JPH0873498A - ポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトミッドカインの化学合成 【構成】 ミッドカインのＣ−ｈａｌｆとＮ−ｈａｌｆ
をカップリングさせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はミッドカインファミリー
に属するポリペプチド、特にヒトミッドカイン（ＭＫ）
ポリペプチドおよびそのペプチド断片、並びにヒトプレ
イオトロフィン（ＰＴＮ）ポリペプチドのペプチド断片
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは先に、レチノイン酸支配下
において、細胞の分化・増殖をコントロールする因子と
して、マウス由来ＭＫポリペプチド（Ｋａｄｏｍａｔｓ
ｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（ＢＢＲＣ），１５１，
１３１２（１９８８）およびＴｏｍｏｍｕｒａ．Ｍ．，
ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１
０７６５（１９９０））およびヒト由来ＭＫポリペプチ
ド（特開平５−９１８８０）を見出してきた。

【０００３】そしてＭＫが神経細胞の生存および神経突
起伸長の２つの活性を持つ神経栄養因子であること、ま
たＭＫが発癌、アルツハイマー病発症とのかかわりがあ
ることがその後の研究により明らかにされた（村松
喬：レチノイン酸応答性のヘパリン結合性成長因子、ミ
ッドカイン（ＭＫ）−発生分化、がん、神経とのかかわ
りで−；生化学第６５巻第１２号、１４９４〜１５０４
頁、１９９３年１２月。特開平６−１７２２１８）。

【０００４】またＭＫに引き続いてＭＫと５０％のアミ
ノ酸相同性を有するｈｅｐａｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇ ｇ
ｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
（ＨＢ−ＧＡＭ）（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．＆ Ｒａ
ｕｖａｌａ，Ｈ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
５，１６７２１−１６７２４，（１９９０））あるいは
プレイオトロピン、ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＰＴ
Ｎ）（Ｌｉ，Ｙ．−Ｓ．，Ｍｉｌｎｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｇ
ｈａｕｈａｎ，Ａ．Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｄｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｍ
ｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．，＆ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．：
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１６９０−１６９４，（１９
９０））、またＭＫと６５％のアミノ酸相同性を有する
ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐ
ａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＩ−Ｈ
Ｂ）（Ｕｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，１７５，
６１７−６２４（１９９１））と呼ばれる分子が発見さ
れ、ＭＫファミリーポリペプチド（蛋白質）に属するも
のであることが、わかってきた。ＨＢ−ＧＡＭ／ＰＴＮ
は神経突起伸長作用を持つ他、内皮細胞の増殖刺激作用
を有することが報告されている（Ｒａｕｖａｌａ，
Ｈ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，８，２９３３−２９４１（１９
８９），Ｗｅｌｌｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５８２−２５８
７（１９９２），Ｃｏｕｒｔｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＢＢＲ
Ｃ，１８０，１４５−１５１（１９９０））。

【０００５】本発明者らはまたＭＫポリペプチド、ＰＴ
ＮポリペプチドなどＭＫファミリーに属するポリペプチ
ドなどを有効成分とする、心筋梗塞、血栓等の予防・治
療剤を提供した（特願平６−１７１３７７）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＭＫファミリーポリペ
プチドを医薬、診断薬、試薬として使用する際には、純
度の高い原末を大量に調製することが必要である。その
ためには大腸菌、酵母などにおいて組み換えＤＮＡを用
いた遺伝子工学的手法で、ＭＫ、ＰＴＮを製造すること
ができる。一方、ＭＫファミリーポリペプチドを化学的
に、あるいは一部酵素合成法を併用して、全化学合成す
ることも考えうるが、実際に実施され成功したという報
告はこれまでになく、ＭＫポリペプチドの全化学合成法
の確立が期待されていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】今日、ペプチドを合成す
るためには、非常に多くの方法が知られている。特に固
相法という便利な方法があり、それを使えば殆どどんな
ペプチドでも合成できるのは事実である。しかし合成す
べきペプチドの分子量が大きくなりアミノ酸数が１００
個以上のポリペプチド、蛋白質の場合、これらを純粋な
型で合成するのはいくら固相法による合成技術が発達し
たとはいえ、非常な困難を伴なうのは周知のとうりであ
る。

【０００８】固相法では、各アミノ酸の縮合反応を自動
的に進行させることができるため、ペプチド鎖の延長に
要する時間を大幅に短縮することができる。しかし一方
で中間体を精製することが出来ないため、合成途上に生
成した副生物はすべて最終生成物中に混入するという理
論的な欠点をもっている。

【０００９】その意味から蛋白質のように分子量の大き
いものを合成する場合に、副生物の生成を抑えようと思
えばやはり液相法によるセグメント縮合法で目的物を注
意深く合成するのが理想的である。その場合、それぞれ
のセグメントは構成アミノ酸１０個前後になるように分
割して合成し、それぞれを十分に精製したのち適当な溶
媒中で注意深く縮合させる必要がある。

【００１０】これらの方法で蛋白質を合成するためには
さらにいくつかの条件を満たす必要がある。第一は各セ
グメントにある全ての官能基を保護しながら、Ｃ末端に
あるカルボン酸の保護基のみを遊離させることである。
第二はＣ末端の遊離カルボキシル基とアミン成分の遊離
アミノ基とをラセミ化させることなく、縮合させる技術
を確立することである。最後に重要なことは、各セグメ
ントをよく溶かし、しかもうまく反応させうるような溶
媒系を見いだすことである。

【００１１】これらの条件を満たすものとして、Ｃ末端
のカルボン酸の保護基としてフエナシルエステル（Ｐａ
ｃ）の使用と各セグメント合成に適当な溶媒中、例えば
ＤＭＦ，ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル）の存在下にて水溶液カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を
用いる縮合法がある。このようにセグメント合成が終了
したのち各セグメントは遊離のカルボン酸に導く必要が
あるが、その時にもそれらセグメントを溶かす適当な溶
媒が必要になる。もしそのセグメントが酢酸によく溶け
るのであれば問題ないが、溶けない場合に有効な溶媒と
してジクロルメタンとトリフルオロエタノールの混合溶
媒（３：１）が良い。そしてこの溶媒中ギ酸アンモニウ
ム（３０当量）と亜鉛末（５０ｅｑ）を用いて室温中反
応すればＣ末端のフエナシルエステルは容易に切断さ
れ、目的とする遊離のカルボン酸をもったセグメントが
得られる。最後に各セグメントどうしの縮合には溶解度
に問題がない場合は、ＤＭＦやＮＭＰ（Ｎ−メチルピロ
リドン中、カルボキシル成分のＣ末端がグリシンやプロ
リンの時は、ＨＯＢｔ存在下ＷＳＣＩ、それ以外の場合
は、ＨＯＯＢｔ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−
４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）存在下、
ＷＳＣＩによる縮合が良い。

【００１２】一方、溶解度が悪いセグメントの縮合に
は、クロロホルムとトリフルオロエタノールの混合溶媒
（３：１）中ＨＯＯＢｔ存在下ＷＳＣＩで縮合させるこ
とができる。このようにして合成した保護基のついたペ
プチドは、無水フッ化水素（ＨＦ）でシステインの保護
基として用いたＡｃｍ（アセトアミドメチル）基以外の
全ての保護基を除去してＡｃｍ基のついた遊離ペプチド
とすることができる。残りのＡｃｍ基は酢酸第二水銀を
用いて５０％酢酸中室温で処理することにより遊離シス
テインを含むペプチドが得られる。この全ての保護基が
除去されたペプチドを適当なＢｕｆｆｅｒ中で環化反応
を行なうことにより目的とする複数のジスルフィド結合
を有するポリペプチドが得られる。

【００１３】以上の方法を用いて実施例に示すようなヒ
トＭＫの全合成を行なうことができた。

【００１４】ヒトＭＫの全合成にあたり、各セグメント
の合成は問題なく行なうことが出来たが、セグメントの
Ｃ末端フエナシル基の脱離の際セグメント、特に８４−
９３，６０−７０，４１−５１，１２−２２および１−
１１が酢酸に全く溶けなかった。しかしこれらは上記の
混合溶媒（シクロルメタン／トリフルオロエタノール）
を用いることにより容易に溶解し、その後の脱フエナシ
ル化反応も容易に行なうことができた。

【００１５】Ｎ−ｈａｌｆ（１−５５）およびＣ−ｈａ
ｌｆ（６０−１２１）の合成は各セグメントをＣ端より
順次縮合させることにより行なった。しかしこの縮合反
応の際にも溶解度に問題が生じた。８４−９３と９４−
１２１あるいは１２−２２と２３−５９の縮合時これら
は非常に難溶となったため、混合溶媒（クロロホルム／
トリフルオロエタノール）の使用が不可欠となった。よ
ってそれ以後の縮合は全て混合溶媒を使用して行なっ
た。最終の１−５９と６０−１２１の縮合も同様最も溶
解力の強いＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）にも不溶
であったが上記混合溶媒を用いることにより容易に縮合
反応を行なうことができた。

【００１６】得られた保護基のついたＮ−ｈａｌｆ（１
−５９）、Ｃ−ｈａｌｆ（６０−１２１）およびヒトミ
ッドカイン（１−１２１）を常法どうりＨＦ処理しそれ
ぞれ（６Ａｃｍ）、（４Ａｃｍ）、（１０Ａｃｍ）の入
ったペプチドとした。これらを酢酸水銀処理して、Ａｃ
ｍ基を除去したのちジスルフィド結合形式反応に供し
た。この反応には種々の条件検討を行なったところ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 存在の５０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．７）のｂｕｆｆｅｒ中で
酸化還元型のグルタチオンをペプチドに対して１：１
０：１００の割合で加え５℃で行なうことが至適条件と
なることが分った。以上のようにＮ−ｈａｌｆ、Ｃ−ｈ
ａｌｆヒトＭＫの合成を行なうことができた。同様にし
て、Ｃ−ｈａｌｆＰＴＮペプチド断片も合成することが
できた。

【００１７】このようにして全化学合成したヒトＭＫ
は、天然由来の本発明者が別途調製したＭＫと、神経突
起伸展作用、プラスミノーゲンアクチベーター誘導活
性、ヘパリン結合活性などの生物活性において、同等の
活性を有することが明らかにされた。またＭＫ、ＰＴＮ
などのそれぞれＣ−ｈａｌｆ断片ペプチドにこれら生物
活性が局在していることも示された。

【００１８】以下本発明を実施例、実験例をもって、更
に具体的に説明するが、もとより本発明はこれら記載に
限られるものではない。

【００１９】

【実施例】

実施例１ ヒト型ｈ−Ｍｉｄｋｉｎｅの合成 保護ペプチド（１−１２１）の合成はアミノ酸１２１個
からなるペプチドを液相法にて図１および図２に示すよ
うに、１３個のフラグメント（１−１１）（１２−２
２）（２３−３１）（３２−４０）（４１−５１）（５
２−５９）（６０−７０）（７１−７７）（７８−８
３）（８４−９３）（９４−１０３）（１０４−１１
２）（１１３−１２１）に分割、合成した。各フラグメ
ントの純度はＴＬＣ，ＨＰＬＣ，アミノ酸分析により確
認した。この後Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）［ｈＭＫ−Ｎ
と略す。］とＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１［ｈＭＫ−Ｃ
と略す。］を合成するべくそれぞれＣ末から順次縮合し
た。各フラグメントの合成およびフラグメント縮合には
全てＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法またはＷＳＣＩ／ＨＯＯＢｔ
法を用いた。（ＷＳＣＩ：１−ｅｔｈｙ１−３，（３−
ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂ
ｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅ
ｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＨＯＯＢｔ：３，４−ｄｉｈ
ｙｄｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏ−１，２，
３−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ）。

【００２０】アミノ酸のＮ末はＢｏｃ基で保護し、アミ
ノ酸側鎖保護基にはそれぞれＡｓｐ（ＯｃＨｅｘ），Ｇ
ｌｕ（ＯｃＨｅｘ），Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｔｈｒ（Ｂｚ
ｌ），Ｌｙｓ（ＣｌＺ），Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｔｙｒ
（ＢｒＺ），Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）、そしてＣｙｓの保護基
にはＡｃｍ基を用いた。その他Ｃ末保護基にはＢｚｌ
基、各フラグメントのＣ末にはＰａｃ基を用いて合成し
た。（ＣＨｅｘ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ），（Ｂｚｌ：
ｂｅｎｚｙｌ），（ＣｌＺ：ｚ−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），（Ｔｏｓ：ｓｙｌ），
（ＢｒＺ：２−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ），Ｆｏｒ（ｆｏｒｍｙｌ），Ａｃｍ（ａｃｅ
ｔａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ），（Ｐａｃ：Ｐｈｅｎａｃ
ｙｌ ｅｓｔｅｒ）。

【００２１】保護ペプチド（１−１２１）３ｇをＨｉｇ
ｈ−ＨＦ（ＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１，０〜−５℃，
１ｈ）で次いでＬｏｗ−ＨＦ（ＨＦ／Ｂｕｔａｎｅｄｉ
ｔｉｏｌ＝７／３，０〜−５℃，３０ｍｉｎ）で処理し
１．９ｇの粗製品を得た。この粗製品１．９ｇをＨＰＬ
Ｃ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３
０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦ
Ａを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、Ｃ
Ｈ₃ ＣＮ濃度１０％から６０％までの１１０分単一濃度
勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶
出した。

【００２２】ＣＨ₃ ＣＮ濃度３０−３２．２％の画分を
集め、減圧濃縮後凍結乾燥して４２０ｍｇのペプチドを
得た。この４２０ｍｇのペプチドをＣＭセルロースのイ
オン交換クロマトグラフィー（３．７×１７ｃｍ）に注
入しｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮ
Ｈ₄ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇｂｕ
ｆｆｅｒ０．７ＭＡｃＯＮＨ₄ ＋３ＭＵｒｅａ（ｐＨ
６）各１．２５Ｌの単一濃度勾配条件で溶出した。１５
ｇずつ分画し０．４８−０．５３Ｍ塩濃度画分（５６本
目から６５本目）を集め溶液のｐＨを酢酸で下げ、その
まま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０×２５０ｍｍ）
に注入した。

【００２３】前述同様溶離液には０．１％ＴＦＡを含む
ＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ
濃度１４％から４４％までの１１０分単一濃度勾配法、
流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。
ＣＨ₃ ＣＮ濃度２８．５−２９．２％の画分を集め、減
圧濃縮後凍結乾燥して１２５ｍｇの１０Ａｃｍペプチド
を得た。

【００２４】このうち９０ｍｇを０．５ｍＭペプチド濃
度になるように５０％ＡｃＯＨで溶かし、暗所でＡｃｍ
基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）₂ を加え窒素雰
囲気下室温で２時間かき混ぜた。その後Ａｃｍ基に対し
て３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加
えさらに２時間かき混ぜた。反応液をＧ−２５のゲルろ
過クロマトグラム（１．１５×７３ｃｍ）に注入し、５
％ＡｃＯＨで溶出した後ペプチドの部分を集め凍結乾燥
してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。

【００２５】ＳＨペプチド４５ｍｇ（３．４μＭ）を１
ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄ およびＧＳＨ
／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮ
Ｈ₄（ｐＨ７．７）の緩衝液、３．４Ｌ（１×１０^-6Ｍ
Ｃｏｎｃ．）に溶かし５℃で４日間かき混ぜた。ＴＦＡ
でｐＨを３とした後、逆相のカラム（ＹＭＣ−Ｃ４，２
０×２５０ｍｍ）に注入し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラ
フィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で
分取した。

【００２６】溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１５
％から３５％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０
ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ Ｃ
Ｎ濃度２９．４−２９．８％の画分を集め、減圧濃縮後
凍結乾燥して５ｍｇのペプチドを得た。

【００２７】ＳＳ結合架橋様式は、トリプシン消化後逆
相ＨＰＬＣで分取した各ピークについて質量分析および
アミノ酸分析により、天然型と同じであることを確認し
た。最終品の純度に関して逆相ＨＰＬＣのみならずキャ
ピラリー電気泳動の検査でもシングルピークを与えた。

【００２８】またアミノ酸分析値および質量分析値も理
論値と良く一致した。ｈＭＫはＯＤＳカラム（４．６×
１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１０
％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ
／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１４．３ｍ
ｉｎに溶出した。

【００２９】質量分析値；１３２４１．２［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ７．５２（８），Ｔｈｒ９．５
１（１０），Ｓｅｒ２．８６（３），Ｇｌｕｌ１．１２
（１１），Ｇｌｙ１６．００（１６），Ａｌａ１０．７
３（１０），Ｃｙｓ９．１７（１０），Ｖａ１４．８７
（５），Ｉｌｅ１．８３（２），Ｌｅｕ１．０２
（１），Ｔｙｒ２．０１（２），Ｐｈｅ３．０１
（３），Ｌｙｓ２３．３２（２３），Ｔｒｐ３．８６
（４），Ａｒｇ６．９０（７），Ｐｒｏ５．９８
（６）。

【００３０】実施例２ ｈＭＫ−Ｎ（Ｎ−ｈａｌｆ）の合成 ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦ、
およびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３
４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグ
ラフィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔ
ｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ₄ （ｐＨ
５）、ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯ
ＮＨ₄ （ｐＨ６）各６００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶
出した。

【００３１】１５ｇずつ分画し０．３４−０．３８Ｍ塩
濃度画分（１４本目から１８本目）を集め溶液のｐＨを
ＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３
０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣ
Ｈ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃
度１５％から４５％までの１１０分単一濃度勾配法、流
速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。Ｃ
Ｈ₃ ＣＮ濃度２８．１−２８．９％の分画を集め減圧濃
縮後、凍結乾燥して７０ｍｇの６Ａｃｍペプチドを得
た。

【００３２】ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド５０ｍｇを５０
％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶か
し、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡ
ｃ）₂を加え窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ
基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎ
ｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過
クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％ＡｃＯ
Ｈで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペ
プチド４０ｍｇを得た。

【００３３】ＳＨペプチド４０ｍｇ（６．１８μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄ および
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡ
ｃＯＮＨ₄ （ｐＨ７．７）の緩衝液６１８ｍｌ（１×１
０^-5ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。Ｔ
ＦＡでｐＨを３とした後逆相のカラムＨＰＬＣ逆相クロ
マトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０
ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣ
Ｈ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃
度１０％から４０％までの１２０分単一濃度勾配法、流
速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。Ｃ
Ｈ₃ ＣＮ濃度２９．１−２５．５％の画分を集め減圧濃
縮後凍結乾燥してｈＭＫ−Ｎ１５ｍｇを得た。

【００３４】ｈＭＫ−ＮはＯＤＳカラム（４．６×１５
０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ溶
液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１０％か
ら４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．９ｍｉｎ
に溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検
査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであ
り、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピーク
であることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析
値も理論値に良く一致した。

【００３５】質量分析値；６４７０．４［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ２．８
８（３），Ｓｅｒ２．８１（３），Ｇｌｕ６．０８
（６），Ｇｌｙ９．００（９），Ａｌａ３．１６
（３），Ｃｙｓ５．８３（６），Ｖａ１２．９１
（３），Ｉｌｅ０．９４（１），Ｐｈｅ２．２４
（２），Ｌｙｓ９．２６（９），Ｔｒｐ２．７８
（３），Ａｒｇ４．００（４），Ｐｒｏ４．０８
（４）。

【００３６】実施例３ ｈＭＫ−Ｃ（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成 ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦお
よびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４
０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラ
フィー（１．３×９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉ
ｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ₄ ＋３ＭＵｒｅ
ａ（ｐＨ５），ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０
ＭＡｃＯＮＨ₄ ＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ６）各８００ｍ
ｌの単一濃度勾配条件で溶出した。

【００３７】２０ｇずつ分画し０．３８−０．４２Ｍ塩
濃度画分（３８本目から４２本目）を集め、溶液のｐＨ
をＴＦＡで下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，
３０×２５０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含む
ＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ
濃度１５％から２５％までの６０分単一濃度勾配法、流
速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。Ｃ
Ｈ₃ ＣＮ濃度２２．０−２４．５％の分画を集め減圧濃
縮後、凍結乾燥して１１０ｍｇの４Ａｃｍペプチドを得
た。

【００３８】ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド１１０ｍｇを５
０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶
かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡ
ｃ） ₂ を加え、窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃ
ｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ
ｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ
過クロマトグラフィー（１．１５×７３ｃｍ，５％Ａｃ
ＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨ
ペプチド６５ｍｇを得た。

【００３９】ＳＨペプチド６５ｍｇ（９．６μＭ）を、
１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄ ） ₂ ＳＯ₄ およびＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＡ Ａｃ
ＯＮＨ₄ （ｐＨ７．７）の緩衝液９６０ｍｌ（１×１０
^-5ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦ
ＡでｐＨを３とした後逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ
−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離
液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％
ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１２％から２２％まで
の６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラ
ム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ ＣＮ濃度２５．１−２
５．５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して４５ｍ
ｇのペプチドを得た。

【００４０】ｈＭＫ−ＣはＯＤＳカラム、（４．６×１
５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ
溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１０％
から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／
ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．５ｍｉ
ｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの
検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じで
あり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピー
クであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分
析値も理論値に良く一致した。

【００４１】質量分析値；６７８９．９［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ４．７１（５），Ｔｈｒ６．５
９（６），Ｇｌｕ５．０４（５），Ｇｌｙ７．００
（７），Ａｌａ７．２６（７），Ｃｙｓ３．８０
（４），Ｖａｌ１．９７（２），Ｉｌｅ０．８８
（１），Ｌｅｕ０．９６（１），Ｔｙｒ１．９２
（２），Ｐｈｅ０．９９（１），Ｌｙｓ１４．００（１
４），Ｔｒｐ０．８７（１），Ａｒｇ２．８６（３），
Ｐｒｏ１．８６（２）。

【００４２】実施例４ ｈＭＫ（６２−１０４）（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成 固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈ
ＭＫ（６２−１０４）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢ
ｚｌを用いた以外は同じ保護基を使用した。保護ペプチ
ド樹脂１．７ｇをＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８
０／５／１５で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製
品７００ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤ
Ｓカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には
０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ
水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１５％から３５％までの１０
０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温
度は室温で溶出した。ＣＨ₃ ＣＮ濃度２５．３−２６．
８％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して６０ｍｇの
ＳＨペプチドを得た。

【００４３】ＳＨペプチド６０ｍｇ（１２．３μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄ および
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡ
ｃＯＮＨ₄ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×１
０^-5ＭＣｏｎｃ．）に溶かし、室温で一晩かき混ぜた。
ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー
（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取し
た。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と
０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度５％から４０
％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉ
ｍ、カラム温度は室温で溶出した。

【００４４】ＣＨ₃ ＣＮ濃度３０．３−３０．６％の画
分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（６２−１０
４）３０ｍｇを得た。ｈＭＫ（６２−１０４）はＯＤＳ
カラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦ
Ａを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用いＣＨ
₃ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配
法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出する
と１８．５ｍｉｎに溶出した。

【００４５】純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検
査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであ
り、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピーク
であることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析
値も理論値に良く一致した。

【００４６】質量分析値；４８３６．２［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ４．６
２（５），Ｇｌｕ５．２２（５），Ｇｌｙ４．９３
（５），Ａｌａ３．１７（３），Ｃｙｓ３．４９
（４），Ｖａｌ１．９６（２），Ｉｌｅ０．８８
（１），Ｌｅｕ１．０５（１），Ｔｙｒ１．９８
（２），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｌｙｓ６．１１
（６），Ｔｒｐ０．８６（１），Ａｒｇ３．００
（３），Ｐｒｏ０．９９（１）。

【００４７】実施例５ ｈＭＫ（１０４−１２１）の合成 ｈＭＫのフラグメント（１０４−１１２）と（１１３−
１２１）を縮合させて合成した保護ペプチド１００ｍｇ
をＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１で０〜−５℃，１ｈ処理
し、得られた粗製品８０ｍｇを逆相クロマトグラフィー
（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５ｍｍ）で分取し
た。

【００４８】溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度３％
から１８％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ
／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ ＣＮ濃
度１０．２５−１１．２５％の画分を集め減圧濃縮後、
凍結乾燥してｈＭＫ（１０４−１２１）６０ｍｇを得
た。

【００４９】ｈＭＫ（１０４−１２１）ＯＤＳカラム
（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含
むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ Ｃ
Ｎ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流
速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１
０．９ｍｉｎに溶出した。純度に関して逆相ＨＰＬＣで
シングルピークであることを確認した。またアミノ酸分
析値、質量分析値ま理論値に良く一致した。

【００５０】質量分析値；１９６０．４［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ１．００（１），Ｔｈｒ２．０
０（２），Ｇｌｙ１．９８（２），Ａｌａ３．０１
（３），Ｃｙｓ０．６８（１），Ｌｙｓ８．０６
（８），Ｐｒｏ０．９９（１）。

【００５１】実施例６ ヒト型ｈ−ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ（６７−１０９）の
合成 固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈ
ＰＴＮ（６７−１０９）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４Ｍｅ
Ｂｚｌ、Ｈｉｓの保護基にＢｏｍを用いた以外は同じ保
護基を使用した）１．５ｇにＣｙｓ３０当量を加え、Ｈ
Ｆ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜
−５℃、１ｈ処理し、得られた粗製品１．５７ｇ（Ｃｙ
ｓを含む）を逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳ
カラム、３０×２５０ｍｍ）で分取した。

【００５２】溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１５
％から３５％までの１００分単一濃度勾配法、流速２０
ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ Ｃ
Ｎ濃度２４．５−２５．６％の画分を集め、減圧濃縮後
凍結乾燥してＳＨペプチド５０ｍｇを得た。

【００５３】ＳＨペプチド５０ｍｇ（１２．３μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄ および
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭ
ＡｃＯＮＨ₄ （ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１×
１０^-5ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。
ＴＦＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー
（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０×２５０ｍｍ）で分取し
た。

【００５４】溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度５％
から４０％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ
／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。

【００５５】ＣＨ₃ ＣＮ濃度２８．５−２９．３％の画
分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＰＴＮ（６７−１
０９）３０ｍｇを得た。ｈＰＴＮ（６７−１０９）はＯ
ＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ）で溶離液に０．１％
ＴＦＡを含むＣＨ₃ ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用
い、ＣＨ₃ ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃
度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶
出すると１７．３ｍｉｎに溶出した。

【００５６】純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検
査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであ
り、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピーク
であることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析
値も理論値に良く一致した。

【００５７】質量分析値；４８４０．５［Ｍ⁺ Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．９８（３），Ｔｈｒ４．７
５（５），Ｓｅｒ１．８７（２），Ｇｌｕ５．１０
（５），Ｇｌｙ２．００（２），Ａｌａ４．０６
（４），Ｃｙｓ３．６０（４），Ｖａｌ０．９７
（１），Ｉｌｅ０．９１（１），Ｌｅｕ３．９５
（４），Ｔｙｒ０．９６（１），Ｐｈｅ０．９８
（１），Ｈｉｓ０．９７（１），Ｌｙｓ５．１０
（５），Ｔｒｐ０．８５（１），Ａｒｇ１．９８
（２），Ｐｒｏ０．９７（１）。

【００５８】実験例１ 細胞内ＰＡ活性測定 ウシ大動脈由来血管内皮細胞を１０％ウシ血清（ＢＳ
Ａ）を含むαＭＥＭ内に分離し、培養した。９６穴培養
プレートに細胞をまきコンフルエントになるまで培養
後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生食液（ＰＢＳ）で洗い、
０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの無血清αＭＥＭ（α
ＭＥＭ−ＢＳＡ）中で培養を行った。

【００５９】この１００μｌの培地中に種々の濃度のＭ
Ｋポリペプチドや断片ペプチドまた対照のレチノールを
添加し、それら薬剤によるＰＡ生産・誘導能を測定し
た。各培養時間ごとに、培養上清をアスピレートし、培
養細胞をＰＢＳで洗い、細胞内ＰＡを０．５％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．１）緩衝液１００μｌ中に抽出し、抽出液中のＰＡ
レベルは¹²⁵ Ｉ−ラベルフィブリンプレート（Ｃｒｏｓ
ｓ．，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，９５，９７４−９８１（１９８２））を用いて測
定した。

【００６０】ＰＡ活性はサンプル中のｍｇタンパクあた
りのＵＫ単位（Ｕ）で表わした。蛋白濃度はＢＳＡを標
準として、マイクロタイタープレートＢＣＡ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により測定し
た。１８時間培養後、未添加の対照に対してレチノール
２μＭの添加で１．５倍のＰＡ活性レベルとなった。

【００６１】レコンビナントＭＫ、化学合成ＭＫ、Ｃ−
ｈａｌｆ ＭＫなどは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度
で、対照に比べて、３倍から１５倍のＰＡ活性が見られ
た。他方ＭＫ自身はプラスミン活性を持たないことおよ
びプラスミノーゲンを直接に活性化することはないこと
がわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】保護されたミッドカイン（１−５９）の合成図

【図２】保護されたミッドカイン（６０−１２１）の合
成図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/48 8318−4Ｈ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＡ ＡＢＳ ＡＣＢ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ (72)発明者 村松 喬 愛知県名古屋市天白区天白町大字島田字黒 石3785−3391 シティコーポ しまだ Ｂ −205 (72)発明者 村松 寿子 愛知県名古屋市天白区天白町大字島田字黒 石3785−3391 シティコーポ しまだ Ｂ −205 (72)発明者 粟屋 昭 神奈川県横浜市戸塚区矢部町4978

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトミッドカイン（ＭＫ）ポリペプチド
   を化学合成するにあたって、Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）
   断片とＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１）断片とを個々に製
   造して、しかる後に両断片をカップリングさせることを
   特徴とするヒトＭＫポリペプチドの製造法。
2. 【請求項２】 ヒトプレイオトロフィンポリペプチドの
   Ｃ−ｈａｌｆ（６７−１０９）断片の製造法。