KR20010103572A

KR20010103572A - 동맥경화 및 ｐｔｃａ술후의 혈관 재협착에 대한예방·치료제

Info

Publication number: KR20010103572A
Application number: KR1020017002298A
Authority: KR
Inventors: 가도마쯔겐지; 호리바미쯔루; 무라마쯔다카시; 이케마쯔신야; 사쿠마사다토시
Original assignee: 무라마쯔 다카시; 나까야마 유; 메이지 뉴교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2001-11-23
Also published as: EP1108436A4; EP1108436A1; US20080107659A1; AU762437B2; KR100608276B1; DE69941263D1; US7309695B2; EP1108436B1; CN1324249A; US7820160B2; ATE439146T1; CA2341638A1; CA2341638C; JP4228111B2; WO2000010608A1; AU5305599A; US20040077579A1; CN1222296C

Abstract

혈관조직에 있어서의 MK의 기능을 저해하는 화합물을 주성분으로 하는, 혈관의 협착방지, 또는 치료를 위한 의약조성물이 제공된다. 본 발명은, 경피적 관상동맥형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty;PTCA) 후의 재협착이나 동맥경화에 의한 혈관협착의 방지나 치료에 유용하다.

MK의 기능을 저해하는 화합물로서는, MK유전자로부터 전사된 한가닥 사슬 mRNA의 세그먼트에 결합하여 세포내의 MK 단백질합성을 저해하는 안티센스 올리고누클레오티드나, MK 단백질에 대한 항체 등이 사용된다.

Description

동맥경화 및 ＰＴＣＡ술후의 혈관 재협착에 대한 예방 ·치료제{Preventives ·remedies for arteriosclerosis and post-PTCA reangiostenosis}

최근, 동맥경화, 특히 관동맥경화가 원인으로 일어나는 협심증이나 심근경색이라고 하는, 허혈성 심질환의 발증빈도가 증가 일로에 있다. 동맥경화의 주요한 병리조직상은, 국소성으로 생기는 내막 비후나 탄성의 저하이다. 이 결과, 순환장해가 생겨, 심근조직으로의 영양부족 및 산소부족을 초래하여, 상기 병태를 일으킨다.

내막 비후의 병리발생에 관하여 다수의 중요한 발견이 있다. 그 대표적인 것이, 예를 들면, 비후 내막의 주된 구성세포는, 중막에서 유주하여 온 평활근세포라고 하는 사실의 발견이다(Parker, F.: Amer. J. Pathol., 36: 19-53, 1960; Webster, W. S., S. P. Bishop & J. C. Geer: Amer. J. Pathol., 76: 245-264, 1974). 더욱이, 동맥경화의 진전이, 상해에 대한 수복반응의 결과라고 하는 설(Ross, R.:N. Engl. J. Med. 314: 488-500, 1986)은, 현재에도 동맥경화 이해의기본이 되고 있다.

이러한 내막 비후에 의한 혈관의 협착부를 벌룬(balloon)으로 팽창시켜, 물리적으로 혈관을 확장시키는 치료법, 즉, 경피적 관상동맥형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty;PTCA)이 현재 활발히 행해지고 있다. PTCA술은, 증상개선율 90% 이상이라고 하는 우수한 효과를 실현하고 있지만, PTCA시행후 6개월 이내에, 동일한 부위에서 30~60%의 빈도로 재협착을 일으키고 있다. 이는, 동맥벽 상해부위에 대한 신생내막의 형성이라고 하는 수복기전이 과잉으로 생긴 결과인 것으로 병리학적으로 인식되고 있다(Nobuyoshi, M. et al:J. Am. Coll. Cardiol. 17: 433-439, 1991;). 또한, 이 신생내막은, 중막으로부터의 혈관평활근세포의 유주, 증식 및 세포외 매트릭스 증생(增生) 등에 의해 형성되어 있는 것이 명백해졌다. 한편, 신생내막의 형성과정에서의 분자생물학적인 기구에 대해서는, 다음과 같은 식견이 얻어졌다. 먼저 혈관평활근세포에 있어서, 수축형에서 합성형으로의 형질전환이 관찰된다. 또한, 세포증식을 촉진하는 다음과 같은 물질이나 그 수용체(receptor)의 과잉발견이 보고되고 있다.

혈소판 유래 증식인자(PDGF),

섬유아세포 증식인자(FGF) 등의 각종 증식인자,

인터루킨이나 종양괴사인자 α(TNF-α) 등의 사이토카인,

안지오텐신 II,

트롬빈

이와 같은 배경을 토대로, 혈관평활근세포의 유주와 증식의 억제에 의해 재협착을 예방할 수 있다고 생각되었다. 그리고 동물실험에서 많은 약제의 내막증식 억제효과가 검토되어, 유효한 것에 대해 임상시험이 실행되었다. 그러나, 어떤 약제도 임상적으로 유효성이 입증되어 있지 않다(Circulation. 86: 100-110, 1992; Weintraub, W. S. et al.: N. Engl. J. Med. 331: 1331-1337, 1994).

미드카인(midkine;MK)은, 레티노인산에 의한 배성 종양세포의 분화유도과정에서, 조기에 발견이 유도되는 유전자의 산물로서 발견되었다(Kadomatsu, K. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 1312-1318, 1988). 플레이오트로핀(PTN;별명 HB-GAM)은, 신경세포 돌기신장능을 갖는 결합단백질로서, 신생래트의 뇌에 발견되었다(Rauvala, H.: EMBO J., 8: 2933-2941, 1989). MK와 PTN은, 발생과정에서의 세포증식, 생존 및 분화를 제어하는 헤파린결합성 단백질(Tomomura, M. et al.:J. Bio. Chem., 265: 10765-10770; Li, Y. et al.: Sience 250: 1690-1694, 1990; Rauvala, H.: EMBO J., 8:2933-2941, 1989; Wellstein, A. et al..: J. Biol. Chem., 267: 2582-2587, 1992)으로, 약 50%의 서열상동성을 갖으며(Tomomura, M. et al.: J. Biol. Chem., 265: 10765-10770; Kuo, M. et al.: J. Biol. Chem., 265: 18749-18752; Tsutsui, J. et al: Biochem. Biophys. Res. Commun, 176: 792-797, 1991), MK패밀리를 형성한다(Muramatsu, T.: Dev. Growth Differ., 36: 1-8, 1994).

성숙 MK단백질은, 염기성 아미노산과 시스테인이 풍부한, 121아미노산으로 된 분자량 13000 단백질로, 그 기능은 실로 다양하여, 신경세포의 생존촉진, 신경돌기신장, 혈관내피세포에 있어서의 선용계 항진, NIH3T3세포의 형질전환 등을 들수 있다. 이들에 더하여, 최근, MK의 조직 재구축으로의 관여가 주목되고 있다. 즉, 뇌경색소 주위의 신경교질 세포(glial cell)나, 발생도상에서 상피-간질간 상호작용이 일어나는 곳의 주로 상피측 등에서 MK의 발현이 관찰되고 있다.

그러나, 동맥경화나 PTCA술후의 혈관재협착과 MK단백질과의 관련성에 대한 보고는 없다.

본 발명은 혈관내막 비후에 기인하는 질환의 치료 ·예방제에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 MK 또는 그 저해제를 유효성분으로 하는 치료 ·예방제에 관한 것이다.

도1은, 래트의 실험적 재협착모델의 혈관조직에 있어서의 경시적인 mRNA의 발현을, RT-PCR에 의해 검출한 결과를 나타내는 도이다.

(a)는 MK의, (b)는 플레이오트로핀(PTN)의, (c)는 Syndecan-1, Syndecan-3 및Syndecan-4의, (d)는-β의, (e)는 GAPDH의 각각에 대한 mRNA의 경시적인 발현의 변화를 나타낸다.

도2는, 래트의 실험적 재협착모델의 혈관조직에 있어서의 mRNA의 경시적인 발현의 변화를 경합적 PCR법에 의해 정량적으로 검출한 도이다. GAPDH는 내부표준으로서 이용했다.

도3은, 래트의 실험적 재협착모델의 혈관조직에 있어서의 MK단백질 발현량의 경시적인 변화를 웨스턴흡입법에 의해 해석한 결과를 나타내는 도이다.

도4의 a∼c는, 래트의 카테테르상해 후, 14일 경과에 있어서의 혈관조직의 헤마톡시린 ·에오신(H.E)염색 파라핀조각을 나타내고, a는 대조군의 14일 경과에 있어서의 H.E도를, b는 재협착모델 제작 후 14일경과에 있어서의 H.E도를, c는 a의 확대도를, 각각 나타낸다.

도5는, 래트의 카테테르상해 후, 14일경과에 있어서의 혈관조직의 파라핀조각을, 항MK 다중클론항체 및 2차항체로서 항토끼 IgG항체(Jackson laboratory)를 사용하여 면역조직 화학염색한 결과를 나타내는 도이다.

발명의 개시

본 발명은 혈관내막의 신생을 조절하기 위한 신규한 약제, 특히 동맥경화의 치료나 PTCA술후의 혈관재협착 방지효과를 갖는 신규한 약제의 제공을 과제로 한다.

본 발명자들은, 다음과 같은 식견을 토대로, 혈관내막의 신생에 있어서의 MK의 역할을 명백히 했다. 즉, 래트의 총경동맥의 내피상해모델의 혈관조직으로 제조한 mRNA에 대해서, RT-PCR 및 경합적 PCR을 실시한 바, 상해 후 7일에서 10일에 거쳐, MK mRNA의 발현이 증대되고 있는 것을 확인했다. 또한, 야생형 마우스 및 MK 녹아웃마우스로 제작한 신생 내막형성모델에 있어서, 야생형 마우스의 신생내막이, MK 녹아웃마우스의 신생내막에 비해 현저히 증대되어 있었다. 또한, MK 녹아웃마우스에 MK를 주입하자 신생내막의 증대가 관찰되었다.

이들 식견을 토대로, 본 발명자들은 혈관내막의 막후에, MK가 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각했다. 그리고 세포에 있어서의 MK의 기능을 저해함으로써, 대응하는 증식-자극활성이 억제되어, MK가 관여하는 동맥경화나, PTCA술후의 혈관재협착방지를 실현할 수 있는 것을 명백히 하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하의 의약조성물 및 그를 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

(1) MK의 기능을 저해하는 화합물을 주성분으로서 포함하는, 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물.

(2) (1)에 있어서, MK의 기능을 저해하는 화합물이, MK 유전자로부터 전사된 한가닥 사슬 mRNA의 세그먼트에 결합하여 세포내의 MK단백질합성을 저해하는 안티센스 올리고누클레오티드인 의약조성물.

(3) (1)에 있어서, MK의 기능을 저해하는 화합물이, MK단백질에 대한 항체, 또는 그 가변영역을 포함하는 단편인 의약조성물.

(4) (1)에 있어서, 혈관협착이, 동맥효과 및 PTCA술후의 혈관재협착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 원인에 의한 것인 의약조성물.

(5) 다음의 공정을 포함하는, 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.

(a) MK 발현세포를 후보화합물과 접촉시키는 공정

(b) MK의 기능을 저해하는 화합물을 선택하는 공정

(6) (5)에 기재된 방법에 의해 선택된 화합물을 유효성분으로서 포함하는 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물.

본 발명은 MK의 기능을 저해하는 화합물을 주성분으로서 포함하는 혈관재협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물이다. 또는 본 발명은, MK의 기능을 저해하는 화합물의, 혈관재협착의 예방, 또는 치료에 있어서의 사용에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은, MK의 기능을 저해하는 화합물의, 혈관재협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 MK의 기능이란, MK유전자가 전사되어, 단백질로 번역되어 그 활성을 발현하는 일련의 과정 전부를 포함한다. 따라서 MK의 기능저해란, 이들의 일련의 과정을 구성하는 어느 하나의 스텝에 있어서 그 스텝을 저해하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 이용 가능한 화합물을 구체적으로 나타내면, 예를 들면 유전자의 전사와 단백질로의 번역을 저해하는 MK 유전자의 안티센스 핵산이나 데코이핵산, MK를 코드화하는 mRNA를 상해하는 리보자임, MK단백질의 활성발현에 간섭하는 MK단백질 결합성 화합물 등이 생각된다.

본 발명자들은, 래트 경동맥의 내피상해모델의 혈관조직으로 제조한 mRNA를 시료로서, MK, HB-GAM(Heparin-binding Growth-associated Molecule;Pleiotrophin), Syndecan 패밀리(Syndecan-1, Syndecan-3, Syndecan-4), RPTP-β(PTN의 수용체의 하나) 및 글리세로알데히드인산 탈수소효소(GAPDH;하우스키핑유전자)(내부표준)에 대해 RT-PCR에 의해 이들 단백질의 발현을 조사했다. 그 결과, MK에 대해서는, 7일에서 14일에 걸쳐 mRNA 발현이 증대되어 있는 것이 인정되었다(도1a). 또한 Syndecan-1은, MK의 발현패턴과 동시에 3일째에서 14일째에 mRNA의 강한 발현이 인정된다. Syndecan-1은, MK의 수용체와 같은 작용을 하는 것으로 생각되고 있는 Syndecan 패밀리의 하나이다.

한편, MK패밀리인 PTN의 발현은, 7일째경에 일과성으로 발현이 증대되고 있다. 또한, PTN의 수용체로 생각되는 RPTP-β(J. Biol. Chem. 271, 21446-21452, 1996)는, 역시 HB-GAM의 발현이 상승되어 피크에 달할 것으로 생각되는 술후 3일에서 7일에 걸쳐 mRNA가 강하게 발현하고 있는 것이 인정된다. 내부표준으로 한 GAPDH는, 술후의 일수에 관계 없이 일정 발현을 나타내고 있는 것이 인정된다(도1e).

또한, 술후의 MK의 발현량의 변화를, Competitive PCR로 조사한 바, GAPDH는, 술후 14일째까지 항상 동일한 발현량을 나타내고 있는 것이 인정되는(10⁵copies/㎕)데 비해, MK는 술후 7일째에 발현이 10배 증대되어 있는 것이 인정된다(도2). 즉, MK는 술후 7일째에 mRNA의 발현이 최고에 달하는 발현형식으로 출현하는 것이 나타내어진다. 3일째, 7일째, 14일째의 각 조직을 웨스턴흡입 해석하여 보면, 확실히 MK단백질이 확인되고, 술후 7일째에도 많은 양의 MK단백질이 발현하는 것이 명백하다(도2). 이상의 결과로부터, MK는 그 패밀리인 PTN과는 mRNA의 발현패턴을 달리 하여, MK만이 신생내막의 형성에 협조한 형태로 발현하고 있는 것으로 생각된다.

내피상해 후의 신생내막의 형성에 대해서(Circulation, 96: 4333-4342, 1997), 14일째의 래트의 혈관조직을 헤마톡시린 ·에오신 염색해 본 바, 내막이 형성되지 않고, 외막 다음에 중막이 그대로 증대되어 있어, 혈관평활근의 증식이 확인되었다(도4b,c). 이에 대해, 처치를 행하지 않은 래트의 혈관내막부는, 혈관이 깨끗하게 외막, 중막 및 내막으로 형성되어 있었다(도4a). 더욱이, 14일째의 래트의 혈관조직에 있어서의 항MK항체(특원평9-205332)에 의한 면역조직화학적 염색의 결과에서는, 이 증식하고 있는 혈관평활근 세포부분이 염색되었다(도4d). 이들의 결과로부터, 평활근세포의 증식에는 MK가 관여하고 있는 것이 명백하다. 따라서, MK의 기능을 저해함으로써 PTCA술후의 재협착의 예방을 실현할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, PTCA술후의 혈관의 협착과 동일한 기구가 동맥경화소에 있어서도 생기고 있는 것으로 생각되고 있는(Nature, 362: 801-809, 1993;Circulation, Res., 77: 445-465, 1995) 것으로부터, MK의 기능저해를 통하여 동맥경화의 예방과 치료를 달성할 수도 있다.

MK의 기능저해는, 예를 들면 MK단백질합성의 저해에 의해 달성할 수 있다. MK단백질 합성은, MK유전자의 전사, 발현, 또는 번역의 억제에 의해 저해된다. 이 목적을 위해, 예를 들면 안티센스 핵산이나 데코이형 핵산을 이용할 수 있다. 안티센스 핵산기술은, 유전자의 상보성을 이용하여, 특정 유전자의 발현을 억제하기 위해, 목적 유전자와 하이브리다이즈하는 핵산서열을 가진 유전자나, 인공적으로 합성한 짧은 핵산(안티센스 올리고)을 도입하는 것이다. 그것에 대해, 데코이형 핵산의약은, 특정 전사조절인자의 결합부위로의 결합을 저해하여, 활성화되는 유전자군의 억제를 행하는 것이다.

안티센스기술은, 유전자산물을 저해하는 매우 특이적이고 효력이 강한 방법을 제공한다(Stein & Chang, Science 261: 1004-1012, 1993). 안티센스 올리코누클레오티드를 mRNA 표적물에 하이브리다이즈시키면, 상응하는 유전자산물의 발현을 다중기구로 저해할 수 있다. 「번역정지」상태에서는, 표적 mRNA와 올리고의 상호작용에 의해 리보솜복합체의 작용이 억제되고, 그것에 의해 mRNA의 단백질로의 번역이 저지된다(Haeuptle et al.: Nucl. Acids. Res. 14: 1427, 1986). 포스포디에스테르 DNA 또는 포스포로티오에이트 DNA 올리고의 경우에는, 포적이 되는 RNA서열이 그 DNA 올리고머에 하이브리다이즈하면, 세포내 RNase H가 그 표적 RNA서열을 신속하게 소화할 수 있다(Walder & Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5011, 1988). 한 종의 올리고누클레오티드는, 목적 유전자를 포함하는 두가닥 사슬의 표준적인 게놈 DNA와 함께 「트리플렉스(triplex)」즉 3중 나선구조를 형성하는 것이 가능하여, 그것에 의해 RNA 폴리메라제에 의한 전사가 방해된다(Giovannangeli et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 10013, 1993).

안티센스 올리고누클레오티드는, 전형적으로는 짧은 DNA서열로, 통상 그 길이는 10~50염기로서, 상응하는 표적 mRNA의 특이적인 영역에 상보적이다. 표적 전사물과 안티센스 올리고누클레오티드의 하이브리다이제이션은, 상보적인 염기대(base pair)를 형성하는 결과, 높은 특이성을 나타낸다. 안티센스 올리고누클레오티드의 하이브리다이제이션은, 표적부위에 대한 안티센스 올리고누클레오티드의 접근하기 쉬움, 화학수식 및 2차구조 등에 영향을 받는다(Stein et al.: Cancer Research 48: 2659, 1988).

발현을 억제하기 위해 mRNA에 대해, 안티센스 올리고누클레오티드의 바람직한 길이를 선택하기 위해서는, 다음과 같은 요소를 고려할 필요가 있다. 먼저, 10~15염기와 같은 짧은 올리고누클레오티드는, 높은 세포침입성을 나타내는 한편, 유전자 특이성이 낮다. 이것과는 대조적으로, 20~30염기의 긴 올리고누클레오티드는, 양호한 특이성을 나타내는 한편, 세포로의 혼입속도는 작아진다. mRNA 표적서열에 접근하는 능력도 중요하다. 예를 들면 표적이 되는 mRNA에 존재하는 루프형성영역은, 한가닥 사슬로 존재할 가능성이 높기 때문에 안티센스 올리고누클레오티드의 접근이 용이하여, 표적염기서열로서 유망하다. 이들 요소를 고려하여, 적절한 표적서열과 안티센스 올리고누클레오티드의 길이를 선택하는 것은, 당업자에게는 자명하다.

본 명세서에 있어서의 「올리고누클레오티드」라는 용어는, DNA 및 RNA의 데옥시리보누클레오티드 및 리보누클레오티드 구조와 같은 천연에 존재하는 올리고머의 핵산부분 및 천연에 존재하는 핵산에 결합하는 능력이 있는 인공 아나로그 양쪽을 포함한다. 본 발명의 올리고누클레오티드는, 포스포디에스테르결합에 의해, 또는 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 또는 다른 결합에 의해 결합한 아나로그에 의해, 결합한 리보누클레오티드 단량체에 토대를 두고 있으면 좋다. 또 그들은, 기본구조 또는 다른 수식은 변화하고 있지만, 천연에 존재하는 DNA구조 및 RNA구조에 결합하는 능력을 유지한 채인, 단량체부분을 가지고 있더라도 좋다. 이와 같은 올리고누클레오티드는, 당업자에게 주지의 방법, 예를 들면 시판의 기계 및 Perkin-Elmer/Applieds Biosystem(Poster City, CA)으로부터 입수할 수 있는 시약을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들 장치는, 100염기 정도 길이의 올리고누클레오티드를 나노몰 단위로 합성할 수 있다.

포스포디에스테르결합한 올리고누클레오티드는, 혈중에서 또는 세포내부에서 뉴클레아제의 작용을 특히 받기 쉽다. 그 때문에 바람직한 태양에 있어서, 본 발명에 사용하는 올리고누클레오티드는, 뉴클레아제 저항성인 것이 명백한 포스포로티오에이트결합 또는 메틸로포스포네이트결합한 아나로그이다(Stein et al.: Cancer Research 48: 2659, 1988).

또한, 안티센스 RNA의 형태에서의 MK 올리고누클레오티드를, 목적으로 하는 세포내에서 표준적인 DNA 발현벡터로부터 일시적으로 발현시킬 수 있다. MK DNA서열은, 표준적인 플라스미드로부터 발현벡터로 클로닝할 수 있어, 그 발현벡터는, 내재하는 올리고누클레오티드를 보다 높은 레벨에서, 또는 보다 효과적으로 발현할 수 있는 특성을 갖추고 있다. 최저한, 이들 구축물은, 삽입된 DNA서열의 전사를 개시시키는 진핵생물의 프로모터서열을 필요로 한다. 바람직한 발현벡터는, 발현을 높은 레벨까지 유도할 수 있는 것이다. 이는, 적당한 숙주세포에 있어서, 하류서열의 전사를 증가시키는 조절영역을 부가함으로써 달성된다.

예를 들면, MK 안티센스 올리고 발현벡터는, 플라스미드 pHIL301-MK의 한가닥 사슬 cDNA로부터 얻어지는 단편을 증폭시키는 PCR을 이용하여 구축할 수 있다. PCR반응을 행할 때에 바람직한 올리고누클레오티드 프라이머의 누클레오티드서열은 당업자라면 적절한 서열을 MK의 cDNA서열(GenBank Acc. No. J05447)을 토대로 설정할 수 있다. 올리고누클레오티드의 합성법 및 정제법은, 공지이다. PCR산물은, 플라스미드에 서브클로닝된다. 이에 관련하여 「클로닝벡터」는 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 DNA분자이고, 그것은 원핵생물의 숙주내에서 자율복제할 수 있다. 클로닝벡터는, 일반적으로 그 클로닝벡터를 사용하여 형질전환된 세포의 동정 및 선택에 사용하기에 바람직한 마커(marker)유전자 뿐 아니라, 그 벡터의 필수 생물기능을 잃지 않고, 외래의 DNA서열을 검출 가능한 상태에서 삽입될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 인식부위를 한군데 또는 여러군데 포함하고 있다. 마커유전자는, 테트라싸이클린 내성 또는 암피실린 내성의 유전자를 포함한다. 클로닝된 안티센스 단편은, 적당한 세균세포를 클로닝벡터를 사용하여 형질변환하고, 적절한 항생물질의 존재하에서 그 세균의 숙주세포를 증식시킴으로써 증폭된다. 계속해서, 세균의 숙주세포에 대해 PCR법을 행하여, MK 안티센스 배향클론에 대해 스크리닝한다.

클로닝한 안티센스 단편은, 클로닝벡터로부터 개열되고, 그리고 발현벡터에 삽입된다. 바람직한 발현벡터에는, 일반적으로 (1) 세균숙주의 복제개시점 및 항생물질 내성마커를 코드화하는 원핵세포의 DNA인자, (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 조절하는 인자 및 (3) 전사의 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사공정을 조절하는 DNA인자가 포함된다. 포유동물의 숙주에서는, 전사조절 및 번역조절 시그날은, 바람직하게는, 예를 들면 아데노바이러스, 소의 파피로마바이러스, 또는 유사한 바이러스 등의 바이러스원 유래이다. 이들 바이러스에 있어서, 조절시그날은, 높은 레벨의 발현을 초래하는 특정 유전자에 관여하고 있다. 바람직한 전사조절서열 및 번역조절서열은 또, 예를 들면 악틴, 콜라겐, 미오신 및 메탈로치오닌 유전자라는, 포유동물의 유전자로부터 얻을 수도 있다. 전사조절서열은, RNA합성을 원활히 개시시킬 수 있는 프로모터영역을 포함하고 있다. 바람직한 진핵세포의 프로모터에는, 마우스메탈로티오닌 1유전자의 프로모터, 헤르페스바이러스의 TK프로모터, 라우스육종바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터 및 싸이토메갈로바이러스프로모터가 포함된다.

또한, 박테리오파지 T3RNA 폴리메라제 프로모터와 같은 원핵세포의 프로모터는, 그 원핵세포의 프로모터가 진핵세포의 프로모터에 의해 조절되는 것이라면, 융합유전자발현을 조절할 때에 사용할 수 있다.

포유동물세포에 있어서의 발현에 바람직한 벡터는, 포유류의 인헨서(enhancer) 프로모터서열로부터 높은 레벨의 전사를 제공하는 벡터이다. 클로닝된 MK 안티센스 벡터는, 세균숙주세포내에서 증폭되고, 세포로부터 단리되어, 상술한 바와 같이 하여 해석된다.

안티센스서열을 이용하기 위한 또 하나의 가능한 방법은, 유전자치료에 의한 것이다. 통상 레트로바이러스 유래인 바이러스양(virus-like)벡터는, 혈관 비후조직이나 혈관내막으로의 안티센스 구축물의 혼입 및 발현을 위한 담체로서 유용한 것이 나타내어질 것이다. 일반적으로, 상기 벡터는 인 비보에서 비복제성으로, 목적으로 하지 않는 비표적세포의 감염을 방해한다. 이러한 경우, 결여되어 있는 복제능을 인 비보에서 주고, 그것에 의해 안티센스 벡터를 증폭시켜 싸넣을 수 있는 헤르바 세포계가 공급된다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드는, MK cDNA의 오픈리딩프레임의 어느 부분에 유래하는 것이더라도 좋다. 바람직하게는, (1) 번역개시부위의 주변에 있고, (2) 루프구조를 형성하는, mRNA서열이 표적이 된다. 인간게놈의 크기를 토대로 하는 통계해석에 의해, 약 14-15염기대의 길이인 DNA세그먼트가 게놈내에 특유의 서열을 가지고 있는 것이 나타내어져 있다. 따라서, MK RNA의 표적서열의 특이성을 확실히 하기 위해서는, 안티센스 올리고누클레오티드의 길이를 적어도 14염기, 바람직하게는 15염기로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 의해 기획되는 올리고누클레오티드에는, MK의 cDNA서열의 1-14번 위치, 1-15번 위치, 1-16번 위치, 1-17번 위치, 1-18번 위치, 1-19번 위치, 2-16번 위치, 3-17번 위치 등에 상당하는 누클레오티드가 포함된다.

본 발명에 있어서의 MK의 기능을 저해하는 화합물에는, MK단백질에 결합하여 그 활성의 발현에 간섭하는 물질을 이용할 수도 있다. 이러한 화합물에는, MK중화항체, 헤파린(Kaneda, N et al., J. Biochem. 119, 1150-1156(1996)참조), 또는 MK의 결합부위를 빼앗아 활성을 억제하는 인간 ·류도칸(Human Ryudocan)(Kojima, T., Katsumi,A.,Yamazaki,T.,Muramatsu, T.,Nagasaka,T.,Ohsumi,K., and Saito,H., J.Biol.Chem. 271,10,5914-5920(1996)참조) 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항 MK단백질항체는, 공지의 수단을 사용하여, 단일클론 또는 다중클론항체 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 MK단백질항체로서, 단일클론항체가 바람직하다. 단일클론항체는, 공지의 방법에 준하여 제작할 수 있다. 예를 들면 인간 MK의 cDNA는 클로닝되어, 그 DNA서열과 그것에 코드되는 아미노산서열이 보고되고 있다. 단일클론항체는, MK단백항원 전체에 대해서도, 또는 그 일부에 대해서도 제작할 수 있다. 특히 바람직한 것은, 가용성형 인간 MK단백항원에 대해 제작된 항체이다.

단일클론항체를 산생(産生)하는 하이브리도마는, 기본적으로는 켈러와 밀스테인의 방법(Kohler, G. & C. Milstein, Nature 256: 495-497, 1975)에 준하여, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, MK단백질을 감작항원으로서 사용하여, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 산생세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

예를 들면, 항체취득의 감작항원으로서 사용되는 MK단백은, 인간 MK에 대해서는, 특개평9-95454에 기재된 MK유전자/아미노산서열을 사용함으로써 얻어진다.

MK는, 본 발명에서 사용되는 항MK항체 취득을 위한 항원으로서 사용되는 한 그 아미노산 잔기수를 묻지 않는다. MK유전자서열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포속 또는 배양상청속에서 목적으로 하는 MK단백을 공지의 방법으로 정제하여, 이 정제 MK단백을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 감작항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특별히 한정되지는 않지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터 등이 사용된다.

MK를 동물에게 면역하기 위해서는, 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, MK를 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, MK를 PBS나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 목적에 따라 보통의 아쥬반트, 예를 들면, 프로인트 완전아쥬반트를 적량혼합하고, 유화 후 포유동물에게 4∼21일 마다 여러차례 투여한다. 또한, 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다. 이렇게 하여 면역하고, 혈청중에 목적으로 하는 항체수준이 상승하는 것을 확인한 후, 포유동물로부터 면역세포를 꺼내 세포융합에 사용한다.바람직한 면역세포로서, 특히 비세포(脾細胞)를 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서의 포유동물의 미엘로마세포로서는, 공지의 각각의 세포주, 예를 들면 P3(P3x63Ag8.653)(Kearny, J. F. et al.: J. Immnol., 123: 1548-1550, 1979), P3x63Ag8U.1(Yelton, D. E. et al.: Current Topics in Microbiology 81: 1-7, 1978), NS-1(Kohler, G. & Milstein, C.: Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976), MPC-11(Margulies, D. H. et al.: Cell, 8: 405-415, 1976), SP2/0(Shulman, M. et al.: Nature, 276: 269-270, 1978), F0(de St. Groth, S. F. & Scheidegger, D.: J. Immnol. Methods, 35: 1-21, 1980), S194(Trowbridge, I. S.: J. Exp. Med., 148: 313-323, 1978), R210(Galfre, G. et al.: Nature, 277: 131-133, 1979) 등이 바람직하다.

상기 면역세포와 미엘로마세포의 세포융합은, 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 밀스테인등의 방법(Galfre, G. & Milstein, C., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981) 등에 준하여 행할 수 있다. 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면, 세포융합촉진제의 존재하에 통상의 영양 배양액속에서 실시된다. 융합촉진제로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스 등이 사용되고, 또한, 융합효율을 높이기 위해, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가하여 사용할 수 있다.

면역세포와 미엘로마세포와의 사용비율은 예를 들면, 미엘로마세포에 대해, 면역세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 세포융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면, 미엘로마세포주에 바람직한 RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, 그 밖에, 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한,소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은, 면역세포와 미엘로마세포와의 소정량을 상기 배양액속에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG용액, 예를 들면, 평균분자량 1000∼6000 정도의 PEG용액을, 통상, 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하여, 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 계속해서, 적당한 배양액을 차차 첨가하고, 원심하여, 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써, 하이브리도마의 생육에 바람직하지 못한 세포융합제 등을 제거할 수 있다.

해당 하이브리도마는, 통상의 선택배양액, 예를 들면, HAT 배양액으로 배양함으로써 선택된다. 해당 HAT 배양액으로의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 몇일∼몇주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하여, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일클로닝이 행해진다.

또한, 본 발명에서는, 재조합 항체나 개변항체를 사용할 수 있다. 재조합 항체로서는 예를 들면, 단일클론항체로서, 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 삽입하여 이것을 숙주에 도입하여, 유전자 재조합 기술을 사용하여 산생시킨 재조합 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck, C. A. K. & Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publishedin the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). 개변항체로서는 예를 들면, 키메라항체, 인간형화항체를 사용할 수 있다. 키메라항체는, 인간항체 이외의 항체V영역을 코드화하는 DNA를 인간항체 C영역을 코드화하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 삽입하여 숙주에 도입하여, 산생시킴으로써 얻어진다(EP 125023, PCT WO96/02576).

본 발명에서 사용되는 항체는, MK에 결합하여 MK의 활성을 저해하는 한, 항체의 단편이나 수식물이더라도 좋다. 항체의 단편으로서는, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H사슬과 L사슬의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 시그날 체인(signal chain) Fv(scFv)를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, MK의 기능을 저해하는 물질로서, 항MK항체를 사용하는 경우의 사용형태는, 일반의 항체요법(예를 들면, 정주점적)에 준한다.

MK의 기능을 저해하는 화합물을 유효성분으로 하는 본 발명에 의한 약조성물은, 공지의 제제학적 제조법에 의해 제제화한 후에, 혈관내막 비후에 기인하는 질환 등의 예방 또는 치료를 목적으로 투여된다. 예를 들면, 약제로서 일반적으로 사용되는 적당한 담체 또는 매체, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 식물유(예, 참기름, 올리브유 등), 착색제, 유화제(예, 콜레스테롤), 현탁제(예, 아라비아고무), 계면활성제(예, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유계 계면활성제), 용해보조제(예, 인산나트륨), 안정제(예, 당, 당알코올, 알부민) 또는 보존제(파라벤) 등과 적절히 조합시켜, 생체에 효과적으로 투여하는데 적합한 주사제, 경비흡수제, 경피흡수제, 경구제 등의 의약용제제, 바람직하게는 주사제로 조제할 수 있다. 예를 들면, 주사제의 제제로서는, 동결건조품이나, 주사용수제, 침투압펌프에 봉입한 형 등으로 제공할 수 있다.

주사제는, 유효성분인 화합물을 적당한 분산제와 함께 용해, 분산매에 용해,또는 분산시킴으로써 얻을 수 있다. 분산매의 선택에 의해, 수성용제와 유성용제 어느 쪽의 제형으로 할 수도 있다. 수성용제로 하기 위해서는, 증류수, 생리식염수, 또는 링거액 등을 분산매로 한다. 유성용제로서는, 각종 식물유나 프로필렌글리콜 등을 분산매로 이용한다. 이 때, 필요에 따라 파라벤 등의 보존제를 첨가할 수도 있다. 또한 주사제중에는, 염화나트륨이나 포도당 등의 공지의 등장화제를 가할 수 있다. 더욱이, 염화벤잘코늄이나 염산프로카인과 같은 무통화제를 첨가할 수 있다.

경구투여용 정제는, 유효성분인 화합물에 부형제, 붕괴제, 결합제 및 활택제 등을 가하여 혼합하고, 압축 정형함으로써 제조할 수 있다. 부형제에는, 유당, 전분, 또는 만니톨 등이 일반적으로 사용된다. 붕괴제로서는, 탄산칼슘이나 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등이 일반적으로 사용된다. 결합제에는, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 폴리비닐피롤리돈이 사용된다. 활택제로서는, 탈크나 스테아린산마그네슘 등이 공지이다.

본 발명에 의한 의약조성물을 포함하는 정제는, 마스킹이나, 장용성제제로 하기 위해, 공지의 코팅을 행할 수 있다. 코팅제에는, 에틸셀룰로오스나 폴리옥시에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물에 있어서의 유효성분의 함유량은, 그 투여형태와 필요한 투여량을 토대로 결정된다. 예를들면, 경구의 경우, 통례 용인되는 1일 유효경구용량은, 항MK단백질항체로서, 약 0.1∼약 1000mg/일, 더 일반적으로는, 약 50∼약 200mg/일일 것이다.

본 발명은 혈관재협착의 예방, 또는 치료를 위한 화합물을 스크리닝하는 방법도 제공한다. MK의 기능저해를 통하여, 혈관재협착의 예방, 또는 치료효과가 달성되는 것으로부터, MK의 기능저해를 지표로 함으로써, 유효한 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. MK합성의 저해에 대해 후보화합물을 스크리닝할 수 있는 몇가지의 방법이 있다. 예를 들면, MK합성이 활발한 수 많은 세포계가 존재한다. 이들의 세포에 의해 산생되는 MK의 레벨은 예를 들면, 방사면역침강, 웨스턴흡입, RIA, 또는 ELISA에 의해 측정할 수 있다. MK 산생세포를 유효한 후보화합물로 처리함으로써, MK레벨의 감소가 야기된다.

또한, MK 활성을 직접 해석하는 것이 가능하다. 상술한 바와 같이, MK레벨이 상승한 세포계가 이용 가능하다. 이들 세포는, 또한, 연한천내(soft agar) 콜로니형성과 같은 이상한 거동에 의해 특징지어진다. 특히 내피세포 증식의 증가를 측정할 수 있어, 이것은 인 비보의 혈관형성을 위한 유용한 인비트로모델이다. 이러한 세포를 유효한 후보화합물로 처리함으로써, 세포의 거동변화가 생겨, 유용한 화합물을 동정하기 때문에 이용할 수 있다. 상술한 바와 같은 분석은, 체내의 혈관내피세포 증식을 위한 표준모델로서 유용하다. 선택된 후보화합물은, 동물모델계에서 인 비보의 효율 및 안전성을 시험할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 재협착모델의 제작

이하의 방법으로 래트 경동맥 balloon injury 모델을 제작했다.

15∼20주 연령의 웅성 위스터래트(체중:350∼400g)는, 복강내에 넨브탈 50mg/kg를 투여하여 마취했다. 래트의 사지를 고정판에 고정했다. 경부를 정중절개하여 외경동맥을 부출(部出)시켰다. 다음에, 총경동맥으로부터 내경동맥과 외경동맥으로 분기하는 부분의 외경동맥을, 두가닥의 실로 적당한 간격을 두고 일주시킨다. 원위부(遠位部)은 결찰하고, 근위부(近位部)은 결찰할 수 있도록 해둔다. 그리고, 두가닥의 실 사이의 외경동맥을 작게 절개했다. 이 절개부로부터, 2F 포거티(Fogarty)카테테르를 삽입하여, 총경동맥까지 카테테르를 진행시키고, 그 기시부(起始部)까지 더 진행시켰다. 그리고, 총경동맥의 기시부에서, 벌룬을 생리식염수로 조금 저항이 있을 만큼 부풀려, 그대로 회전시키면서 천천히 경동맥부분 기부(岐部)까지 벌룬을 되돌렸다. 벌룬을 수축시킨 후, 다시 카테테르를 기시부까지 진행시키고, 벌룬을 부풀려 되돌린다고 하는 조작을, 2회 더 반복했다. 이 조작에 의해 혈관내피가 박리되어, 중막평활근에 상해가 가해져, 비후 내막이 형성된다. 카테테르를 뽑는 동시에 가까운 위치의 부분의 실을 결찰했다. 수술부를 봉합하고, 래트 경동맥 balloon injury 모델(재협착모델)의 제작을 완료했다. 래트는 마취로부터 회복한 후, 개별의 케이지(cage)에 되돌렸다.

[실시예 2] 혈관내막 비후와 발현과의 해석

재협착모델을 사용하여, 내막 비후와 MK발현과의 관련을, 1) PCR, 2) 웨스턴흡입 및 3) 조직형태 관찰에 의해 해석했다.

(1) PCR에 의한 MK발현의 검출

대조군으로서 정상 래트(3마리), 재협착모델군으로서, 카테테르에 의한 상해 후, 3시간, 3일, 7일 및 14일 경과한 각 모델(각 3마리)을 설정했다.

(a) RT-PCR에 의한 혈관조직의 각 단백질 mRNA의 검출

대조군, 재협착모델군(3시간, 3일, 7일 및 14일경과)에 있어서의 혈관조직의 MK, PTN, Syndecan-1, Syndecan-3, Syndecan-4, RPTP-β 및 GAPDH(내부표준)의 mRNA 발현량을, RT-PCR에 의해 검출했다. 각 조직으로 mRNA를 조제하고, 이것을 출발재료로서 RT-PCR를 행했다. 프라이머는, 기지의 부분의 최적이라고 생각되는 부분을 선택하여 설정했다(구라보주식회사). 사용한 프라이머의 염기서열을 이하에 나타낸다.

MK 센스 프라이머

5'-gccggatccatgcagcaccgaggcttcttc3'(30mer)(서열번호:1)

MK 안티센스 프라이머

5'-actagcataatcaggaacatcatagtcctttccttttccttt-3'(42mer)(서열번호:2)

PTN 센스 프라이머

5'-actggtgccgagtgcaaacaa-3'(21mer)(서열번호:3)

PTN 안티센스 프라이머

5'-gagtttgccacagggcttgga-3'(21mer)(서열번호:4)

syndecan-1 센스 프라이머

5'-ggaggcacttctgtcatcaa-3'(20mer)(서열번호:5)

syndecan-1 안티센스 프라이머

5'-agcacttccttcctgtccaa-3'(20mer)(서열번호:6)

syndecan-3 센스 프라이머

5'-gatgagccagaggtgccagt-3'(20mer)(서열번호:7)

syndecan-3 안티센스 프라이머

5'-gccacctacgatcacagcta-3'(20mer)(서열번호:8)

syndecan-4(ryudocan) 센스 프라이머

5'-gaagacgctgggggccttgag-3'(21mer)(서열번호:9)

syndecan-4(ryudocan) 안티센스 프라이머

5'-tctgaggggacacggatgcca-3'(21mer)(서열번호:10)

RPTP-β 센스 프라이머

5'-atcggatccccgttctcaacacatccctgaat-3'(32mer)(서열번호:11)

RPTP-β 안티센스 프라이머

5'-cgtctcgagctaagcatctggagaaaatgtctc-3'(33mer)(서열번호:12)

GAPDH 센스 프라이머

5'-gaccacagtccatgccatcac-3'(21mer)(서열번호:13)

GAPDH 안티센스 프라이머

5'-gtagccgtattcattgtcatacc-3'(23mer)(서열번호:14)

PCR 반응은, 열변성: 94℃ 30초(1사이클째는 1분), 어닐링: 55℃ 30초, 신장반응: 72℃ 30초를 MK의 경우 28사이클, PTN의 경우 35사이클, Syndecan-1,3 및 4의 경우 33사이클, RPTP-β의 경우 35사이클, GAPDH의 경우 상기 모든 조건의 사이클을 반복했다. 이상의 RT-PCR의 결과를 도1의 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 나타낸다.

(b) 경합적 PCR(competive PCR)에 의한 MK mRNA의 정량

대조군, 재협착모델군(3시간, 3일, 7일 및 14일 경과)에 있어서의 혈관조직의 MK 및 GAPDH의 mRNA 발현량을, 경합적 PCR법에 의해 정량적으로 조사했다(도2의 a 및 b). 타겟 및 경합물의 밴드의 농도는 눈으로 직접 봐서 판정했다. 모두 위, 아래(target과 competitor) 2개의 밴드가 거의 동일한 농도의 것이, 각각 중앙에 위치하도록 늘여놓았다. MK에 대해서는, 대조군(C)에서 경합물의 카피수가 10⁷로 타겟과 동일했던 것이, 3시간 후에는 10⁶으로 오히려 감소하지만, 7일 후에는 10⁸으로 동일해져 증가하고 있다. 즉, MK에서는 7일 후에는 대조군의 약 10배량의 mRNA가 발현되고 있는 것이 인정되었다. 이것에 대해, GAPDH에서는 대조군(C), 3시간 후, 3일 후, 7일 후, 14일 후의 모두에 있어서 10⁵로 동량으로, 해석에 사용한 각 샘플간 전체 RNA양에 격차가 없는 것이 인정되었다.

(2) 웨스턴흡입 해석

대조군으로서 정상 래트(2마리), 재협착모델군으로서, 카테테르에 의한 상해 후, 3일, 7일 및 14일 경과한 각 모델(각 2마리)을 설정했다.

혈관조직에서의 MK단백 발현량을 웨스턴흡입법 의해 해석했다(도3). 도3으로부터, 재협착모델 제작 후 3시간 경과에 있어서는, MK단백 발현량은, 대조군과 차이가 인정되지 않지만, 7일 경과에 있어서는, MK 발현량은 최대가 되고, 14일 경과에 있어서는, 발현량은 감소하고 있지만, 또한, 대조군에 비교하여 MK단백 발현량의 증가가 인정된다.

(3) 조직형태의 해석

대조군으로서 정상 래트(3마리), 재협착모델군으로서, 카테테르에 의한 상해 후, 3일(3마리), 7일(4마리) 및 14일 경과(3마리)한 각 모델을 설정했다.

(a) 헤마톡시린 ·에오신염색

4% 파라포름알데히드(와코쥰야쿠공업주식회사) 고정액을 사용하여 혈관조직 조각을 제작했다. 전자동 포매기를 사용하여 파라핀포매 후, 5㎛ 조각을 제작하여, 헤마톡시린 ·에오신염색(이하, H.E 염색이라 칭함)했다(도4a, b 및 c). a는 대조군에 있어서의 H.E도를, b는 카테테르에 의한 상해 후 14일 경과에 있어서의 H.E도를, c는 a의 확대도를, 각각 나타낸다. 도로부터 명백한 바와 같이, 대조군에 있어서는, 내막의 비후가 인정되지 않았던 것에 비해, 카테테르에 의한 상해 후 14일 경과한 재협착모델에 있어서는, 현저한 비후가 관찰되었다.

(b) 면역조직화학

카테테르에 의한 상해 후 14일 경과에 있어서의 혈관조직 조각을, 항MK 다중클론항체 및 2차항체로서 항토끼 IgG항체(Jackson laboratory)를 사용하여 면역조직 화학염색했다(도5). 도로부터 명백한 바와 같이, 신생내막부분에 두드러진 MK단백질의 발현이 인정된다.

[실시예 3] MK 녹아웃 마우스의 혈관내막신생에 대한 MK의 영향

재협착과 MK발현과의 관련을, 보다 인 비보에 가까운 상태로 조사하기 위해,MK유전자 녹아웃 마우스를 사용하여, 혈관내막의 신생에 대한 MK의 영향을 조사했다. MK는, 특개평9-95454의 실시예에 기재된 방법으로 제작한 MK를 사용했다.

MK 녹아웃 마우스는, MK유전자의 엑손2의 일부와 3의 일부를 파괴한 녹아웃 마우스(Homo)(Gene Cells, 1998 Dec ; 3(12) : 811-822)(129/Sv계, 10∼12주 연령의 웅성(25∼30g))를 사용했다.

야생형 마우스(129/Sv계, 10∼12주 연령의 웅성(25∼30g))(10마리), MK 녹아웃 마우스(10마리), MK 녹아웃 마우스(생리식염수 주입펌프 삽입)(10마리), MK 녹아웃 마우스(MK 주입펌프 삽입)(10마리)의 4군을 설정했다.

각 군은, 넨브탈 50mg/kg을 마우스의 복강내에 투여하여, 마취를 걸었다. 마우스는, 총경동맥 분기부를 결찰하여, 신생내막형성모델을 제작했다. 마우스는 상대적으로 혈압이 높은 때문인지, 혈전에 의한 완전폐색은 일어나기 어렵고, 압부하에 의한 자극으로 신생내막이 형성된다(Arterioscler Thromb Vasc Biol.1997; 17:2238-2244).

신생내막을 병리학적으로 해석한 바, 야생형 마우스의 신생내막이, MK 녹아웃 마우스의 신생내막에 비해, 현저히 증대되어 있는 것이 관찰되었다. 이들 결과와 실시예 1의 결과로부터, MK가 혈관신생내막형성에 관여하고 있을 가능성이 추찰되었다.

따라서, MK 녹아웃 마우스를, MK 투여군과 생리식염수투여군(대조군)의 2군(1군 10마리)으로 나눠, 신생내막형성모델을 제작했다. MK 0.8mg/mL를 100μL 주입한 펌프(Micro-Osmotic Pump"alet-MODEL 10070":alza; 0.5μL/hr.로 7일간 유효), 또는 생리식염수를 주입한 펌프를 마우스 복부피하에 삽입하고, 7일째에 교환, 14일째까지 유치한 후, 도살하여 혈관내막의 형성상태를 해석했다.

혈관은, 4% 파라포름알데히드(와코쥰야쿠공업주식회사)로 고정했다. 전자동 포매기를 사용하여 파라핀포매 후, 5㎛ 조각을 제작하고, H.E.염색하여 관찰했다. 그 결과, MK투여군은 신생내막이 대조군에 비해 지나치게 형성되어 있었다. 이 결과에 의해, MK가 혈관확장술후 재협착에 관여하고 있는 것이, 녹아웃 마우스를 사용한 인 비보 실험으로 간접적으로 증명되었다.

본 발명에 의한 의약조성물의 투여에 의해, 동맥경화나 PTCA술후의 혈관재협착에 기인하는 혈관의 협착증상이 효과적으로 예방된다. 또는 본 발명의 의약조성물은, 진행된 혈관의 협착증상을 완화하기 위한 치료용도에 있어서도 유용하다.

Claims

MK의 기능을 저해하는 화합물을 주성분으로서 포함하는, 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물.
제1항에 있어서, MK의 기능을 저해하는 화합물이, MK유전자로부터 전사된 한가닥 사슬 mRNA의 세그먼트에 결합하여 세포내의 MK단백질합성을 저해하는 안티센스 올리고누클레오티드인 의약조성물.
제1항에 있어서, MK의 기능을 저해하는 화합물이, MK단백질에 대한 항체, 또는 그 가변영역을 포함하는 단편인 의약조성물.
제1항에 있어서, 혈관협착이 동맥효과 및 PTCA술후의 혈관재협착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 원인에 의한 것인 의약조성물.
다음 공정을 포함하는 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.

(a) MK 발현세포를 후보화합물과 접촉시키는 공정

(b) MK의 기능을 저해하는 화합물을 선택하는 공정
제5항의 방법에 의해서 선택된 화합물을 유효성분으로서 포함하는 혈관협착의 예방, 또는 치료를 위한 의약조성물.