JPH09507381A

JPH09507381A - 血管平滑筋細胞の増殖の阻害

Info

Publication number: JPH09507381A
Application number: JP6525809A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ゾー、ヴィクター
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザリーランドスタンフォードジュニアユニヴァースティ
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1997-07-29
Also published as: EP0701609A1; CA2163234A1; WO1994026888A1; US5821234A

Abstract

(57)【要約】本発明は、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼを発現する遺伝子を阻害する、少なくとも１の該遺伝子に対する少なくとも１のアンチセンスオリゴマー配列の有効量を投与することよりなる哺乳動物において血管病巣形成に関連する細胞の血管細胞活性を阻害する方法を含む。さらに詳しくは、本発明は、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、ＥまたはサイクリンＸ（ｐ４６）およびサイクリン依存性キナーゼｃｄｃ２、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４、またはｃｄｋ５の発現を阻害するアンチセンス配列を投与することを含む。各々、異なるサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼの核酸からの２つのアンチセンス配列を用いるのが好ましい。該サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼは、好ましくは、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と組み合わせて投与する。ＴＧＦ−β₁、ＴＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦのごとき増殖因子の発現の阻害に向けられたアンチセンス方法および組成物も本発明に含まれる。アンチセンス配列はリポソーム、特にＨＶＪを含有するリポソームに取り込み、直接に、管腔内、壁内または外膜周囲に投与される。本発明の方法は、大腿頸動脈および腎臓動脈における病巣のごとき広範囲のスペクトルの血管病巣、特に、腎臓透析瘻に由来する病巣を治療するのに有用である。本発明は、特に、冠動脈血管形成術に関連する血管病巣を治療するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】血管平滑筋細胞の増殖の阻害関連出願の参照本出願は、１９９２年９月１０日付け出願の米国特許出願第０７／９４４,８８２号の一部継続出願である１９９３年５月１９日付け出願の米国特許出願第０８／０６３,９８０号の一部継続出願であり、ここに出典明示して両出願の内容を本明細書の一部とみなす。本明細書に開示された成果はＮＩＨの援助ＨＬ３５６１０、ＨＬ３５２５２、ＨＬ４２６６３およびカリフォルニア大学タバコ関連病プログラムＩＲＴ２１５によって支持されたものである。米国政府は本発明において権利を有し得る。発明の背景技術分野本発明の分野は、血管病巣に関連した細胞活性の阻害である。関連技術の背景多細胞生物の増殖および維持において、生物は細胞の増殖を活性化または阻害する複数プロセスを経なければならなかった。生物は多数のメカニズムを進展させ、それにより、細胞内または細胞外メッセンジャーによってシグナルを細胞に与える。増殖の制御は、器官の形成、造血における白血球のサブセットの維持、傷の治癒等を供する。しかしながら、傷害または病気状態のごとき多くの状況において、傷害または病気に対する生物の反応は、事実、生物の健康にとって有害であろう。傷害に対する血管反応は、３つの基本的な細胞過程：細胞増殖、細胞移動および細胞外マトリックス産生の変化を含む。傷害に対するこの血管反応は、アテローム動脈硬化症、血管形成後の再狭窄、静脈バイパイ移植狭窄、補綴移植狭窄、脈管形成および高血圧を含むが（それらの限定されることのない）種々の血管病の病因に特徴的である。例えば、アテローム動脈硬化症病巣は、血管平滑筋の内膜下スペースへの移動、増殖および豊富な細胞外マトリックスの産生の結果として起こる。同様に、血管形成後の再狭窄、静脈バイパイ移植狭窄、補綴移植狭窄、脈管形成および高血圧は、血管細胞の増殖、移動およびマトリックス組成の異常性が関与する、これらの細胞過程の調節の変化の原因となる正確なメカニズムは余り特徴付けられていない。 Dzau(Hypertension，８，553-559(1986))は、血管レニン−アンジオテンシン経路を記載している。Geisterfer,et al.(Circulation Research 62，749-756(1 988))は、アンジオテンシンＩＩは培養したラット大動脈平滑筋細胞の肥大を報告している。Barrett and Benditt(Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85，2810-2 814(1988))は、ヒト・アテローム動脈硬化症粥状斑および正常動脈壁における血小板由来増殖因子の発現を記載している。Powell，et al．(Science 245，186-188(1989))は、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤が、血管傷害後に筋肉内膜増殖を防止することを報告している。Naftilan，et al．(J．Clin．Invest，83，1413-1424(1989) )は、培養したラット血管平滑筋細胞におけるアンジオテンシンＩＩによる血小板由来増殖因子Ａ鎖の誘導およびｃ−ｍｙｃ遺伝子発現を報告している。Sarzan i，et al．(J．Clin．Invest，83，1404-1408(1989))は、大動脈におけるまたは正常血圧および高血圧ラットにおける種々の増殖因子の発現を記載している。Ma jesky，et al.(J．Clin．Invest，88，904-910(1991))は、動脈傷害の回復の間におけるＴＧＦ−β₁の産生を報告している。Linder，et al．(Circulation Res earch，68，106-113(1991))は、血管病巣形成における塩基性繊維芽細胞増殖因子の役割を記載している。Daemen，et al．(Circulation Research，68，450-45 6(1991))は、正常および傷害ラット動脈壁における平滑筋細胞増殖でのアンジオテンシンＩＩの役割を報告している。Ferns，et al.(Science，253，1129-1132( 1991))は、ＰＤＧＦに対する抗体による血管形成後のネオ内膜平滑筋蓄積の阻害を報告している。Gibbons，et al.(Clin．Research，38，287A(1990))は、アンジオテンシンＩＩに対する血管平滑筋細胞の二官能性増殖反応の形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）による変調を報告している。Itoh，et al．(Biochem．Biophys．Res．Comm，176，1601-160 9(1991))は、プロトオンコジーン発現および血管細胞増殖に対する動脈ナトリウム排泄増加性ポリペプチドおよびアンジオテンシンＩＩの相互作用を報告している。 Simons and Rosenberg(Circ．Res.，70，835-843(1992))は、非筋肉ミオシン重鎖およびｃ−ｍｙｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、in vitroにおいて平滑筋細胞増殖を抑制することを報告している。Speir and Epstein(Circ ulation，86，538-547(1992))は、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するアンチセンスが、in vitroにて平滑筋増殖を阻害することを報告している。Rosenber g et al．(PCT/US92/05305，1993年１月)は、ｃ−ｍｙｂまたはＰＣＮＡ蛋白質の阻害に関与する局在オリゴヌクレオチド療法のアンチセンスアプローチを記載している。細胞合成の種々の期におけるサイクリンの発現と有糸分裂周期との関係が、Th e Journal of NIH Research(1992年12月、第４巻、55-59頁)に記載されている。例えば、図１は、細胞増殖のＧ１（ｇａｐ１）、合成、Ｇ２（ｇａｐ２）および有糸分裂期の間におけるサイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２およびＥの大まかのレベルを示す。Williams，et al.(The Journal of Biological Chemist ry，第266巻、第12号、1993年４月25日、8871-8880頁)は、サイクリンｘ（ｐ４６）の単離を示している。これらの後者の２つの論文の両者およびO'Connor，et al．(The Journal of B iological Chemistry，第286巻、第11号、1993年４月15日、8298-8308頁)のような文献は、ｃｄｃ２およびｃｄｋ２のごとき種々のサイクリン依存性キナーゼならびにサイクリンＡおよびＢの相互作用を説明している。 Jaskulski et al．(Science，第240巻、第4845号、1544-6頁(1988))は、増殖するＢａｌｂ／Ｃ３１３細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を記載している。アンチセンス分子は合成および有糸分裂を阻害し、センスオリゴは効果を有しなかったことが示されている。Sala et al．(Proc．Natl．Acad．S ci．U.S.A.、第89巻、第21号、10415-9頁(1992年11月))は、ｃ−ｍｙｂ発現を阻害するｃ−ｍｙｂ遺伝子に対するアンチセンス配列を記載している。Kimeki(J． Cell Biochem.，第50巻、第１号、1-9頁(1992))は、in vitroにおけるＣ−ｍｙｃまたはサイクリンＡの妨害を記載している。Doyle et al．(Antisense Res．D ev.，第１巻、第１号、春季号、11-20頁(1991))は、アフリカツメガエル卵母細胞におけるサイクリンＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載している。Zindly et al.(Biochem．Biophys．Res．Commun.，第1897巻、第３号、1144 -54頁(1992))は、ラットにおけるサイクリンＡまたはサイクリンＢの産生のアンチセンス妨害を記載している。また、サイクリンＡアンチセンスオリゴヌクレオチドがNature(第354巻、第6351号、314-7頁(199 1)およびGuerria et al.(EMBO J.，第10巻、第11号、3343-9頁(1991)に記載されている。これらの文献は、中期Ｉ卵母細胞におけるサイクリンＡまたはサイクリンＢオリゴの影響を報告している。さらに、アフリカツメガエル胚におけるアンチセンス研究が、Development(第III巻、第４号、1173-8(1991))およびJ．Cell ．Biol.(第114巻、第４号、767-72頁(1991))に記載されている。Lapidot-Lifson et al．(Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、第89巻、第２号、579-83頁(1992))は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでのｃｄｃ２の下降(down)調節を記載している。発明の概要本発明は、アンチセンス配列が当該遺伝子の発現を阻害するサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼの遺伝子についての少なくとも１つのｍＲＮＡまたはプレ−ＬＲＮＡに対する少なくとも１つのアンチセンス配列の有効量を投与することを特徴とする哺乳動物における血管病巣形成に関連する細胞の血管細胞活性を阻害する方法を含む。さらに詳しくは、本発明は、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、ＥまたはサイクリンＸ（ｐ４６）およびサイクリン依存性キナーゼｃｄｃ２、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４またはｃｄｋ５の発現を阻害するアンチセンス配列の投与を含む。各々が、異なるサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼの発現を阻害する２種のアンチセンス配列を使用するのが好ましい。もう１つの態様において、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼに対するアンチセンス配列は、好ましくは、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するアンチセンス配列と組み合わせて投与される。形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のごとき増殖因子の発現の阻害に向けられるアンチセンス方法および組成物も本発明に含まれる。アンチセンス配列はリポソーム、特に、ＨＶＪを含有し、かつ直接、管腔内投与、壁内投与または外膜周囲投与されるリポソームに取り入れる。本発明の方法は、広範囲な血管病巣スペクトルを治療するのに有用である。かかる病巣は、大腿大動脈および腎臓動脈における病巣、特に、腎臓透析瘻に由来する病巣を含むが、それらの限定されるものではない。本発明の方法は、心血管形成術に関連する血管病巣を治療するのに有用である。かかる使用については、アンチセンス配列を血管形成術に適用して再狭窄を減少させる。発明の詳細な記載図面の簡単な記載図１は、種々の細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２、またはＭ期状態における種々のサイクリンの適切なレベルの模式的ダイアグラムである。図２は、再狭窄の組織学を示す。図３は、ネオ内膜についてのｃｄｃ２およびＰＣＮＡに対する組合せアンチセンス治療の経時的効果を示す。図４は、ネオ内膜／中膜領域の比についてのｃｄｋ２およびｃｄｃ２に対するアンチセンスの効果を示す。図５は、ネオ内膜／中膜領域の比についてのｃｄｃ２キナーゼ／ＰＣＮのアンチセンスおよびセンスＯＤＮの長期効果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１対センス細胞周期の間のサイクリンの発現の大まかなレベルは図１に示され、サイクリンＤはｇａｐ１（Ｇ１）期に出現し、増殖因子の存在下で周期を通して発現される。サイクリンＣは初期Ｇ１に蓄積し、次いで、減少する。サイクリンＤ２およびＥはＧ１の終わりに蓄積し、合成（Ｓ）期に分解され、サイクリンＡはまず（Ｓ）期で検出され、細胞が有糸分裂（Ｍ）に入るにつれて分解される。サイクリンＢ１およびＢ２は、サイクリンＡの後まもなくして出現し、中期−Ｍ期で分解される。これらのサイクリンは細胞周期において重要な蛋白質であり、そのアミノ酸期同性によって関連蛋白質のファミリーとして認識される。サイクリンはキナーゼと活性複合体を形成し、これらの活性複合体は蛋白質をリン酸化する。図２は、血管形成術後の再狭窄過程を示す。血管形成術は、動脈中でバルーンを膨張させて、閉塞性アテロール動脈硬化症病巣を緩和することによってなされる。病巣を圧縮する過程において、該手法は、内部弾性板（ｌａｍｉｎａ）（ＩＥＬ）の破裂を誘導する。血流の増加は、狭い状態からの解放に由来する。バルーン膨張によるＩＥＬの破裂および血管壁の傷害は、血管平滑筋の増殖反応を誘導し、その結果、ネオ内膜が形成され、血管内腔に対する閉塞が更新される。該ネオ内膜は平滑筋細胞およびマトリックスよりなり、ポスト血管形成を形成するのに１〜６月かかる。表１および２は、代表的なサイクリンまたは、サイクリン依存性キナーゼ、およびＰＣＮＡにつき、種々の増殖因子のセンスおよびアンチセンス配列を示す。表３は、本発明の治療剤を製造するためのアンチセンス配列情報を得るのに有用である種々のヒトＤＮＡ配列を示す。表４は、種々の例で用いる細胞調節遺伝子に対するＯＤＮの配列を示す。表５は、実施例４で決定したネオ内膜／中膜領域の比についてのアンチセンスＯＤＮである。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて蛋白質をコードする遺伝子の発現を阻害する方法に関する。該方法は、in vivoにおける特異的部位へのオリゴヌクレオチドの局所化適用に基づく。該オリゴヌクレオチドは、好ましくは、インプラントまたはゲルと混合して標的組織に直接的に投与するか、あるいは直接的注射または注入によって投与する。１の態様において、該オリゴヌクレオチドを修飾して、それらを、内因性酵素による分解または改変に対しin vivo で耐性とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる治療アプローチは、遺伝子からの蛋白質の発現を、当該遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的な適切な長さのオリゴヌクレオチドを供することによって下降(down)調節するという原理に基づいている。アンチセンス鎖はｍＲＮＡにハイブリダイズし、該ｍＲＭＡを下降調節の標的とし、それにより、リボソーム翻訳、引き続いての蛋白質合成を妨げる。好ましいオリゴマー選択されたオリゴマーは、荷電したまたは荷電していない骨格を有するものを含めた、いずれのタイプであってもよい。好ましいオリゴマーは、アルキル−およびアリール−ホスホレートオリゴマーを包含し、特に好ましいものはメチルホスホネートオリゴマーである。他の好ましいオリゴマーは、ホスホロチオエートオリゴマー、ホスホロジチオエートオリゴマー、モルホリノアナログ、ホルムアセタールアナログ、チオホルムアセタールアナログおよびペプチド核酸（「ＰＮＡ」）アナログを包含する。好ましくは、オリゴマーは、各々、約４ないし約４０ヌクレオシド、より好ましくは、約６ないし３０ヌクレオシドよりなる。特に好ましいのは、約８ないし約２０ヌクレオシドである。核酸標的配列がｍＲＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡである場合の好ましい標的配列領域は、３’−非翻訳領域、暗号領域、プレ−ｍＲＮＡのスプライス部位（スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位含む）、ＡＵＧスタートコドンよりわずかに下流の領域を含めた開始コドン（好ましくは、ＡＵＧ開始コドンから約２０ヌクレオチド下流まで）、開始コドンから直ぐの５’側領域（好ましくは、ＡＵＧスタートコドンの約５ないし２００ヌクレオチド５’側）および５’ −キャップ部位である。別の好ましい態様によると、タンデムオリゴマーを使用する。好ましいタンデムオリゴマーは合計約２０ないし約４０ヌクレオシドよりなるものを包含する。選択されたヌクレオチド間結合を有するオリゴマーは、都合よくは、当業者に公知の合成技術に従って調製することができる。例えば、ホスホジエステルおよびある種の他の含リン−ヌクレオチド間結合を有するオリゴマーの合成には、市販の機器、試薬およびプロトコルが利用できる(Gait，M.J.，Oli gonucleotide Synthesis: A Practical Approach(IRL Press，1984); Cohen，Ja ck S.，Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitors of Gene Expression,(CR C Press，Boca Raton，FL，1989); Oligonucleotides and Analogues: A Practi cal Approach，(F．Eckstein，1991); and Agarwal，S.，Protocols for Oligon ucleotides and Analogs Synthesis and Properties，(Humana Press，N.J.，19 93)参照)。ある種のリンを含有しないヌクレオチド間結合を有するオリゴマーの調製は米国特許第５,１４２,０４７号に記載されており、ここに出典明示してその開示を本明細書の一部とみなす。メチルホスホネートオリゴマーを調製するための合成方法は、Lee B.L.，et a l.(Biochemistry 27:3197-3203(1988)、Miller，P.S.，et al.(Biochemistry 25 :5092-5097(1986))、およびProtocols for Oligonucleotides and Analogs Synt hesis and Properties中の「An Improved Method for the Synthesis and Deprot ection of Methylphosphonate Oligonucleotides」(S．Agarwal編(Humana Press ，N.J.，1993));および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７８６４およびＷＯ９２／０７８８２に記載されており、ここに出典明示してその開示を本明細書の一部となす。また、好ましいのは、ヌクレオシド／非−ヌクレオシドポリマーであるオリゴマーである。また、適当なオリゴマーは、コンポジットＲＮＡ、ＤＮＡアナログであるキメラオリゴヌクレオチドを含む(Inouo et al. ，FEBS Lett．2115:327(1987))。他の適当なオリゴマーは、キメラ骨格を有するオリゴマーを含む。かかるキメラ骨格オリゴマーは、ＲＮアーゼＨを活性化できるヌクレオシド配列、ＲＮアーゼＨを活性化しないヌクレオシド配列を含めた混合ホスフェート骨格を有するオリゴマーを含み、かくして、ＲＮＡ分子の部位特異的切断を可能とする。ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第４,１４９,７９７号参照。また、キメラ骨格オリゴマーは、モルホリニル結合、ホルムアセタール結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合等のごとき、リン原子を含んでも含んでいなくてよいヌクレオシジル間結合の混合物を有するオリゴマーを包含する。中性の骨格、例えば、切断もしくは架橋部位が付着したメチルホスホネートオリゴマーを有するオリゴマーは、ある状況では有利であろう：かかるオリゴマーは長いin vivo半減期を有するであろう。というのは、中性の構造は、該切断もしくは架橋部位が標的ポリヌクレオチド配列の不活性化を促進することができ、ヌクレアーゼ消化の速度を低下させるからである。本発明の１の態様によると、これらのアンチセンスオリゴマーは、選択された標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部に相補的な配列を有する。阻害の正確な分子メカニズムは結論としては決定されていないにも拘わらず、それはアンチセンスオリゴマーと標的遺伝子から転写されたＲＮＡとの間のデュプレックスの形成に由来することが示唆されている。形成されたデュプレックスは、ｍＲＮＡ配列の翻訳、プロセッシングまたは輸送を阻害するか、あるいは酵素ＲＮアーゼＨによる消化を導びくものである。また、２つのＤＮＡ鎖のうちの一方でデュプレックスを形成し、標的鎖の第２のＤＮＡがデュプレックスから置き換えられるように、一本鎖オリゴマーはデュプレックスＤＮＡ標的に結合できる。好ましいのは、ＤＮＡデュプレックス標的（「侵入デュプレックス」）のコーディング鎖でのオリゴマーによるデュプレックスの形成である。かく形成された該侵入デュプレックスは転写を阻害し得る。一般に、使用するオリゴマーは、標的核酸の配列に相補的に配列を有するであろう。しかしながら、絶対的相補性は必要とはされず；一般に、標的核酸とで安定なデュプレックスを形成するのに十分な相補性を有するいずれのオリゴマーも適当であると考えられる。安定なデュプレックス形成は、ハイブリダイズするオリゴマーの配列および長さならびにアンチセンスオリゴマーと標的配列との間の相補性の程度に依存するので、当該系は、より長いオリゴマーを使用する場合、より低い適合度（相補性）を許容する。しかしながら、生理条件下で約４０ ℃を超える融解温度を有するデュプレックスを形成するのに十分な相補性を有する長さが約８ないし約４０ヌクレオシジル単位であるオリゴマーが、本発明の方法で用いるのに適当である。定義本明細書中で用いるごとく、特に断りのない限り、以下の用語は以下の意味を有する。「プリン」または「プリン塩基」なる語は、天然に生じるアデニンおよびグアニン塩基のみならず、８−位が置換された塩基、６−位が修飾されたグアニンアナログもしくはアデニンのアナログ、２−アミノプリン、ならびに９−デアザプリン誘導体および他のプリンアナログのごとき９−位で窒素を置換した炭素を有するプリンのアナログのような塩基の修飾も含む。「ヌクレオシド」なる語はヌクレオシジル単位を含み、それと相互に交換して用いられ、５炭糖および含窒素塩基よりなる核酸のサブユニットをいう。該用語は、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを塩基として有するヌクレオシジル単位のみならず、天然に生じる塩基のアナログおよび修飾形を包含する。ＲＮＡにおいては、５炭糖はリボースであり；ＤＮＡにおいては、それは２’−デオキシリボースである。用語ヌクレオシドは２’−Ｏ−アルキルリボースのごとき修飾糖を有するものを含めたかかるサブユニットの他のアナログを含む。「ホスホレート」なる語は、以下の基をいう。ここに、Ｒは水素またはアルキルもしくはアリール基である。適当なアルキルまたはアリール基は、ホスホレート結合の立体障害にならないか、相互に反応しないものを含む。ホスホレート基は、「Ｒ」または「Ｓ」立体配置のいずれかで存在する。ホスホレート基はヌクレオシジル間リン基結合（またはリンク）として用いられて、ヌクレオシジル単位を連結する。「ホスホジエステル」または「ジエステル」なる語は、以下の基をいう。ここに、ホスホジエステル基はヌクレオシジル単位を連結するためのヌクレオシジル間リン基結合（またはリンク）として使用され得る。「非ヌクレオシドモノマー単位」とは、塩基、糖および／またはリン骨格が他の化学部位によって置き換えられたモノマー単位をいう。「ヌクレオシド／非−ヌクレオシドポリマー」とは、ヌクレオシドおよび非− ヌクレオシドモノマー単位よりなるポリマーをいう。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」なる語は、一般に長さが約４ないし約１００ヌクレオシドであるが、長さが約１００ヌクレオシドを超えてもよいヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシドの鎖をいう。それらは、一般に、ヌクレオシドモノマーから合成されるが、酵素法によって得ることもできる。かくして、「オリゴマー」なる語は、ヌクレオシドモノマーを連結させるヌクレオシジル結合を有するオリゴヌクレオシド鎖をいい、かくして、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオチドアルキル−およびアリール−ホスホレートアナログ、アルキル−およびアリール−ホスホノチオエート、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエートアナログ、オリゴヌクレオチドのホスホルアミデートアナログ、ホスホトリエステルのごとき中性のホスフェートエステルオリゴヌクレオチドアナログ、ならびに他のオリゴヌクレオチドアナログおよび修飾オリゴヌクレオチドを包含し、また、ヌクレオシド／非−ヌクレオシドポリマーを包含する。また、該用語は、モノマー単位間の１以上のリン基結合がホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、スルファメート結合、またはカルバメート結合のごとき非-リン結合で置き換えられたヌクレオシド/非-ヌクレオシドポリマーも含む。また、それは、モルホリノ塩基アナログ、またはポリアミド塩基アナログのごとき、糖およびリン部位双方が置換されまたは修飾されたヌクレオシド/非-ヌクレオシドポリマーも含む。また、それは、塩基、糖、リン酸骨格またはヌクレオシドが非−ヌクレオシド部位で置き換えられるか、あるいは非−ヌクレオシド部位がヌクレオシド/非-ヌクレオシドポリマーに挿入されたヌクレオシド/非-ヌクレオシドポリマーを含む。所望により、該ヌクレオシド部位は、標的配列と相互作用するかまたは標的細胞への取込みを変化させる他の小分子を連結できるものであってもよい。「アルキル−またはアリール−ホスホレートオリゴマー」なる語は、少なくとも１つのアルキル−またはアリールホスホレートヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーをいう。適するアルキル−またはアリールホスホレート基は、ホスホレート結合の立体障害とならないかまたは相互に反応しないアルキル−またはアリール−基をいう。好ましいアルキル基は、約２ないし約６個の炭素原子を有する低級アルキル基を含む。適当なアリール基は共役パイ電子系を有する少なくとも１つの環を有し、炭素環アリールおよび複素環アリール基を含み、それは、所望により置換されていてもよく、また、好ましくは約１０個までの炭素原子を有する。「メチルホスホネートオリゴマー」（または「ＭＰ−オリゴマー」）なる語は、少なくとも１つのメチルホスホネートヌクオシジル間結合を有するオリゴマーをいう。「中性のオリゴマー」なる語は、ヌクオシドモノマー間の非イオン性ヌクオシド間結合（すなわち、正または負のイオン電荷を有しない結合）を有するオリゴマーをいい、例えば、アルキル−もしくはアリール−ホスホレート結合、アルキル−もしくはアリール−ホスホノチオエート、ホスホトリエステル結合のごとき中性ホスフェートエステル結合（特に中性エチルトリエステル結合）；およびスルファーメート、モルホリノ、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、およびカルバメート結合のごとき非−リン含有ヌクレオシジル間結合を包含する。所望により、中性オリゴマーは、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド／非−ヌクレオシドポリマーと結合パートナーよりなる第２の分子との間の結合よりなっていてもよい。かかる結合パートナーは、インターカレーター、アルキル化剤、細胞表面受容体用の結合基質、親油性剤、プソラレン(psoralen)のごとき光架橋剤を含む核酸修飾基、および核酸の標的部分を切断できる基等を含む。かかる結合パートナーは、さらに、オリゴマーの取り込みを促進し、オリゴマーと標的配列との相互作用を修飾し、またはオリゴマーの薬物動態学的分布を変化させる。必須の要件は、オリゴマー結合体からなるオリゴオクレオチドまたはヌクレオシド／非−ヌクレオシドポリマーが実質的に中性であってその相補的標的配列にハイブリダイズできることである。オリゴマーにつき「実質的に中性」なる語は、ヌクレオシドモノマー間のヌクシオシジル間結合の少なくとも約８０パーセントが非イオン性結合であるオリゴマーをいう。「中性のアルキル−またはアリルール−ホスホレートオリゴマー」なる語は、少なくとも１つのアルキル−もしくはアリール−ホスホレート結合よりなる中性のヌクレオシジル結合を有するオリゴマーをいう。「中性のメチルホスホネートオリゴマー」なる語は、少なくとも１つのメチルホスホネート結合よりなるヌクシオシジル間結合を有する中性のオリゴマーをいう。「タンデムオリゴヌクレオチド」または「タンデムオリゴマー」なる語は、標的核酸配列の５’または３’側に位置する配列に相補的であって、標的配列に相補的な第２オリゴマーと共に同時ハイブリダイズするオリゴオクレオチドまたはオリゴマーをいう。タンデムオリゴマーは、標的核酸配列の二次構造を減少させることによるごとく、標的配列をかかるオリゴマーにより接近可能とするのに助力することによって、標的に対するこれらのオリゴマーのハイブリダイゼーションを促進できる。加えて、タンデムオリゴマーの対のうち１つのメンバーは、第２オリゴマーの５’または３’末端においてらせん構造を促進することによって標的核酸配列に対する第２タンデムオリゴマーのハイブリッド安定性を促進でき、逆もできる。好ましい療法は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼに対して標的化されたアンチセンス分子の組合せである。「に対するアンチセンス分子」、「に対するアンチセンス配列」、「に対するアンチセンス」や同様の用語は、オリゴマーが特定のサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼの発現または機能を妨げるまたはそれに干渉する特定のサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼについての核酸標的配列に相補的なオリゴマーを意味する。平滑筋増殖および再狭窄に関与すると報告されているサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼのある組合せ。細胞のＧ１からＳ−期（血管壁の傷害に反応しての平滑筋増殖の初期段階）への転換において、キナーゼｃｄｋ２がＧ１の後期に出現するサイクリンＡおよびＥの組合せによって活性化されると報告されている(Koff，et al.，Sci ence，1992 257:1689)。従って、再狭窄を低下させまたは阻害するアンチセンス分子の好ましい組合せは、サイクリンＡおよびｃｄｋ２またはサイクリンＥおよびｃｄｋ２に対するアンチセンスオリゴマーの組合せいずれがあろう。サイクリンＰ４６またはサイクリンＸ(Williams et al.，J．Biol．Chem.，1993 268:8871)は中期Ｇ１で出現し、サイクリンＡおよびＥに先駆けてｃｄｋ２を活性化すると報告されている。かくして、もう１つの好ましい組合せは、サイクリンＸおよびｃｄｋ２に対するアンチセンスの組合せであろう。細胞周期依存性キナーゼｃｄｋ４はｃｄｋ２においてよりもＧ１早期に活性化されることが報告されており、Ｇ１−Ｓ−期転移で重要なようである。ｃｄｋ４はサイクリンＤ２およびＤ３の誘導によって活性化されると報告されている(Matsushime，et al.，Cell，1992，71:323)。本発明者らは、Ｄ２およびｃｄｋ４に対するアンチセンス配列の組合せを信じており、あるいはＤ３およびｃｄｋ４も好ましい。一旦細胞がＧ１−Ｓ−期転移を通過し、そのＤＮＡを複製したならば、それらは「コンピテント」と呼ばれる。細胞分裂は合成を妨げることによって阻害でき、あるいはＧ２から「有糸分裂」と呼ばれるＭ−期への後期段階転移を阻害することによって逆となる。ｃｄｃ２キナーゼは「進行」を制御し、それは、サイクリンＢ１、Ｂ２およびＡと複合体化することによって活性化される(Parker and Pinwoica-Worms，Science，1992，257:1955)。かくして、有糸分裂を阻害するアンチセンスオリゴマーの好ましい組合せはサイクリンＢ−ｃｄｃ２、またはサイクリンＡ−ｃｄｃ２であろう。サイクリンの誘導は、細胞の細胞周期へのおよびそれを通じての転移に導くサイクリン−キナーゼｃｄｋ２複合体の活性化における鍵となる事象として報告されている(Ohtsubo and Roberts，Science，1993，259:1908)。ｃｄｋ４を活性化すると報告されているサイクリンＤ−型、Ｄ２およびＤ３(Ajchenbaum et al.， J．Biol．Chem.，1993，268:4113)は、増殖因子によって誘導されると報告されている。従って、これらの蛋白質に対するアンチセンスオリゴマーは本発明の方法で使用できる。サイクリンの誘導の正味の効果は、核キナーゼ複合体の活性化であり、これは、核蛋白質のリン酸化、そして続いてのＤＮＡの複製および有糸分裂で重要な遺伝子の発現を促進するＥ２Ｆのごとき遊離転写因子の遊離に導く。O'Connor et al．(J．Biol．Chem.，1993，268:8298)は、窒素マスタード薬物（細胞分裂の公知の阻害剤）は、サイクリンＡ−ｃｄｋ２キナーゼ複合体およびサイクリンＢ１ −ｃｄｃ２キナーゼ複合体に特に干渉することによって働くことを報告している。サイクリンＡ−ｃｄｋ２複合体と干渉するアンチセンス分子の組合せはＤＮＡ合成を妨げ、サイクリンＢ１−ｃｄｃ２複合体に干渉する分子は有糸分裂に干渉すると信じられる。好ましい組合せは、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するアンチセンス配列およびサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼに対するアンチセンス配列、特にＰＣＮＡおよびｃｄｃ２に対するアンチセンス配列である。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）単独を、または前記したサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼと組み合わせて発現する蛋白質のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列が本発明で有用である。オリゴヌクレオチドの適用方法アンチセンス配列は、生理学的に許容されるいずれかの適宜のビヒクル中にて投与できる。ほとんどの場合、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、水性エタノール、またはオリゴマーおよび処理すべき組織もしくは細胞に適合する他の媒質組成のごとき液体媒質を使用する。いくつかの場合、リポソームを用いて、特に、リポソームが標的細胞受容体についてのリガンドに結合する状況で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的血管平滑筋細胞への取り込みを容易とすることができ、リポソームは主題の組成物のエンドサイトーシスに供される。また、ヒドロゲルを、病巣部位に入れるためのデポ剤として使用することもできる。例えば、ＷＯ９３／０１２８６参照。特に興味あるものには、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）(Itoh，et al.，Hypertension 16，325（アブストラクト）(19 90))に使用するカチオン性リポソームまたは中性リポソームの使用である。リポソームの濃度は、一般に、媒質中約１〜５、好ましくは２〜４μｇ／ｍｌの範囲であり、ＤＮＡに対するリポソームの比は、一般に、約１：３〜１：１０（ｗ／ｗ）、好ましくは約１：６（ｗ／ｗ）である。また、中性リポソームも適用され、ここに、モノもしくはジエステルグリセリド（８〜２４個の炭素原子の脂肪酸、飽和または不飽和）、特にホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン等、コレステロール、または他の中性リポソーム形成モノマーが使用される。さらに、ウイルス外皮蛋白質、表面膜蛋白質に対するモノクローナル抗体のごとき、リポソームの結合および取り込みに助けとなる蛋白質のリポソームに対する複合体化または共有結合も使用される。結合の様式および特定の蛋白質は、標的組織、投与法、蛋白質利用性、安定性、免疫原性のレベルに応じて変化するであろう。本発明は、冠動脈血管形成術、腎臓動脈血管形成術、大動脈外科手術、腎臓透析瘻狭窄、および血管移植狭窄ごとき種々の血管的手法において平滑筋細胞の増殖を防止するのに有用である。アンチセンス配列は医薬上許容される組成物に入れ、血管傷害部位に直接適用される。 Kato，et al．(The Journal of Biological Chemistry，第266巻、第６号、19 91年２月25日、3361-3364頁)、Kaneda et al．(Science，第243巻、375-378頁(1 988))は、ＤＮＡを細胞に送達するためのビヒクルとして、センダイウイルス（h emagglutinating virus of Japan）(HVJ)を含有するリポソームを記載している。ＨＶＪ含有リポソームは、本発明のアンチセンス配列の局所送達についての特に有用なビヒクルであることが判明した。可能であればいつも、主題組成物の投与は、細胞表面認識マーカーによって、あるいはカテーテル、注射、デポ剤等のごとき、投与方法によって局所化されるであろう。ある例において、主題の組成物は、その活性を変調すべき細胞部位の上流に注入することができる。当該薬剤は血管壁に管腔内投与、壁内投与または外膜周囲に導入して、薬剤を病巣部位に局所化することができる。１の好ましい方法は、血管形成術後の病巣部位の冠動脈に入れたカテーテルを通じてアンチセンス薬物を送達することである。局所化された濃度または投与量は経験によって決定することができ、投与目的、治療すべき領域、組成物の有効性、投与様式等に依存する。局所濃度は望ましくは約０．１ないし５０μＭの範囲である。以下の実施例は例示的なものであって、本発明を限定するものではない。実験実施例１培養における血管平滑筋細胞の増殖 Owens，et al.(J．Cell．Biol.，102，343-352[1986])の方法に準じて単離し、培養したラット大動脈平滑筋細胞（５〜１０継代）を、１×１０⁴細胞／ウェルにて、２４ウェル培養プレートで平板培養した。密集すると、インスリン（５×１０^-7Ｍ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、およびアスコンビン酸塩（０.２ｍＭ）を含有する成分のはっきりとした無血清（ＤＳＦ）培地中、４８時間インキュベートすることによって細胞を休止させた。この培養条件は、平滑筋細胞を休止した非代謝性状態に維持し、平滑筋細胞特異的収縮性蛋白質の発現を促進する。オリゴマーの合成および精製本実験で用いたオリゴヌクレオチド配列およびＴＧＦ−β₁、ｂＦＧＦ、よびＰＤＧＥＡ鎖ｍＲＮＡに対する関係（Sporn，et al.，J．Cell Biol.，105，103 9-1045[1987]; Burgess and Maciag，Ann．Rev．Biochem．58，575-606[1989]; Betsholz，et al.，Nature 320，695-699[1986]）を以下に示す。標準的なホスホルアミダイト化学を用い、未修飾の１５−塩基デオキシヌクレオチドを自動固相合成器(Applied Biosystems Incorporated)で合成した。使用に先立ち、ゲル濾過によってオリゴマーを精製し、エタノール沈殿させ、凍結乾燥し、培地に溶解した。アンチセンスＴＧＦ、アンチセンスＦＧＦおよびアンチセンスＰＤＧＦオリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位において、各々、ヒトＴＧＦ−β₁ ｍＲＮＡ、ｂＦＧＦおよびｍＲＮＡ、およびＰＤＧＲＡ鎖ｍＲＮＡに相補的であった。対照オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド（センスＴＧＦ、センスＦＧＦ、センスＰＤＧＦ）であるか、または同一のオリゴヌクレオチド配列を有するが、逆の５’−３’向き（逆ＴＧＦ、逆ＦＧＦ）を持つオリゴヌクレオチドであった。オリゴヌクレオチドをＶＳＭＣに導入するため、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション方法（リポフェクション）を用いた(Itoh，et al.，Hypertension 16，325［アブストラクト］[1990]; Nab el，et al.，Science 249，1285-1288[1900])。５０μｌＤＳＦ培地に溶解したオリゴヌクレオチドを、６／１（w/w）の比で同一容量の水に溶解させたLipof ectin^TM試薬DOTMA(Ｎ[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]-Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド)(BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD) と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、オリゴヌクレオチド／リポソーム複合体（１００μｌ）を各ウェルに滴下した。ＴＧＦ−βについてのバイオアッセイ１０％子ウシ血清および０．１ｍＭ非必須アミノ酸を追加したＭＥＭ中で、ＣＣＬ−６４ミンク肺外皮細胞(Danielpour，et al.，J．Cell Physiol．138，79- 86[1989])を維持した。アッセイの１日前、２４−ウェルプレート中、４×１０⁴ 細胞／ウェル密度で細胞を広げた。密集した細胞を１回洗浄し、ビヒクルまたはＴＧＦ−β(ヒトＴＧＦ−β₁、Ｒ＆Ｄ Systems，Minneapolis，MN)を含有するＤＳＦを与えた。２０時間後、細胞に、³Ｈ−チミジン（１０μＣｉ／ｍｌ）をパルス状に８時間与えた。³Ｈ−チミジンの取り込みは後記するごとく測定し、（ＴＧＦ−β無しの）対照ウェルの取り込みのパーセントとして表した。１４時間周期で休止ＶＳＭＣから分泌されたＴＧＦ−βのレベルを４倍希釈にて同様にアッセイした。順化培地の阻害効果がＴＧＦ−βによるものであるという証明は、増殖阻害効果を中和抗体でブロッキングすることによって達成した。新鮮なＤＳＦ培地、ＤＳＦ培地中のヒトＴＧＦ−β₁（２ｎｇ／ｍｌ）、またはＶＳＭＣから収集した順化培地を、シチメンチョウ・プレ免疫血清またはシチメンチョウ抗−ヒトＴＧＦ−β₁抗血清(Danielpour，et al.，1989，前掲)(１／２希釈にてＣＣＬ−６４ミンク肺上皮細胞アッセイに添加するに先立って１／２００最終希釈)と共に３７℃で１時間インキュベートした。この治療により、順化培地の増殖阻害が完全に無くなった(Gibbons，et al.，Clin．Res.，38，287a[1990])。ｂＦＧＦについてのバイオアッセイＶＳＭＣからのｂＦＧＦの抽出およびマウス３Ｔ３繊維芽細胞を用いてのｂＦＧＦ活性についてのアッセイは、従前の報告におけるごとくに行った(Klagsbrun ，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.83，2448-2452[1986])。アンチセンスＦＧＦ−オリゴヌクレオチドで前処理したまたはしていない密集休止ラットＶＳＭＣ（１．３×１０^-7）を、トリプシン処理によって単層から収穫し、リン酸緩衝生理食塩水（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタイン（４μＭ）およびフェニルメチルスルホニルフロライド（１ｎＭ）で洗浄した。３サイクル凍結および解凍し、続いて１分間超音波処理することによって細胞を破壊した後、ホモジネートを２５,０００×ｇで３０分間遠心し、上清を０．１ＭＮａＣｌ／０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して一晩透析した。すべての手法は４℃ で行い、細胞抽出物の一部を使用するまで−８０℃で貯蔵した。ｂＦＧＦ活性の測定については、１０μｇ／ｍｌの抗−ｂＦＧＦＩｇＧ(R & D Systems，Minn eapolis，MN)または非免疫ＩｇＧと共にプレインキュベート（３７℃で２時間）したヒトｂＦＧＦ標準試料０．０３−３ｎｇ／ｍｌ(Genzyme Corporation，Bost on，MA)またはサンプルを休止Swiss ３Ｔ３細胞と共に２０時間インキュベートし、しかる後、細胞を１０μＣｉ／ｍｌ ³Ｈ−チミジンで８時間パルス標識した。非免疫ＩｇＧの添加は、基礎チミジン取込みまたはｂＦＧＦ−刺激チミジン取込みに影響を有さず、また、基礎チミジン摂取後における抗−ｂＦＧＦＩｇＧの投与も同じであった。抗−ｂＦＧＦＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）は、ほとんど完全に、酸性ＦＧＦまたはＰＤＧＦの分裂促進活性に影響することなく、１ｎｇ／ｍｌ組換えヒトｂＦＧＦの分裂促進活性を無くした。細胞抽出物の系列希釈曲線は、ｂＦＧＦの標準曲線に平行であり、細胞ｂＦＧＦ含量は、サンプル中の抗体抑制可能な分裂促進活性によって評価した。ＤＮＡ合成の測定ＤＮＡ合成の相対速度は、従前に報告されているごとくに(Itoh，et al.，J． Clin．Invest.，86，1690-1697[1990])、トリチウム化チミジン（１０μＣｉ／ｍｌ）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−沈殿可能な物質への取込みによってアッセイした。結果ミンク肺上皮細胞バイオアッセイを用い、ＡｎｇＩＩは、ＶＳＭＣ合成および生物学的に活性なＴＧＦ−βの放出を２．５倍増加することを誘導することが示された。このアッセイにおいて、活性ＴＧＦ−βは、細胞のＤＮＡ合成の用量依存性阻害を引き起こした（ＩＣ₅₀＝８×１０^-11Ｍ）。ＶＳＭＣの順化培地における増殖阻害活性は、特異的ＴＧＦ−β中和抗体と共に培地を予めインキュベートすることによって無くすることができた。これは、ＴＧＦ−βについてのアッセイの特異性を示した。ｂＦＧＦのＶＳＭＣによる合成はＡｎｇＩＩによって刺激されることが示された。ｂＦＧＦについてのメッセンジャーＲＮＡはＡｎｇＩＩによって中程度誘導され（ほぼ２倍）、一方、Swiss３Ｔ３細胞アッセイで検出して、細胞抽出物における抗体−阻害可能なｂＦＧＦ活性は３倍増加した。このアッセイにおいて、密集した休止ＶＳＭＣをビヒクル（基礎）またはＡｎｇＩＩ（１０^-6Ｍ）に暴露し、細胞を抽出し、Swiss３Ｔ３繊維芽細胞をバイオアッセイとして用いて、抗体−阻害可能ｂＦＧＦ活性をアッセイした。標準曲線は、ｂＦＧＦによるＤＮＡ合成の用量依存性刺激を示した。ＡｎｇＩＩ−処理細胞からの抽出物は２〜３倍高いｂＦＧＦ活性を含有していた。ヒトＴＧＦ−β₁ ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦＡ鎖ｍＲＮＡならびに対照オリゴヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（１５量体）を合成した。図１参照。オリゴヌクレオチドを、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）によってＶＳＭＣに導入した。カチオン性リポフェクションの最適in vivo濃度および細胞毒性を最小化しＤＮＡ摂取を最適化したＤＮＡに対するその比は、各々、２〜４μｇ／ｍｌおよび１：６（ｗ／ｗ）であると決定された。ＴＧＦ−βおよびｂＦＧＦの産生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を測定するために、密集休止ＶＳＭＣを、ＴＧＦ−βまたはｂＦＧＦに向けられたアンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（５μＭ）で処理した。５０および２５０μｌの順化培地を２０時間後に収集し、ミンク肺上皮細胞アッセイを用いてＴＧＦ−β活性についてアッセイした。アンチセンスオリゴヌクレオチドの結果、ＴＧＦ−β活性が７５％減少した。対照またはアンチセンスオリゴマー処理ＶＳＭＣの抽出物中ｂＦＧＦ含量を、Swiss３Ｔ３バイオアッセイを用いてアッセイした。アンチセンスオリゴマーはｂＦＧＦの産生を８５％阻害した。休止ＶＳＭＣからの抽出物は、蛋白質１ｍｇ当たり２．９ｎｇのｂＦＧＦを含有していた。この量は、対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって影響されなかったが、細胞を４μＭのアンチセンスオリゴマーと共に２４時間インキュベートした場合には検出可能レベル未満（＜１ｎｇ／ｍｇ蛋白質）に減少した。対の実験において、自己分泌増殖因子としてｂＦＧＦを利用する培養した内皮細胞の増殖も、ｂＦＧＦに向けられたアンチセンスオリゴマーで効果的に阻害された。次の実験において、基礎およびＡｎｇＩＩ刺激ＶＳＭＣにおけるＤＮＡ合成に対するアンチセンスＴＧＦ−βオリゴヌクレオチドの効果を測定した。ＶＳＭＣ増殖に対するアンチセンスオリゴマーの効果は、ビヒクルまたはＡｎｇＩＩ（１０^-6Ｍ）の添加４時間前に、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（５μ Ｍ）で密集休止ＶＳＭＣをトランスフェクトすることによって測定した。２０時間後、細胞を１０μＣｉ／ｍｌ ³Ｈ-チミジンで８時間標識した。次いで、細胞の放射能を測定することによってチミジンの取込みを測定した。ＴＧＦ−βアンチセンスオリゴマー（５μＭ）は、基礎状態においてＤＮＡ合成を３５％増強したが、ＡｎｇＩＩ刺激状態においてはより顕著であった（８７％、Ｐ＞０．０５）。対照的に、対照オリゴマーでトランスフェクトしたＡｎｇ−ＩＩ−刺激細胞群でＤＮＡ合成速度に変化はなかった。結果は、ＴＧＦ−βはＶＳＭＣ増殖に対して緊張性阻害作用を働き、ＡｎｇＩＩ−刺激状態においては、それは増殖阻害において大きな役割を演ずることを示す。また、アンチセンスＴＧＦ処理は、基礎状態において、ＲＮＡ合成の６０％のかなりの減少を引き起こす（³Ｈ−ウリジン取込み）。これらの結果は、ＴＧＦ−βの内因性産生は、肥大性および抗増殖性作用を働くという結論を支持する。５μＭで使用したｂＦＧＦに対するアンチセンスオリゴマーの効果は、基礎状態において、ＤＮＡ合成を抑制することが示され、ＡｎｇＩＩ−刺激状態において、このプロセスを（３０％と）かなり阻害した。ｂＦＧＦは特にＡｎｇＩＩ− 刺激状態において、ＶＳＭＣ増殖のプロモーターとして作用する。対照的に、ＰＤＧＦ−Ａに向けられたアンチセンスオリゴマーは、基礎チミジン取込みまたはＡｎｇＩＩ−刺激³Ｈ−チミジン取込みに対して効果を有しなかった。データは、ＡｎｇＩＩが、ｂＦＧＦによって一義的に媒介される増殖−刺激経路を活性化するという結論を支持する。ＴＧＦ−βアンチセンスオリゴマーでのｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーの同時トランスフェクションは、ほとんど完全に、ＡｎｇＩＩ−誘導ＶＳＭＣ増殖を無くした。ＴＧＦ−βアンチセンスオリゴマーでのｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーの同時トランスフェクションは、ほとんど完全に、ＴＧＦ−β産生のブロックによってマスクを解除されたＡｎｇＩＩＶＳＭＣ増殖を無くした。対照的に、ＰＤＧＦ−Ａに向けられたアンチセンスのトランスフェクションは、ＴＧＦ−βに向けられたアンチセンスオリゴマーによって解除されたＤＮＡ合成に対して効果を有しなかった。前記データは、ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β増殖因子は、オートクラインおよび／またはイントラクライン様式で、同一集団内で逆の作用をするという結論を支持する。ｂＦＧＦは、ＴＧＦ−βの活性化について決定的な、プラスミノーゲンアクチベーターの産生を促進することが知られているので、これらの増殖因子の産生および活性化におけるこれらのデァアルオートクラインループの相互作用はＶＳＭＣ増殖の調節の本質的態様である。実施例２実施例１に記載したごとくに培養した密集休止細胞を、ｃｄｃ２キナーゼ、ｃｄｋ２キナーゼ、およびサイクリンＢに向けられたアンチセンスオリゴマーの組合せで暴露した（表２および３）（各々、４μＭ）。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを使用したことを除き、オリゴマーを前記したごとくに合成した。オリゴマー（アンチセンスおよび対照）を、ウイルスに媒介されたリポソーム摂取を用いて、細胞に導入した(Kaneda，et al.，J．Biol．Chem.，(1989)264，12126-12129)。これらのオリゴマーのＶＳＭＣに対する効果を評価するために、オリゴマー暴露の４日後、細胞を増殖させた。次いで、トリプシンによって細胞を収穫し、ＤＮＡ含量をアッセイした。結果は、センスオリゴマー処理培養は対照の未処理培養とは区別できないＤＮＡ含量を有することを示し、これは、センスオリゴマーはＶＳＭＣ培養の基礎増殖に対しては効果を有しないことを示す。他方、アンチセンスオリゴマーに暴露した細胞はＤＮＡ含量の５０％減少を示し、これは、これらのオリゴマーはこれらの培養の基礎増殖を５０％減少させることを示す。また、これらのオリゴマーは増殖因子刺激による増殖を阻害した。これらの細胞をＦＧＦで処理すると、ＤＮＡの含量を４倍増加させた。ＦＧＦとセンスオリゴマーで処理した培養において、ＤＮＡ含量は３倍増加し、これは、センスオリゴマーの存在はＤＮＡ含量の増殖因子−誘導増加に対してほとんど影響を有しないことを示す。しかしながら、ＦＧＦ−処理細胞をアンチセンスオリゴマーに暴露すると、ＤＮＡの基礎レベルにおける増加は観察されず、これは、これらのオリゴマーはこれらの細胞の増殖因子誘導による増殖をブロックすることを示す。同様の結果が、ｃｄｃ２キナーゼおよびＰＣＮＡに向けられたアンチセンスオリゴマーの組合せを用いた場合に観察された。実施例３傷害に対する反応における血管平滑筋のin vivo増殖体重５００〜５５０グラムの雄Sprague-Dawleyラットを用いた。血管壁に対する内皮細胞の裸出および傷害は頸動脈で行った。ケタミン塩酸塩（８０ｍｇ／ｋｇ）(Parke-Davis，Morris Plains，NJ)およびキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）(L loyd Laboratories,Shenandoah，IA)を投与してラットを麻酔した。Clowes，et al.(Lab Invest．49，208-215[1983])の従前に記載されている方法に準じて、左外頸動脈を介して、２仏式塞栓切除バルーンカテーテル(American Edward Labor atories，Santa Ana，CA)を左総頸動脈に通した。エバンス・ブルー染色を用い、本発明者らは、この手法により内皮細胞を効果的に裸出したことを記載しておく。右の未傷害頸動脈を対照として用いた。傷害の時点において、いくつかの動物に、ｃｄｃ２キナーゼおよびＰＣＮＡに向けられたアンチセンスオリゴマーの組合せを摂取させた（表２および３）。オリゴマーの合成は、ホスホチオネート修飾配列を使用した以外は前記した通りである。オリゴマーを血管壁に管腔内導入した。ＤＮＡの摂取はウイルスにより被覆したリポソームを介して媒介させた（Kaneda，et al.，J．Biol.Ch em.，264，12126-12129[1989]）。傷害血管におけるＤＮＡ合成に対するオリゴマー治療の効果を測定するために、動物にＢｒｄＵｒを注射した。このチミジンアナログは新たに合成されたＤＮＡに取り込まれ、免疫組織化学的に検出される。傷害４日後に、すべてのラットを安楽死させた。ラットを麻酔し、左バーチクルを介して、血液を上行大動脈から抜いた。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを用い、上行大動脈を介して、１１０ｍｍ／Ｈｇの圧力にて、ラットを潅流した。頸動脈を取り出し、小片を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、バラフィン埋没させた。５ミクロンのセクションを回転ミクロトームで切断し、２％３−アミノプロピルトリエトキシシラン(Sigma Chemica l，St．Louis，MO)を含有するアセトンで予め２０秒間処理したスライドグラス上に置いた。３７℃にて、ＰＢＳ中の０．１％トリプシン(Sigma Chemical，St ．Louis，MO)で該セクションを１２分間消化した。次いで、該セクションを、第２工程抗体を産生した種からの正常血清と共にプレインキュベートした。次いで、該セクションをＢｒｄＵｒにつき特異的な一次抗体で被覆し、４℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ビオチン化第２抗体と共にインキュベートした。洗浄した後、該セクションをアビジンビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(Vectastain ABCキット、Vector Laboratory，Bu rl ingame，CA)と共にインキュベートし、０．１％ジアミノベンジジン四塩酸塩(Al drich Chemical，Milwaukee，WI)および０．０２％Ｈ₂Ｏ₂(Sigma Chemical，S t．Louis，MO)で展開し、次いで、該スライドをヘマトキシリンで逆染色した。陽性染色は色が茶色となった。負の対照は以下の１）一次および二次抗体の省略、２）一次抗体の、同一種の非免疫血清または免疫グロブリンでの置換を含むものであった。結果は、対照未傷害血管は、非常に低レベルのＤＮＡ合成を呈することを示した（＜１％ＢｒｄＵｒ標識指標）。他方、傷害未処理血管は高レベルのＢｒｄＵｒ染色を阻害し（２３％ＢｒｄＵｒ標識指標）、これは、血管傷害は血管壁内でＤＮＡ合成を誘導することを示す。これらの傷害血管をアンチセンスオリゴマーに暴露した場合は、ＤＮＡ合成は６０％減少した。さらに、アンチセンス処理血管壁内のＤＮＡ含量は、センス処理血管と比較して、４０％減少した。ネオ内膜形成は、ブラインド様式にて、バルーン傷害の１４日後、潅流−固定検体の体型測定によってアッセイした。１の結果は、ＰＣＮＡ−ｃｄｃ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の組合せによるネオ内膜形成の用量依存性抑制を示した。低用量（各々３μＭ）のアンチセンスＯＤＮは、ＨＶＪ−リポソーム複合体単独（ｎ＝５）またはセンスＯＤＮ−処理血管（ｎ＝８）で処理した血管と比較して、ほぼ６０％（ｎ＝７）ネオ内膜形成を阻害した。アンチセンスＯＤＮは、内側領域に対して有意な効果を有しなかった。各々１５μＭの用量において、ＰＣＮＡ−ｃｄｃ２アンチセンスＯＤＮ組合せの単一投与は、ネオ内膜形成を完全に無くし（ｎ＝８）（９５％を超える）、一方、センス対照ＯＤＮは効果を有しなかった（ｎ＝８）（図３）。重要なことには、ネオ内膜形成の有意な阻害は、センス対照と比較して、ＰＣＮＡ −ｃｄｃ２アンチセンスＯＤＮ組合せの投与４および８週間まで観察された（図３）。ＰＣＮＡアンチセンスＯＤＮ単独での管腔内トランスフェクションは、ネオ内膜形成を阻害しなかった（ネオ内膜領域＝０．２３７±０．０１６ｍｍ²− 対−センス対照領域＝０．２１４±０．０２２ｍｍ²、ｐ．０．０５）。これらのデータは、ＰＣＮＡおよびｃｄｃ２アンチセンスＯＤＮ双方の組合せ投与の増幅された阻害効果があることを示す。さらに、ネオ内膜の阻害は管腔内トランスフェクションの領域に限定されないという観察によって、アンチセンスＯＤＮ効果の選択性を確認した。対照的に、アンチセンストランスフェクションの領域外の隣接傷害頸動脈セグメントは、センスＯＤＮ−処理対照と同様のネオ内膜病巣を示した。これらの結果を図３に示す。ＨＶＪ法にて、アンチセンスｃｄｋ２単独を３μＭおよび１５μＭで管腔内投与した結果、ＢｒｄＵｒ標識によって測定してＤＮＡ合成が６０％減少し、ならびに血管障害２週間後にネオ内膜病巣形成が６０％減少した（図４、カラム４および６）。図４、カラム５から分かるごとく、ｃｄｋ２アンチセンスＯＤＮ（３μＭ）およびｃｄｃ２（３μＭ）アンチセンスＯＤＮの組合せ投与がネオ内膜形成に与える効果はｃｄｋ２（３μＭ）単独と有意に異ならなかった。傷害血管の細胞におけるＤＮＡ合成はネオ内膜病巣の十分な進展に必要であるので、それらの細胞におけるＤＮＡ合成の阻害は、病巣形成を阻害するはずである。都合よくは、ＰＣＮＡおよびｃｄｃ２に対するアンチセンスの前記濃度を用いて、ネオ内膜形成に関連する平滑筋のＤＮＡ合成および心血管細胞活性の修飾に対するこれらの配列の相乗効果を証明した。望む範囲のアンチセンス濃度は、アンチセンス配列の相違につき経験的に決定でき、アンチセンスによって標的化される配列の性質および位置ならびにアンチセンス配列の長さのごとき因子に依存するが、これらに限定されるものではない。実施例４本実施例は、アンチセンスＯＤＮの細胞摂取および安定性の効率を促進させようとして行った実験を要約する。該実験はウイルス蛋白質媒介ＯＤＮ移行技術を含む。オリゴマーの合成および配列標的の選択本実施例で用いた細胞周期調節遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の配列は表４に示す。合成ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解する。上清をＮＡＰ１０カラム(Pharmacia)で精製し、Itoh，J．Mukoyama，M.，Pratt，R．e.，Dzau，V.J. (1992)Biochem．Biophysic Res．Comm．188，1205-1213)に記載されている分光分析によって定量した。ＨＶＪ-リポソームの調製 Kaneda，Y.，Iwai，K.，Uchida，T．(1989)Science 243，375-378; Tomita，N .，Higaki，J.，Morishita，R.，Kato，K.，Mikami，J.,Kaneda，Y.，Ogihara， T．（1992）Biochem．Biophysic Res．Comm．186，129-134; Morishita，R.，Gi bbons，G.H.，Kaneda，Y.，Ogihara，T.，Dzau，V.J.，J．Cell．Biochem.; Ito h，J.，Mukoyama，M.，Pratt，R.e.，Dzau，V.J．（1992）Biochem．Biophysic Res．Comm．188，1205-1213に記載されているごとく、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびコレステロールを重量比１：４．８：２で混合した。センスまたはアンチセンス−ＯＤＮ（６００ｎｍｏｌ）を含有するバランス塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍＭＮａＣ１、５．４ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７．６）２００μｌ中で乾燥脂質を水和した。振盪し音波処理することによって、リポソームを調製した。精製したＨＶＪ（Ｚ株）を使用の丁度３分前にＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ²／ｓｅｃ）によって不活性化した。リポソーム懸濁液を合計容量４ｍｌのＢＳＳ中のＨＶＪ（１００００血球凝集単位）と混合した。混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で穏やかに振盪しつつ３０分間インキュベートした。遊離ＨＶＪをＨＶＪ−リポソームからショ糖密度勾配遠心によって除去した。ショ糖勾配の頂部層を使用のために収集した。Kaneda，Y.， Iwai K.，Uchida，T.(1989)Science 243，375-378; Tomita，N．Higaki，J.，Mo rishita，R.，Kato，K.，Mikami，J.，Kaneda，Y.，Ogihara，T．（1992）Bioch em.，Biophysic Res．Comm．186，129-134; Morishita，R.，Gibbons，G.H.，Ka neda，Y.，Ogihara，T.，Dzau，V.J.，J．Cell Biochem.に従って計算して、アンチセンスＯＤＮの最終濃度は１５μＭと同等であった。ＯＤＮのin vivo移行 Rakugi，J.，Jacob，J.K.，Krieger，J.E.，Ingelfinger，J.R.，Pratt，R.E. ，（1993）Circulation 87，283-290に記載されているごとく、２仏式フォーガティーカテーテルを用いて雄Sprague-Dawleyラット(４００〜５００ｇ；Charles River Breeding Laboratories)に血管傷害を誘導した。ラットを麻酔し、外頸動脈を介して、カニューレを左総頸動脈に導入した。総頸動脈の血管傷害の後、遠位傷害セグメントを仮結紮することによって一時的に摘出した。ＨＶＪ−リポソーム複合体を該セグメントに注入し、室温で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーションの後、注入カニューレを取り出した。トランスフェクションに続き、総頸動脈への血流を結紮を解放することによって回復した。この手法を受けた動物では神経学的悪影響または血管的効果は観察されなかった。トランスフェクション後２、４および８週に、ラットを犠牲にし、血管を４％パラホルムアルデヒドで潅流固定した。トランスフェクトセグメントの中央からの３つの個々のセクションを分析した。加えて、傷害未トランスフェクト領域の中央セクションからの３つの個々のセクションも分析した。個々の動物がいずれの処理を受けたかの知識なくして、操作および分析を行うように、動物にコードを付した。結果の統計解析を表５に示す。すべての値は平均値±ＳＥＭとして表す。すべての実験は少なくとも３回反復した。引き続いてダンカン検定を行う偏差解析を用いて、多重比較にて有意差を決定した。Ｐ＜０．０５は有意であった。最初に、ラット頸動脈モデルにおけるネオ内膜形成の阻害に対する１５μＭの単一アンチセンスＯＤＮの効果を調べた。アンチセンスｃｄｃ２キナーゼ（マウスおよびラット配列双方）またはアンチセンスｃｄｋ２キナーゼＯＤＮの投与の結果、バルーン傷害の後にネオ内膜形成の部分的阻害が得られた一方、アンチセンスＰＣＮＡＯＤＮ単独ではいずれの阻害効果も示さなかった。さらなる阻害を達成するために、これらのＯＤＮの組合せを投与した。事実、ＰＣＮＡ／ｃｄｃ２（マウス配列）アンチセンスＯＤＮ組合せ１５μＭの単一投与は、ネオ内膜形成を完全なくした（ｎ＝８）一方、センス対照ＯＤＮ（各々１５μＭ）は効果を有しなかった（ｎ＝８）。アンチセンスＯＤＮは中膜領域で有意な効果を有しなかった。ｃｄｃ２キナーゼ（ラット配列）およびＰＣＮＡＯＤＮの組合せ投与はネオ内膜形成をほとんど完全に阻害した。また、アンチセンスｃｄｃ２キナーゼおよびサイクリンＢＯＤＮの組合せを調べた。アンチセンスｃｄｃ２およびサイクリンＢＯＤＮの組合せの単一投与は、ネオ内膜形成を有意に阻害した。さらに、ネオ内膜形成の阻害が、傷害頸動脈と共に管腔内トランスフェクションの領域に限定されるという観察によって、アンチセンスＯＤＮ効果の選択性を確認した（表４）。対照的に、アンチセンストランスフェクションの領域外の隣接傷害頸動脈セグメントは、センスＯＤＮ− 処理対照傷害頸動脈と同様のネオ内膜病巣を示した。また、アンチセンストロンボモジュリンＯＤＮのトランスフェクションはネオ内膜形成に対していずれの阻害効果も示さなかった。これらの結果を表５にまとめる。ＰＣＮＡ／ｃｄｃ２アンチセンスＯＤＮ組合せ１５μＭの単一投与は、トランスフェクション後８週間の間、ネオ内膜形成の程度を有意に阻害した（図５）。アンチセンス処理４週間においてネオ内膜病巣についての証拠があったが、該病巣はセンス処理と比べて有意に阻害された（Ｐ＜０．０１）。さらに、単一アンチセンス投与後８週間において病巣のさらなる進行は観察されなかった。本実施例の結果は、バルーン血管形成術後のネオ内膜病巣形成は、細胞周期調節遺伝子に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの単一管腔内投与によって防止できることを示す。この治療戦略は、成功に要する基準、すなわち、適当な薬物標的、効果的な薬物送達方法および管腔内アプローチを満足する。ヒトにおける再狭窄を防止する戦略の定義において、薬物送達の方法は非常に重要である。管腔内送達は、それが管腔内血管術に付随して行えるので望ましい（臨床関連の現実的結果）。細胞周期進行のブロックは特に魅力的である。というのは、それは細胞を、細胞傷害を誘導することなく、休止した分化表現型に維持するからである。ＨＶＪ−ＯＦＮ管腔内方法は、実質的に、in vivoにおけるＯＤＮの摂取および安定性の効率を増加させ、それにより、高濃度（すなわち、＞１５０μＭ）のＯＤＮの可能な毒性を回避する。ＨＶＪ−リポソーム複合体の使用によるアンチセンスＯＤＮ薬物動態学の修飾は、１）器官潅流を維持するための省略された管腔内インキュベーション時間を可能とし、２）生物学的作用の持続を延長し、３）特異的活性を増進することによってこれらの薬剤の可能な臨床的利用を可能とする。実施例５本実施例は、高効率ウイルス媒介移行方法（ＨＶＪ）を用いてin vivoにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の運命を調べる。未修飾ＦＩＴＣ −標識ＯＤＮの直接移行は、中膜層で蛍光を示し、１日以内に消失した。対照的に、ＨＶＪ法によるトランスフェクトした未修飾ＦＩＴＣ−ＯＤＮは、中膜層でかなりの蛍光を示し、蛍光は少なくとも１週間継続した(２週間以内に消失した) 。さらに、ＨＶＪ粒子なくしてリポソームに包まれたホスホロチオエートＦＩＴＣ−ＯＤＮの移行の結果、短時間存在した蛍光が生じたが（４日以内）、ＨＪＶ方法による移行の結果、移行後２週間までの継続的蛍光が生じた。ＨＶＪ方法がＯＤＮの半減期を延長したならば、バルーン傷害ラット頸動脈につき、ｃｄｋキナーゼに対するアンチセンスホスホロチオエートＯＤＮの効果も調べた。アンチセンスｃｄｋ２ＯＤＮの特異性は、傷害血管におけるｃｄｋ２キナーゼのｍＲＮＡはアンチセンスＯＤＮ処理によって顕著に減少したという観察によって確認した。トランスフェクション後２週間において、アンチセンスｃｄｋ２ＯＤＮ処理の結果、ネオ内膜形成が有意に阻害されたが、センスＯＤＮ処理および未処理のものは減少しなかった。他方、アンチセンスｃｄｃ２ＯＤＮの投与も、ネオ内膜形成を部分的に阻害した。さらに、アンチセンスｃｄｃ２およびｃｄｋ２ＯＤＮの組合せの単一管腔内投与は、アンチセンスｃｄｃ２ＯＤＮ単独と比較して、さらなるネオ内膜阻害を示した。本実施例は、ＨＶＪ方法によるｃｄｃ２およびｃｄｋ２キナーゼのごとき細胞周期調節遺伝子に向けられたアンチセンスＯＤＮの単一管腔内投与が、カテーテル送達系を介し、ラット頸動脈傷害モデルのバルーン血管形成術後にネオ内膜形成を防止したことを示す。オリゴマーの合成および配列標的の選択本実験で用いたヒトｃｄｋ２キナーゼに対するＯＤＮの配列は以下の通りであった：アンチセンス：5'-GAA-GTT-CTC-CAT-GAA-GCG-3'［配列番号：４１］、センス］5'-CGC-TTC-ATG-GAG-AAC-TTC-3'［配列番号：４０］（ヒト配列の−６ないし＋１２；これらの配列はマウスおよびヒトｃｄｋ２キナーゼの間で差異はなかった）。このアンチセンスＯＤＮは、ラットＶＳＭＣにおいてｃｄｋ２キナーゼ蛋白質合成および血清刺激増殖を特異的に阻害した。また、Furukawa，U.,Piw nica-Worms，H.，Ernst，T.J．Kanakura，Y.，Griffin，JJ.D．（1990）Science 250，805-808 Scienceに記載されているごとく、センスおよびアンチセンスｃｄｃ２キナーゼＯＤＮ（アンチランス：5'-GTC-TTC-CAT-AGT-TAC-TCA［配列番号：３７］、センス：5'-TGA-GTA-ACT-ATG-GGA-GAC-3'［配列番号：３６］、マウス配列の−９ないし＋９）を合成した。合成ＯＤＮはＮＡＰ１０カラム（Pharmacia）で精製し、分光分析によって定量した。ＨＶＪ−リポソームの調製ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびコレステロールを重量比１：４．８：２で混合した。アンチセンス−ＯＤＮ（１２０ｎｍｏｌ）を含有するバランス塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍＭＮａＣｌ、５．４ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）２００μｌ中で乾燥脂質を水和した。対照群をＯＤＮ無し（ＢＳＳ２００μｌ）として用いた。振盪し音波処理することによって、リポソームを調製した。精製したＨＶＪ（Ｚ株）を使用の丁度３分前にＵＶ照射（１００ｅｒｇ／ｍｍ²／ｓｅｃ）によって不活性化した。リポソーム懸濁液（０．５ｍｌ、脂質１０ｍｇ含有）を合計容量４ｍｌのＢＳＳ中のＨＶＪ（１００００血球凝集単位）と混合した。混合物を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で穏やかに振盪しつつ３０分間インキュベートした。遊離ＨＶＪをＨＶＪ−リポソームからショ糖密度勾配遠心によって除去した。最終濃度は３μＭと同等であった。本実験では、ＨＶＪ複合体の調製を最適化して、ＶＳＭＣにおけるアンチセンスＯＤＮの効率の最大化を達成した。 in vivo遺伝子移行２仏式フォガーティカテーテルを用いて雄Sprague-Dawleyラット(４００〜５００ｇ；Charles River Breeding Laboratories)に血管傷害を誘導した。これらのラットをケタミンで麻酔し、左総頸動脈を外科手術により暴露した。外頸動脈を介して、カニューレを総頸動脈に導入した。in vivo遺伝子移行は以下の条件下で評価した：総頸動脈の血管傷害は、外頸動脈における動脈切開を介してバルーンカテーテルを３回通し膨張させることによって誘導した。傷害セグメントを仮結紮することによって一時的に摘出した。ＨＶＪ−リポソーム複合体、ＨＶＪ粒子を含まないリポソーム複合体、またはＯＤＮ単独を該セグメントに注入し、前記したごとく室温で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーションの後、注入カニューレを取り出した。トランスフェクションに続き、総頸動脈への血流を結紮を解放することによって回復し、次いで、傷を閉じた。この手法を受けた動物では神経学的悪影響または血管的効果は観察されなかった。ＦＩＴＣ標識ＯＤＮのin vivoトランスフェクションＦＩＴＣ標識未修飾およびホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮはClontech Inc.(Palo Alto，CA)によって親切にも提供された。ＦＩＴＣをＯＤＮ（１６量体）の３’および５’に標識した。動物外科手術は前記したごとくに行った。未修飾ＯＤＮの移行は２つのプロトコル下で行った。（１）ＦＩＴＣ標識未修飾ＯＤＮ（３μＭ）とのＨＶＪ複合体を１０分間インキュベートした。（２）ＯＤＮ単独：未修飾ＯＤＮ３０μＭも１０分間インキュベートした。ホスホロチオエートＯＤＮの移行も２つのプロトコル下で行った；（１）ＦＩＴＣ標識ホスホロチオエートＯＤＮ（３μＭ）とのＨＶＪ複合体は１０分間インキュベートした。（２）ＨＶＪ粒子を含まないリポソーム中のＯＤＮ：ＯＤＮ（３μＭ）を含むがＨＶＪ粒子を含まないリポソーム複合体を１０分間インキュベートした。トランスフェクションの後１０分、１、４、７および１４日に血管を収穫し、ＰＢＳの潅流後に３％パラホルムアルデヒドで固定した。エリクロムブラックＴ溶液中で５分間染色し、ＰＢＳ中で３分間２回洗浄した後、セクションを蛍光顕微鏡で調べた。弾性繊維は暗赤色に染色され、エリクロムブラックＴ溶液による処理によって特異的ＦＩＴＣＯＤＮから容易に区別される。逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲトランスフェクションの１および１４日後に、ラットを、ＲＮＡｚｏｌ(Tel-T est，Inc.，Texas)によって、アンチセンスまたはセンスＯＤＮ（ｃｄｋ２キナーゼ；リポソームに包んだ１５μＭ）処理傷害血管からＲＮＡを抽出した。また、対側動脈を無傷動脈として用いた。ｃｄｋ２およびベーター−アクチンｍＲＮＡのレベルを逆転写−ＰＣＲによって測定した。ｃｄｋ２５’プライマー（ヒト配列のヌクレオチド−６ないし１２）は5'-CGCTTCATGGAGAACTTC-3' ［配列番号：４６］；3'プライマー(ヌクレオチド340-357)は5'-ATGGCAGAAAGCTA GGCC-3'［配列番号：４７］であった。ラット・ベーター−アクチン遺伝子に相補的なプライマーは5'-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3'［配列番号：４８］；3’ プライマーは5'-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3'［配列番号：４９］であった(Clo ntech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。痕跡量の実験ＲＮＡでの組織試料の汚染を回避すべく細心の注意を払った。無傷および傷害血管に由来するＤＮＡの分割量をＰＣＲ（３５サイクル）によって同時に増幅し、負の対照（ＲＮＡプライマー無し）と比較した。増幅産物を、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルを通して電気泳動に付した。アンチセンスＯＤＮのin vivoトランスフェクション前記したごときバルーン傷害の後、センスまたはアンチセンスｃｄｋ２キナーゼまたはｃｄｃ２キナーゼＯＤＮ（リポソームに包んだ３または１５μＭ）を含有するＨＶＪ−リポソーム複合体５００μｌを１０分間、ルーメン内でインキュベートした。また、直接移行（ｃｄｋ２ＯＤＮ：１５０μＭ）およびＨＶＪ粒子無しのリポソーム媒介移行（ｃｄｋ２ＯＤＮ；１５μＭ）をラット傷害頸動脈につき調べた。トランスフェクション２週間後、ラットを犠牲に、血管を４％パラホルムアルデヒドで潅流固定した。試料の同一性を知らされていない個人によって、形態測定によりネオ内膜形成をアッセイした。内膜および中膜領域を計数票(Southern Micr o Instruments，Model 2200，Atlanta，GA)にて測定した。統計解析すべての値は平均値±ＳＥＭで表す。すべての実験は３回反復した。引き続いてのダンカン検定の偏差解析を用いて、多重比較にて有意差を決定した。Ｐ＜０．０５は有意とみなした。結果ＦＩＴＣ標識未修飾およびホスホロチオエートＯＤＮの局所化ＨＶＪ方法なくしてのＦＩＴＣ未修飾ＯＤＮ（３０μＭ）のラット頸動脈への直接移行は、トランスフェクション１０分後における中膜層での蛍光を明らかにした。しかしながら、この蛍光はトランスフェクション１日後に消失した。対照的に、ＨＶＪ法によるＦＩＴＣ未修飾ＯＤＮ（３μＭ）の移行の結果、かなり低濃度のＯＤＮに拘わらず、トランスフェクション１０分後において、ＨＶＪなくしての直接移行よりもかなり広い蛍光が得られた。さらに、蛍光は核において刺激され、トランスフェクション１週間後まで継続した。トランスフェクション２週間後において、蛍光は中膜層では観察されなかった。ＨＶＪ粒子の有無にての、ＦＩＴＣ標識ホスホロチオエートＯＤＮ−リポソーム複合体の移行の比較を図８Ａに示す。ＨＶＪ粒子なくしてのＯＤＮ−リポソーム（３μＭ）トランスフェクト血管の蛍光は、主として中膜層で観察されたが、直接移行と同様に、トランスフェクション１０分後において外膜でも観察された。この蛍光はトランスフェクション１日後に顕著に減衰し、４日以内に消失した。ＨＶＪ法によるＦＩＴＣ標識ホスホロチオエートＯＤＮ（３μＭ）の移行の結果、中膜および外膜層で観察されるかなり広い蛍光が得られ、２週間まで継続した。蛍光のこの延長は、ヌクレアーゼに対するその耐性のためのホスホロチオエートに対するＯＤＮの骨格の修飾によるものであった。これらの知見は、アンチセンス戦術におけるホスホロチオエートＯＤＮの利用性を支持する。トランスフェクション１および２週間後において、蛍光は主として中膜層で見い出され、ネオ内膜病巣では見い出されなかった。蛍光はこの段階では核で観察できた。ＯＤＮ処理なくしてのＨＶＪ複合体未処理血管は、弾性ラミナでの自己蛍光を除き、特異的蛍光を明らかにしなかった。ＦＩＴＣ標識ＯＤＮによって得られた蛍光は自己蛍光から容易に区別された。血管中の遊離ＦＩＴＣのインキュベーションの結果特異的蛍光は得られず、これは、この蛍光がＦＩＴＣ標識ＯＤＮに特異的であったことを示す。表６はこれらの結果をまとめる。 in vivoにおけるｃｄｋ２キナーゼｍＲＮＡ発現の逆転写酵素ＰＣＲラット頸動脈傷害モデルにおけるｃｄｋ２キナーゼのｍＲＮＡ発現を調べて、アンチセンスｃｄｋ２ＯＤＮの特異性を評価した。アンチセンスまたはセンスｃｄｋ２ＯＤＮ（１５μＭ）でトランスフェクトした血管のｐいずれかからのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。傷害１日後に、センスＯＤＮでトランスフェクトした傷害血管からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲはｃｄｋ２キナーゼｎＲＮＡに対応する単一のバンドを示したが、無傷血管からのものは示さなかった。しかしながら、ｃｄｋ２ＯＤＮの投与は増加するｍＲＮＡを無くした。傷害から少なくとも１４日後において、センスまたはアンチセンスＯＤＮでトランスフェクトしなかったＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲは、ｃｄｋ２ｍＲＮＡの検出可能なレベルを示した。対照的に、ベーターアクチンのｍＲＮＡは同一プロトコルで容易に検出された。アンチセンスｃｄｋ２およびｃｄｃ２キナーゼＯＤＮに対する効果ＨＶＪ移行法によってホスホロチオエートＯＤＮが中膜層で２週間以内に安定化されるラット傷害血管に、アンチセンスｃｄｋ２キナーゼホスホロチオエートＯＤＮを適用した。未処理およびセンスＯＤＮ（２および１５μＭ）トランスフェクト血管は、トランスフェクション後２週間においてネオ内膜形成を呈した。対照的に、アンチセンスｃｄｋ２キナーゼＯＤＮ（３μＭ）の単一投与の結果、ネオ内膜形成は有意に減少した(センスＯＤＮ処理血管と比較してほぼ６０％)。１５μＭの高用量において、アンチセンスｃｄｋ２ＯＤＮの結果、ネオ内膜形成はさらに阻害されたが、有意ではなかった。それらの処理は中膜領域を変化させなかったが、これは、中膜生存度がＨＶＪ移行方法によっては影響されないことを示す。ネオ内膜形成におけるこの反応は、トランスフェクト病巣に限定されたが、同一動物における非トランスフェクト病巣ではそうではなかった（ネオ内膜／中膜領域比；トランスフェクト領域＝０．５９７± ０．１３１−対−非トランスフェクト領域＝１．１５６±０．０７９、Ｐ＜０．０１）。in vivoにおけるＯＤＮの高められた寿命に対するＨＶＪ移行の寄与を調べるために、直接移行、ＨＶＪ粒子無くしてのリポソーム媒介移行のうちのアンチセンスｃｄｋ２ＯＤＮの生物学的作用をＨＶＪ方法と比較した。直接移行（１５０μＭ）またはＨＶＪ粒子無くしてのリポソーム媒介移行（１５μＭ）はいずれもアンチセンスＯＤＮのいずれの阻害効果も示さなかった。（１）アンチセンスｃｄｃ２キナーゼＯＤＮ単独（１５μＭ）、および（２）ｃdｃ２およびｃｄｋ２キナーゼＯＤＮ（各々１５μＭ）を投与して、細胞周期調節遺伝子をブロックするアンチセンス戦略を調べた。アンチセンスｃｄｃ２キナーゼＯＤＮの投与は、ｃｄｋ２ＯＤＮ単独と同様にネオ内膜形成を部分的に阻害し、一方、センスｃｄｃＯＤＮはそうではなかった。ｃｄｃ２およびｃｄｋ２キナーゼＯＤＮの組合せは、アンチセンスｃｄｃ２またはｃｄｋ２キナーゼＯＤＮ単独と比較して、ネオ内膜形成の促進された阻害を示した。本実施例は、ＨＶＪ方法が、ＦＩＴＣ−標識ＯＤＮのトランスフェクション後において、各々、１週間（未修飾ＯＤＮ）および２週間（ホスホロチオエートＯＤＮ）まで中膜層で蛍光の存在を延長したことを示す。これらの知見は、ＨＶＪ方法はエンドサイトーシスを迂回することを示す。これは、恐らくは、ＨＶＪ粒子の役割によるものであろうが、ＨＶＪ粒子無くしてのＯＤＮ−リポソーム複合体がかかる延長を生じないので、リポソームによるものではない。さらに、ＨＶＪ方法によってのみ観察できた核における蛍光の刺激はアンチセンスＯＤＮの特異性を増大し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼを発現する少なくとも１の遺伝子に対する少なくとも１のアンチセンスオリゴマー配列の有効量を血管病巣形成に関連する部位に投与することよりなり、ここに、該アンチセンス配列が該遺伝子の発現を阻害することを特徴とする哺乳動物において血管病巣形成に関連する細胞の血管細胞活性を阻害する方法。２．該サイクリンがサイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、ＥまたはサイクリンＸ（ｐ４６）であり、該サイクリン依存性キナーゼがｃｄｃ２、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４、またはｃｄｋ５である請求の範囲第１項記載の方法。３．各々、異なるサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼの核酸に相補的な少なくとも２のアンチセンス配列を血管病巣形成の部位に投与する請求の範囲第１項記載の方法。４．該血管病巣が心血管の血管形成術に関連し、該アンチセンス配列を血管形成術部位に投与して再狭窄を減少させる請求の範囲第１項記載の方法。５．サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼに対するアンチセンス配列を、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するアンチセンス配列と組み合わせて投与する請求の範囲第１項記載の方法。６．該アンチセンス配列は、リポソーム中にある状態で投与される請求の範囲第１項記載の方法。７．該リポソームはセンダイウイルス（ＨＶＪ）を含有する請求の範囲第６項記載の方法。８．該アンチセンス配列を管腔内投与、壁内投与または外膜周囲に投与する請求の範囲第１項記載の方法。９．該アンチセンス配列がｃｄｃ２およびＰＣＮＡに対するものである請求の範囲第５項記載の方法。１０．該アンチセンス配列がサイクリンＡおよびｃｄｃ２に対するものである請求の範囲第３項記載の方法。１１．該アンチセンス配列がサイクリンＢおよびｃｄｃ２に対するものである請求の範囲第３項記載の方法。１２．該アンチセンス配列がサイクリンＡおよびｃｄｋ２に対するものである請求の範囲第３項記載の方法。１３．該オリゴマーが、アルキル−もしくはアリール−ホスホレートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、ホスホロジチオエートオリゴマー、ホルムアセタールオリゴマー、チオホルムアセタールオリゴマーまたはペプチドオリゴマーである請求の範囲第１項記載の方法。１４．該アンチセンスオリゴマーが１２ないし３０ヌクレオチドの長さであって、１以上のホスホロチオエート結合によって安定化されている請求の範囲第１３項記載の方法。１５．該オリゴマーをリポフェクチンとして（Ｎ−［１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドと共に処方した組成物にて投与する請求の範囲第１項記載の方法。１６．該リポソームがカチオン性、中性またはアニオン性リポソームである請求の範囲第６項記載の方法。