고 있으며 siIE22와 gs_PS1 siIE22가 Somagenics사의 siRNA들 중 가장 항바이러스 효능을 보인 HCVc-wt(27-mer)보다 표적 RNA 절단능력이 우수함을 보여주고 있다. gs_PS1 siIE22는 PS 수식화를 통해 안정성이 증가되어 더욱 높은 RNAi 효력을 보이는 것으로 보인다. 나아가 이상의 결과는 siRNA와 RISC 복합체와의 상호작용이 siRNA의 전체 길이에 따라 달라질 수 있음을 보여주고 있다. 이는 RNAi를 통한 표적 RNA의 저해효과는 오버행을 포함하여 21개의 뉴클레오타이드로 제작되었을 때 가장 좋은 저해효과를 가진다는 보고와도 부합하는 결과이다. 표적은 5'-말단에 ³²p가 표지된 30개의 뉴클레오타이드이다(HCV IRES 314-343 부분).

Somagenics사 이외에 승인되지 않았지만 Xavier University of Louisiana(미국 공개특허 제2012-0308642호)와 Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science(WO2010-061881)에서 개시된 서열들을 R-1 세포주에서 1 nM의 농도에서 항바이러스 효과를 비교 분석하였다. R-1 세포주에서 항-HCV효능 분석은 qRT-PCR 분석법으로 분석하였다.

Xavier University의 서열들(Xi_316-334, Xi_si321)은 각각 51%와 33%의 저해효력을 보였고, Tokyo Metropolitan Institute의 서열(TK_9.10)은 68%의 항바이러스 효능을 보인데 반해 gs_PS1_siIE22는 1 nM 농도에서 약 82%의 높은 항바이러스 효능을 보였다(도 6F). TK_9.10은 siIE22와 서열이 매우 유사하나 3'-오버행 서열이 패신저 가닥에서는 CA, 가이드 가닥에서는 CG로 되어 있으며 이들 오버행 서열은 HCV 게놈 서열에서 유래하고 있다. siIE22는 패신저 가닥 및 가이드 가닥 모두에서 3'-오버행 서열이 UU이다.

요약하면, 상기 실험예 1, 2와 6은 1개 또는 2개의 서열의 간격을 두고 siRNA를 IRES에 타일링(tiling)하여 디자인하고 이들의 항바이러스 효능을 분석하여 기존의 HCV IRES 표적 siRNA보다 항바이러스 효능이 우수한 siRNA를 제공한다.

특히, 높은 항-HCV 효능을 보이는 siRNA, 즉 siIE19, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 24, 25가 서열 313-343을 포함하는 총 31개 염기서열내에 집중해 표적되고 있음을 보이고, 이중 siIE22 및 이로부터 유래한 안정성이 증가된 siRNA인 gs_PS1 siIE22는 기존의 HCV IRES 타겟팅 siRNA에 비해 더 높은 항바이러스 효능을 보인다. 가장 항바이러스 효능이 높은 siIE22의 표적으로부터 5' 혹은 3' 방향으로 표적을 1개 또는 2개 서열 이동이 될 경우 siRNA의 항바이러스 효능은 상당히 감소한다.

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Therapeutic HCV IRES-silencing siRNA for the treatment of hepatitis C virus infection <130> P15U16C0681 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV IRES 319-337 nt <400> 1 ggaggucucg uagaccgug 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siIE22 guide strand <400> 2 cacggucuac gagaccuccu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siIE22 passenger strand <400> 3 ggaggucucg uagaccgugu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_PS1 siIE22 modified guide strand <220> <221> variation <222> (1)..(21) <223> Two ribonucleotides of 18th and 19th are bounded by a phosphorothioate linkage. <400> 4 cacggucuac gagaccuccu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_PS2 siIE22 modified guide strand <220> <221> variation <222> (1)..(21) <223> Two ribonucleotides of 17th and 18th are bounded by a phosphorothioate linkage. And, two ribonucleotides of 18th and 19th are bounded by a phosphorothioate linkage. <400> 5 cacggucuac gagaccuccu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_Py-F siIE22 modified guide strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> gs_Py-F siIE22 modified guide strand is chemically modified by substituting 2'-fluoro for the ribose of pyrimidine 2'-OH group. <400> 6 cacggucuac gagaccuccu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ps_PS1 modified passenger strand <220> <221> variation <222> (1)..(21) <223> Two ribonucleotides of 18th and 19th are bounded by a phosphorothioate linkage. <400> 7 ggaggucucg uagaccgugu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ps_PS2 modified passenger strand <220> <221> variation <222> (1)..(21) <223> Two ribonucleotides of 17th and 18th are bounded by a phosphorothioate linkage. And, two ribonucleotides of 18th and 19th are bounded by a phosphorothioate linkage. <400> 8 ggaggucucg uagaccgugu u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ps_2'O-Me modified passenger strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> 6th, 11th and 18th nt of the modified passenger strand is substituted with 2'-O-methyl for the ribose 2'-OH group. <400> 9 ggaggucucg uagaccgugu u 21

Claims (10)

1. SEQ ID NO: 1로 표시되는 HCV IRES mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며,
   SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥의 이중가닥으로 이루어지고, 상기 가이드 가닥과 패신저 가닥은 3'-UU 오버행을 포함하는, siRNA(small interfering RNA).
   
2. 제1항에 있어서,
   siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것이며, 상기 화학적 변형은
   a) 3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 변형하는 것;
   b) 3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid)를 도입하는 것; 및
   c) 라이보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH₂(아미노기), -C-allyl(알릴기), -F(플루오로기), 및 -O-Me(메틸기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 치환하는 것 중 하나 이상인, siRNA.
   
3. 제2항에 있어서, 화학적으로 변형된 siRNA는
   SEQ ID NO: 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 중 어느 하나의 가이드 가닥; 및
   SEQ ID NO: 3 및 7 내지 9로 표시되는 염기서열 중 어느 하나의 패신저 가닥으로 이루어진 것인, siRNA.
   
4. 제1항의 siRNA를 포함하는 발현 벡터.
   
5. 제4항에 있어서,
   발현 벡터는 플라즈미드, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 및 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터.
   
6. 제1항의 siRNA를 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   siRNA를 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   핵산 전달체는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼 및 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택되는 C형 간염 치료용 조성물.
   
9. 제7항에 있어서,
   복합체는 이중가닥 siRNA, 콜레스테롤 및 세라마이드에 컨쥬게이트된 PEG로부터 형성된 리피도이드 제형인, C형 간염 치료용 조성물.
   
10. 제6항에 있어서, 병용투여를 위한,
    1) NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 비구조 단백질 저해제;
    2) 캡시드 단백질 C, 외피 당단백질 E1 또는 E2, 및 p7 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 구조 단백질 저해제;
    3) IFN-α 및 리바비린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 범용성 항바이러스제;
    4) HCV internal ribosome entry site(IRES), 캡시드 단백질 C 코딩 유전자 및 HCV 3'-미번역 영역(3'-UTR)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 유전자 저해제; 또는
    5) PRK2, Hsp90, PDK1, CD81 및 HCV 구조 단백질 또는 비구조 단백질에 결합하는 숙주 인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HCV 복제 또는 증식 조절 숙주 표적 유전자 저해제를 추가로 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.
    

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