JP3553655B2 - ポリペプチドの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はミッドカインファミリーに属するポリペプチド、特にヒトミッドカイン（ＭＫ）ポリペプチドおよびそのペプチド断片、並びにヒトプレイオトロフィン（ＰＴＮ）ポリペプチドのペプチド断片の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは先に、レチノイン酸支配下において、細胞の分化・増殖をコントロールする因子として、マウス由来ＭＫポリペプチド（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（ＢＢＲＣ），１５１，１３１２（１９８８）およびＴｏｍｏｍｕｒａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１０７６５（１９９０））およびヒト由来ＭＫポリペプチド（特開平５−９１８８０）を見出してきた。
【０００３】
そしてＭＫが神経細胞の生存および神経突起伸長の２つの活性を持つ神経栄養因子であること、またＭＫが発癌、アルツハイマー病発症とのかかわりがあることがその後の研究により明らかにされた（村松 喬：レチノイン酸応答性のヘパリン結合性成長因子、ミッドカイン（ＭＫ）−発生分化、がん、神経とのかかわりで−；生化学第６５巻第１２号、１４９４〜１５０４頁、１９９３年１２月。特開平６−１７２２１８）。
【０００４】
またＭＫに引き続いてＭＫと５０％のアミノ酸相同性を有するｈｅｐａｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＨＢ−ＧＡＭ）（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．＆ Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６７２１−１６７２４，（１９９０））あるいはプレイオトロピン、ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＰＴＮ）（Ｌｉ，Ｙ．−Ｓ．，Ｍｉｌｎｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｇｈａｕｈａｎ，Ａ．Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｄｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．，＆ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１６９０−１６９４，（１９９０））、またＭＫと６５％のアミノ酸相同性を有するｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＩ−ＨＢ）（Ｕｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，１７５，６１７−６２４（１９９１））と呼ばれる分子が発見され、ＭＫファミリーポリペプチド（蛋白質）に属するものであることが、わかってきた。ＨＢ−ＧＡＭ／ＰＴＮは神経突起伸長作用を持つ他、内皮細胞の増殖刺激作用を有することが報告されている（Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，８，２９３３−２９４１（１９８９），Ｗｅｌｌｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５８２−２５８７（１９９２），Ｃｏｕｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ，１８０，１４５−１５１（１９９０））。
【０００５】
本発明者らはまたＭＫポリペプチド、ＰＴＮポリペプチドなどＭＫファミリーに属するポリペプチドなどを有効成分とする、心筋梗塞、血栓等の予防・治療剤を提供した（特願平６−１７１３７７）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＭＫファミリーポリペプチドを医薬、診断薬、試薬として使用する際には、純度の高い原末を大量に調製することが必要である。そのためには大腸菌、酵母などにおいて組み換えＤＮＡを用いた遺伝子工学的手法で、ＭＫ、ＰＴＮを製造することができる。一方、ＭＫファミリーポリペプチドを化学的に、あるいは一部酵素合成法を併用して、全化学合成することも考えうるが、実際に実施され成功したという報告はこれまでになく、ＭＫポリペプチドの全化学合成法の確立が期待されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今日、ペプチドを合成するためには、非常に多くの方法が知られている。特に固相法という便利な方法があり、それを使えば殆どどんなペプチドでも合成できるのは事実である。しかし合成すべきペプチドの分子量が大きくなりアミノ酸数が１００個以上のポリペプチド、蛋白質の場合、これらを純粋な型で合成するのはいくら固相法による合成技術が発達したとはいえ、非常な困難を伴なうのは周知のとうりである。
【０００８】
固相法では、各アミノ酸の縮合反応を自動的に進行させることができるため、ペプチド鎖の延長に要する時間を大幅に短縮することができる。しかし一方で中間体を精製することが出来ないため、合成途上に生成した副生物はすべて最終生成物中に混入するという理論的な欠点をもっている。
【０００９】
その意味から蛋白質のように分子量の大きいものを合成する場合に、副生物の生成を抑えようと思えばやはり液相法によるセグメント縮合法で目的物を注意深く合成するのが理想的である。その場合、それぞれのセグメントは構成アミノ酸１０個前後になるように分割して合成し、それぞれを十分に精製したのち適当な溶媒中で注意深く縮合させる必要がある。
【００１０】
これらの方法で蛋白質を合成するためにはさらにいくつかの条件を満たす必要がある。第一は各セグメントにある全ての官能基を保護しながら、Ｃ末端にあるカルボン酸の保護基のみを遊離させることである。第二はＣ末端の遊離カルボキシル基とアミン成分の遊離アミノ基とをラセミ化させることなく、縮合させる技術を確立することである。最後に重要なことは、各セグメントをよく溶かし、しかもうまく反応させうるような溶媒系を見いだすことである。
【００１１】
これらの条件を満たすものとして、Ｃ末端のカルボン酸の保護基としてフエナシルエステル（Ｐａｃ）の使用と各セグメント合成に適当な溶媒中、例えばＤＭＦ，ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の存在下にて水溶液カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を用いる縮合法がある。このようにセグメント合成が終了したのち各セグメントは遊離のカルボン酸に導く必要があるが、その時にもそれらセグメントを溶かす適当な溶媒が必要になる。もしそのセグメントが酢酸によく溶けるのであれば問題ないが、溶けない場合に有効な溶媒としてジクロルメタンとトリフルオロエタノールの混合溶媒（３：１）が良い。そしてこの溶媒中ギ酸アンモニウム（３０当量）と亜鉛末（５０ｅｑ）を用いて室温中反応すればＣ末端のフエナシルエステルは容易に切断され、目的とする遊離のカルボン酸をもったセグメントが得られる。最後に各セグメントどうしの縮合には溶解度に問題がない場合は、ＤＭＦやＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン中、カルボキシル成分のＣ末端がグリシンやプロリンの時は、ＨＯＢｔ存在下ＷＳＣＩ、それ以外の場合は、ＨＯＯＢｔ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）存在下、ＷＳＣＩによる縮合が良い。
【００１２】
一方、溶解度が悪いセグメントの縮合には、クロロホルムとトリフルオロエタノールの混合溶媒（３：１）中ＨＯＯＢｔ存在下ＷＳＣＩで縮合させることができる。このようにして合成した保護基のついたペプチドは、無水フッ化水素（ＨＦ）でシステインの保護基として用いたＡｃｍ（アセトアミドメチル）基以外の全ての保護基を除去してＡｃｍ基のついた遊離ペプチドとすることができる。残りのＡｃｍ基は酢酸第二水銀を用いて５０％酢酸中室温で処理することにより遊離システインを含むペプチドが得られる。この全ての保護基が除去されたペプチドを適当なＢｕｆｆｅｒ中で環化反応を行なうことにより目的とする複数のジスルフィド結合を有するポリペプチドが得られる。
【００１３】
以上の方法を用いて実施例に示すようなヒトＭＫの全合成を行なうことができた。
【００１４】
ヒトＭＫの全合成にあたり、各セグメントの合成は問題なく行なうことが出来たが、セグメントのＣ末端フエナシル基の脱離の際セグメント、特に８４−９３，６０−７０，４１−５１，１２−２２および１−１１が酢酸に全く溶けなかった。しかしこれらは上記の混合溶媒（シクロルメタン／トリフルオロエタノール）を用いることにより容易に溶解し、その後の脱フエナシル化反応も容易に行なうことができた。
【００１５】
Ｎ−ｈａｌｆ（１−５５）およびＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１）の合成は各セグメントをＣ端より順次縮合させることにより行なった。しかしこの縮合反応の際にも溶解度に問題が生じた。８４−９３と９４−１２１あるいは１２−２２と２３−５９の縮合時これらは非常に難溶となったため、混合溶媒（クロロホルム／トリフルオロエタノール）の使用が不可欠となった。よってそれ以後の縮合は全て混合溶媒を使用して行なった。最終の１−５９と６０−１２１の縮合も同様最も溶解力の強いＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）にも不溶であったが上記混合溶媒を用いることにより容易に縮合反応を行なうことができた。
【００１６】
得られた保護基のついたＮ−ｈａｌｆ（１−５９）、Ｃ−ｈａｌｆ（６０−１２１）およびヒトミッドカイン（１−１２１）を常法どうりＨＦ処理しそれぞれ（６Ａｃｍ）、（４Ａｃｍ）、（１０Ａｃｍ）の入ったペプチドとした。これらを酢酸水銀処理して、Ａｃｍ基を除去したのちジスルフィド結合形式反応に供した。この反応には種々の条件検討を行なったところ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 存在の５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．７）のｂｕｆｆｅｒ中で酸化還元型のグルタチオンをペプチドに対して１：１０：１００の割合で加え５℃で行なうことが至適条件となることが分った。以上のようにＮ−ｈａｌｆ、Ｃ−ｈａｌｆヒトＭＫの合成を行なうことができた。同様にして、Ｃ−ｈａｌｆＰＴＮペプチド断片も合成することができた。
【００１７】
このようにして全化学合成したヒトＭＫは、天然由来の本発明者が別途調製したＭＫと、神経突起伸展作用、プラスミノーゲンアクチベーター誘導活性、ヘパリン結合活性などの生物活性において、同等の活性を有することが明らかにされた。またＭＫ、ＰＴＮなどのそれぞれＣ−ｈａｌｆ断片ペプチドにこれら生物活性が局在していることも示された。
【００１８】
以下本発明を実施例、実験例をもって、更に具体的に説明するが、もとより本発明はこれら記載に限られるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
ヒト型ｈ−Ｍｉｄｋｉｎｅの合成
保護ペプチド（１−１２１）の合成はアミノ酸１２１個からなるペプチドを液相法にて図１および図２に示すように、１３個のフラグメント（１−１１）（１２−２２）（２３−３１）（３２−４０）（４１−５１）（５２−５９）（６０−７０）（７１−７７）（７８−８３）（８４−９３）（９４−１０３）（１０４−１１２）（１１３−１２１）に分割、合成した。各フラグメントの純度はＴＬＣ，ＨＰＬＣ，アミノ酸分析により確認した。この後Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）［ｈＭＫ−Ｎと略す。］とＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１［ｈＭＫ−Ｃと略す。］を合成するべくそれぞれＣ末から順次縮合した。各フラグメントの合成およびフラグメント縮合には全てＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法またはＷＳＣＩ／ＨＯＯＢｔ法を用いた。（ＷＳＣＩ：１−ｅｔｈｙ１−３，（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＨＯＯＢｔ：３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏ−１，２，３−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ）。
【００２０】
アミノ酸のＮ末はＢｏｃ基で保護し、アミノ酸側鎖保護基にはそれぞれＡｓｐ（ＯｃＨｅｘ），Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ），Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｌｙｓ（ＣｌＺ），Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｔｙｒ（ＢｒＺ），Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）、そしてＣｙｓの保護基にはＡｃｍ基を用いた。その他Ｃ末保護基にはＢｚｌ基、各フラグメントのＣ末にはＰａｃ基を用いて合成した。（ＣＨｅｘ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ），（Ｂｚｌ：ｂｅｎｚｙｌ），（ＣｌＺ：ｚ−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），（Ｔｏｓ：ｓｙｌ），（ＢｒＺ：２−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），Ｆｏｒ（ｆｏｒｍｙｌ），Ａｃｍ（ａｃｅｔａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ），（Ｐａｃ：Ｐｈｅｎａｃｙｌ ｅｓｔｅｒ）。
【００２１】
保護ペプチド（１−１２１）３ｇをＨｉｇｈ−ＨＦ（ＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１，０〜−５℃，１ｈ）で次いでＬｏｗ−ＨＦ（ＨＦ／Ｂｕｔａｎｅｄｉｔｉｏｌ＝７／３，０〜−５℃，３０ｍｉｎ）で処理し１．９ｇの粗製品を得た。この粗製品１．９ｇをＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から６０％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。
【００２２】
ＣＨ３ ＣＮ濃度３０−３２．２％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して４２０ｍｇのペプチドを得た。この４２０ｍｇのペプチドをＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（３．７×１７ｃｍ）に注入しｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．７ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ６）各１．２５Ｌの単一濃度勾配条件で溶出した。１５ｇずつ分画し０．４８−０．５３Ｍ塩濃度画分（５６本目から６５本目）を集め溶液のｐＨを酢酸で下げ、そのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。
【００２３】
前述同様溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１４％から４４％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．５−２９．２％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して１２５ｍｇの１０Ａｃｍペプチドを得た。
【００２４】
このうち９０ｍｇを０．５ｍＭペプチド濃度になるように５０％ＡｃＯＨで溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え窒素雰囲気下室温で２時間かき混ぜた。その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜた。反応液をＧ−２５のゲルろ過クロマトグラム（１．１５×７３ｃｍ）に注入し、５％ＡｃＯＨで溶出した後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。
【００２５】
ＳＨペプチド４５ｍｇ（３．４μＭ）を１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液、３．４Ｌ（１×１０−６ＭＣｏｎｃ．）に溶かし５℃で４日間かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相のカラム（ＹＭＣ−Ｃ４，２０×２５０ｍｍ）に注入し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００２６】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２９．４−２９．８％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して５ｍｇのペプチドを得た。
【００２７】
ＳＳ結合架橋様式は、トリプシン消化後逆相ＨＰＬＣで分取した各ピークについて質量分析およびアミノ酸分析により、天然型と同じであることを確認した。最終品の純度に関して逆相ＨＰＬＣのみならずキャピラリー電気泳動の検査でもシングルピークを与えた。
【００２８】
またアミノ酸分析値および質量分析値も理論値と良く一致した。ｈＭＫはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１４．３ｍｉｎに溶出した。
【００２９】
質量分析値；１３２４１．２［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ７．５２（８），Ｔｈｒ９．５１（１０），Ｓｅｒ２．８６（３），Ｇｌｕｌ１．１２（１１），Ｇｌｙ１６．００（１６），Ａｌａ１０．７３（１０），Ｃｙｓ９．１７（１０），Ｖａ１４．８７（５），Ｉｌｅ１．８３（２），Ｌｅｕ１．０２（１），Ｔｙｒ２．０１（２），Ｐｈｅ３．０１（３），Ｌｙｓ２３．３２（２３），Ｔｒｐ３．８６（４），Ａｒｇ６．９０（７），Ｐｒｏ５．９８（６）。
【００３０】
実施例２
ｈＭＫ−Ｎ（Ｎ−ｈａｌｆ）の合成
ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦ、およびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ６）各６００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶出した。
【００３１】
１５ｇずつ分画し０．３４−０．３８Ｍ塩濃度画分（１４本目から１８本目）を集め溶液のｐＨをＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から４５％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．１−２８．９％の分画を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して７０ｍｇの６Ａｃｍペプチドを得た。
【００３２】
ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド５０ｍｇを５０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％ＡｃＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド４０ｍｇを得た。
【００３３】
ＳＨペプチド４０ｍｇ（６．１８μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液６１８ｍｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後逆相のカラムＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２９．１−２５．５％の画分を集め減圧濃縮後凍結乾燥してｈＭＫ−Ｎ１５ｍｇを得た。
【００３４】
ｈＭＫ−ＮはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．９ｍｉｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００３５】
質量分析値；６４７０．４［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ２．８８（３），Ｓｅｒ２．８１（３），Ｇｌｕ６．０８（６），Ｇｌｙ９．００（９），Ａｌａ３．１６（３），Ｃｙｓ５．８３（６），Ｖａ１２．９１（３），Ｉｌｅ０．９４（１），Ｐｈｅ２．２４（２），Ｌｙｓ９．２６（９），Ｔｒｐ２．７８（３），Ａｒｇ４．００（４），Ｐｒｏ４．０８（４）。
【００３６】
実施例３
ｈＭＫ−Ｃ（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成
ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦおよびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ５），ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ６）各８００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶出した。
【００３７】
２０ｇずつ分画し０．３８−０．４２Ｍ塩濃度画分（３８本目から４２本目）を集め、溶液のｐＨをＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から２５％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２２．０−２４．５％の分画を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して１１０ｍｇの４Ａｃｍペプチドを得た。
【００３８】
ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド１１０ｍｇを５０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え、窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％ＡｃＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。
【００３９】
ＳＨペプチド６５ｍｇ（９．６μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＡ ＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液９６０ｍｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１２％から２２％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２５．１−２５．５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して４５ｍｇのペプチドを得た。
【００４０】
ｈＭＫ−ＣはＯＤＳカラム、（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．５ｍｉｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００４１】
質量分析値；６７８９．９［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ４．７１（５），Ｔｈｒ６．５９（６），Ｇｌｕ５．０４（５），Ｇｌｙ７．００（７），Ａｌａ７．２６（７），Ｃｙｓ３．８０（４），Ｖａｌ１．９７（２），Ｉｌｅ０．８８（１），Ｌｅｕ０．９６（１），Ｔｙｒ１．９２（２），Ｐｈｅ０．９９（１），Ｌｙｓ１４．００（１４），Ｔｒｐ０．８７（１），Ａｒｇ２．８６（３），Ｐｒｏ１．８６（２）。
【００４２】
実施例４
ｈＭＫ（６２−１０４）（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成
固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈＭＫ（６２−１０４）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢｚｌを用いた以外は同じ保護基を使用した。保護ペプチド樹脂１．７ｇをＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製品７００ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１００分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２５．３−２６．８％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して６０ｍｇのＳＨペプチドを得た。
【００４３】
ＳＨペプチド６０ｍｇ（１２．３μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし、室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度５％から４０％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｍ、カラム温度は室温で溶出した。
【００４４】
ＣＨ３ ＣＮ濃度３０．３−３０．６％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（６２−１０４）３０ｍｇを得た。ｈＭＫ（６２−１０４）はＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用いＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１８．５ｍｉｎに溶出した。
【００４５】
純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００４６】
質量分析値；４８３６．２［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ４．６２（５），Ｇｌｕ５．２２（５），Ｇｌｙ４．９３（５），Ａｌａ３．１７（３），Ｃｙｓ３．４９（４），Ｖａｌ１．９６（２），Ｉｌｅ０．８８（１），Ｌｅｕ１．０５（１），Ｔｙｒ１．９８（２），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｌｙｓ６．１１（６），Ｔｒｐ０．８６（１），Ａｒｇ３．００（３），Ｐｒｏ０．９９（１）。
【００４７】
実施例５
ｈＭＫ（１０４−１２１）の合成
ｈＭＫのフラグメント（１０４−１１２）と（１１３−１２１）を縮合させて合成した保護ペプチド１００ｍｇをＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製品８０ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５ｍｍ）で分取した。
【００４８】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度３％から１８％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度１０．２５−１１．２５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（１０４−１２１）６０ｍｇを得た。
【００４９】
ｈＭＫ（１０４−１２１）ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１０．９ｍｉｎに溶出した。純度に関して逆相ＨＰＬＣでシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値ま理論値に良く一致した。
【００５０】
質量分析値；１９６０．４［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ１．００（１），Ｔｈｒ２．００（２），Ｇｌｙ１．９８（２），Ａｌａ３．０１（３），Ｃｙｓ０．６８（１），Ｌｙｓ８．０６（８），Ｐｒｏ０．９９（１）。
【００５１】
実施例６
ヒト型ｈ−ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ（６７−１０９）の合成
固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈＰＴＮ（６７−１０９）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢｚｌ、Ｈｉｓの保護基にＢｏｍを用いた以外は同じ保護基を使用した）１．５ｇにＣｙｓ３０当量を加え、ＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜−５℃、１ｈ処理し、得られた粗製品１．５７ｇ（Ｃｙｓを含む）を逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００５２】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１００分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２４．５−２５．６％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥してＳＨペプチド５０ｍｇを得た。
【００５３】
ＳＨペプチド５０ｍｇ（１２．３μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００５４】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度５％から４０％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。
【００５５】
ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．５−２９．３％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＰＴＮ（６７−１０９）３０ｍｇを得た。ｈＰＴＮ（６７−１０９）はＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１７．３ｍｉｎに溶出した。
【００５６】
純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００５７】
質量分析値；４８４０．５［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．９８（３），Ｔｈｒ４．７５（５），Ｓｅｒ１．８７（２），Ｇｌｕ５．１０（５），Ｇｌｙ２．００（２），Ａｌａ４．０６（４），Ｃｙｓ３．６０（４），Ｖａｌ０．９７（１），Ｉｌｅ０．９１（１），Ｌｅｕ３．９５（４），Ｔｙｒ０．９６（１），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｈｉｓ０．９７（１），Ｌｙｓ５．１０（５），Ｔｒｐ０．８５（１），Ａｒｇ１．９８（２），Ｐｒｏ０．９７（１）。
【００５８】
実験例１ 細胞内ＰＡ活性測定
ウシ大動脈由来血管内皮細胞を１０％ウシ血清（ＢＳＡ）を含むαＭＥＭ内に分離し、培養した。９６穴培養プレートに細胞をまきコンフルエントになるまで培養後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生食液（ＰＢＳ）で洗い、０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの無血清αＭＥＭ（αＭＥＭ−ＢＳＡ）中で培養を行った。
【００５９】
この１００μｌの培地中に種々の濃度のＭＫポリペプチドや断片ペプチドまた対照のレチノールを添加し、それら薬剤によるＰＡ生産・誘導能を測定した。 各培養時間ごとに、培養上清をアスピレートし、培養細胞をＰＢＳで洗い、細胞内ＰＡを０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）緩衝液１００μｌ中に抽出し、抽出液中のＰＡレベルは１２５ Ｉ−ラベルフィブリンプレート（Ｃｒｏｓｓ．，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５，９７４−９８１（１９８２））を用いて測定した。
【００６０】
ＰＡ活性はサンプル中のｍｇタンパクあたりのＵＫ単位（Ｕ）で表わした。蛋白濃度はＢＳＡを標準として、マイクロタイタープレートＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により測定した。１８時間培養後、未添加の対照に対してレチノール２μＭの添加で１．５倍のＰＡ活性レベルとなった。
【００６１】
レコンビナントＭＫ、化学合成ＭＫ、Ｃ−ｈａｌｆ ＭＫなどは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、対照に比べて、３倍から１５倍のＰＡ活性が見られた。他方ＭＫ自身はプラスミン活性を持たないことおよびプラスミノーゲンを直接に活性化することはないことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】保護されたミッドカイン（１−５９）の合成図
【図２】保護されたミッドカイン（６０−１２１）の合成図
【産業上の利用分野】
本発明はミッドカインファミリーに属するポリペプチド、特にヒトミッドカイン（ＭＫ）ポリペプチドおよびそのペプチド断片、並びにヒトプレイオトロフィン（ＰＴＮ）ポリペプチドのペプチド断片の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは先に、レチノイン酸支配下において、細胞の分化・増殖をコントロールする因子として、マウス由来ＭＫポリペプチド（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（ＢＢＲＣ），１５１，１３１２（１９８８）およびＴｏｍｏｍｕｒａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１０７６５（１９９０））およびヒト由来ＭＫポリペプチド（特開平５−９１８８０）を見出してきた。
【０００３】
そしてＭＫが神経細胞の生存および神経突起伸長の２つの活性を持つ神経栄養因子であること、またＭＫが発癌、アルツハイマー病発症とのかかわりがあることがその後の研究により明らかにされた（村松 喬：レチノイン酸応答性のヘパリン結合性成長因子、ミッドカイン（ＭＫ）−発生分化、がん、神経とのかかわりで−；生化学第６５巻第１２号、１４９４〜１５０４頁、１９９３年１２月。特開平６−１７２２１８）。
【０００４】
またＭＫに引き続いてＭＫと５０％のアミノ酸相同性を有するｈｅｐａｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＨＢ−ＧＡＭ）（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．＆ Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６７２１−１６７２４，（１９９０））あるいはプレイオトロピン、ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＰＴＮ）（Ｌｉ，Ｙ．−Ｓ．，Ｍｉｌｎｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｇｈａｕｈａｎ，Ａ．Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｄｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．，＆ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１６９０−１６９４，（１９９０））、またＭＫと６５％のアミノ酸相同性を有するｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＩ−ＨＢ）（Ｕｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，１７５，６１７−６２４（１９９１））と呼ばれる分子が発見され、ＭＫファミリーポリペプチド（蛋白質）に属するものであることが、わかってきた。ＨＢ−ＧＡＭ／ＰＴＮは神経突起伸長作用を持つ他、内皮細胞の増殖刺激作用を有することが報告されている（Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，８，２９３３−２９４１（１９８９），Ｗｅｌｌｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５８２−２５８７（１９９２），Ｃｏｕｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ，１８０，１４５−１５１（１９９０））。
【０００５】
本発明者らはまたＭＫポリペプチド、ＰＴＮポリペプチドなどＭＫファミリーに属するポリペプチドなどを有効成分とする、心筋梗塞、血栓等の予防・治療剤を提供した（特願平６−１７１３７７）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＭＫファミリーポリペプチドを医薬、診断薬、試薬として使用する際には、純度の高い原末を大量に調製することが必要である。そのためには大腸菌、酵母などにおいて組み換えＤＮＡを用いた遺伝子工学的手法で、ＭＫ、ＰＴＮを製造することができる。一方、ＭＫファミリーポリペプチドを化学的に、あるいは一部酵素合成法を併用して、全化学合成することも考えうるが、実際に実施され成功したという報告はこれまでになく、ＭＫポリペプチドの全化学合成法の確立が期待されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今日、ペプチドを合成するためには、非常に多くの方法が知られている。特に固相法という便利な方法があり、それを使えば殆どどんなペプチドでも合成できるのは事実である。しかし合成すべきペプチドの分子量が大きくなりアミノ酸数が１００個以上のポリペプチド、蛋白質の場合、これらを純粋な型で合成するのはいくら固相法による合成技術が発達したとはいえ、非常な困難を伴なうのは周知のとうりである。
【０００８】
固相法では、各アミノ酸の縮合反応を自動的に進行させることができるため、ペプチド鎖の延長に要する時間を大幅に短縮することができる。しかし一方で中間体を精製することが出来ないため、合成途上に生成した副生物はすべて最終生成物中に混入するという理論的な欠点をもっている。
【０００９】
その意味から蛋白質のように分子量の大きいものを合成する場合に、副生物の生成を抑えようと思えばやはり液相法によるセグメント縮合法で目的物を注意深く合成するのが理想的である。その場合、それぞれのセグメントは構成アミノ酸１０個前後になるように分割して合成し、それぞれを十分に精製したのち適当な溶媒中で注意深く縮合させる必要がある。
【００１０】
これらの方法で蛋白質を合成するためにはさらにいくつかの条件を満たす必要がある。第一は各セグメントにある全ての官能基を保護しながら、Ｃ末端にあるカルボン酸の保護基のみを遊離させることである。第二はＣ末端の遊離カルボキシル基とアミン成分の遊離アミノ基とをラセミ化させることなく、縮合させる技術を確立することである。最後に重要なことは、各セグメントをよく溶かし、しかもうまく反応させうるような溶媒系を見いだすことである。
【００１１】
これらの条件を満たすものとして、Ｃ末端のカルボン酸の保護基としてフエナシルエステル（Ｐａｃ）の使用と各セグメント合成に適当な溶媒中、例えばＤＭＦ，ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の存在下にて水溶液カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を用いる縮合法がある。このようにセグメント合成が終了したのち各セグメントは遊離のカルボン酸に導く必要があるが、その時にもそれらセグメントを溶かす適当な溶媒が必要になる。もしそのセグメントが酢酸によく溶けるのであれば問題ないが、溶けない場合に有効な溶媒としてジクロルメタンとトリフルオロエタノールの混合溶媒（３：１）が良い。そしてこの溶媒中ギ酸アンモニウム（３０当量）と亜鉛末（５０ｅｑ）を用いて室温中反応すればＣ末端のフエナシルエステルは容易に切断され、目的とする遊離のカルボン酸をもったセグメントが得られる。最後に各セグメントどうしの縮合には溶解度に問題がない場合は、ＤＭＦやＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン中、カルボキシル成分のＣ末端がグリシンやプロリンの時は、ＨＯＢｔ存在下ＷＳＣＩ、それ以外の場合は、ＨＯＯＢｔ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）存在下、ＷＳＣＩによる縮合が良い。
【００１２】
一方、溶解度が悪いセグメントの縮合には、クロロホルムとトリフルオロエタノールの混合溶媒（３：１）中ＨＯＯＢｔ存在下ＷＳＣＩで縮合させることができる。このようにして合成した保護基のついたペプチドは、無水フッ化水素（ＨＦ）でシステインの保護基として用いたＡｃｍ（アセトアミドメチル）基以外の全ての保護基を除去してＡｃｍ基のついた遊離ペプチドとすることができる。残りのＡｃｍ基は酢酸第二水銀を用いて５０％酢酸中室温で処理することにより遊離システインを含むペプチドが得られる。この全ての保護基が除去されたペプチドを適当なＢｕｆｆｅｒ中で環化反応を行なうことにより目的とする複数のジスルフィド結合を有するポリペプチドが得られる。
【００１３】
以上の方法を用いて実施例に示すようなヒトＭＫの全合成を行なうことができた。
【００１４】
ヒトＭＫの全合成にあたり、各セグメントの合成は問題なく行なうことが出来たが、セグメントのＣ末端フエナシル基の脱離の際セグメント、特に８４−９３，６０−７０，４１−５１，１２−２２および１−１１が酢酸に全く溶けなかった。しかしこれらは上記の混合溶媒（シクロルメタン／トリフルオロエタノール）を用いることにより容易に溶解し、その後の脱フエナシル化反応も容易に行なうことができた。
【００１５】
Ｎ−ｈａｌｆ（１−５５）およびＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１）の合成は各セグメントをＣ端より順次縮合させることにより行なった。しかしこの縮合反応の際にも溶解度に問題が生じた。８４−９３と９４−１２１あるいは１２−２２と２３−５９の縮合時これらは非常に難溶となったため、混合溶媒（クロロホルム／トリフルオロエタノール）の使用が不可欠となった。よってそれ以後の縮合は全て混合溶媒を使用して行なった。最終の１−５９と６０−１２１の縮合も同様最も溶解力の強いＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）にも不溶であったが上記混合溶媒を用いることにより容易に縮合反応を行なうことができた。
【００１６】
得られた保護基のついたＮ−ｈａｌｆ（１−５９）、Ｃ−ｈａｌｆ（６０−１２１）およびヒトミッドカイン（１−１２１）を常法どうりＨＦ処理しそれぞれ（６Ａｃｍ）、（４Ａｃｍ）、（１０Ａｃｍ）の入ったペプチドとした。これらを酢酸水銀処理して、Ａｃｍ基を除去したのちジスルフィド結合形式反応に供した。この反応には種々の条件検討を行なったところ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 存在の５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．７）のｂｕｆｆｅｒ中で酸化還元型のグルタチオンをペプチドに対して１：１０：１００の割合で加え５℃で行なうことが至適条件となることが分った。以上のようにＮ−ｈａｌｆ、Ｃ−ｈａｌｆヒトＭＫの合成を行なうことができた。同様にして、Ｃ−ｈａｌｆＰＴＮペプチド断片も合成することができた。
【００１７】
このようにして全化学合成したヒトＭＫは、天然由来の本発明者が別途調製したＭＫと、神経突起伸展作用、プラスミノーゲンアクチベーター誘導活性、ヘパリン結合活性などの生物活性において、同等の活性を有することが明らかにされた。またＭＫ、ＰＴＮなどのそれぞれＣ−ｈａｌｆ断片ペプチドにこれら生物活性が局在していることも示された。
【００１８】
以下本発明を実施例、実験例をもって、更に具体的に説明するが、もとより本発明はこれら記載に限られるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
ヒト型ｈ−Ｍｉｄｋｉｎｅの合成
保護ペプチド（１−１２１）の合成はアミノ酸１２１個からなるペプチドを液相法にて図１および図２に示すように、１３個のフラグメント（１−１１）（１２−２２）（２３−３１）（３２−４０）（４１−５１）（５２−５９）（６０−７０）（７１−７７）（７８−８３）（８４−９３）（９４−１０３）（１０４−１１２）（１１３−１２１）に分割、合成した。各フラグメントの純度はＴＬＣ，ＨＰＬＣ，アミノ酸分析により確認した。この後Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）［ｈＭＫ−Ｎと略す。］とＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１［ｈＭＫ−Ｃと略す。］を合成するべくそれぞれＣ末から順次縮合した。各フラグメントの合成およびフラグメント縮合には全てＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法またはＷＳＣＩ／ＨＯＯＢｔ法を用いた。（ＷＳＣＩ：１−ｅｔｈｙ１−３，（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＨＯＯＢｔ：３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏ−１，２，３−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ）。
【００２０】
アミノ酸のＮ末はＢｏｃ基で保護し、アミノ酸側鎖保護基にはそれぞれＡｓｐ（ＯｃＨｅｘ），Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ），Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｌｙｓ（ＣｌＺ），Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｔｙｒ（ＢｒＺ），Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）、そしてＣｙｓの保護基にはＡｃｍ基を用いた。その他Ｃ末保護基にはＢｚｌ基、各フラグメントのＣ末にはＰａｃ基を用いて合成した。（ＣＨｅｘ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ），（Ｂｚｌ：ｂｅｎｚｙｌ），（ＣｌＺ：ｚ−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），（Ｔｏｓ：ｓｙｌ），（ＢｒＺ：２−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），Ｆｏｒ（ｆｏｒｍｙｌ），Ａｃｍ（ａｃｅｔａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ），（Ｐａｃ：Ｐｈｅｎａｃｙｌ ｅｓｔｅｒ）。
【００２１】
保護ペプチド（１−１２１）３ｇをＨｉｇｈ−ＨＦ（ＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１，０〜−５℃，１ｈ）で次いでＬｏｗ−ＨＦ（ＨＦ／Ｂｕｔａｎｅｄｉｔｉｏｌ＝７／３，０〜−５℃，３０ｍｉｎ）で処理し１．９ｇの粗製品を得た。この粗製品１．９ｇをＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から６０％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。
【００２２】
ＣＨ３ ＣＮ濃度３０−３２．２％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して４２０ｍｇのペプチドを得た。この４２０ｍｇのペプチドをＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（３．７×１７ｃｍ）に注入しｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．７ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ６）各１．２５Ｌの単一濃度勾配条件で溶出した。１５ｇずつ分画し０．４８−０．５３Ｍ塩濃度画分（５６本目から６５本目）を集め溶液のｐＨを酢酸で下げ、そのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。
【００２３】
前述同様溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１４％から４４％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．５−２９．２％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して１２５ｍｇの１０Ａｃｍペプチドを得た。
【００２４】
このうち９０ｍｇを０．５ｍＭペプチド濃度になるように５０％ＡｃＯＨで溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え窒素雰囲気下室温で２時間かき混ぜた。その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜた。反応液をＧ−２５のゲルろ過クロマトグラム（１．１５×７３ｃｍ）に注入し、５％ＡｃＯＨで溶出した後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。
【００２５】
ＳＨペプチド４５ｍｇ（３．４μＭ）を１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液、３．４Ｌ（１×１０−６ＭＣｏｎｃ．）に溶かし５℃で４日間かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相のカラム（ＹＭＣ−Ｃ４，２０×２５０ｍｍ）に注入し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００２６】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２９．４−２９．８％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥して５ｍｇのペプチドを得た。
【００２７】
ＳＳ結合架橋様式は、トリプシン消化後逆相ＨＰＬＣで分取した各ピークについて質量分析およびアミノ酸分析により、天然型と同じであることを確認した。最終品の純度に関して逆相ＨＰＬＣのみならずキャピラリー電気泳動の検査でもシングルピークを与えた。
【００２８】
またアミノ酸分析値および質量分析値も理論値と良く一致した。ｈＭＫはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１４．３ｍｉｎに溶出した。
【００２９】
質量分析値；１３２４１．２［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ７．５２（８），Ｔｈｒ９．５１（１０），Ｓｅｒ２．８６（３），Ｇｌｕｌ１．１２（１１），Ｇｌｙ１６．００（１６），Ａｌａ１０．７３（１０），Ｃｙｓ９．１７（１０），Ｖａ１４．８７（５），Ｉｌｅ１．８３（２），Ｌｅｕ１．０２（１），Ｔｙｒ２．０１（２），Ｐｈｅ３．０１（３），Ｌｙｓ２３．３２（２３），Ｔｒｐ３．８６（４），Ａｒｇ６．９０（７），Ｐｒｏ５．９８（６）。
【００３０】
実施例２
ｈＭＫ−Ｎ（Ｎ−ｈａｌｆ）の合成
ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦ、およびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ６）各６００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶出した。
【００３１】
１５ｇずつ分画し０．３４−０．３８Ｍ塩濃度画分（１４本目から１８本目）を集め溶液のｐＨをＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から４５％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．１−２８．９％の分画を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して７０ｍｇの６Ａｃｍペプチドを得た。
【００３２】
ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド５０ｍｇを５０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％ＡｃＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド４０ｍｇを得た。
【００３３】
ＳＨペプチド４０ｍｇ（６．１８μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液６１８ｍｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後逆相のカラムＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２９．１−２５．５％の画分を集め減圧濃縮後凍結乾燥してｈＭＫ−Ｎ１５ｍｇを得た。
【００３４】
ｈＭＫ−ＮはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．９ｍｉｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００３５】
質量分析値；６４７０．４［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ２．８８（３），Ｓｅｒ２．８１（３），Ｇｌｕ６．０８（６），Ｇｌｙ９．００（９），Ａｌａ３．１６（３），Ｃｙｓ５．８３（６），Ｖａ１２．９１（３），Ｉｌｅ０．９４（１），Ｐｈｅ２．２４（２），Ｌｙｓ９．２６（９），Ｔｒｐ２．７８（３），Ａｒｇ４．００（４），Ｐｒｏ４．０８（４）。
【００３６】
実施例３
ｈＭＫ−Ｃ（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成
ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦおよびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラフィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ５），ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯＮＨ４ ＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ６）各８００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶出した。
【００３７】
２０ｇずつ分画し０．３８−０．４２Ｍ塩濃度画分（３８本目から４２本目）を集め、溶液のｐＨをＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から２５％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２２．０−２４．５％の分画を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して１１０ｍｇの４Ａｃｍペプチドを得た。
【００３８】
ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド１１０ｍｇを５０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）２ を加え、窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％ＡｃＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。
【００３９】
ＳＨペプチド６５ｍｇ（９．６μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＡ ＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液９６０ｍｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１２％から２２％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２５．１−２５．５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して４５ｍｇのペプチドを得た。
【００４０】
ｈＭＫ−ＣはＯＤＳカラム、（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．５ｍｉｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００４１】
質量分析値；６７８９．９［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ４．７１（５），Ｔｈｒ６．５９（６），Ｇｌｕ５．０４（５），Ｇｌｙ７．００（７），Ａｌａ７．２６（７），Ｃｙｓ３．８０（４），Ｖａｌ１．９７（２），Ｉｌｅ０．８８（１），Ｌｅｕ０．９６（１），Ｔｙｒ１．９２（２），Ｐｈｅ０．９９（１），Ｌｙｓ１４．００（１４），Ｔｒｐ０．８７（１），Ａｒｇ２．８６（３），Ｐｒｏ１．８６（２）。
【００４２】
実施例４
ｈＭＫ（６２−１０４）（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成
固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈＭＫ（６２−１０４）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢｚｌを用いた以外は同じ保護基を使用した。保護ペプチド樹脂１．７ｇをＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製品７００ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１００分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２５．３−２６．８％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して６０ｍｇのＳＨペプチドを得た。
【００４３】
ＳＨペプチド６０ｍｇ（１２．３μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし、室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度５％から４０％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｍ、カラム温度は室温で溶出した。
【００４４】
ＣＨ３ ＣＮ濃度３０．３−３０．６％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（６２−１０４）３０ｍｇを得た。ｈＭＫ（６２−１０４）はＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用いＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１８．５ｍｉｎに溶出した。
【００４５】
純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００４６】
質量分析値；４８３６．２［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ４．６２（５），Ｇｌｕ５．２２（５），Ｇｌｙ４．９３（５），Ａｌａ３．１７（３），Ｃｙｓ３．４９（４），Ｖａｌ１．９６（２），Ｉｌｅ０．８８（１），Ｌｅｕ１．０５（１），Ｔｙｒ１．９８（２），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｌｙｓ６．１１（６），Ｔｒｐ０．８６（１），Ａｒｇ３．００（３），Ｐｒｏ０．９９（１）。
【００４７】
実施例５
ｈＭＫ（１０４−１２１）の合成
ｈＭＫのフラグメント（１０４−１１２）と（１１３−１２１）を縮合させて合成した保護ペプチド１００ｍｇをＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製品８０ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５ｍｍ）で分取した。
【００４８】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度３％から１８％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度１０．２５−１１．２５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（１０４−１２１）６０ｍｇを得た。
【００４９】
ｈＭＫ（１０４−１２１）ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１０．９ｍｉｎに溶出した。純度に関して逆相ＨＰＬＣでシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値ま理論値に良く一致した。
【００５０】
質量分析値；１９６０．４［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ１．００（１），Ｔｈｒ２．００（２），Ｇｌｙ１．９８（２），Ａｌａ３．０１（３），Ｃｙｓ０．６８（１），Ｌｙｓ８．０６（８），Ｐｒｏ０．９９（１）。
【００５１】
実施例６
ヒト型ｈ−ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ（６７−１０９）の合成
固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈＰＴＮ（６７−１０９）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢｚｌ、Ｈｉｓの保護基にＢｏｍを用いた以外は同じ保護基を使用した）１．５ｇにＣｙｓ３０当量を加え、ＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜−５℃、１ｈ処理し、得られた粗製品１．５７ｇ（Ｃｙｓを含む）を逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００５２】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１００分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ３ ＣＮ濃度２４．５−２５．６％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥してＳＨペプチド５０ｍｇを得た。
【００５３】
ＳＨペプチド５０ｍｇ（１２．３μＭ）を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×１０−５ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。
【００５４】
溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度５％から４０％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。
【００５５】
ＣＨ３ ＣＮ濃度２８．５−２９．３％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＰＴＮ（６７−１０９）３０ｍｇを得た。ｈＰＴＮ（６７−１０９）はＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ３ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１７．３ｍｉｎに溶出した。
【００５６】
純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値も理論値に良く一致した。
【００５７】
質量分析値；４８４０．５［Ｍ＋ Ｈ］
アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．９８（３），Ｔｈｒ４．７５（５），Ｓｅｒ１．８７（２），Ｇｌｕ５．１０（５），Ｇｌｙ２．００（２），Ａｌａ４．０６（４），Ｃｙｓ３．６０（４），Ｖａｌ０．９７（１），Ｉｌｅ０．９１（１），Ｌｅｕ３．９５（４），Ｔｙｒ０．９６（１），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｈｉｓ０．９７（１），Ｌｙｓ５．１０（５），Ｔｒｐ０．８５（１），Ａｒｇ１．９８（２），Ｐｒｏ０．９７（１）。
【００５８】
実験例１ 細胞内ＰＡ活性測定
ウシ大動脈由来血管内皮細胞を１０％ウシ血清（ＢＳＡ）を含むαＭＥＭ内に分離し、培養した。９６穴培養プレートに細胞をまきコンフルエントになるまで培養後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生食液（ＰＢＳ）で洗い、０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの無血清αＭＥＭ（αＭＥＭ−ＢＳＡ）中で培養を行った。
【００５９】
この１００μｌの培地中に種々の濃度のＭＫポリペプチドや断片ペプチドまた対照のレチノールを添加し、それら薬剤によるＰＡ生産・誘導能を測定した。 各培養時間ごとに、培養上清をアスピレートし、培養細胞をＰＢＳで洗い、細胞内ＰＡを０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）緩衝液１００μｌ中に抽出し、抽出液中のＰＡレベルは１２５ Ｉ−ラベルフィブリンプレート（Ｃｒｏｓｓ．，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５，９７４−９８１（１９８２））を用いて測定した。
【００６０】
ＰＡ活性はサンプル中のｍｇタンパクあたりのＵＫ単位（Ｕ）で表わした。蛋白濃度はＢＳＡを標準として、マイクロタイタープレートＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により測定した。１８時間培養後、未添加の対照に対してレチノール２μＭの添加で１．５倍のＰＡ活性レベルとなった。
【００６１】
レコンビナントＭＫ、化学合成ＭＫ、Ｃ−ｈａｌｆ ＭＫなどは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、対照に比べて、３倍から１５倍のＰＡ活性が見られた。他方ＭＫ自身はプラスミン活性を持たないことおよびプラスミノーゲンを直接に活性化することはないことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】保護されたミッドカイン（１−５９）の合成図
【図２】保護されたミッドカイン（６０−１２１）の合成図
Claims (2)
- ヒトミッドカイン（ＭＫ）ポリペプチドを化学合成するにあたって、Ｎ−ｈａｌｆ（１〜５９）断片とＣ−ｈａｌｆ（６０〜１２１）断片とを個々に液相法により製造して、しかる後に両断片をカップリングさせることを特徴とするヒトＭＫポリペプチドの製造法。
- ヒトミッドカイン（ＭＫ）ポリペプチドのアミノ酸配列の１番〜１１番の断片、１２番〜２２番の断片、２３番〜３１番の断片、３２番〜４０番の断片、４１番〜５１番の断片及び５２番〜５９番の断片をそれぞれ個々に液相法により合成してから結合して前記Ｎ−ｈａｌｆ（１〜５９）断片とし、６０番〜７０番の断片、７１番〜７７番の断片、７８番〜８３番の断片、８４番〜９３番の断片、９４番〜１０３番の断片、１０４番〜１１２番の断片及び１１３番〜１２１番の断片をそれぞれ個々に液相法で合成してＣ−ｈａｌｆ（６０〜１２１）断片とする請求項１に記載のヒトＭＫポリペプチドの製造法。
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