JP2023551050A - セリンプロテアーゼ阻害活性を有する、ジスルフィド結合を含むポリペプチド、それに由来するハイブリッドペプチド及びその適用 - Google Patents

セリンプロテアーゼ阻害活性を有する、ジスルフィド結合を含むポリペプチド、それに由来するハイブリッドペプチド及びその適用 Download PDF

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Abstract

本発明は、バイオ医薬品の分野に属する。本発明は、ジスルフィド結合を含有し、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド及びその適用であり、それぞれトリプシン、キモトリプシン（β-キモトリプシン）及びエラスターゼなどの小腸タンパク質代謝酵素の活性を阻害する直鎖状ポリペプチド分子を有し、これらのポリペプチド分子は、疾患治療活性を有する他のポリペプチドまたはタンパク質医薬品と広く融合してハイブリッドペプチドを形成することができる。ハイブリッドペプチドは、代謝酵素の分解を阻害し、さらに疾病を治療するポリペプチドまたはタンパク質医薬品の安定性を高めることができ、直接注射投与の治療効果を高めるだけでなく、小腸におけるポリペプチドまたはタンパク質医薬品の直接投与の吸収を促進し、タンパク質・ポリペプチド医薬品の経口投与を実現することができる。

Description

本発明は、生物医学技術分野に属する。トリプシン、キモトリプシン（chymotrypsin）又はエラスターゼなどのセリン代謝酵素活性を阻害するポリペプチド分子及びそれらのペグ化、リン酸化、アミド化、アシル化によって修飾されるアナログ又はその薬学的に許容される塩、さらにセリンプロテアーゼ活性の阻害を有するぺプチドの適用に関するものである。これらのポリペプチド分子及びそれらのペグ化、リン酸化、アミド化、アシル化によって修飾されるアナログ又はその薬学的に許容される塩は、治療活性を有するタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質と、N又はC末端融合、又は介在タンパク質又はポリペプチド分子内融合によってハイブリッドペプチドを形成する。前記ハイブリッドペプチドは、セリン代謝酵素活性を阻害する活性を維持し、それによって生体内投与の安定性及び有効性を向上させる。
生理活性タンパク質及びポリペプチドは既にがん、炎症性疾患及び糖尿病など、生命を脅かす可能性のあるさまざまな慢性疾患の治療に広く使用されている。タンパク質及びポリペプチドは、特異性結合、標的分子への特異性の高い相互作用及び非標的分子に対する低い特異性を示す場合がある。ポリペプチド及びタンパク質を長期間使用すると、組織への蓄積が少なくなるため、投与の副作用が軽減される。さらに、ポリペプチドは体内でそれを構成するアミノ酸に分解されるため、毒性の代謝中間体による合併症のリスクが軽減される。現在、タンパク質及びポリペプチド類薬物の皮下又は静脈内投与は、胃腸管におけるタンパク質及びポリペプチドの安定性及び分子サイズ関連の吸收障害によるバイオアベイラビリティの低さから、最も広く使用されている投与経路である。広く利用可能で便利な経口投与経路は患者にとって特に魅力的であるが、消化管中の消化酵素による加水分解及び腸管上皮細胞の低透過性という2つの主要な障害を克服する必要がある1, 2。
胃腸管での安定性及び小腸上皮細胞層を介した低透過吸収等、タンパク質及びポリペプチドの経口送達に関連する課題に対処するために、吸収促進剤、プロテアーゼ阻害薬及び生分解性担体材料を含む多くの医薬品製剤技術が共同経口投与用に開発されている。これらは腸溶性コーティング及びナノ粒子技術とともに、生体分子がプロテアーゼ分解及び浸透吸収に対する障壁を克服するのに有効である。
小腸の微小解剖学的構造及び生理機能について、成人の小腸には約200 m2の腸絨毛吸収面があり、体の栄養素の最大90%の吸収と輸送を担っている。このことは小腸がタンパク質及びポリペプチド薬物の経口送達に最も理想的な放出部位であることを示している。腸溶性コーティングの薬物送達システムを使用することで、生物学的薬物が胃を通過する際の酵素分解を回避し、小腸に直接吸収させることができる。生物学的薬物の経口投与の実例において遭遇するもうひとつの問題は、小腸の内腔に膵臓又は小腸粘膜細胞によって分泌される高濃度の蛋白分解酵素が含まれることである。そのため、適切な経口活性薬を得る鍵は、小腸の内腔でのプロテアーゼ分解から治療用タンパク質及びポリペプチドを保護することである。近年の研究報告では、大豆トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、及びTrasylol（トラシロール）などの多くのトリプシン及びキモトリプシン阻害剤の適用はこれらの酵素の分解効果を減衰させ、インスリンの経口バイオアベイラビリティを向上させることが認められた3。
ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤は毒性が低く、阻害活性が強いため、治療用タンパク質ポリペプチド薬物の経口投与における酵素分解の障害を克服するための補助剤として非常に有効である。これらのポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤のうち、大豆トリプシン阻害剤ファミリーから選択されるBBIファミリー阻害剤には、ヒトトリプシン及びプロテアーゼを阻害する2つの活性ループ（Loop）が含まれる。更に、BBIファミリーのプロテアーゼ阻害剤はエラスターゼに対しても阻害活性を示した。それらの多機能特性は、膵臓による代謝酵素の分泌によって引き起こされる複数の酵素加水分解の問題に適している。従って、この種のプロテアーゼ阻害剤は、PCT特許WO2014191545、WO2019239405、WO2017161184にて公開されている、治療用タンパク質ポリペプチドのプロテアーゼ阻害剤として広く使用されている。
BBIポリペプチド阻害剤と比べて、ヒマワリトリプシン阻害剤-1（SFTI-1）は、ヒマワリの種子から分離された14個のアミノ酸残基のみを含む頭尾環化の環状ペプチドである。PCT特許WO2020023386号は、糖尿病の治療のための経口医薬成分であるプロテアーゼ阻害剤としてのその使用についても記載している。SFTI-1は2つの短いβフォールディング、1分子内ジスルフィド結合及び頭尾環化を含む、剛体構造を形成する。これらの構造的特徴は、トリプシンに対する非常に強力な阻害活性（Ki < 0.1 nM）の分子構造基盤4を構成するSFTI-1のプロテアーゼ阻害活性ループ（Loop）を安定化するのに有効である。SFTI-1は、多くの治療標的を持つセリンプロテアーゼ阻害剤にエンジニアリング的に合成され、蛋白分解酵素（matriptase）5, 6、mesotrypsin7及びカリクレイン関連ペプチダーゼ4（KLK4）8, 9等を含む、癌関連プロテアーゼ阻害剤に工学的再建される。SFTI-1はKLK510, 11, 12, 13や KLK714などの皮膚疾患に関連するプロテアーゼの阻害剤に工学的再建される。さらに、SFTI-1変異体は、鉄過剰症の標的プロテアーゼmatriptase-215、サブチリシン様プロテアーゼFurin16、慢性炎症に関連するカテプシン G（cathepsin G）17, 18、特異性の好中球エラスターゼ様プロテアーゼ319、線維素溶解に関与するフィブリナーゼ20、免疫機能に関連するβ-キモトリプシン様プロテアーゼchymase）21等のプロテアーゼ阻害剤に設計されている。その他、SFTI-1分子が小さく、酵素加水分解に対する耐性があるという構造特性により、優れたタンパク質工学的分子骨格として新しい機能性ペプチドセグメントがSFTI-1分子構造へ移植可能である。それにより放射性治療薬22、血管新生促進化合物23、ブラジキニン B1 受容体拮抗薬24、コルチコチン受容体アゴニスト25、及びアネキシンA1（annexin A1）、α-フィブリノーゲンエピトープとCD接着ドメイン由来の他のペプチドセグメントがSFTI-1分子構造へ移植し、炎症性腸疾患（IBDs）26及び関節リウマチ27,28の治療に使用できる。しかし、これらの工学的に作られるプロテアーゼ阻害ループ（Loop）又はグラフトの活性エピトープの長さは10アミノ酸残基以下に限定されている。SFTI-1分子中の骨格は、グルカゴン様ペプチド-1などのより長いポリペプチド、又は抗体などのタンパク質のエンジニアリング再構築にはまだ使用されていない。
ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と生物学的薬物分子は、ナノ粒子システムに同時にパッケージ化でき、酵素分解による薬物分子への破壊を効率的に保護するため、ポリペプチド及びタンパク質の腸管吸収を向上させることができる。しかし、ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤の大きな欠点は、毒性が高く、特に長期間の投与が必要なことである。一方、プロテアーゼ阻害剤は、胃腸管での正常なタンパク質の消化と吸収を妨害する可能性があり、人間の胃腸管で可逆的又は不可逆的な構造及び機能的損傷を引き起こす可能性がある。ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤は特異的で、特定の時点及び部位のみで作用し、また、生物学的薬物とポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤が代謝吸収部位を同時に通過する必要がある。さらに、ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤を使用すると、吸収部位での薬物全体の量が増加し、薬物がバイオフィルムを通過するのを防ぐことができる。ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤の存在は、胃腸管での栄養素の正常な吸収に影響を与え、さらに代謝酵素の過剰な分泌と発現を刺激し、フィードバック調節を引き起こし、長期の処置は脾腫大及び細胞増殖につながる。
本発明は、分子内ジスルフィド結合を含有し、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチドを提供するものである。既存のSFTI-1ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤の活性ループ（Loop）構造を単純化することにより、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチドを得ることができる。これらのポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化、アシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩はトリプシン、プロテアーゼ及びエラスターゼ等のセリンプロテアーゼの阻害剤として使用することができる。また、薬物治療活性を有するポリペプチド又はタンパク質と融合してハイブリッドペプチドを形成することができ、得られたハイブリッドペプチドはトリプシン、プロテアーゼ、エラスターゼの阻害活性を維持しながら、他の代謝酵素による分解に対する安定性及びin vivo での薬理活性を高める。
本発明の一の態様において、一般式Mで示される構造を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
Xaa6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' -Xaa8' （M）
式中、
Xaa1は、Lys、Arg、Tyr、Phe、Ala又はLeuから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp、Gly、Thr、Arg、システイン又はホモシステインから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala、Thr、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln、Nleから選択されるか又は存在せず、
Xaa6は、システイン、ホモシステインであるか又は存在せず、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala、Met、Asp、Trp又はGluから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg、Gly又はTrpから選択され、
Cys6’がシステイン又はホモシステインから選択される。
Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser、Hyp、Val、Arg又はIleから選択され、
Xaa8'は、Gly、Alaから選択されるか又は存在せず、
ここで、Xaa3とXaa6のうち1つだけがCys又はHcyでなければならない。
Xaa3がシステイン又はホモシステインの場合、Xaa5及びXaa6が存在せず、前記ポリペプチドは、Xaa3とCys6'の間のジスルフィド結合を介して環化され、
Xaa6がシステイン又はホモシステインの場合、前記ポリペプチドは、Xaa6とCys6'の間のジスルフィド結合を介して環化される。
一実施形態において、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有する、一般式Iで示される構造を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
Cys6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' （I）
式中、Cys6又はCys6'は、システイン又はホモシステインから独立して選択され、前記ポリペプチドは、Cys6とCys6'の間のジスルフィド結合によって環化され、
そのうち、Xaa1がLys又はArgから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp又はGlyから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln又はNleから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala又はMetから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser又はHypから選択され、
Xaa1がTyr又はPheから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
Xaa4は、Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp又はGluから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser又はHisから選択され、
Xaa1がAla又はLeuから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Asn、Tyr又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Gln、Tyr、Arg、His又はAsnから選択される。
ここに記載のポリペプチドがSEQ ID NO: 1を有するポリペプチドを含めない。
前記アミノ酸又はその残基が本発明の目的に適したアミノ酸のリスト1を以下に提供する。略語は、有機化学命名法に関するIUPAC委員会及び生化学命名法に関するIUPAC-IUB合同委員会によって提案された、一般的に採用されている命名規則に対応する。
Figure 2023551050000001
 本発明の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、トリプシン阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Lys又はArgから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Gly、Nle、Ser、Thr又はGlnから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa5は、Ala、Gly、Pro、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln又はNleから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile、Ala又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Phe又はTyrから選択される。
本発明の別の好ましい実施形態において、トリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69とSEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78及びSEQ ID NO: 79から選択できる。
本発明の別のより好ましい実施形態において、トリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78及びSEQ ID NO: 79から選択できる。
本発明の別の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、キモトリプシン阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Tyr又はPheから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala又はAbuから選択され、
Xaa4は、Ser、Ala、Phe又はThrから選択され、
Xaa5は、Ala、Gly又はProから選択され、
Xaa1'は、Serから選択され、
Xaa2'は、Ile、Ala又はAsnから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Gln又はHisから選択され、
Xaa8'がGly、Alaから選択される、又は存在しない。
本発明の別の好ましい実施形態において、キモトリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、
SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 111及びSEQ ID NO: 112から選択できる。
本発明の別の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、キモトリプシン様エラスターゼ阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Ala又はLeuから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile又はAsnから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Gln又はTyrから選択される。
本発明の別の好ましい実施形態において、エラスターゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 140及びSEQ ID NO: 165から選択できる。
別の実施形態において、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有する、一般式IIで示される構造を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
Xaa4-Cys3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7'-Xaa8' （II）
式中、Cys3又はCys6'は、システイン又はホモシステインから独立して選択され、前記ポリペプチドは、Cys3とCys6'の間のジスルフィド結合によって環化され、
そのうち、Xaa1がLys又はArgから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala又はMetから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser又はHypから選択され、
Xaa8'は、存在せず、
Xaa1がTyr又はPheから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp又はGluから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser又はHisから選択され、
Xaa8'は、Gly、Alaから選択されるか又は存在せず、
Xaa1がAla又はLeuから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Asn、Tyr又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Gln、Tyr、Arg、His又はAsnから選択され、
Xaa8'は、存在せず、
ここで、前記ポリペプチドがSEQ ID NO: 1を有するポリペプチドを含めない。
本発明の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、トリプシン阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Lys又はArgから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile、Ala又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Phe又はTyrから選択され、
Xaa8'は、存在しない。
本発明の別の好ましい実施形態において、トリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 65及びSEQ ID NO: 66から選択できる。
本発明の別の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、キモトリプシン阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Tyr又はPheから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Ser、Ala、Phe又はThrから選択され、
Xaa1'は、Serから選択され、
Xaa2'は、Ile、Ala又はAsnから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Gln又はHisから選択され、
Xaa8'は、Gly、Alaから選択されるか又は存在しない。
本発明の別の好ましい実施形態において、キモトリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132及びSEQ ID NO: 133から選択できる。
本発明の別のより好ましい実施形態において、キモトリプシン阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 85及びSEQ ID NO: 90から選択できる。
本発明の別の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、キモトリプシン様エラスターゼ阻害活性を有することが好ましい。
式中、Xaa1は、Ala又はLeuから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile又はAsnから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Gln又はTyrから選択され、
Xaa8'は、存在しない。
本発明の別の好ましい実施形態において、エラスターゼ阻害活性を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158及びSEQ ID NO: 162から選択できる。
本発明の別のより好ましい実施形態において、エラスターゼ阻害活性を有するペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩は、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 155及びSEQ ID NO: 156から選択できる。
本発明の特定の実施形態において、セリンプロテアーゼの阻害剤、好ましくはトリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼを阻害する阻害剤を提供する。
本発明はまた、セリンプロテアーゼを阻害する上記ポリペプチドを含む、ハイブリッドペプチドを提供する。これらのポリペプチドのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩は、治療用タンパク質及びポリペプチドのN末端又はC末端と融合する、又は治療用タンパク質及びポリペプチドの分子内に挿入してハイブリッドペプチドを形成し、一般式III、IV、Vの構造を有する。
B-L-A （III）
A-L-B （IV）
A1-L1-B-L2-A2 （V）
式中、
ハイブリッドペプチドの分子量範囲は1.5-30 kDaであり、
Bは、セリンプロテアーゼ阻害活性を有する、分子内ジスルフィド結合を含むペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩であり、
Lは、リンカーで、1、2、3、4又は5つのグリシン又はプロリン残基を任意に含み、
Aは、生理活性オリゴペプチドであり、
A1、A2はそれぞれ生理活性オリゴペプチドのN末端とC末端のペプチドセグメントであり、
L1又はL2はリンカーであり、1、2、3、4又は5つのグリシン又はプロリン残基を任意に含むか、又は存在しない。
一態様において、本発明は治療用グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩の適用方法を提供し、上記ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドは、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208及びSEQ ID NO: 209から選択される。前記ハイブリッドペプチドは2型糖尿病及び/又は肥満症の治療に使用される。
別の態様において、本発明は治療用活性ペプチド（SEQ ID NO: 210）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩の適用方法を提供し、当該活性ペプチドはプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン9型と低密度リポタンパク質受容体（（LDLR）との相互作用を阻害する。上記ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドは、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及びSEQ ID NO: 233から選択される。前記ハイブリッドペプチドは、家族性高コレステロール血症の治療に使用される。
別の態様において、本発明は治療用活性ペプチドサケカルシトニン（SEQ ID NO: 234）、N末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩の適用方法を提供し、上記ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドはSEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236及びSEQ ID NO: 237から選択される。前記ハイブリッド ペプチドは、骨粗鬆症及び/又は変形性関節症などの骨関連疾患及びカルシウム障害の治療に使用される。
別の態様において、本発明は治療用活性ペプチド（SEQ ID NO: 238）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩の適用方法を提供し、この活性ペプチドはIL-17AとIL-17RAとの相互作用を阻害する。前記ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドはSEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240及びSEQ ID NO: 241から選択される。前記ハイブリッドペプチドは炎症性肺疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、全身性硬化症などの炎症性疾患の治療に使用される。
本発明は、さらに、一般式I又はIIで示される構造を有するポリペプチド、又はそれらのアナログ、又はその薬学的に許容される塩を少なくとも１つ、２つ又は３つ含んでもよく、上記ハイブリッドペプチド、前記ハイブリッドペプチドのアナログ、又はその薬学的に許容される塩を一つ又は複数含んでもよいポリペプチド組成物を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、治療用グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩が、ポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドを有する組成物は、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 204及びSEQ ID NO: 208から選択できる。
本発明の好ましい実施形態において、治療用活性ペプチド（SEQ ID NO: 210）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩が、上記のポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドを有する組成物は、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NOs: 214-216、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NOs: 224-233から選択できる。
本発明の好ましい実施形態において、治療用活性ペプチドサケカルシトニン（SEQ ID NO: 234）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されている変異体及びその薬学的に許容される塩が、上記のポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドを有する組成物は、SEQ ID NOs: 235-237から選択できる。
本発明の別の好ましい実施形態において、治療用活性ペプチド（SEQ ID NO: 238）、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されている変異体及びその薬学的に許容される塩が、上記のポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤と形成されるハイブリッドペプチドを有する組成物は、SEQ ID NOs: 239-241から選択できる。
一態様において、本発明は、小腸の上皮を介した生理活性ハイブリッドペプチド又は薬学的に許容される塩の伝達吸収を促進する薬学的に許容される担体、希釈剤、分散剤、促進剤及び/又は賦形剤をさらに含む、同時投与することができる医薬品添加物を提供する。
一方、本発明は、静脈内投与及び／又は経口投与に適した生理活性ハイブリッドペプチド又は薬学的に許容される塩の投与形態を提供する。
一実施形態において、本発明は、生理活性ハイブリッドペプチド又は生物学的製剤を腸吸収部位に効果的に輸送し、生理活性ハイブリッドペプチド又は薬学的に許容される塩とペプシンとの接触及び分解をブロックする、腸溶コーティングカプセル、マイクロカプセル又は微粒子を含む保護薬物送達ビヒクルを提供する。
別の実施形態において、本発明のポリペプチド類プロテアーゼ阻害剤、治療用オリゴペプチド及びハイブリッドペプチド、例えば上記のようなSEQ ID NO: 1-241は、従来の固相又は液相化学合成等の周知のポリペプチド合成技術を使用して取得するか、又は組換えDNA技術によって合成することができる。
有益な技術的効果：本発明は、様々な疾患の治療のための生理活性ペプチドのIn vivo安定性を向上させ、経口投与の実現を促進し、患者の服薬コンプライアンスを改善し、副作用を軽減することができ、有益な経済的価値を有する。
本発明の理解と実施を容易にするために、添付図面を参照して、本発明の１つ又は複数の好ましい実施形態のみを例として説明する。
本発明の様々な特徴は、特許請求の範囲において特別である。以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の特徴及び利点をよりよく理解することができ、本発明の原理は、前記例示的な実施形態で利用される。前記添付図面は以下を含む。
トリプシンのミカエリス定数Kmの測定。Prismソフトを使用して、基質BApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、基質BApNAに対するトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 トリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のトリプシン阻害ペプチド（BT1、BT2、BT3及びBT45）を添加して、トリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 トリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のトリプシン阻害ペプチド（BT1、BT5、BT6及びBT7）を添加して、トリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 トリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のトリプシン阻害ペプチド（BT45、BT9、BT10、BT11、BT15、BT16、BT17、BT27及びBT28）を添加して、トリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 トリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のトリプシン阻害ペプチド（BT9、BT25、BT26、BT35、BT47、BT50、BT53及びBT54）を添加して、トリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 トリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のトリプシン阻害ペプチド（BT9、BT25、BT26、BT66及びBT67）を添加して、トリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 キモトリプシンのミカエリス定数Kmの測定。Prismソフトを使い、基質AAPFpNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、基質AAPFpNAに対するキモトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 キモトリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のキモトリプシン阻害ペプチド（CH1、CH4、CH5及びCH7）を添加して、キモトリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 キモトリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のキモトリプシン阻害ペプチド（CH5、CH10、CH11、CH13、CH17、CH18、CH19、CH23及びCH24）を添加して、キモトリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 キモトリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のキモトリプシン阻害ペプチド（CH10、CH26、CH27、CH31、CH32、CH33、CH34及びCH35）を添加して、キモトリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 キモトリプシン阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のキモトリプシン阻害ペプチド（CH10、CH47、CH49、CH51、CH52及びCH53）を添加して、キモトリプシンに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 エラスターゼのミカエリス定数Kmの測定。Prismソフトを使い、基質AAApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、基質AAApNAに対するエラスターゼの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 エラスターゼ阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のエラスターゼ阻害ペプチド（EC1、EC2、EC7及びEC12）を添加して、エラスターゼに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 エラスターゼ阻害ペプチド阻害活性の測定。異なる濃度のエラスターゼ阻害ペプチド（EC12、EC18、EC19、EC22、EC23及びEC29）を添加して、エラスターゼに対するそれらの阻害効果及び酵素活性の50％阻害濃度（IC50値）を測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 DPP-IVによるGLP-1及びそのアナログの酵素加水分解作用分析。25 μMのGLP-1及びそのアナログと0.5 ng/μLのDPP-IVを100 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）にて37℃で延べ12 hインキュベーションする。0時における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で50 μLを取り出し、10%（v/v）TFAを加えて反応を停止させ、原型ポリペプチドに対するその時点でのポリペプチドの残存割合（%）を逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定する。実験では、3回の繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。A，SEQ ID NO: 186-190，SEQ ID NO: 192，SEQ ID NO: 193；B，SEQ ID NO: 194-201；C，SEQ ID NO: 202-205；D，SEQ ID NO: 206-209。 NEP24.11によるGLP-1及びそのアナログの酵素加水分解作用分析。30 μMのGLP-1及びそのアナログと1.0 ng/μLのNEP24.11を50 mM HEPES、50 mM NaCl緩衝液（pH 7.4）にて37℃で延べ8 hインキュベーションする。0時における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で50 μLを取り出し、10%（v/v）TFAを加えて反応を停止させ、原型ポリペプチドに対するその時点でのポリペプチドの残存割合（%）を逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定する。実験では、3回の繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。A，SEQ ID NO: 186-193；B，SEQ ID NO: 194-201。 トリプシンによるGLP-1及びそのアナログに対する酵素分解作用の分析 60 μMのGLP-1及びそのアナログと2.0 ng/μLのトリプシンを50 mM Tris、20 mM CaCl2の緩衝液（pH 7.8）にて37℃で延べ9 min又は60 minインキュベーションする。0時における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で25 μLを取り出し、10%（v/v）TFAを加えて反応を停止させ、原型ポリペプチドに対するその時点でのポリペプチドの残存割合（%）を逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定する。実験では、3つの繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。A，SEQ ID NO: 186-193；B，SEQ ID NO: 194，SEQ ID NO: 196，SEQ ID NO: 198，SEQ ID NO: 200；C，SEQ ID NO: 195，SEQ ID NO: 197，SEQ ID NO: 199，SEQ ID NO: 201。 キモトリプシンによるGLP-1及びそのアナログに対する酵素分解作用の分析 60 μMのGLP-1及びそのアナログと1.0 ng/μLのキモトリプシンを50 mM Tris、20 mM CaCl2の緩衝液（pH 7.8）にて37℃で延べ9 min又は60 minインキュベーションする。0時における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で25 μLを取り出し、10%（v/v）TFAを加えて反応を停止させ、原型ポリペプチドに対するその時点でのポリペプチドの残存割合（%）を逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定する。実験では、3回の繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。A，SEQ ID NO: 186-193；B，SEQ ID NO: 194-201；C，SEQ ID NO: 202-205。 エラスターゼによるGLP-1及びそのアナログに対する酵素分解作用の分析。60 μMのGLP-1及びそのアナログ（SEQ ID NO: 206-209）と10 ng/μLのエラスターゼを50 mM Trisの緩衝液（pH 8.0）にて37℃で延べ60 minインキュベーションする。0時における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で25 μLを取り出し、10%（v/v）TFAを加えて反応を停止させ、原型ポリペプチドに対するその時点でのポリペプチドの残存割合（%）を逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定する。実験では、3回の繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。 ヒト血清によるGLP-1及びそのアナログに対する酵素分解作用の分析 30 μMのGLP-1及びそのアナログと25%（v/v）のヒト血清を50 mM Trisの緩衝液（pH 7.0）にて37℃で延べ12 hインキュベーションする。0時間における原型ポリペプチドの量を100%とし、異なる時点で100 μL反応液を取り出し、事前に冷却した無水メタノール300μLを添加して反応を停止させる。試料を高速遠心分離し、上清を分取し、凍結乾燥させ、50% （v/v）メタノール/水溶液の再溶解試料60μLを加え、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、原型ポリペプチドに対するその時点のポリペプチドの残存割合（%）を測定する。実験では、3回の繰り返しが設定され、計算値が平均値± 標準偏差として表される。A，SEQ ID NO: 194，SEQ ID NO: 196，SEQ ID NO: 198，SEQ ID NO: 200；B，SEQ ID NO: 202-205；C，SEQ ID NO: 206-209。 GLP-1アナログ皮下投与時のIn Vivo血糖降下活性 正常ICRマウスにGLP-1及びそのアナログ、又は対応する容量の生理食塩水（1.0 μmol/kg，n = 10）を皮下注射投与し、30 min後にブドウ糖溶液（2 g/kg）を強制経口投与し、糖投与後30 min、60 min及び120 minにそれぞれ尾の先端から採血し、グルコースオキシダーゼ法で血糖値を測定し、各時刻における血糖値及び血糖曲線下面積（AUC）を計算した。計算値が平均値±標準偏差で表され、p < 0.05が統計学的差異があると考えられる。A，SEQ ID NO: 194，SEQ ID NO: 196，SEQ ID NO: 198，SEQ ID NO: 200；B，SEQ ID NO: 195，SEQ ID NO: 197，SEQ ID NO: 199，SEQ ID NO: 201；C，SEQ ID NO: 202-205；D，SEQ ID NO: 206-209。 GLP-1アナログの十二指腸投与のIn Vivo血糖降下活性。正常ICRマウスをジエチルエーテル吸入麻酔後、十二指腸を外科的に摘出し、GLP-1及びそのアナログ、又は相応する容量の生理食塩水（10.0μmol/kg、n=9-11）を注入し、最後に創傷を縫合した。15 min後にブドウ糖溶液（2 g/kg）を強制経口投与し、糖投与後15 min、30 min及び60 minにそれぞれ尾の先端から採血し、グルコースオキシダーゼ法で血糖値を測定し、各時刻における血糖値および血糖曲線下面積（AUC）を計算した。計算値が平均値±標準偏差で表され、p < 0.05が統計学的差異があると考えられる。A，SEQ ID NO: 194，SEQ ID NO: 196，SEQ ID NO: 198，SEQ ID NO: 200；B，SEQ ID NO: 202-205；C，SEQ ID NO: 206-209。 GLP-1アナログの十二指腸組合せ投与のIn Vivo血糖降下活性及び用量反応関係 正常ICRマウスをジエチルエーテル吸入麻酔後、十二指腸を外科的に摘出し、異なる容量（2.5、5.0、10.0 μmol/kg，n = 9-11）又は異なる割合での組合せ（5.0 + 5.0 μmol/kg、5.0 + 5.0 +5.0 μmol/kg，n = 14-15）のGLP-1アナログ、又は該当する体積の生理食塩水を注入し、最後に創傷を縫合した。15 min後にブドウ糖溶液（2 g/kg）を強制経口投与し、糖投与後15 min、30 min及び60 minにそれぞれ尾の先端から採血し、グルコースオキシダーゼ法で血糖値を測定し、各時刻における血糖値および血糖曲線下面積（AUC）を計算した。計算値が平均値±標準偏差で表され、p < 0.05が統計学的差異があると考えられる。A，SEQ ID NO: 200の用量反応関係；B，SEQ ID NO: 204の用量反応関係；C，二重組成物（SEQ ID NO: 200とSEQ ID NO: 204）及び三重組成物（SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 204及びSEQ ID NO: 208）の用量反応関係。 ラットの血中カルシウム濃度の割合-時間曲線。通常の対照群（Con）と比べると、市販サケカルシトニン（sCat）群のラット血中カルシウム濃度は投与後3、4、6、8、12、24時間に有意に低下し、統計的に有意差があった（**p<0.01）。合成カルシトニンアナログ（CalM）群のラットは投与後3時間目に有意に低下し、統計学的に有意差があった（**p< <0.01）。カプセル剤形Cal-BT群ラットは投与後24時間以内に実験ラットの血中カルシウム濃度を効果的に低下させる効果を示さず、統計的に有意差がなかった。
SFTI-1天然ポリペプチド類のプロテアーゼ阻害剤の構造を簡素化し、その活性Loopの特異性及びセリンプロテアーゼ阻害活性を向上させるために、合理的な設計方法を用いて、分子内ジスルフィド結合を含むポリペプチドの3つのシリーズをスクリーニングし、同定し、膵臓から分泌されるトリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼの酵素分解活性をそれぞれ特異的に阻害する。これら3つのプロテアーゼの代謝酵素活性は治療性ポリペプチドタンパク質が小腸上皮で吸収され、血液循環に入り、作用を果たすための主な制約因子である。そこで、本発明は、実験対象として4つの生物活性ポリペプチドを選択し、前述3種類のプロテアーゼ阻害活性の異なるポリペプチドが、治療性ポリペプチドと融合したハイブリッドペプチドを形成するための汎用分子骨格として機能し得るかどうか、ハイブリッドペプチドにおける治療性ポリペプチドの代謝酵素分解に耐える安定性を向上させることができるかどうか、小腸上皮におけるハイブリッドペプチドの吸収及びin vitro薬理活性を促進することができるかどうかを実験的に検証する。実験結果により、異なるプロテアーゼ阻害活性を有するその3つのポリペプチド分子骨格が治療性ポリペプチドタンパク質の安定性及びin vitro効果の向上に幅広く使用できることが確認された。
In vitro酵素阻害活性測定方法を利用する際、まず、裁断されてジスルフィド結合のみを含むSFTI-1変異体BT45（SEQ ID NO:45）を設計・合成し、その阻害定数（Ki）がジスルフィド結合のみを含む単環SFTI-1（BT1,SEQ ID NO:1）と同じ（6.4 nM）であることが実験により検証された。最後、裁断された変異体BT45のペプチドセグメントがトリプシンを阻害する最もコアなペプチドセグメント（分子骨格）であると確定された。P3部位の変異がコア骨格のトリプシン阻害活性に深刻な影響を及ぼすかどうかを探索するために、CysをGly、Alaに変異すると同時に、ジスルフィド結合間のアミノ酸残基を添加し、即ち、ジスルフィド結合間の環（Loop）を拡張し、検証した結果から、トリプシン阻害活性を有する分子骨格を変化させることができ、つまり、2）、BT3（SEQ ID NO:3）が得られることが確認された。これに基づいて、別の好ましい実験プロトコルにおいて、トリプシン阻害活性が増強された分子骨格SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及びSEQ ID NO：7が得られた。上記の切断されたコア骨格とジスルフィド結合間のペプチドセグメント拡張に合わせて、一連のアミノ酸部位変異を行い最適化し、分子骨格SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78及びSEQ ID NO: 79が得られた。これらのポリペプチド分子骨格がトリプシン活性を良好に阻害できる。
セリンプロテアーゼ阻害ペプチドのP1部位が異なるセリンプロテアーゼの特異性を決定する。その内、キモトリプシンのP1部位はTyr、Pheで、エラスターゼのP1部位はAla、Leuである。膵臓に分泌されるキモトリプシン29, 30, 31とエラスターゼ32を阻害する活性ポリペプチドゼ分子骨格に関する文献はいくつかあるが、活性阻害が比較的に弱い。本発明がトリプシンを阻害するコア分子骨格に基づいて、P1部位の置換によりペプチド分子骨格を阻害するプロテアーゼの特異性を変化させ、更に異なる認識部位の置換及び阻害活性の評価を行い、一連の最適化実験を経て、キモトリプシンを阻害するポリペプチド分子骨格SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132及びSEQ ID NO: 133、ブタ膵臓エラスターゼ阻害のポリペプチド分子骨格SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158及びSEQ ID NO: 162が得られた。
定義：
本願において特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての用語が本発明の分野における当業者が理解するものと同じ意味を有する。以下の定義が本発明の詳細な説明及び特許請求を記述するために使用される用語の明瞭さを提供するために提供される。
文脈によって特に明確に示されない限り、単数形「一個/一種（a）」、「一個/一種（an）」及び「前記（the）」には複数形が含まれる。
「含む」という用語が「これらに限定されない」を意味する。「含む」と「これらに限定されない」が互換使用可能である。
本願において「アミノ酸」又は「任意アミノ酸」という用語が天然に存在するアミノ酸（例えば、α-アミノ酸）、非自然（Unnatural）アミノ酸及び非天然（non-natural）アミノ酸を含む任意かつ全てのアミノ酸を意味する。D-アミノ酸とL-アミノ酸が含まれる。天然アミノ酸は天然に存在するアミノ酸を含む。例えば、組み合わせてペプチド鎖を形成して、大量のタンパク質の構造単位を形成する20種類のアミノ酸があり、これらのアミノ酸が主にL立体異性体である。「非自然」又は「非天然」アミノ酸は非タンパク質アミノ酸（即ち、自然にコードされていないか、又は遺伝的コドンに存在しないもの）であり、自然発生または化学的に合成されるものである。これらの「非自然」又は「非天然」アミノ酸は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物がある。即ち、ホモシステイン、n-ロイシン、ヒドロキシプロリン及び2-アミノブタン酸等、水素結合炭素、カルボキシル基、アミノ基及びR基に結合する炭素が挙げられ、分子内ペプチド結合に関与する際、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
当業者は、本願に開示されるポリペプチド配列が左から右に示され、配列の左端がポリペプチドのN末端であり、右端がポリペプチドのC末端であることを明らかにする。
用語「蛋白」と「ポリペプチド」は、本願において交換的に使用され、広義には2つ以上のアミノ酸がペプチド結合を介して連結された配列を意味する。2つの用語が特定の長さのアミノ酸ポリマーを暗示するものではなく、ポリペプチドが組換え技術、化学合成または酵素合成によって産生されるか、または天然に存在するか否かを暗示又は区別することを意図しないことを理解すべきである。
本願の用語「薬学的に許容される塩」が本発明のポリペプチド又は化合物の塩又は両性イオン形態を表し、水溶性又は油溶性又は分散性であり、疾患の治療に適している以外に、過度の毒性、刺激及びアレルギー反応が無い。合理的なメリット/ハザード比に相応し、意図された使用に有効である。前記塩が化合物の最終分離及び精製中に調製することができる。又は、アミノ基を適当な酸と反応させることにより単独で調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、塩酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。
本願に使用されるように、本願の用語「阻害環（Loop）」とは反応環を意味し、SchecterとBergerの命名法33に従い、一般式IとIIで「阻害環」が分子内ジスルフィド結合を有し、基質-プロテアーゼ相互作用部位をカバーする。一般式IとIIにおけるXaa1残基に対応するP1部位がトリプシンの特異性の主要决定因子である。
本願に使用されるように、本願の用語「分子骨格」が「阻害環」を指すか、それと互換使用できる。それが、一般式IとIIにおけるXaa1残基のP1部位に対応し、異なるプロテアーゼの特異性を決定する。いくつかの実施形態では、前記分子骨格は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を置換する修飾を含む変異体骨格である。
本願において「リンカー」という用語は広義に、2つのポリペプチドを結合して1つの化学構造を形成することができる、折り返し構造からグリシン又はプロリンが豊富なペプチドセグメントへの形成を促進するものである。
当業者が理解するように、複数のシステイン残基を有するポリペプチドが常に、このような2つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を形成する。本願に示すような全てのポリペプチドが任意に1つ以上のジスルフィド結合を含むように定義される。
本願の用語「プロテアーゼ阻害薬」又は「酵素阻害剤」はプロテアーゼの機能を阻害するポリペプチド分子を指す。本発明の一態様において、プロテアーゼ阻害薬がセリンプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ阻害薬）類からのプロテアーゼを阻害する。本発明の一態様において、プロテアーゼ阻害剤が哺乳動物の消化器に発見されるトリプシンを阻害する。
治療用ポリペプチド：
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）が抗糖尿病活性を有する内因性ホルモンである。GLP-1がエキソペプチダーゼであるジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）及び中性エンドペプチダーゼ24.11（neutral endopeptidase （NEP） 24.11）によって不活化される。完全に活性なGLP-IがIn vivoでの実効半減期が約90秒となる。その血液循環における安定性を向上させるために、阻害ペプチドであるdiprotin A （IPI）34及び/又はOpiorphin （QRFSR）35が「GG」（2つのグリシンペプチドセグメント）などのリンカー（Linker）を介して、GLP-1のN末端に連結される。候補であるGLP-1アナログが本発明に開示されたポリペプチド阻害剤（分子骨格）と更に融合し、経口投与による血糖降下作用を検証する。一実施形態について、まず、皮下注射投与実験にてGLP-1アナログSEQ ID NO: 184、SEQ ID NOs: 186-209が血糖降下活性を有することが実証された。別の十二指腸への直接投与実施形態にてSEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205が十二指腸上皮吸収により血循環に入り、血糖降下活性を有し、本質的には腸溶性カプセル投与によりGLP-1アナログの経口投与による血糖降下作用を達成することができる。別の実施形態では、異なるプロテアーゼ阻害ペプチドを含むGLP-1アナログが組合せ効果を有することを提供する。
プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン9型（PCSK9）がLDL受容体（LDLR）タンパク質分解を媒介することにより、低比重リポ蛋白-コレステロール（LDL-C）のレベルを調整する。PCSK9がPCSK9-LDLRのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を阻害することで血漿LDL-Cレベルを制御するための重要な標的であるため、PCSK9とLDLRの結合を抑制するための主な戦略はPCSK9とLDLRの結合部位に拮抗するのを利用してLDL-Cレベルを効果的に低下させることである36。これらのモノクローナル抗体薬がPCSK9の阻害を成功した方略を代表するが、患者長期治療のコンプライアンス問題を解決できない。患者のコンプライアンスを向上させるために、阻害ペプチドPep2-837が同定されたが、in vitroでの生化学的分析と細胞レベルの活性研究のみが確認された。Pep2-8のアナログ（SEQ ID NO: 210，PCSK9_1）を治療性ポリペプチドの候補として選択し、本発明に開示されたポリペプチド類のセリンプロテアーゼ阻害剤（分子骨格）と更に融合し、十二指腸への直接投与による高コレステロール血症の治療効果を検討した。一つの実施形態では、in vitroでPCSK9-LDLR分子作用を阻害する実験で、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及びSEQ ID NO: 233が比較的良好な阻害作用があることが確認された。また、もう一つの実施形態では、高脂血モデルを用いて皮下注射投与によってSEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230及びSEQ ID NO: 231を評価した。それらのポリペプチドがIn vivo血中脂質（総コレステロール）降下活性を示した。
ヒトカルシトニン（hCT）は、主に甲状腺濾胞傍細胞によって産生される32個のアミノ酸残基を含むポリペプチドホルモンである。サケカルシトニン（salmon calcitonin，sCT）、ウナギカルシトニン、ブタカルシトニン、ニワトリカルシトニン等、多くのカルシトニン同族体が既に分離されている。そのうち、sCTは、hCTに比べてより効果的で、より長く持続でき、骨粗鬆症、骨転移、パジット病、高カルシウム血症ショック、末期癌慢性疼痛の治療に幅広く使用されている。現時点、カルシトニンは、溶液形態のみで、静脈内投与、筋肉注射、皮下注射、又は鼻内投与などの方式によって投与することができる。しかし、これらのカルシトニンの投与方法が経口投与ほど便利ではなく、より多くの患者に不快感を与えている。通常、この不便又は不快感により、患者が治療レジメンを余りにも遵守しないことにつながる。これらの制限を克服し、より良い忍容性のある治療形態を提供するために、治療性ポリペプチドの候補であるsCTアナログが本発明に開示されたポリペプチド類のセリンプロテアーゼ阻害薬（分子骨格）と更に融合し、経口投与により骨粗鬆症又は変形性関節症の治療効果を有することが確認された。
インターロイキン-17A（IL-17A）は、活性化されたTh17細胞、CD8+T細胞、y6 T細胞及びNK細胞などが分泌したサイトカインであり、抗菌ペプチド（ディフェンシン）等のメディエーターの産生を調節し、線維芽細胞や滑膜細胞等、複数細胞種における炎症性サイトカイン及びケモカインが好中球生物学、炎症、臓器破壊及び宿主防御に関与する。IL-17Aがインターロイキン-17受容体A（IL-17RA）及び受容体C（IL-17RC）との相互作用により機能する。L-17Aの不適切又は過剰産生が関節リウマチ、気道アレルギー（喘息などのアレルギー性気道疾患を含む）、皮膚アレルギー（アトピー性皮膚炎を含む）、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患を含む肺疾患を含む様々な疾患及び疾患の病理学と関連性がある。Secukizumab、Ixekizumab及びBimekizumab等の抗IL-17A抗体がIL-17Aを介した炎症性障害及び疾患の治療に使用されている。抗体療法の薬物動態、効果・安全性が特定の成分に依存するため、IL-17Aを介した疾患の治療に適した抗体薬を改善する必要がある。構造的にIL-17A/IL-17RA相互作用の大きくて浅い相互作用界面に対して、タンパク質相互作用に対する小分子化合物を開発しにくい。L-17Aとの親和性が高いポリペプチドアンタゴニストと抗IL-22抗体との融合による二重特異性融合体の形成について検討した。残念なことに、これらの研究結果が細胞培養において抗IL-17Aのペプチド阻害の安定性が悪い38,39という問題を示唆した。IL-17Aポリペプチドアンタゴニストのアナログ（SEQ ID NO: 238）を治療性ポリペプチドの候補として選択し、本発明に開示されたポリペプチド類のセリンプロテアーゼ阻害剤（分子骨格）と更に結合し、十二指腸への直接投与によるIn vivo抗炎症活性を検証した。一実施形態では、耳部腫脹モデルを用いて皮下注射投与によってSEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240がより良い抗炎症活性を有すると評価した。もう一つ実施形態において、十二指腸への直接投与によって、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240が小腸上皮吸収を経て血流循環に入る時に抗炎症活性を有すると検証した。
本発明により得られるポリペプチドプロテアーゼ阻害剤が治療性ポリペプチド又はタンパク質抗消化酵素の安定性向上に幅広く使用できる。そのうち、治療性ポリペプチド又はタンパク質が本発明に開示された例として選択されたポリペプチドに限定されない。前記治療性ポリペプチド又はタンパク質が下記配列から選択できる：例えば、抗菌、抗ウイルス及び免疫調節活性を有するLL-37（SEQ ID NO: 242，LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES）及びそのアナログ；正電荷が豊富なカチオン性抗菌ペプチドHistatin 5（SEQ ID NO: 243，DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY）、indolicidin（SEQ ID NO: 244，ILPWKWPWWPWRR）、Pexiganan（SEQ ID NO: 245，GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK）及びそのアナログ；抗菌ペプチドMAF-1A（SEQ ID NO: 246，KKFKETADKLIESALQQLESSLAKEMK）；抗HIVポリペプチド薬Sifuvirtide（SEQ ID NO: 247，SWETWEREIENYTRQIYRILEESQEQQDRNERDLLE）、Enfuvirtide（SEQ ID NO: 248，YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF）及びそのアナログ；抗HBVポリペプチドC1-1（SEQ ID NO: 249，YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF）及びそのアナログ；抗HCV活性ポリペプチドp14（SEQ ID NO: 250，RRGRTGRGRRGIYR）、E2-550（SEQ ID NO: 251，SWFGCTWMNSTGFTKTC）、C5A（SEQ ID NO: 252，SWLRDIWDWICEVLSDFK）及びそのアナログ；抗ピロリ菌活性ポリペプチドcagL-cagL（SEQ ID NO: 253，KNKNFIKGIRKLMLAHNK）、CagA-ASPP2（SEQ ID NO: 254，GPNIQKLLYQRTTIAAMETI）、P1（SEQ ID NO: 255，TGTLLLILSDVNDNAPIPEPR）及びそのアナログ；１型糖尿病治療のDiaPep 277（SEQ ID NO: 256，VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED及びそのアナログ；２型糖尿病治療のエキセナチド（exendin-4，SEQ ID NO: 257，HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS）及びそのアナログ；血中脂質を下げる活性ポリペプチドEGF-A1（SEQ ID NO: 258，GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDI）、EGF-A5（SEQ ID NO: 259，GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECL）、BMS-962476（SEQ ID NO: 260，PYKHSGYYHRP）及びそのアナログ；抗炎症活性ポリペプチドTag7（SEQ ID NO: 261，ALRSNYVLKGHRDVQRTLSPG）、ZDC（SEQ ID NO: 262，HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS）及びそのアナログ；以下のような腫瘍の発生又は進行を阻害する活性ポリペプチド：腫瘍血管新生阻害エンドセリン（endostatin，SEQ ID NO: 263，CPAASARDFQPVLHLVALCSPLSGGMRGIR）、低酸素誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）阻害ペプチド（SEQ ID NO: 264，GLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN）、Bcl-2 BH3（SEQ ID NO: 265，EDIIRNIARHLAQVGDSNDRSIW）、免疫チェックポイント阻害ペプチド（herpes virus entry mediator，HVEM）（SEQ ID NO:266，ECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEP）、p53/MDM2に拮抗するpDI（SEQ ID NO: 267，LTFEHYWAQLTS）、Bak/Bcl-2に拮抗するPPKID4（SEQ ID NO: 268，GPSQPTYPGDDAPVRRLSFFYILLDLYLDAPGVC）のような腫瘍因子相互作用のアンタゴニストペプチド等及びそのアナログ。前記各治療性活性ポリペプチドと本発明で得られたポリペプチド類のプロテアーゼ阻害薬によって形成されるハイブリッドペプチドが皮下注射投与又は経口投与又は局所外用に限定されない。
ポリペプチド合成
本発明のポリペプチドが種々の方法により製造することができる。例えば、ポリペプチドが一般的に使用される固相合成法によって合成することができる。当技術分野で公知のα-アミノ基のt-BOC又はFMOC保護に関する方法が挙げられる。ここで、アミノ酸が成長するアミノ酸鎖に逐次的に付加される。固相合成法が特に大量生産におけるポリペプチド又は比較的短いポリペプチド、例えば、約70アミノ酸までの長さのポリペプチドの合成に好適である。
酵素阻害活性の測定
合成した各種の活性ポリペプチド類のプロテアーゼ阻害薬（分子骨格）の阻害定数を測定した。発色基質N-サクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリン（AAPFpNA）、Nα-ベンゾイル-L-アルギニン-4-ニトロアニリン塩酸塩（BApNA）及びN-サクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリン（AAApNA）をそれぞれ用いて、競合結合によりブタα-キモトリプシン、ウシトリプシンとブタ膵臓エラスターゼの阻害活性を測定した。ブタα-キモトリプシンとウシトリプシンの阻害活性の関連実験を20 mM CaC12、50 mM Tris-HC1緩衝液（pH 7.8）で行い、ブタエラスターゼの阻害活性相関実験を50 mM Tris-HC1緩衝液（pH 8.0）で行った。ポリペプチド濃度を280nmにおける光学密度（OD）で測定した。酵素加水分解基質のミスター定数（Km）を405nmにおける基質加水分解の初速度から算出した。完全加水分解後基質の吸光度値を405nmで測定した。全てのデータを非線形回帰処理された。
腸溶性カプセル
本発明の固形経口薬物組成物が剤形を含み、この固形経口薬物組成物の剤形が腸溶性カプセルである。このようなカプセルは、経口投与を封入するための医薬品製剤の比較的安定したシェルに限定されない。カプセルの2つの主要なタイプは、ハードシェルカプセルとソフトシェルカプセルであり、乾燥、粉末成分、マイクロペレット又はミニ錠剤によく使用され、主に油及び油に溶解又は懸濁する活性成分に使用されている。ハードシェルとソフトシェルカプセルの両方がゲル化剤の水溶液から作ることができる。ゼラチン等の動物タンパク質、カラゲニン等の植物多糖類又はそれらの誘導体、又は修飾形態のデンプン及びセルロースが挙げられる。可塑剤、グリセリン及び/又はソルビトール、着色剤、防腐剤、崩壊剤、潤滑剤及び表面処理剤などの他の成分をゲル化剤の溶液に添加することでカプセルの硬度を低減することができる。本発明のカプセルは、ポリメタクリル酸/アクリレートでコーティングされる腸溶性カプセルである。十二指腸及び小腸を標的とするカプセル包材がEudragit L100又はL100-55から選択される。結腸を標的とする包材がEudragit S100から選択され、当該技術分野において公知の方法に従って、腸溶性コーティング又は変性腸溶性コーティングを調製することができる。
固形経口医薬組成物の調製方法
本発明の固形経口医薬組成物が当該技術分野において公知の方法で調製することができる。前記固形経口医薬組成物が本願の実施例に記載のように調製することができる。
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以下の実施例を引用することで本発明の実施形態を説明する。本発明をよりよく理解できるのが唯一の目的で、本発明の範囲又は精神を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1 ポリペプチド固相合成
各ポリペプチドのアミノ酸残基の配列に従って、C末端からN末端まで、９‐フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）の固相化学合成法を用いて1つずつ合成する。アミノ酸側鎖保護用の直鎖状ペプチドの合成が完了したら、樹脂から直鎖状ペプチドを切断し、直鎖状ペプチド中のアミノ酸残基の保護基を除去し、更に分子内メルカプト基の酸化環化でジスルフィド結合を形成し、最後に高速液体クロマトグラフィーの逆相C18カラムクロマトグラフィーで精製して標的ポリペプチドを得る。
一、原材料
（1）樹脂：Fmoc-L-アラニン-Wang樹脂（Fmoc-Ala-Wang resin）、Fmoc-N-(2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾジヒドロフラン-5-スルホニル)-L-アルギニン-Wang樹脂（Fmoc-Arg(Pbf)-Wang resin）、Fmoc-N-トリチル-L-アスパラギン-Wang樹脂（Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin）、Fmoc-L-アスパラギン酸4-tert-ブチル-Wang樹脂（Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin）、Fmoc-N-トリチル -L-グルタミン-Wang樹脂（Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin）、Fmoc-グリシン-Wang樹脂（Fmoc-Gly-Wang resin）、Fmoc-N-tert-ブトキシカルボニル-L-アルギニン-Wang樹脂（Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin）、Fmoc-L-フェニルアラニン-Wang樹脂（Fmoc-Phe-Wang resin）、Fmoc-L-プロリン-Wang樹脂（Fmoc-Pro-Wang resin）、Fmoc-O-tert-ブチル-L-セリン-Wang樹脂（Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin）、Fmoc-O-tert-ブチル-L-チロシン-Wang樹脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin）、Fmoc-L-バリン-Wang樹脂（Fmoc-Val-Wang resin）、Fmoc-S-トリチル-L-ホモシステイン-2-クロロトリチル樹脂（Fmoc-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resin）、Fmoc-L-プロリン-2-クロロトリチル樹脂（Fmoc-Pro-2-Cl-Trt resin）、Fmoc-N-tert-ブトキシカルボニル-L-アルギニン-Rink Amide AM樹脂（Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin）、Fmoc-L-プロリン-Rink Amide AM樹脂（Fmoc-Pro-Rink Amide-AM Resin）、Fmoc-L-フェニルアラニン-Rink Amide AM樹脂（Fmoc-Phe Rink Amide-AM Resin）。
（2）アミノ酸：Fmoc-L-アラニン（Fmoc-Ala-OH）、Fmoc-N-(2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾジヒドロフラン-5-スルホニル)-L-アルギニン（Fmoc-Arg(Pbf)-OH）、Fmoc-N-トリチル-L-アスパラギン（Fmoc-Asn(Trt)-OH）、Fmoc-L-アスパラギン酸4-tert-ブチル（Fmoc-Asp(OtBu)-OH）、Fmoc-S-トリチル-L-システイン（Fmoc-Cys(Trt)-OH）、Fmoc-S-アセトアミノメチル-L-システイン（Fmoc-Cys(Acm)-OH）、Fmoc-N-トリチル-L-グルタミン（Fmoc-Gln(Trt)-OH）、Fmoc-L-グルタミン酸5-tert-ブチル（Fmoc-Glu(OtBu)-OH）、Fmoc-グリシン（Fmoc-Gly-OH）、N-Fmoc-N'-トリチル-L-ヒスチジン（Fmoc-His(Trt)-OH）、Fmoc-L-イソロイシン（Fmoc-Ile-OH）、Fmoc-L-ロイシン（Fmoc-Leu-OH）、Fmoc-N-tert-ブトキシカルボニル-L-アルギニン（Fmoc-Lys(Boc)-OH）、Fmoc-L-メチオニン（Fmoc-Met-OH）、Fmoc-L-フェニルアラニン（Fmoc-Phe-OH）、Fmoc-L-プロリン（Fmoc-Pro-OH）、Fmoc-O-tert-ブチル-L-セリン（Fmoc-Ser(tBu)-OH）、Fmoc-O-tert-ブチル-L-トレオニン（Fmoc-Thr(tBu)-OH）、Fmoc-N-tert-ブトキシカルボニル-L-トリプトファン（Fmoc-Trp(Boc)-OH）、Fmoc-O-tert-ブチル-L-チロシン（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）、Fmoc-L-バリン（Fmoc-Val-OH）、Fmoc-S-トリチル-L-ホモシステイン（Fmoc-homoCys(Trt)-OH）、Fmoc-L-α-アミノ酪酸（Fmoc-Abu-OH）、Fmoc-トリチル-L-4-ヒドロキシプロリン（Fmoc-Hyp(Trt)-OH）及びFmoc-L-ノルロイシン（Fmoc-Nle-OH）。
（3）試薬：ピペリジン、DMF(N,N-ジメチルホルムアミド)、DCM(ジクロロメタン)、4-ピコリン(4-メチルピリジン)、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)、HATU(2-(7-アザベンゾトリアゾール)-N,N,N′,N′-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸エステル)、HOBT(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、TBTU(O-(1-ベンゾトリアゾリル)-N,N,N′,N′-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート)、DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)、TFA(トリフルオロ酢酸)、EDT(1,2-エタンジチオール)、TIPS(トリイソプロピルシラン)、TA(ベンゾチアゾール)、フェノール、ジエチルエーテル、DMSO(ジメチルスルホキシド)、純水。
二、合成方法1
SEQ ID NO: 9（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
（1）Fmoc-Phe-Wang resinを出発原料とし、合成スケールは0.1 mmolとする。C末端からN末端方向への合成では、まずピペリジン/DMF(1:3, v/v)でN末端Fmoc保護基を除去し、N末端を遊離アミノ基にする。Fmoc-Cys(Trt)-OHの4倍当量をHOBt/DICに溶解し、樹脂とグラフトし、C末端2番目のアミノ酸残基（Cys）を導入して、Fmoc-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを得る。このように、まず保護を除去し、ポリペプチド配列の各アミノ酸残基を繰り返して順次連結することで、最終的に保護基を有するペプチドセグメントを得る。即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin。上記各反応後に、いずれもDMFとDCMを用いて交互に樹脂を6回洗浄する必要がある。また、カイザーテストを樹脂に対して行うとき、アミノ酸縮合反応が不完全な場合、必要とする標的ペプチドセグメントが得られるまで縮合を1回繰り返す。
（2）Fmocを除去し、さらに切断試薬（TFA、EDT、TA、フェノール、純水、TIPSを一定の割合で混合したもの）を用いて30℃で3時間切断し、標的ポリペプチドを樹脂から切断してアミノ酸側鎖保護基を除去し、濾液を多量の冷ジエチルエーテルに加えてポリペプチドを沈殿し析出させ、遠心分離する。ジエチルエーテルで数回洗浄後に凍結乾燥し、ポリペプチド粗品Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Pheを得る。
（3）上記ポリペプチド粗品をとり、4 mg/mLとなるようDMSO/H2O(1:4,v/v)溶液に溶ける。24時間後に反応液を採取しHPLCによる追跡を行う。酸化反応が完全な場合にそのまま精製処理とし、酸化反応が不完全な場合に反応時間を完全反応までに延長する。
（4）高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、標的ポリペプチドを得る。MALDI-TOF質量スペクトルでその化学構造を表す。SEQ ID NO: 9の実測分子量は1391.06 Da([M + H]+)である。
SEQ ID NO: 1（Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Asp）
SEQ ID NO: 1はFmoc-Asp(OtBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Asp(OtBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1532.31Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 10
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Ala-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 10はSEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Ala-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量が1364.72 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 211
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 211はSEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2956.82 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 212
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 212はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は3013.20 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 214
（Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 214はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に該当するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は3012.71 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 215
（Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 215はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は3082.43 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 216
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 216はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、最終的に標的ペプチドセグメントをる。実測分子量は3105.15 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 218
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 218はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2977.09 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 224
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 224はFmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2999.77 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 225
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 225はFmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2766.11 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 226
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 226はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2999.12 Da ([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 227
（Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 227はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2766.78 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 228
（Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 228はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2999.34 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 229
（Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 229はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2822.72 Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 230
（Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly- Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 230はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1021.6 Da ([M+H]3-) である。
SEQ ID NO: 231
（Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser）
SEQ ID NO: 231はFmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2891.97 Da ([M+H]+) である。
SEQ ID NO: 232
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 232はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は3091.42 Da ([M+H]+) である。
SEQ ID NO: 233
（Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val）
SEQ ID NO: 233はFmoc-Val-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は2858.21 Da ([M+H]+) である。
三、合成方法2
SEQ ID NO: 45（Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
（1）Fmoc-Phe-Wang resinを量り、ガラスカラムに入れてDCMを加えて30分間膨潤させ、減圧下でDCMを抽出する。
（2）樹脂をDMFで3回洗浄し、ピペリジン/DMF(1:4,v/v)溶液を加えて20分反応させ、保護基Fmocを除去し、減圧下でDCMを抽出し、DMFで6回洗浄する。
（3）2番目のアミノ酸であるFmoc-Cys(Trt)-OH、TBTUをそれぞれに量り、樹脂に添加し、DMFを溶解し、DIEAを加え、30分間反応させる。カイザーテストを樹脂に対して行うとき、溶液が山吹色に、樹脂が黄色に認められた場合、反応が完全であることを示し、減圧下で溶媒を抽出する。
（4）ステップ（2）と（3）を繰り返して、最終的に保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Arg (Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを得て、Fmocを除去し、さらにDMF、DCMとメタノールでそれぞれ3回洗浄して樹脂を抽出する。
（5）溶解液 (TFA、EDT、TA、フェノール、純水を一定の割合で混合したもの) を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、砂コアで濾過し、濾液にジエチルエーテルを加えて析出し、遠心分離し、固体を3回洗浄して抽出する。
（6）H2O/アセトニトリル(9:1、v/v)で溶解し100mLとし、希アンモニア水を加えてアルカリ性(pH≒8)に調整し、サンプルをとり、メルカプト基活性を測定し、黄色の場合はメルカプト基が存在することを示す。過酸化水素水2-3滴を加え、5-10分間に反応させ、再測定する。溶液が透明になる場合は、完全に酸化されたこと(90%以上)を示す。氷酢酸を加えて酸性(pH≒6)に調整し、質量スペクトルでその化学構造を表し、結果が正確になった後に高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、標的ポリペプチドを得る。
（7）SEQ ID NO: 45の実測分子量は1262.40 Da（[M + 3H]3+ = 421.80）である。
SEQ ID NO: 16
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Leu-Pro-Ala-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 16はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Pro-Ala-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液 を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1365.09Da([M+H]+)である。
SEQ ID NO: 17
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Arg-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 17はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1418.88 Da（[M + 2H]2+ = 710.44）である。
SEQ ID NO: 25
（Cys-Gly-Thr-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 25はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1335.00 Da（[M + 2H]2+ = 668.50）である。
SEQ ID NO: 27
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ala-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 27はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ala-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1374.80 Da（[M + 2H]2+ = 688.40）である。
SEQ ID NO: 28
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Nle-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 28はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Nle-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1390.00 Da（[M + 2H]2+ = 696.00）である。
SEQ ID NO: 35
（Cys-Gly-Arg-Abu-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 35はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Abu-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1404.50 Da（[M + 2H]2+ = 703.25）である。
SEQ ID NO: 46
（Cys-Hyp-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 46はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Hyp(Trt)-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-PheWang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1446.60 Da（[M + 3H]3+ = 483.20）である。
SEQ ID NO: 47
（Cys-Gly-Arg-Ser-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 47はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1407.00 Da（[M + 3H]3+ = 470.00）である。
SEQ ID NO: 49
（Cys-Gly-Arg-Ile-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 49はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ile-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1432.50 Da（[M + 3H]3+ = 478.50）である。
SEQ ID NO: 50
（Cys-Gly-Arg-Nle-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 50はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Nle-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1432.50 Da（[M + 3H]3+ = 478.50）である。
SEQ ID NO: 51
（Cys-Gly-Arg-Val-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 51はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1418.40 Da（[M + 3H]3+ = 473.80）である。
SEQ ID NO: 53
（Cys-Gly-Arg-Tyr-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 53はSEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1482.90 Da（[M + 3H]3+ = 495.30）である。
SEQ ID NO: 54
（Cys-Gly-Arg-Gln-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 54は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys（Trt）-Gly-Arg（Pbf）-Asn（Trt）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Ser（tBu）-Ile-Pro-Pro-Pro-Ile-Cys（Trt）-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1447.50 Da（[M + 3H]3+ = 483.50）である。
SEQ ID NO: 55
（Cys-Gly-Arg-Asn-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 55は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、溶離液を添加して樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1433.40 Da（[M + 3H]3+ = 478.80）である。
SEQ ID NO: 57
（Cys-Gly-Arg-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 57は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1505.70 Da（[M + 3H]3+ = 502.90）である。
SEQ ID NO: 60
（Cys-Gly-Arg-Gly-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 60は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1376.20 Da（[M + 2H]2+ = 689.10）である。
SEQ ID NO: 65
（Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Leu-Pro-Pro-Gln-Cys-Ser）
SEQ ID NO: 65は、Fmoc-Ser(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1216.80 Da（[M + 3H]3+ = 406.60）である。
SEQ ID NO: 66
（Cys-Pro-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 66は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1430.10 Da（[M + 3H]3+ = 477.70）である。
SEQ ID NO: 67
（Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 67は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1404.30 Da（[M + 3H]3+ = 469.10）である。
SEQ ID NO: 69
（Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Hyp-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 69は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1420.80 Da（[M + 3H]3+ = 474.60）である。
SEQ ID NO: 70
（Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Hyp-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 70は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1420.80 Da（[M + 3H]3+ = 474.60）である。
SEQ ID NO: 85
（Phe-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 85は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1360.02 Da（[M + K + H]2+ = 700.01）である。
SEQ ID NO: 90
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 90は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1375.55 Da（[M + Na]+ = 1398.55）である。
SEQ ID NO: 91
（Ser-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 91は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1300.55 Da（[M + H]+である。
SEQ ID NO: 98
（Ala-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Ala-Lys-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 98は、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1200.80 Da（[M + 2H]2+ = 601.40）である。
SEQ ID NO: 105
（Gly-Thr-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Asn-Pro-Asn）
SEQ ID NO: 105は、Fmoc-Asn(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1461.00 Da（[M + 2H]2+ = 731.50）である。
SEQ ID NO: 106
（Gly-Thr-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Asn）
SEQ ID NO: 106は、Fmoc-Asn(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1249.50 Da（[M + Na]+ = 1272.50）である。
SEQ ID NO: 113
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr）
SEQ ID NO: 113は、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1318.80 Da（[M + 2H]2+ = 660.40）である。
SEQ ID NO: 114
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Ala）
SEQ ID NO: 114は、Fmoc-Ala-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ala-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1390.80 Da（[M + 2H]2+ = 696.40）である。
SEQ ID NO: 115
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Arg）
SEQ ID NO: 115は Fmoc-Arg(Pbf)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1312.20 Da（[M + 2H]2+ = 657.10）である。
SEQ ID NO: 131
（Pro-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr）
SEQ ID NO: 131は、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1268.80 Da（[M + 2H]2+ = 635.40）である。
SEQ ID NO: 132
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Hyp-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 132は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1392.40 Da（[M + 2H]2+ = 697.20）である。
SEQ ID NO: 133
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Hyp-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 133は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1392.00 Da（[M + 2H]2+ = 697.00）である。
SEQ ID NO: 134
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr）
SEQ ID NO: 134は、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1193.20 Da（[M + 2H]2+ = 597.60）である。
SEQ ID NO: 145
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 145は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1143.50 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 151
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 151は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1157.60 Da（[M + 2H]2+ = 579.80）である。
SEQ ID NO: 155
（Val-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 155は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Val-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1129.10 Da（[M + 2H]2+ = 565.55）である。
SEQ ID NO: 156
（Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 156は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1143.15 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 158
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Asn-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 158は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1143.80 Da（[M + 2H]2+ = 572.90）である。
SEQ ID NO: 162
（Tyr-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 162は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1193.30 Da（[M - H]- = 1192.30）である。
SEQ ID NO: 163
（Cys-Gly-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 163は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1270.80 Da（[M + 2H]2+ = 636.40）である。
SEQ ID NO: 164
（Cys-Gly-Ile-Abu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 164は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Abu-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1285.70 Da（[M + H]+ = 1285.70）である。
SEQ ID NO: 165
（Cys-Gly-Ile-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 165は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Nle-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1312.80 Da（[M + 2H]2+ = 657.40）である。
SEQ ID NO: 166
（Cys-Gly-Ile-Leu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 166は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Leu-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1313.00 Da（[M + 2H]2+ = 657.50）である。
SEQ ID NO: 167
（Cys-Gly-Ile-Ser-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 167は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1287.00 Da（[M + 2H]2+ = 644.50）である。
SEQ ID NO: 168
（Cys-Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 168は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1301.95 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 169
（Cys-Gly-Ile-Phe-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 169は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Phe-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1346.80 Da（[M + 2H]2+ = 674.40）である。
SEQ ID NO: 170
（Cys-Gly-Ile-Tyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 170は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1363.23 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 171
（Cys-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 171は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1314.27 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 172
（Cys-Gly-Ile-Gln-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 172は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1327.80 Da（[M + 2H]2+ = 664.90）である。
SEQ ID NO: 173
（Cys-Gly-Ile-His-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 173は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1337.00 Da（[M + 2H]2+ = 669.50）である。
SEQ ID NO: 174
（Cys-Gly-Ile-Arg-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 174は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1356.58 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 175
（Cys-Gly-Ile-Lys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 175は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1328.00 Da（[M + 2H]2+ = 665.00）である。
SEQ ID NO: 176
（Cys-Gly-Ile-Trp-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 176は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Trp(Boc)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1386.33 Da（[M + H]+）である。
SEQ ID NO: 177
（Cys-Pro-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 177は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ちFmoc-Cys(Trt)-Pro-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去してさらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1311.70 Da（[M + H]+ = 1311.70）である。
SEQ ID NO: 178
（Cys-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 178は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1285.40 Da（[M + 2H]2+ = 643.70）である。
SEQ ID NO: 179
（Cys-Hyp-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 179は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Hyp(Trt)-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1327.20 Da（[M + 2H]2+ = 664.60）である。
SEQ ID NO: 180
（Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Hyp-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 180 Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1159.20 Da（[M + 2H]2+ = 580.60）である。
SEQ ID NO: 181
（Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Hyp-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 181は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は1158.60 Da（[M - H]- = 1157.60）である。
SEQ ID NO: 194
（Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 194は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5492.00 Da（[M + 8H]8+ = 687.50）である。
SEQ ID NO: 195
（Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 195は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5842.40 Da（[M + 8H]8+ = 731.30）である。
SEQ ID NO: 196
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro）
SEQ ID NO: 196は、Fmoc-Pro-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 9に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5437.75 Da（[M + 5H]5+ = 1088.55）である。
SEQ ID NO: 197
（Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro）
SEQ ID NO: 197は、Fmoc-Pro-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5789.70 Da（[M + 6H]6+ = 965.95）である。
SEQ ID NO: 198
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 198は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5465.85 Da（[M + 5H]5+ = 1094.17）である。
SEQ ID NO: 199
（Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 199は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に分離、精製して標的ペプチドセグメントを得る。実測分子量は5815.56 Da（[M + 6H]6+ = 970.26）である。
SEQ ID NO: 200
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 200は、Fmoc-Phe-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5465.60 Da（[M + 7H]7+ = 781.80）である。
SEQ ID NO: 201
（Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 201は、Fmoc-Phe-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5816.70 Da（[M + 6H]6+ = 970.45）である。
SEQ ID NO: 202
（Ser-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 202は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5333.10 Da（[M - 3H]3- = 1776.70）である。
SEQ ID NO: 203
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 203は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5391.00 Da（[M + 5H]5+ = 1079.20）である。
SEQ ID NO: 204
（Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 204は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5395.20 Da（[M - 3H]3- = 1797.40）である。
SEQ ID NO: 205
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 205は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5450.50 Da（[M + 5H]5+ = 1091.10）である。
SEQ ID NO: 206
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 206は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5268.50 Da（[M + 5H]5+ = 1054.70）である。
SEQ ID NO: 207
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr）
SEQ ID NO: 207は、Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5267.00 Da（[M + 5H]5+ = 1054.40）である。
SEQ ID NO: 208
（Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
SEQ ID NO: 208は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5218.00 Da（[M + 5H]5+ = 1044.60）である。
SEQ ID NO: 209
（Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 209は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5218.00 Da（[M + 5H]5+ = 1044.60）である。
SEQ ID NO: 239
（Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
SEQ ID NO: 239は、Fmoc-Phe-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は3122.40 Da（[M + 4H]4+ = 781.60）である。
SEQ ID NO: 240
（Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 240は、Fmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は3108.00 Da（[M + 3H]3+ = 1037.00）である。
SEQ ID NO: 241
（Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 241は、Fmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 45に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は2874.90 Da（[M + 3H]3+ = 959.30）である。
四、合成方法3
SEQ ID NO: 29（Hcy-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Hcy）
（1）Fmoc-homoCys（Trt）-2-Cl-Trt resinを量り、ガラスカラムに入れてDCMを加えて30分間膨潤させ、減圧下でDCMを抽出する。
（2）樹脂をDMFで3回洗浄し、ピペリジン/DMF(1:4,v/v)溶液を加えて20分間反応させ、保護基Fmocを除去し、減圧下で溶液を抽出し、DMFで6回洗浄する。
（3）2番目のアミノ酸であるFmoc-Phe-OH、TBTUをそれぞれ量り、樹脂に添加し、DMFを溶解し、DIEAを加えて、30分間反応させる。カイザーテストを樹脂に対して行うとき、溶液が山吹色に、樹脂が黄色に認められた場合、反応が完全であることを示し、減圧下で溶媒を抽出する。
（4）ステップ（2）と（3）を繰り返して、最終的に保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-homoCys(Trt)- Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resinを得て、Fmocを除去し、更にDMF、DCM及びメタノールでそれぞれ３回洗浄して樹脂を抽出する。
（5）溶解液 （TFA、EDT、TA、フェノール、純水を一定の割合で混合したもの） を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、砂コアで濾過し、ろ液にジエチルエーテルを加えて析出し、遠心分離し、固体を3回洗浄して抽出する。
（6）H2O/アセトニトリル(9:1、v/v)で溶解し100mLとし、希アンモニア水を加えてアルカリ性（pH≒8）に調整し、サンプルをとり、メルカプト基活性を測定し、黄色の場合はメルカプト基が存在することを示す。過酸化水素2-3滴を加え、5-10分間に反応させ、再測定する。溶液が透明になる場合は、完全に酸化されたこと（90%以上）を示す。氷酢酸を加えて酸性（pH≒6）に調整し、質量スペクトルでその化学構造を表し、結果が正確になった後に高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、標的ポリペプチドを得る。
（7）SEQ ID NO: 29の実測分子量は1489.00 Da（[M + 2H]2+ = 745.50）である。
SEQ ID NO: 33
（Hcy-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Gly-Hcy）
SEQ ID NO: 33は、SEQ ID NO: 29に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-homoCys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Gly-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は1546.60 Da（[M + 2H]2+ = 774.30）である。
五、合成方法4
SEQ ID NO: 234
（Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro）
（１）Fmoc-Pro-2-Cl-Trt resinを量り、ガラスカラムに入れてDCMを加えて30分間膨潤させ、減圧下でDCMを抽出する。
（２）樹脂をDMFで3回洗浄し、ピペリジン/DMF(1:4,v/v)溶液を加えて20分間反応させ、保護基Fmocを除去し、減圧下で溶液を抽出し、DMFで6回洗浄する。
（３）2番目のアミノ酸であるFmoc-Thr（tBu）-OH、TBTUをそれぞれ量り、樹脂に添加し、DMFを溶解し、DIEAを加えて、30分間反応させる。カイザーテストを樹脂に対して行うとき、溶液が山吹色に、樹脂が黄色に認められた場合、反応が完全であることを示し、減圧下で溶媒を抽出する。
（４）ステップ（2）と（3）を繰り返して、最終的に保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-2-Cl-Trt resinを得て、Fmocを除去し、さらにDMF、DCM及びメタノールでそれぞれ3回洗浄して樹脂を抽出する。
（５）溶解液 （TFA、EDT、TA、フェノール、純水を一定の割合で混合したもの） を加えて樹脂とすべての保護基を除去し、砂中子で濾過し、ろ液にジエチルエーテルを加えて析出し、遠心分離し、固体を3回洗浄して抽出する。
（6）H2O/アセトニトリル（9:1、v/v）で溶解し100mLとし、希アンモニア水を加えてアルカリ性（pH≒8）に調整し、サンプルをとり、メルカプト基活性を測定し、黄色の場合はメルカプト基が存在することを示す。過酸化水素2-3滴を加え、5-10分間に反応させ、再測定する。溶液が透明になる場合は、完全に酸化されたこと（90%以上）を示す。氷酢酸を加えて酸性（pH≒6）に調整し、質量スペクトルでその化学構造を表し、結果が正確になった後に高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、標的ポリペプチドを得る。
（７）SEQ ID NO: 234の実測分子量は3349.00 Da（[M + 3H]3+ = 670.80）である。
六、合成方法5
SEQ ID NO: 235
（Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
（１）Fmoc-Phe-Wang resinを量り、ガラスカラムに入れてDCMを加えて30分間膨潤させ、減圧下でDCMを抽出する。
（２）樹脂をDMFで3回洗浄し、ピペリジン/DMF(1:4,v/v)溶液を加えて20分間反応させ、保護基Fmocを除去し、減圧下で溶液を抽出し、DMFで6回洗浄する。
（3）2番目のアミノ酸であるFmoc-Cys（Trt）-OH、TBTUをそれぞれに量り、樹脂に添加し、DMFを溶解し、DIEAを加え、30分間反応させる。カイザーテストを樹脂に対して行うとき、溶液が山吹色に、樹脂が黄色に認められた場合、反応が完全であることを示し、減圧下で溶媒を抽出する。
（4）ステップ（2）と（3）を繰り返して、最終的に保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resinを得て、Fmocを除去し、さらにDMF、DCM及びメタノールでそれぞれ3回洗浄して樹脂を抽出する。
（５）溶解液 （TFA、EDT、TA、フェノール、純水を一定の割合で混合したもの） を加えて樹脂とすべての保護基を除去し、砂中子で濾過し、ろ液にジエチルエーテルを加えて析出し、遠心分離し、固体を3回洗浄して抽出する。
（６）試料を高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、精製1回目のピークを溶出した液体に希アンモニア水を加えてアルカリ性（pH ≒ 8）に調整し、サンプルをとり、メルカプト基活性を測定し、黄色の場合はメルカプト基が存在することを示す。過酸化水素2-3滴を加え、5～10分間反応させ、再測定する。溶液が透明になる場合は、１回目が完全に（90%以上）酸化されたことを示す。氷酢酸を加えて酸性（pH ≒ 6）に調整し、再度試料を精製し、ピークを溶出する。
（7）2回目のピークを溶出した溶液にヨウ素含有メタノール溶液（1 g ヨウ素/100mLメタノール）を加え、色が変化せず、暗褐色になるまでゆっくりと滴下し、質量スペクトルでその化学構造を表し、反応が完了するまで観察し、精製して最終的な標的ポリペプチドを得る。
（8）SEQ ID NO: 235の実測分子量は4792.80 Da（[M + 6H]6+ = 799.80）である。
SEQ ID NO: 236
（Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly）
SEQ ID NO: 236はFmoc-Gly-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 235に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は4764.50 Da（[M + 5H]5+ = 953.90）である。
SEQ ID NO: 237
（Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln）
SEQ ID NO: 237はFmoc-Gln(Trt)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 235に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resinを合成し、Fmocを除去して、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は4531.50 Da（[M + 5H]5+ = 907.30）である。
七、合成方法6
アセチル化及びアミド化のSEQ ID NO: 194（Ac-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2）
（1）Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resinを出発原料とし、合成スケールは0.1 mmolとする。C末端からN末端方向への合成では、まずピペリジン/DMF(1:3, v/v)でN末端Fmoc保護基を除去し、N末端を遊離アミノ基にする。Fmoc-Gly-OHの4倍当量をHOBt/DICに溶解し、樹脂とグラフトし、C末端2番目のアミノ酸残基（Gly）を導入して、Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Rink Amide AM resinを得る。このように、保護を除去してから後続の各アミノ酸残基を繰り返して順次連結し、ペプチド鎖連結の最終段階で最後のアミノ酸残基のFmocをHOBt/DICの反応法によって除去し、過剰の10倍量の無水酢酸と20倍量のDIEAをDMFに溶解した溶液を用いて、酢酸化反応を行い、ポリペプチド全体の合成終了後に保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Ac-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Rink-Amide Am resinを得る。上記の反応の各ステップの後、樹脂をDMFとDCMで交互に6回以上洗浄し、カイザーテストを使用して反応を制御する。あるアミノ酸の縮合反応が不完全な場合、必要な標的ペプチドセグメントが得られるまで縮合を1回繰り返す。
（２）切断試薬（TFA、EDT、TA、フェノール、純水、TIPSを一定の割合で混合したもの）を用いて30°Cで3時間切断し、標的ポリペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖保護基を除去し、ろ液を大量の冷エーテルに加えてポリペプチドを析出させてから遠心分離する。ジエチルエーテルで数回洗浄後、凍結乾燥して、ポリペプチド粗品Ac-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2を得る。
（3）上記ポリペプチド粗品をとり、4 mg/mLとなるようにDMSO/H2O（1:4,v/v）溶液に溶ける。24時間後、反応液をHPLC追跡用に採取し、反応が完全である場合、精製を直接行い、反応が不完全な場合、反応が完了するまで反応時間を延長する。
（４）高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製して標的ポリペプチドを得る。その化学構造はMALDI-TOF質量スペクトルによって表される。アセチル化及びアミド化のSEQ ID NO: 194の実測分子量は5533.01（[M + H]+）である。
アセチル化及びアミド化のSEQ ID NO: 196
（Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-NH2）
SEQ ID NO: 196はFmoc-Pro-Rink Amide-AM resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 194に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Rink Amide-AM resinを合成し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5476.14（[M + H]+）である。
アセチル化及びアミド化のSEQ ID NO: 198
（Ac-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2）
SEQ ID NO: 198はFmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 194に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Ac-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Rink Amide AM resinを合成し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5506.83（[M + H]+）である。
アセチル化及びアミド化のSEQ ID NO: 200
（Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-NH2）
SEQ ID NO: 200はFmoc-Phe-Rink Amide AM resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 194に記載の方法に従って合成するとき、まずポリペプチド配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Rink Amide AM resinを合成し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。その実測分子量は5507.42（[M + H]+）である。
八、合成方法7
N-末端PEG修飾のSEQ ID NO: 200
（PEG-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe）
（１）Fmoc-Phe-Wang resinを量り、ガラスカラムに入れてDCMで30分間膨潤させ、減圧下でDCMを抽出する。
（２）樹脂をDMFで3回洗浄し、ピペリジン/DMF(1:4,v/v)溶液を加えて20分間反応させ、保護基Fmocを除去し、減圧下で溶液を抽出し、DMFで6回洗浄する。
（３）１番目のアミノ酸であるFmoc-Cys(Trt)-OH、TBTUをそれぞれ量り、樹脂に添加し、DMFを溶解し、DIEAを加えて、30分間反応させる。カイザーテストを樹脂に対して行うとき、溶液が山吹色に、樹脂が黄色に認められた場合、反応が完全であることを示し、減圧下で溶媒を抽出する。
（4）ステップ（2）と（3）で、最後の原料Fmoc-PEG8-CH2CH2COOHを受け取るまで、8時間反応させ、N末端Fmocを除去して、N末端がPEGに修飾され、側鎖に保護基を有するペプチドセグメント、即ちPEG-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang樹脂を得る。さらにDMF、DCM及びメタノールでそれぞれ３回洗浄して樹脂を抽出する。
（５）溶解液 （TFA、EDT、TA、フェノール、純水を一定の割合で混合したもの） を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、砂中子で濾過し、ろ液にジエチルエーテルを加えて析出し、遠心分離し、固体を3回洗浄して抽出する。
（６）H2O/アセトニトリル（9:1、v/v）で溶解し100mLとし、希アンモニア水を加えてアルカリ性（pH≒8）に調整し、サンプルをとり、メルカプト基活性を測定し、黄色の場合はメルカプト基が存在することを示す。過酸化水素2-3滴を加え、5~10分間反応させ、再測定する。溶液が透明になる場合は、完全（90%以上）に酸化されたことを示す。氷酢酸を加えて酸性（pH ≒ 6）に調整し、結果が正確になった後に高速液体クロマトグラフィー逆相C18カラムを用いて精製し、標的ポリペプチドを得る。その化学構造は質量スペクトルによって表される。その実測分子量は5888.73（[M + H]+）である。
N-末端PEG修飾のSEQ ID NO: 204
（PEG-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys）
N-末端PEG修飾のSEQ ID NO: 204は、Fmoc-Lys(Boc)-Wang resinを出発原料として選択し、SEQ ID NO: 200に記載の方法に従って合成するとき、まずアミノ酸配列に対応するアミノ酸原料を順次添加し、保護基を有するペプチドセグメント、即ち、Fmoc-PEG-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resinを合成し、Fmocを除去し、さらに溶解液を加えて樹脂とアミノ酸側鎖保護基を除去し、酸化してジスルフィド結合を形成し、最終的に標的ペプチドセグメントを得る。化学構造は質量スペクトルによって表される。その実測分子量は5817.47（[M + H]+）である。
実施例２・トリプシンを阻害するポリペプチド分子の設計及び阻害活性の評価
ミカエリス定数Kmの測定：
（1）96ウェルプレートに200 μL、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加え、37℃で15分間予熱する。さらに、濃度が異なる基質（p-Nitroanilide，pNA）５ μLを加え（終濃度0.5% DMSOで調製）、500 rpmで1分間よく混合し、37℃で120minインキュベーションした後、OD405 nmでの吸光度を測定する。205 μL反応系において、pNAの終濃度はそれぞれ0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2、0.25 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、pNA濃度をOD405 nm値に対してプロットし、検量線を求める。
（2）96ウェルプレートに190 μL、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）及び10 μL、１ μMのトリプシンを加え、37℃で15 min予熱する。さらに、濃度が異なる基質であるBApNA（終濃度0.5% DMSOで調製）５ μLを加え、500 rpmで1分間よく混合し、37℃で120min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定する。205 μL反応系において、BApNAの終濃度はそれぞれ0、0.125、0.2、0.33、0.5、0.75、1.0及び1.25 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、時間をOD405 nm値に対してプロットし、対応する曲線を求める。曲線の傾きを検量線の傾きと酵素濃度で除して初速度V0（mM/（min*mM protein）を得る。Prismソフトを使用して、基質BApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、BApNAに対するトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。
阻害定数Ki値の測定:
（1）異なる濃度のトリプシンを阻害するポリペプチド阻害剤（BTs）、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を予め冷却した96ウェルプレートに加え、総容量を190 μLとし、37℃、500 rpmで5 min予熱する。10 μL、1 μMのトリプシンを加え、37℃、500 rpmで10minインキュベートする。5 μL、50 mMの基質BApNAを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で260 min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定する。各濃度に3つの重複ウェルを設け、ブランク対照には反応緩衝液と基質のみを加え、最小吸収値 （Min OD405 nm） とする。陰性対照には反応緩衝液、酵素及び基質のみを加え、最大吸収値（Max OD405 nm）とする。
（2）205 μL反応系において、トリプシンの終濃度は約50nMとし、BApNAの終濃度は1.22 mMとする。
（3）データ集計
酵素の残存活性（%）=（1-（Max OD405 nm - Sample OD405 nm）/（Max OD405 nm - Min OD405 nm）* 100
基質濃度を酵素の残存活性に対してプロットし、トリプシンを阻害するBTs骨格の50%阻害濃度（IC50）を求め、式Ki= IC50/（1+ S/Km）（S、IC50及びKmはそれぞれ基質濃度、50%阻害濃度及びミスター定数である）に代入すると、トリプシンを阻害するBTs骨格の阻害定数Kiを得ることができる。
結果：
異なる濃度のBApNAによる一定濃度のトリプシンへの触媒加水分解によって生成されたpNAでOD405 nmでの吸光度値を測定し、検量線を参照し、Prismソフトを使用して、基質BApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、BApNAに対するトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値は0.33 mM（R2= 0.9966 ）（図1）である。合理的な設計方法を用いて、合成直鎖状及びN-/C-切断型SFTI-1ポリペプチドアナログBT1及びBT45を設計し、トリプシンに対する直鎖状及びN-/C-切断型SFTI-1ポリペプチドアナログBT1及びBT45の阻害定数（Ki）を実験で測定した結果、いずれも6.4 nM（図2と表3）であり、文献で開示されている研究結果と一致している[Korsinczky ML, Schirra HJ, Rosengren KJ, West J, Condie BA, Otvos L, et al. Solution structures by 1H NMR of the novel cyclic trypsin inhibitor SFTI-1 from sunflower seeds and an acyclic permutant. J Mol Biol, 2001, 311: 579-591.]。その結果から直鎖状SFTI-1のN末端及びC末端での1（G）及び2（FD）アミノ酸残基の切断がトリプシン阻害活性に影響を及ぼさないことを確認した。また、P3部位に変異を加えたBT2及びBT3を設計及び合成し、それらの阻害定数（Ki）を測定した結果、それぞれ650 nM及び140 nM（図2と表3）であった。これら2つのポリペプチド阻害活性が低下するにもかかわらず、SFTI-1に基づく阻害活性ループP3部位が変異に耐えられること、そして、ジスルフィド結合間のペプチドセグメント（環）が延長される可能性があることを示している。その後、ジスルフィド結合間の環を最適化してBT5、BT6及びBT7を合成し、その阻害定数（Ki）（図3、表2及び表4）を測定した結果、それぞれ30 nM、60nM及び50 nMであった。次に、単純化された構造とP3部位変異後の拡張環を組み合わせて、P1'-P7'などの部位を標的とする一連のアミノ酸残基置換変異体（BT8-BT36）を設計及び合成し（表2）、その阻害定数（Ki）の測定結果から、P7'部位でのフェニルアラニンの欠損（BT8、IC50>50 μM）とP3'部位でのプロリンのアラニンへの置換（BT20、IC50 > 50 μM）が、そのトリプシン阻害活性を有意に低下させることを示した。その中で、BT45に基づく拡張環に由来するBT9はより優れた阻害活性（Ki = 10 nM）部位を示し、他の部位の置換は異なる影響を示し、BT10のP4′部位はプロリンからアラニンへの変異体であり、その阻害活性にほとんど影響を与えなかった（Ki= 20 nM）。次いで、BT17のP1部位ではリジンからアルギニンへの変異体の阻害活性がBT9活性に対して約12倍低下し、更に、他の部位P1′（BT27、BT22）及びP2'（BT28、BT16、BT14、BT21）である。一方、P5'（BT15、BT12）及びP7'（BT12、BT18、BT19、BT24）のアミノ酸置換も大きな影響を示した。さらに、BT9に基づいてジスルフィド結合間の環の長さをさらに延長しても、良好な阻害活性を維持した（BT11、BT13、BT32、BT33、BT29）（図4、表2及び表5）。
BT9のP2（BT26）、P3（BT35）、P4（BT25）及びP5（BT66）部位での変異研究により、それらが他のアミノ酸残基に置き換えられることが分かった。その中で、P3部位のアラニンがγ-アミノ酪酸に置換されると、BT9とほぼ同等の阻害活性を示すため、P3部位を標的とする一連のBT47-BT60シリーズの骨格分子をさらに合成し、BT47、BT50、BT53及びBT54はより優れた阻害活性を示した（図5、表2及び表6）。P5部位でのグリシン置換はβフォールディングの形成を促進するプロリンでもあるが、それでもより優れた阻害活性を示したため、BT66-BT80シリーズの骨格ポリペプチド分子を合成し、その中でBT66、BT67は高いトリプシン阻害活性を示した（図6、表2及び表7）。
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 実施例3 キモトリプシンを阻害するポリペプチド分子の設計及び阻害活性の評価
ミカエリス定数Km値の測定：
（1）96ウェルプレートに190 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加え、37℃で15 min予熱した。さらに、濃度が異なる基質であるpNA（DMSOで調製）2 μlを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で20 minインキュベートした後、OD405 nmでの吸光度を測定した。200 μl反応系において、pNAの終濃度はそれぞれ0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.25、及び0.3 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、pNA濃度をOD405 nm値に対してプロットし、検量線を求めた。
（2）96ウェルプレートに190 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）及び8 μl、0.75 μMのキモトリプシンを加え、37℃で5 min予熱した。さらに、濃度が異なる基質であるAAPFpNA（DMSOで調製）2 μlを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で20 min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定した。200 μl反応系において、AAPFpNAの終濃度はそれぞれ0、0.125、0.25、0.285、0.33、0.4及び0.5 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、時間をOD405 nm値に対してプロットし、対応する曲線を求めた。曲線の傾きを検量線の傾きと酵素濃度で割って、初速度V0（mM/（min*mM protein）を得た。Prismソフトを使い、基質AAPFpNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、AAPFpNAに対するキモトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。
阻害定数Ki値の測定：
（1）異なる濃度のCHs骨格、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を予め冷却した96ウェルプレートに加え、総容量を190 μlとし、37℃で5 min予熱した（500 rpm、1 min遠心分離、4 min静置）。8 μl、750 nMのキモトリプシンを加え、37℃で10 minインキュベートした（500 rpm、1 min遠心分離、9 min静置）。2 μl、50 mMの基質AAPFpNAを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で90 min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定した。各濃度に3つの重複ウェルを設け、ブランク対照は緩衝液及び基質のみを加え、最小吸収値（Min OD405 nm）とする。陰性対照は緩衝液、酵素及び基質のみを加え、最大吸収値（Max OD405 nm）とする。
（2）200 μl反応系において、キモトリプシンの終濃度は30 nMとし、AAPFpNAの終濃度は約0.5 mMとする。
（3）データ集計
酵素の残存活性（%）=（1-（Max OD405 nm - Sample OD405 nm）/（Max OD405 nm - Min OD405 nm）* 100
基質濃度を酵素の残存活性に対してプロットし、CHs骨格のキモトリプシンに対する阻害の50%阻害濃度（IC50）を求め、計算式Ki = IC50 / （1+ S / Km）（S、IC50及びKmはそれぞれ基質濃度、50%阻害濃度、ミカエリス定数）に代入し、CHs骨格のキモトリプシンに対する阻害の阻害定数Kiを得た。
結果：
異なるAAPFpNA濃度で一定濃度のキモトリプシンが加水分解を触媒して得られたpNAについて、OD405 nmでの吸光度を測定し、検量線を参照し、Prismソフトを使い、基質AAPFpNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、AAPFpNAに対するキモトリプシンの加水分解のミカエリス定数Km値0.38 mM （R2 = 0.9988）を得た（図7）。
BBI及びSFTI-1由来のキモトリプシンを阻害する活性ペプチドに基づく研究は少なく、その中で、CH4のアナログがトリプシンに対して良好な阻害活性を有することが文献で報告されている[McBride JD, Freeman N, Domingo GJ, Leatherbarrow RJ. Selection of chymotrypsin inhibitors from a conformationally-constrained combinatorial peptide library. J Mol Biol, 1996, 259: 819-827.]。本発明は、セリンプロテアーゼのP1部位における特異性及びトリプシン阻害ペプチドの研究結果を合わせ、CH1、CH4及びCH5を合成しており、キモトリプシンを阻害する阻害定数Kiはそれぞれ0.46 μM、0.55 μM、0.08 μMである。同時に、トリプシンのジスルフィド結合間の環が延長可能という特徴を参照し、類似のポリペプチドであるCH2、CH3、CH6、CH7、CH8及びCH9も合成した。そのうち、CH7及びCH9のみが一定のキモトリプシン阻害活性を有し、キモトリプシンは構造においてトリプシンと区別する可能性があり、ジスルフィド結合間の環拡張構造がキモトリプシン阻害ペプチドの構造最適化に適用しないことが示された（図8、表8及び表9）。
キモトリプシンのP1部位における特異性及びCH5が良好な阻害活性を有することを合わせ、P1及びP4部位に対して一連のアナログ及びそのジスルフィドの拡張環のアナログを合成し、そのキモトリプシンの阻害定数を測定したところ、CH10が良好な阻害活性を持つことが示された（Ki = 30 nM）。CH11、CH17、CH18及びCH19の阻害活性と比較すると、P1部位はチロシンであることが好ましく、P4は疎水性アミノ酸残基であることが好ましい。一方、対応するジスルフィド結合間の拡張環のアナログであるCH13、CH23及びCH24が良好な阻害活性を示した（図9及び表8）。キモトリプシン阻害活性に対するP4'、P5'及びP7'部位のアミノ酸残基の置換による影響について、CH26-CH35のポリペプチドアナログを合成し、阻害定数を測定した結果、P4'、P5'及びP7'部位のアミノ酸の置換がその活性に大きく影響することが示された。そのうち、CH26、CH33、CH34及びCH35が良好な阻害活性を示し、同様に、ジスルフィ結合の拡張環のポリペプチドアナログであるCH27、CH31及びCH32も一定の阻害活性を示した（図10、表8及び表10）。また、異なる部位の置換を組み合わせたアナログであるCH36-CH53を合成し、阻害定数を測定した結果、CH47、CH49、CH51、CH52及びCH53が良好なキモトリプシン阻害活性を示した（図11及び表8）。
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 実施例4・膵エラスターゼを阻害するポリペプチド分子の設計及び阻害活性の評価
ミカエリス定数Km値の測定：
（1）96ウェルプレートに198 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を加え、37℃で15 min予熱した。さらに、濃度が異なる基質であるpNA（DMSOで調製）2 μlを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で30 minインキュベートした後、OD405 nmでの吸光度を測定した。200 μl反応系において、pNAの終濃度はそれぞれ0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175及び0.2 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、pNA濃度をOD405 nm値に対してプロットし、検量線を求めた。
（2）96ウェルプレートに190 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）及び8 μl、4.375 μMのエラスターゼを加え、37℃で5 min予熱した。さらに、濃度が異なる基質であるAAApNA（DMSOで調製）2 μlを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で30 min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定した。200 μl反応系において、AAApNAの終濃度はそれぞれ0、0.125、0.166、0.2、0.25、0.33、0.6、0.75及び1.25 mMとする。各濃度に3つの重複ウェルを設け、時間をOD405 nm値に対してプロットし、対応する曲線を求めた。曲線の傾きを検量線の傾きと酵素濃度で割って、初速度V0（mM/（min*mM protein）を得た。Prismソフトを使い、基質AAApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、AAApNAに対するエラスターゼの加水分解のミカエリス定数Km値を得た。
阻害定数Ki値の測定：
（1）異なる濃度のECs骨格、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を予め冷却した96ウェルプレートに加え、総容量を190 μlとし、37℃で5 min予熱した（500 rpm、1 min遠心分離、4 min静置）。8 μl、12.5 μMのエラスターゼを加え、37℃で10 minインキュベートした（500 rpm、1 min遠心分離、9 min静置）。2 μl、100 mMの基質AAApNAを加え、500 rpmで1 minよく混合し、37℃で60 min反応させた後、OD405 nmでの吸光度を測定した。各濃度に3つの重複ウェルを設け、ブランク対照は緩衝液及び基質のみを加え、最小吸収値（Min OD405 nm）とする。陰性対照は緩衝液、酵素及び基質のみを加え、最大吸収値（Max OD405 nm）とする。
（2）200 μl反応系において、エラスターゼの終濃度は0.5 nMとし、AAApNAの終濃度は約1 mMとする。
（3）データ集計
酵素の残存活性（%）=（1-（Max OD405 nm - Sample OD405 nm）/（Max OD405 nm - Min OD405 nm）* 100
基質濃度を酵素の残存活性に対してプロットし、ECs骨格のエラスターゼに対する阻害の50%阻害濃度（IC50）を求め、計算式Ki = IC50 / （1+ S / Km）（S、IC50及びKmはそれぞれ基質濃度、50%阻害濃度、ミカエリス定数）に代入し、ECs骨格のエラスターゼに対する阻害の阻害定数Kiを得た。
結果：
異なるAAApNA濃度で一定濃度のエラスターゼが加水分解を触媒して得られたpNAについて、OD405 nmでの吸光度を測定し、検量線を参照し、Prismソフトを使い、基質AAApNAの濃度を初速度V0に対してプロットし、AAApNAに対するエラスターゼの加水分解のミカエリス定数Km値0.40 mM （R2 = 0.9885）を得た（図12）。
膵エラスターゼの活性ペプチドに関する研究報告は極めて少なく、その中で、EC1のアナログが膵エラスターゼに対して良好な阻害活性を有することを報告した文献しかない[McBride JD, Freeman HN, Leatherbarrow RJ. Selection of human elastase inhibitors from a conformationally constrained combinatorial peptide library. Eur J Biochem, 1999, 266: 403-412.]。本発明は、セリンプロテアーゼのP1部位における特異性並びにそのトリプシン及びキモトリプシン阻害ペプチドの研究結果を合わせ、EC1-EC12のエラスターゼ阻害ペプチドを合成し、エラスターゼの阻害定数Kiを測定した結果、P1部位はアラニンであるEC1及びEC12が好ましく、良好なエラスターゼ阻害活性を有することが示され、分析において、EC12はEC1及びEC2よりも良好な阻害活性を有することを示しており、このことから、P5'及びP7'部位のアミノ酸置換はその阻害活性に大きな影響を与えるが、対応するジスルフィド結合の拡張環のアナログはEC7のみが弱い阻害活性を示すことが示された（図13及び表11）。その後、異なる部位の置換を組み合わせたアナログであるEC13-EC29を合成し、阻害定数を測定した結果、EC23（Ki = 70 nM）の阻害活性がEC12（Ki = 110 nM）よりある程度向上したが、EC25-EC28の阻害活性は低下しており、P1'部位のアミノ酸置換の影響が大きいことを示した。そのうち、P4、P5'及びP7′の置換はその阻害活性に影響を与えるが、P1'部位と比較して、その影響が小さいものである（図14、表11及び表12）。その後、EC23に基づいてEC30-EC45及びヒドロキシプロリン含有のアナログであるEC46-EC48を合成した。
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 実施例5 in vivo代謝酵素ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）及び中性エンドペプチダーゼ24.11（NEP24.11）に対するグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）の安定性の向上
血液循環におけるGLP-1の安定性を高めるために、DPP-IVを阻害するdiprotin A（IPI）及びNEP24.11を阻害するOpiorphin（QRFSR）の2つのペプチドセグメントを含むGLP-1アナログ（ハイブリッドペプチド）を設計して合成し、その構造配列を表13に示す。
DPP-IVに対するGLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）の耐性：
DPP-IVに対するGLP-1及びそのアナログの耐性を考察するための実験プロセスは以下の通りである。
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに5 μl、250 μM GLP-1またはGLP-1アナログ、45 μl、100 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）及び7.5 μl、10%TFAを加え、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）に対するDPP-IVの酵素分解速度論：(1)3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに30 μl、250 μM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び240 μl、100 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を加えた。(2)別の無菌EPチューブに一定容量の0.005 μg/μlのDPP-IV酵素液を調製した。(3)ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ30 μl DPP-IV酵素液を加えてよく混合した。計時を開始し、0.5、2.0、4.0、8.0及び12.0 h反応後にそれぞれ50 μlの反応液を取り出し、7.5 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。50 μl反応系において、GLP-1またはGLP-1アナログの終濃度は25 μMとし、DPP-IVの終濃度は0.5 ng/μlとする。μ各時点で3回繰り返し、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。
結果：DPP-IV酵素加水分解GLP-1及びそのアナログに対する高い活性を有するトリプシン阻害ペプチドの影響を排除するために、BT43（SEQ ID NO： 43）の一部ペプチドセグメントのGLP-1アナログSEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191及びSEQ ID NO：193を合成した（表13）。HPLCクロマトグラフィー分析方法を用いて、DPP-IVが異なる時間で作用した後に残留した試料の未変化体の比率を測定した結果、GLP-1のN-末端に直接7つのグリシンを導入すると、DPP-IV酵素分解に対するGLP-1の耐性保護作用を形成することができる（G7-GLP-1、SEQ ID NO： 186）ことが示された。12 h作用した後、G7-GLP-1は約34.5%残り、GLP-1 （7-37）は約4 h後にほぼ完全に分解された。一方、DPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）を含むように導入したD-GLP-1（SEQ ID NO： 187）は安定で、DPP-IV酵素分解に対して良好な耐性を示し、12 h作用した後、85.6%残った（図15A及び表14）。GLP-1のN-/C末端にトリプシン阻害ペプチド（SEQ ID NO：194-201）を導入したGLP-1アナログはすべて安定で、DPP-IV酵素分解に対して良好な耐性を示した（図15B及び表14）。GLP-1のN-/C末端にキモトリプシン阻害ペプチド（SEQ ID NO：202-205）を導入したGLP-1アナログもすべて安定で、DPP-IV酵素分解に対して良好な耐性を示した（図15C及び表14）。同様に、GLP-1のN-/C末端にエラスターゼ阻害ペプチド（SEQ ID NO：206-209）を導入したGLP-1アナログはすべて安定で、DPP-IV酵素分解に対して良好な耐性を示した（図15 D及び表14）。実験結果によると、異なる代謝酵素を阻害する活性ペプチド骨格であるD、N、T、BT、CH及びECを導入することで、DPP-IVに対するGLP-1の耐性を高めることができる。
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 NEP24.11に対するGLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）の耐性：
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに6 μl、250 μM GLP-1またはGLP-1アナログ、44 μl、50 mM HEPES、50 mM NaCl緩衝液（pH 7.4）及び7.5 μl、10%TFAを加え、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）に対するNEP24.11の酵素分解速度論：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに30 μl、250 μM GLP-1またはGLP-1アナログ、215 μl、50 mM HEPES及び50 mM NaCl緩衝液（pH 7.4）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.04 μg/μlのNEP24.11酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ5 μl NEP24.11酵素液を加えてよく混合した。計時を開始し、0.5、2.0、4.0及び8.0 h反応後にそれぞれ50 μlの反応液を取り出し、7.5 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。50 μl反応系において、GLP-1またはGLP-1アナログの終濃度は30 μMとし、NEP24.11の終濃度は1.0 ng/μlとする。μ各時点で3回繰り返し、RP-HPLCを用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。
結果：NEP24.11により酵素分解8 h後、GLP-1（7-37）及びG7-GLP-1はほぼ完全に分解された。NEP24.11を阻害するOpiorphin（QRFSR）を含むペプチドセグメントN-GLP-1（SEQ ID NO：188）の安定性が最も向上し、残存量は約56.4%で、このOpiorphin（QRFSR）ペプチドセグメントが確実にNEP24.11を阻害する役割を果たすことができることが示された。NEP24.11の酵素切断部位はGLP-1分子全体に分散しているため、2つまたは3つの酵素阻害骨格を含む分子は立体障害の作用により、いずれもNEP24.11に対して異なる程度の耐性を持ち、最も耐性の強いD-GLP-1-BT 1（SEQ ID NO：196）は、酵素と8 h反応させた後の残存量が80%に近かった（表15）。GLP-1及びそのアナログに対するNEP24.11の酵素分解速度論のプロセスを図16に示す。実験結果より、代謝酵素を阻害するD、N、T及びBTペプチドセグメントを導入することは、いずれもNEP24.11に対するGLP-1の耐性を高めることができることが示された。
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 実施例6. 膵トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼに対するグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）の安定性の向上
トリプシンの酵素分解に対するGLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）の安定性分析：
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに1.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、23.5 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）及び3.75 μl、10%TFAを加え、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1アナログSEQ ID NO：186-193はトリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有せず、トリプシンによる酵素分解のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに9 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び135 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.05 μg/μlのトリプシン酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ6 μl トリプシンを加えてよく混合した。計時を開始し、1.5、3.0、4.5、6.0及び9.0 min反応後にそれぞれ25 μlの反応液を取り出し、3.75 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1アナログSEQ ID NO：194-201はトリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有し、トリプシンによる酵素分解のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに13.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び202.5 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.05 μg/μlのトリプシン酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ9 μl トリプシンを加えてよく混合した。計時を開始し、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0及び60.0 min反応後にそれぞれ25 μlの反応液を取り出し、3.75 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
上記2種類の実験試料について、25 μl反応系において、GLP-1またはGLP-1アナログの終濃度は60 μMとし、トリプシンの終濃度は2.0 ng/μlとする。μ各時点で3回繰り返し、RP-HPLCを用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。
結果：トリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有しないGLP-1アナログSEQ ID NO：186-193はトリプシンによる酵素分解に対して耐性が悪く、9 minでほぼ完全に分解された。BT43（SEQ ID NO：43）のトリプシン阻害活性は弱いが、BT43（SEQ ID NO：43）部分阻害ペプチドセグメントを含有するGLP-1アナログは一定の耐性を示した（図17A及び表16）。この結果より、この阻害ペプチド骨格はある程度でGLP-1分子のトリプシンに対する耐性を高めることができ、その他の阻害ペプチド分子骨格の導入はそれに対して無効であることが示された。DNT-GLP-1（SEQ ID NO：193）も完全に分解されており、その原因は二次構造に大きな変化が発生したことである。一方、プロテアーゼを阻害する骨格であるBT1及びBT9を導入したGLP-1アナログSEQ ID NO：194-201は、トリプシンにより60 min酵素分解した後、未変化分子の残存量が75%を超え、このことから、この阻害ペプチド分子はGLP-1のトリプシンに対する耐性を大きく向上させたことが示された（図17B、図17C及び表16）。
Figure 2023551050000034
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Figure 2023551050000036
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 キモトリプシンの酵素分解に対するGLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）の安定性分析：
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに1.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、23.5 μl、50 mM Tris、20 mM CaCl2（pH 7.8）緩衝液及び3.75 μl、10% TFAを加え、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1アナログSEQ ID NO：186-201はキモトリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有せず、GLP-1及びそのアナログに対するキモトリプシンによる酵素分解のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに9 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び138 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.05 μg/μlのキモトリプシン酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ3 μlキモトリプシン酵素液を加えてよく混合した。計時を開始し、1.5、3.0、4.5、6.0及び9.0 min反応後にそれぞれ25 μlの反応液を取り出し、3.75 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1アナログSEQ ID NO：202-205はキモトリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有し、キモトリプシンによる酵素分解のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに13.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び207 μl、20 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.05 μg/μlのキモトリプシン酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ4.5 μlキモトリプシン酵素液を加えてよく混合した。計時を開始し、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0及び60.0 min反応後にそれぞれ25 μlの反応液を取り出し、3.75 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
上記2種類の実験試料について、25 μl反応系において、GLP-1またはGLP-1アナログの終濃度は60 μMとし、キモトリプシンの終濃度は1.0 ng/μlとする。μ各時点で3回繰り返し、RP-HPLCを用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。
結果：GLP-1はキモトリプシンにより9 min酵素分解した後、完全に分解されており、2回の実験結果が同じである。GLP-1アナログSEQ ID NO：186-201はキモトリプシン阻害ペプチドの分子骨格を含有せず、キモトリプシンの酵素分解に対する安定性が低かったが、BT43（SEQ ID NO：43）部分阻害ペプチドセグメントを含むように導入したGLP-1アナログSEQ ID NO：189-191及びSEQ ID NO：193は、GLP-1分子と比べて一定の耐性を示し、キモトリプシンにより9 min酵素分解した後、残存の未変化ペプチドが50%を超えた（図18A & 18B及び表17）。一方、キモトリプシン阻害骨格を特異的に導入したGLP-1アナログSEQ ID NO：202-204だけ、60 minのキモトリプシンによる酵素分解を行っても残存の未変化ペプチドが60%を超えた。ただし、GLP-1アナログSEQ ID NO：205は例外である。このハイブリッドペプチドの未変化ペプチド分子と酵素分解物はベースライン分離を実現することが難しく、計算誤差によりそのキモトリプシンによる酵素分解後の残存量が低値であった。（図18C及び表17）。
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Figure 2023551050000040
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Figure 2023551050000042
 エラスターゼの酵素分解に対するGLP-1及びそのアナログ（ハイブリッドペプチド）の安定性分析：
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに1.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、23.5 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）及び3.75 μl、10%TFAを加え、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。
GLP-1アナログSEQ ID NO：206-209はエラスターゼ阻害ペプチド分子を含有し、エラスターゼによる酵素分解のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに13.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び207 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量の0.5 μg/μlエラスターゼ酵素液を調製した。その後、ポリペプチド及び酵素を入れた4つのEPチューブを同時に37℃で5 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ4.5 μlエラスターゼ酵素液を加えてよく混合した。計時を開始し、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0及び60.0 min反応後にそれぞれ25 μlの反応液を取り出し、3.75 μl、10% TFAを加えて反応を停止させ、8000 rpmで30 s遠心分離してよく混合した。25 μl反応系において、GLP-1またはGLP-1アナログの終濃度は60 μMとし、エラスターゼの終濃度は10 ng/μlとする。μ各時点で3回繰り返し、RP-HPLCを用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。
結果：トリプシン及びキモトリプシンの阻害ペプチドの分子骨格を含有するGLP-1アナログは分子骨格が代謝酵素による分解を標的とする安定性を有することに基づき、本実験計画はエラスターゼ阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログ（SEQID NOs：206-209）のエラスターゼによる酵素分解に対する耐性のみを評価した。その結果より、GLP-1は15 min酵素分解した後に約10%しか残っていないが、エラスターゼ阻害ペプチド分子を含むように導入したGLP-1アナログの残存量はいずれも50%を超えていることが示された。30 min酵素分解した後、GLP-1未変化分子は検出されなかった。60 min酵素分解した後、N-末端にエラスターゼ阻害ペプチドを融合したGLP-1アナログ（SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：208）は約20%残った。一方、C-末端にエラスターゼ阻害ペプチドを融合したGLP-1アナログ（SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209）は約45%残っており、EC阻害ペプチド分子をGLP-1分子のC末端に導入したほうが、エラスターゼ酵素分解に対する安定性を高めることができることが示された（図19及び表18）。
Figure 2023551050000043
 実施例7. グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アナログ（ハイブリッドペプチド）の血清安定性
対照実験：3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに3 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、25 μlヒト血清（南京森貝伽生物科技有限公司から購入）、72 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）及び予め冷却した300 μl無水メタノールを加え、転倒混合した後に-20℃で一夜放置した。同時に、3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに25 μlヒト血清、75 μl、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）及び予め冷却した300 μl無水メタノールを加え、同じ方法で処理して陰性対照とする。これは、主にメタノール沈殿後の目的ポリペプチドのピーク溶出時間に、ヒト血清自体に含まれるタンパク質またはポリペプチドの干渉を排除するためである。
血清安定性実験のプロセスは以下の通りである。3つの無菌EPチューブを取り、各EPチューブに16.5 μl、1 mM GLP-1またはGLP-1アナログ、及び396 μl、50 mM Tris（pH 7.0）緩衝液を加えた。同時に、別の無菌EPチューブに一定容量のヒト血清を加えた。その後、ポリペプチド及びヒト血清を入れた4つのEPチューブを37℃で10 min予熱し、ポリペプチドを入れた各EPチューブにそれぞれ137.5 μlヒト血清を加えてよく混合し、そのGLPまたはGLP-1アナログの終濃度は0.03 mMとし、ヒト血清の終濃度は25%（v/v）とする。計時を開始し、0.5、2.0、4.0、8.0及び12.0 hインキュベートした後にそれぞれ100 μlの反応液を取り出し、予め冷却した300 μl無水メタノールを加え、転倒混合した後に-20℃で一夜放置した。すべての試料は18000 g、4℃で10 min遠心分離し、上清を採取し、吸引瓶で有機溶媒を全部抽出し、凍結乾燥した。60 μl、50%（v/v）メタノール/水溶液を加えて試料を溶解し、18000 g、4℃で5 min遠心分離し、上清を採取してRP-HPLC分析に用いた。各時点で3回繰り返し、RP-HPLCを用いて各時点のポリペプチドのピーク面積を測定し、0 hにおける原型ポリペプチドのピーク面積に対する測定時間T（h）における試料の残存ピーク面積の比をポリペプチドの残存率（%）として計算した。陰性対照は、ヒト血清自体に含まれるタンパク質またはポリペプチドがこの処理方法で目的ポリペプチドの検出に干渉しないことを示した。
結果：GLP-1及びそのアナログをヒト血清とともに12 hインキュベートした後、GLP-1は約3.5%残り、これはその血漿中半減期がわずか1-2分であるという文献報告と一致していない。なぜなら、体循環においては、主に代謝酵素DPP-IV及びNEP24.11によって分解して代謝されるが、この2つの代謝酵素は膜タンパク質であり、正常の血清における濃度が極めて低いからである。特に血液循環に放出されるNEP24.11は多くの生理・病理のバイオマーカーとして使用できる。一方、トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログは、いずれも高い血清安定性を示し、トリプシン阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログは、N-末端融合（SEQ ID NO：194及びSEQ ID NO：198）及びC-末端融合（SEQ ID NO：196及びSEQ ID NO：200）のいずれも良好な血清安定性を示した。そのうち、C末端にキモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209）は、N-末端にキモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NO：202、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO：208）と比較して、血清安定性がより高かった（図20及び表19）。この結果より、セリンプロテアーゼを阻害する阻害ペプチド分子を融合したGLP-1アナログは血清サイクルにおいて、DPP-IV及びNEP24.11のほかに、他のセリン類代謝酵素に対しても阻害作用を有し、その血清安定性が高めたことが示された。
Figure 2023551050000044
Figure 2023551050000045
Figure 2023551050000046
 実施例8. 正常ICRマウスに対するGLP-1アナログ（ハイブリッドペプチド）のin vivo血糖降下活性
皮下投与：
実験前日、動物は15-16 h絶食し、水を自由に摂取させた。実験当日、動物を体重別に無作為に群分けし、各群10匹とする。まず動物の尾の先端から0時間血を採取し、その後、各群の動物に1 μmol/kgで試料（GLP-1アナログSEQ ID NOs：194-201）または生理食塩水を皮下投与し、30 min後にブドウ糖溶液（2 g/kg）を強制経口投与した。糖投与後30 min、60 min及び120 minにそれぞれ尾の先端から採血し、グルコースオキシダーゼ法で血糖値を測定し、各時刻における血糖値及び血糖曲線下面積（AUC）を計算した。
AUC （mg×h/dl） = （BG0 + BG30） × 30/60 + （BG30 + BG60） × 30/60 + （BG60 + BG120） × 60/60，そのうち、BG0、BG30、BG60及びBG120はそれぞれブドウ糖負荷後0 min、30 min、60 min、120 minでの血糖値を示す。
結果：トリプシンの阻害ペプチド分子BT9（SEQ ID NO：9）、BT45（SEQ ID NO：45）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを同時に含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NO： 194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198及びSEQ ID NO：200）を皮下投与することにより、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後30、60、120 minにおける血糖値及びAUCを有意に低下させることができる（図21A及び表20）。トリプシンの阻害ペプチド分子BT9（SEQ ID NO：9）、BT45（SEQ ID NO：45）及びNEP24.11を阻害するOpiorphin （QRFSR）ペプチドセグメントを同時に含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：201）を皮下投与することにより、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後30、60minにおける血糖値及びAUCを有意に低下させることができる（図21B及び表20）。以上の結果より、トリプシン阻害ペプチド分子の導入がGLP-1と受容体との結合を破壊しなかったことが示された。
キモトリプシンの阻害ペプチド分子CH4（SEQ ID NO：84）、CH10（SEQ ID NO：90）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを同時に含有するGLP-1アナログSEQ ID NO：202-205を皮下投与することも、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後30、60、120 minにおける血糖値及びAUC値（図21C及び表20）を有意に低下させることができ、キモトリプシン阻害ペプチド分子の導入がGLP-1と受容体との結合を破壊しなかったことが示された。
エラスターゼの阻害ペプチド分子EC1（SEQ ID NO：134）、EC12（SEQ ID NO：145）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを同時に含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NOs： 206-209）を皮下投与することも、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後30、60minにおける血糖値及びAUC値（図21D及び表20）を有意に低下させることができ、エラスターゼ阻害ペプチド分子の導入がGLP-1と受容体との結合を破壊しなかったことが示された。
アセチル化及びアミド化のGLP-1アナログSEQ ID NO：194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198及びSEQ ID NO：200及びN-末端PEG修飾のSEQ ID NO：200とSEQ ID NO: 204を皮下投与した場合は、その未修飾の分子と比較して、血糖降下活性に有意差はなかった。
Figure 2023551050000047
Figure 2023551050000048
Figure 2023551050000049
Figure 2023551050000050
 十二指腸内投与
薬物送達技術は腸溶性コーティング技術を用いて小腸を標的とする経口投与を実現できることに基づき、本発明はGLP-1の小腸直接投与の実施可能性を確認するため、十二指腸内投与を設計し、その実験プロセスは以下の通りである。実験前日、動物は15-16 h絶食し、水を自由に摂取させた。実験当日、動物を体重別に無作為に群分けし、各群9-11匹または14-15匹（複合投与）、まず、動物の尾の先端から0時間血を採取し、その後、動物をジエチルエーテル吸入による麻酔下におき、胃に近い下の部位で手術用はさみで小さな開口を切り、十二指腸を慎重に取り出し、10 μmol/kgで試料（GLP-1アナログSEQ ID NO：194-209）または生理食塩水を注入し、最後に創傷を縫合した。15 min後にブドウ糖溶液（2 g/kg）を強制経口投与し、糖投与後15 min、30 min及び60 minにそれぞれ尾の先端から採血し、グルコースオキシダーゼ法で血糖値を測定し、各時刻における血糖値及び血糖曲線下面積（AUC）を計算した。
AUC mg×h/dl） = （BG0 + BG15） × 15/60 + （BG15 + BG30） × 15/60 + （BG30 + BG60） × 30/60，そのうち、BG0、BG15、BG30及びBG60はそれぞれブドウ糖負荷後0 min、15 min、30 min、60 minでの血糖値を示す。
結果：トリプシンの阻害ペプチド分子BT9（SEQ ID NO：9）、BT45（SEQ ID NO:：45）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを含むGLP-1アナログ（SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：200）を十二指腸内投与する場合、そのうち、D-GLP-1-BT9（SEQ ID NO：200）は、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後15、30、60 minの血糖値及びAUC値を有意に低下させることができる。Nor群と比較して、BT1-D-GLP-1（SEQ ID NO：194）は、マウスの60 minにおける血糖値を23.2%低下させたが、この時点の血糖値は統計学的検定に合格していない。BT9-D-GLP-1（SEQ ID NO：198）を投与した場合、マウスの60 minにおける血糖値及びAUC値をそれぞれ22.7%及び20.1%を低下させたが、この時点の血糖値及びAUC値も統計学的検定に合格していない（図22A及び表21）。この結果より、トリプシンの阻害ペプチド分子BT9及びDPP-IVを阻害するdiprotin A（IPI）ペプチドセグメントを同時に導入することで、GLP-1アナログの耐酵素分解安定性を高め、十二指腸内投与で薬効を発揮させることができ、また、阻害ペプチド分子BT9がGLP-1のC末端に直接結合する時のポリペプチドの活性がより強いことが示された。BT1-D-GLP-1及びBT9-D-GLP-1の十二指腸内投与はマウスにおいても一定の血糖降下作用を示した。
トリプシンの阻害ペプチド分子BT9（SEQ ID NO：9）、BT45（SEQ ID NO：45）及びNEP24.11を阻害するOpiorphin （QRFSR）ペプチドセグメントを含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：199及びSEQ ID NO：201）の十二指腸内投与は、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後の血糖値を改善することができない。
キモトリプシンの阻害ペプチド分子CH4（SEQ ID NO：84）、CH10（SEQ ID NO：90）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NOs：202-205）を十二指腸内投与する場合、そのうち、CH4-D-GLP-1（SEQ ID NO：202）は、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後30 minの血糖値及びAUC値を有意に低下させることができ、30minの血糖値及びAUC値はそれぞれ32.3%及び23.6%低下した。CH10-D-GLP-1（SEQ ID NO：204）は、正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後15 minの血糖値及びAUC値を有意に低下させることができ、15minの血糖値及びAUC値はそれぞれ20.4%及び15.8%低下した。D-GLP-1-CH10（SEQ ID NO：205）も正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後15 minの血糖値を有意に低下させることができ、血糖値は24.8%低下した（図22B及び表21）。この結果より、キモトリプシンの阻害ペプチド分子CH4、CH10及びDPP-IVを阻害するdiprotin A（IPI）ペプチドセグメントを導入することでGLP-1アナログの安定性を高めることができ、さらに十二指腸内に投与した薬物が血液循環に効果的に吸収され薬効を発揮させることができる。
エラスターゼの阻害ペプチド分子EC1（SEQ ID NO：134）、EC12（SEQ ID NO：145）及びDPP-IVを阻害するdiprotin A （IPI）ペプチドセグメントを含有するGLP-1アナログ（SEQ ID NOs：206-209）を十二指腸内投与した場合、4つのGLP-1アナログはいずれも正常ICRマウスのブドウ糖経口負荷後の血糖値及びAUC値を低下させることができなかった。構造改造後、これらGLP-1アナログのエラスターゼによる酵素分解に耐える安定性が増強されたが、この分子骨格を有するペプチドはトリプシン及びキモトリプシンの分解になかなか抵抗できないことが示された。しかし、Nor群と比較して、EC12-D-GLP-1（SEQ ID NO：208）は15、30、60 minにおける血糖降下率はそれぞれ11.9%、19.9%及び17.4%（図22C及び表21）であり、一定の血糖降下治療効果があるが、統計学的意義がない。
Figure 2023551050000051
Figure 2023551050000052
Figure 2023551050000053
 GLP-1アナログ組成物の十二指腸内投与の用量反応性：
小腸内で膵臓から分泌されるプロテアーゼは主にトリプシン（総蛋白の19%を占める）、キモトリプシン（総蛋白の9%を占める）、エラスターゼ[Whitcomb DC, Lowe ME. Human pancreatic digestive enzymes. Dig Dis Sci. 2007, 52, 1-17.]であり、異なるセリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格を含有するGLP-1アナログが複合効果を持つかどうかを検出するために、単用量（10 μmol/kg）での十二指腸内投与が有効なGLP-1アナログD-GLP1-BT9（SEQ ID NO：200）及びCH10-D-GLP-1（SEQ ID NO：204）を選択して用量反応性試験を行った。試験結果より、D-GLP1-BT9及びCH10-D-GLP-1の2.5または5.0 μmol/kg投与量では血糖降下活性がないことが示された。その後、単回投与無効用量（5 μmol/kg）のD-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1の組成物並びにD-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1、EC12-D-GLP-1（SEQ ID NO：208）の組成物を用いて、それぞれ十二指腸内投与試験を行った結果、D-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1の組成物の5.0 μmol/kg用量は15分間で顕著な血糖降下作用を示した（p = 0.0319）。D-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1の組成物は30及び60 minで依然として一定の血糖降下活性を維持しているが、統計学的意義がない。しかし、最も驚くべき発見は、3つの5.0 μmol/kg用量のD-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1、EC12-D-GLP-1の組成物が、ICRマウスのブドウ糖経口負荷後の15（p=0.0035）、30（p=0.0087）及び60 min（p=0.0083）の血糖値及びAUC値（p=0.0069）を顕著に低下させたことである（図23及び表22）。この結果より、異なるセリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログは複合効果があることが示され、ポリペプチド/タンパク質の十二指腸・経口投与には、ポリペプチド/タンパク質の分解を阻害し、小腸上皮におけるポリペプチド/タンパク質の効果的な吸収を促進するために、複数のセリンプロテアーゼ阻害剤が必要であることも示唆された。
Figure 2023551050000054
 実施例9. セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格によるPCSK9を標的とする阻害ペプチドのin vivo活性の向上
セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格を含有するGLP-1アナログのin vivo活性研究に基づき、これらのポリペプチド分子骨格が他の治療性ポリペプチドの治療効果を高めるために広く使用できるかどうかをさらに研究するために、PCSK9-LDLRのタンパク質間相互作用を阻害するPep 2-8（PCSK9_1，SEQ ID NO：210）を研究目標として、PCSK9-LDLR相互作用を標的とする一連のポリペプチドを設計して合成した（表23）。
in vitro阻害活性：
ポリペプチドPCSK9_1-14（SEQ ID NOs：210-223）を純水またはDMSOで溶解した。85 μl Reaction Buffer、5 μl 1 mMポリペプチド試料及び10 μl 750 ng/ml PCSK9タンパク質を室温で20 minプレインキュベートした後、96ウェルプレートに加え、PCSK9-LDLR in vitro Binding Assay Kit （CY-8150）キット（MBL社、中国北京）の説明書に従ってOD450/540 nmの値を測定した。溶媒対照：ポリペプチドを5 μl溶媒に置き換えた。100 μl反応系において、ポリペプチドの終濃度は50 μMとし、PCSK9の終濃度は75 ng/mlとする。
ポリペプチドの阻害率（%）= （OD450/540 nm（溶媒対照）- OD450/540 nm（試料）） / OD450/540 nm（溶媒対照）* 100
結果：終濃度が50 μMの場合、トリプシンの阻害ペプチド分子骨格BT9を含有するポリペプチドPCSK9_2、PCSK9_3、PCSK9_5、PCSK9_6、PCSK9_7、PCSK9_8及びトリプシンの阻害ペプチド分子骨格BT45を含有するPCSK9_9は、文献で報告されている試料PCSK9_1と比べて、PCSK9-LDLR相互作用に対してより優れた阻害活性を有し、キモトリプシン及びエラスターゼの阻害分子骨格CH10及びEC12を含有するポリペプチドPCSK9_2CH、PCSK9_2EC、PCSK9_3CH、PCSK9_3EC、PCSK9_5CH、PCSK9_5EC、PCSK9_6CH、PCSK9_6EC、PCSK9_9CH及びPCSK9_9ECもPCSK9-LDLR相互作用に対して良好な阻害活性を有する（表24）。この結果より、トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子骨格（BT9、BT45、CH10及びEC12）はポリペプチドPep2-8（PCSK9_1）のPCSK9-LDLR相互作用に対する阻害活性を2-3倍高めることができることが示された。特にPCSK9_9ポリペプチド分子に挿入されたトリプシンの阻害ペプチド分子はキモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子と高い類似性を有し、キモトリプシン及びエラスターゼの阻害ペプチド分子も、Pep 2-8（PCSK 9_1）のPCSK 9-LDLR相互作用に対する阻害活性を高めることができることが示唆された。
Figure 2023551050000055
Figure 2023551050000056
 in vivo脂質降下活性：
モデルの作製及び検証：正常ICRマウスを一晩絶食させ、水を自由に摂取させた。翌日にポロキサマー407（P407，500 mg/kg）を腹腔内投与し、24 h後に血清総コレステロール（TC）及び低比重リポ蛋白コレステロール（LDL-C）値が有意に増加した。臨床薬であるRepatha 40 mg/kgの皮下投与24 h後、P407を腹腔内投与し、P407投与後24 hに血清TC及びLDL-C値を測定した（表25）。結論：P407の腹腔内投与はICRマウスに高TC及び高LDL-Cモデルの形成を明らかに誘導することができ、Repatha（40 mg/kg）の皮下投与はマウス血清TC及びLDL-C値を有意に低下させることができる。
Figure 2023551050000057
 PCSK9阻害ペプチドの皮下投与による脂質降下作用：
実験用ポリペプチド試料はPEG400で調製され、PCSK9試料の皮下投与の終濃度は2 μmol/kg、PEG400の終濃度は20%（w/v）とする。対照群はPEG400を含有する生理食塩水である。正常ICRマウスを一晩絶食させ、水を自由に摂取させた。翌日にすべてのマウスを体重別にモデル対照群（Con）及び投与群のいずれかに無作為割付け、各投与群の用量はいずれも2 μmol/kgである。次に、各群のマウスにP407（500 mg/kg）を腹腔内投与し、2 h後に飼料を添加してマウスを飼育した。正常対照群（Nor）として6匹のマウスを選択し、P407を注射しなかった。24 h後、モデル群のマウスにPEG400-生理食塩水を皮下投与し、投与群マウスに各ポリペプチドを投与し、投与後の異なる時点で採血し、血清総コレステロール（TC）値を測定した。評価モデルにおける血清LDL-C値に影響を与える要因が複雑であり、特に単回投与及び長期投与の適時性に関する問題があることに基づき、PCSK9阻害ペプチドのin vivo活性について、マウス血清TC値の変化を観察することに焦点を当てた。
その結果、Nor群と比較して、Con群マウスの血清TC値が有意に上昇し、高脂血症モデルの形成が示唆された。Con群と比較して、PCSK9_5、PCSK9_6、PCSK9_9、PCSK9_5EC、PCSK9_6CH、及びPCSK9_6ECの単回皮下投与は、マウス血清TC値を低下させた（表26）。
Figure 2023551050000058
Figure 2023551050000059
 PCSK9阻害ペプチドの十二指腸を標的とする投与による脂質降下作用：
腸溶性コーティング技術を用いて小腸を標的とする経口投与を実現できることに基づき、胃排出や胃の物理的障害などの影響要因を考慮し、PCSK9を標的とする阻害ペプチドの小腸直接投与の実施可能性を正確に測定するために、十二指腸内投与を設計し、その実験プロセスは以下の通りである。
実験用ポリペプチド試料はPEG400で調製され、PCSK9試料の十二指腸内投与の終濃度は20 μmol/kg、PEG400の終濃度は50%（w/v）とする。対照群はPEG400を含有する生理食塩水である。
正常ICRマウスを一晩絶食させ、水を自由に摂取させた。翌日、すべてのマウスにポロキサマー407（P407，500 mg/kg）を腹腔内投与し、脂質代謝障害モデルを形成した。正常対照群（Nor）として6匹のマウスを選択し、生理食塩水を腹腔内投与した。2 h後に通常の摂食に戻った。モデル動物を体重別にモデル群（Con）及び投与群のいずれかに無作為割付け、尾の先端から採血（0 min）した後、ジエチルエーテルで動物を麻酔し、十二指腸露出手術を行い、同時に十二指腸を経由して試料またはPEG400を含有する生理食塩水を注射し、最後に創傷を縫合した。投与後15、30、60及び90 minに尾の先端から採血し、マウスの血清総コレステロール値を測定した。
結果：上記の皮下投与したPCSK9を標的とする阻害ペプチドのin vivo活性データに基づき、PCSK9_6、PCSK9_6CH及びPCSK9_6ECを代表分子として十二指腸内投与実験を行った。実験の測定結果により、低用量（20 μmol/kg）では脂質降下活性を示さなかった（表27）。その原因は、合成して調製した試料の純度が低く、原型ポリペプチドPCSK9_1（Pep2-8）自体は既に皮下投与実験において、総コレステロールを低下させる作用がほとんどないことを示した。
Figure 2023551050000060
 トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼに対するPCSK9阻害ペプチドの安定性分析：
実施例5における実験方法を参照し、皮下投与活性を有するPCSK9阻害ペプチドについて、in vitroでキモトリプシンに対する耐性の安定性分析を行った。
結果：PCSK9_1は分子内に塩基性アミノ酸を含まないため、キモトリプシン及びエラスターゼに対しては不安定であるが、トリプシンに対しては非常に安定である。体内脂質降下活性を有するPCSK9_6を代表として、キモトリプシン及びエラスターゼに対する安定性を分析した。その実験結果より、対応するセリンプロテアーゼ阻害ペプチドを含有していないにもかかわらず、他の2つのプロテアーゼに対して一定の阻害作用があることが示された（表28及び29）。
Figure 2023551050000061
Figure 2023551050000062
 実施例 10. セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格によるサケカルシトニンアナログの経口吸収促進の体内活性
サケカルシトニンは老人性骨粗鬆症及び変形性関節症を治療するポリペプチド薬であり、その効果は比較的明確である。臨床投与剤形は注射液及び鼻噴霧剤であり、セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格がサケカルシトニン経口投与の治療効果を高めることができるかどうかを確認するために、異なるプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格を含有するサケカルシトニンアナログを設計して合成した（表30）。
Figure 2023551050000063
 トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼに対するサケカルシトニンアナログの安定性分析
実施例5における実験方法を参照し、経口投与活性を有するサケカルシトニンアナログについて、in vitroでトリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼによる酵素分解に対する耐性の安定性分析を行った。
結果：サケカルシトニンアナログ（CalM）はトリプシンに対して極めて不安定で、3 min作用後にほとんど分解された。CalMはキモトリプシンに対して一定の安定性があり、60 min作用後の未変化ペプチドが約4.9%残る。セリンプロテアーゼ阻害分子骨格を含有するサケカルシトニンアナログCal-BT、Cal-CH及びCal-ECはそれぞれ阻害ペプチド分子骨格に対応するプロテアーゼの分解に対して耐性があり、そのうち、Cal-BTはトリプシンの分解だけでなく、キモトリプシンに対しても高い耐性を有する。Cal-ECはキモトリプシンに対して一定の耐性を有する（表31及び32）。
Figure 2023551050000064
Figure 2023551050000065
 サケカルシトニンの皮下投与による血中カルシウム降下作用
実験前にラットを12 h絶食させ，蒸留水を自由に摂取させた。動物を無作為に4群（各群5匹）に分け、正常対照群は生理食塩水溶液を注射し、投与群はそれぞれ市販のサケカルシトニン（sCat）及び合成カルシトニンアナログ（CalM）を皮下投与、及びカプセル剤形のCal-BT（1 umol/kg，p.o.）を強制経口投与した。
事前に設定した時点でラットの内眼角から採血：0 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 hの各時点で少なくとも0.2 ml採血した。血液検体を4℃で静置して分層し、3000 rpmで10 min遠心分離し、血清を採取し、血清カルシウムイオンの濃度を測定した。
0 hの血清カルシウムイオン濃度を基準とし、それ以外の時間の血中カルシウム濃度を0 h時の血中カルシウム濃度の百分率に換算し、時間をX軸とし、血中カルシウムの濃度百分率（%）をY軸とし、カルシトニンのin vivo薬効試験の血中カルシウム曲線を作成した。
結果：SDラットの体重に対する異なる投与群の影響（表33）。投与後の異なる時間におけるSDラット体内の血中カルシウム濃度の低下を評価基準として測定した結果、市販のサケカルシトニン（sCat）投与後3、4、6、8、12、24時間にラット体内のカルシウムイオン濃度を効果的に低下させることができる。サケカルシトニンアナログ（CalM）は投与3時間後にラット体内のカルシウムイオン濃度を効果的に低下させたが、カプセル剤形のCal-BTはラット体内のカルシウムイオン濃度を効果的に低下させることができなかった（図24）。
Figure 2023551050000066
 実施例11. セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格によるインターロイキン-17A（IL-17A）を標的とする阻害ペプチドのin vivo活性の向上
セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子を含有するGLP-1アナログのin vivo活性研究に基づき、これらのポリペプチド分子骨格が他の治療性ポリペプチドの治療効果を高めるために広く使用できるかどうかをさらに研究するために、インターロイキン-17A（IL-17A）に対して阻害作用を有する17A（SEQ ID NO：238）を研究目標として、IL-17Aを標的とする一連の阻害ペプチドを設計して合成した（表34）。
Figure 2023551050000067
 トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼに対するIL-17A阻害ペプチドの安定性分析：
実施例5における実験方法を参照し、17A及びそのアナログについて、in vitroでトリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼによる酵素分解に対する耐性のの安定性分析を行った。
結果：17Aは分子内に塩基性アミノ酸を含まないため、キモトリプシン及びエラスターゼに対しては不安定であるが、トリプシンに対しては非常に安定である。17A-BT、17A-CH及び17A-ECは、それぞれ阻害ペプチド分子骨格に対応するプロテアーゼの分解に対して耐性があり、同時に他の2つのプロテアーゼにも一定の阻害作用がある（表35）。
Figure 2023551050000068
 IL-17A阻害ペプチドの抗炎症活性：
IL-17Aは多くの慢性炎症反応の炎症因子であり、その抗炎症効果を迅速に評価して分析するために、まずマウス耳腫脹モデルを用いて抗炎症活性の予備的スクリーニングを行った。実験プロセスは以下の通りである。昆明雄マウス（18-20 g）を1群10匹とし、ピクリン酸で標識した。各群のマウスに対して、右耳の表裏両面にそれぞれ10 μlクロトン油を塗布した。モデル作製した直後に、実薬であるセクキヌマブ群（5 mg/kg）は17A、17A-BT、17A-CH及び17A-EC阻害ペプチド（30 mg/kg）を皮下投与し、モデル対照群（Con）は対応する容量の生理食塩水を注射した。炎症を起こした4 h後、各群のマウスを頸椎脱臼により致死させ、パンチを用いて左右の耳の対称部位に耳片を取り、天秤で秤量し、その質量を記録し、腫脹度及び腫脹率を計算した：
腫脹率＝（（右耳の質量-左耳の質量）/左耳の質量）*100%
結果：IL-17Aを標的とする阻害ペプチド17A-BT及び17A-CHは、30 mg/kg皮下投与の場合にクロトン油による耳部腫脹炎症反応を顕著に抑制でき、17A及び17A-ECは抑制作用がなく、セリンプロテアーゼの阻害ペプチド分子骨格を含有することで、血液循環におけるIL-17A阻害ペプチドの安定性をよく向上させ、さらにその体内治療効果を高めることができることが示された（表 36）。
Figure 2023551050000069
 IL-17A阻害ペプチドの十二指腸内投与の抗炎症活性：
腸溶性コーティング技術を用いて小腸を標的とする経口投与を実現できることに基づき、胃排出や胃の物理的障害などの影響要因を考慮し、IL-17Aを標的とする阻害ペプチドの小腸直接投与の実施可能性を正確に測定するために、十二指腸内投与を設計した。各群マウス8匹とし、マウスはジエチルエーテル麻酔下で手術により十二指腸を露出させ、異なる群分け計画に従って注射投与し、モデル対照群（Con）にPEG400（50%, w/v）/生理食塩水を投与し、投与群に異なるポリペプチド試料（300 mg/kg）を投与し、陽性対照群にデキサメタゾン（1 mg/ml、10 ml/kg）を投与し、その後筋肉層及び皮膚層を縫合した。縫合後6 minに耳腫脹モデルを作製した。各群のマウスに対して、右耳の表裏両面にそれぞれ10 μlクロトン油を塗布した。炎症を起こした4 h後、各群のマウスを頸椎脱臼により致死させ、パンチを用いて左右の耳の対称部位に耳片を取り、天秤で秤量し、その質量を記録し、腫脹度及び腫脹率を計算した：
腫脹率＝（（右耳の質量-左耳の質量）/左耳の質量）*100%
結果：モデル群と比較して、IL-17Aを標的とする阻害ペプチド17A-BT（P<0.01）及び17A-CH（P<0.05）の十二指腸内投与によるマウス耳部腫脹に対する抑制作用は、統計学的に有意差があった（表37）。
Figure 2023551050000070
 実施例12. 浸漬塗布法によりコーティングされた腸溶性カプセル
カプセル（size M, Torpac）に腸溶性コーティングのトレーサとしてブロモフェノールブルー粉末を十分に充填し、2/3のカプセル表面をコーティング材料であるEudragit L 100-55混合物（Eudragit L100-55/0.9 g，PEG 400/0.14 g、Tween 80/0.01 g、アセトン/3.8 ml、イソプロパノール/5.7 ml、水/0.5 ml）に15 s浸漬し、30 min乾燥した。次に、それを転倒し、残りの1/3のカプセル表面を同じ方法で処理し、浸漬塗布を3回繰り返し、ドラフト内で室温で72 h乾燥した。その後、腸溶性コーティングされたカプセルをpH 1.6の模擬胃液（gastric fluid）に2時間浸漬するか、pH 6.5の模擬腸液（intestinal fluid）に1時間浸漬し、浸漬時間の経過に伴ってカプセルが崩壊して放出したブロモフェノールブルーの量をモニターし、すなわち422 nMにおける光吸収量を測定し、カプセルのコーティング効果を確認した。その結果、カプセルコーティングの厚さは0.16±0.05 nm、カプセルを模擬胃液に2時間浸漬した後に放出したブロモフェノールブルーは2.8 ~ 6.5%（92 ~ 97%は完全な状態に維持）、カプセルを模擬腸液に1時間浸漬した後に放出したブロモフェノールブルーは44 ~ 51.3%であった。
Xaa6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' -Xaa8' （M）
式中、
Xaa1は、Lys、Arg、Tyr、Phe、Ala又はLeuから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp、Gly、Thr、Arg、システイン又はホモシステインから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala、Thr、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Gln、Nleから選択されるか又は存在せず、
Xaa6は、システイン、ホモシステインであるか又は存在せず、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala、Met、Asp、Trp又はGluから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg、Gly又はTrpから選択され、
Cys6’がシステイン又はホモシステインから選択される。
Cys6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' （I）
式中、Cys6又はCys6'は、システイン又はホモシステインから独立して選択され、前記ポリペプチドは、Cys6とCys6'の間のジスルフィド結合によって環化され、
そのうち、Xaa1がLys又はArgから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp又はGlyから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Gln又はNleから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala又はMetから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser又はHypから選択され、
Xaa1がTyr又はPheから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
Xaa4は、Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp又はGluから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
Xaa5'は、Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu又はGlyから選択され、
Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser又はHisから選択され、
Xaa1がAla又はLeuから選択される場合、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Asn、Tyr又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Gln、Tyr、Arg、His又はAsnから選択される。
式中、Xaa1は、Lys又はArgから選択され、
Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Gly、Nle、Ser、Thr又はGlnから選択され、
Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
Xaa5は、Ala、Gly、Pro、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Gln又はNleから選択され、
Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
Xaa2'は、Ile、Leu、Nle又はAlaから選択され、
Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
Xaa4'は、Pro又はAlaから選択され、
Xaa5'は、Ile、Ala又はGlnから選択され、
Xaa7'は、Phe又はTyrから選択される。

Claims (28)

  1. 下記の一般式Mで示される構造を有するポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ、又はその薬学的に許容される塩。
    Xaa6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' -Xaa8' （M）
    （式中、
    Xaa1は、Lys、Arg、Tyr、Phe、Ala又はLeuから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp、Gly、Thr、Arg、システイン又はホモシステインから選択され、
    Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala、Thr、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
    Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln、Nleから選択されるか又は存在せず、
    Xaa6は、システイン、ホモシステインであるか又は存在せず、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala、Met、Asp、Trp又はGluから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg、Gly又はTrpから選択され、
    Cys6’は、Cys又はHcyから選択され、
    Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser、Hyp、Val、Arg又はIleから選択され、
    Xaa8'は、Gly、Alaから選択されるか又は存在せず、
    ここで、Xaa3とXaa6のうち、1つだけがシステイン又はホモシステインでなければならず、
    Xaa3がシステイン又はホモシステインの場合、Xaa5及びXaa6が存在せず、前記ポリペプチドは、Xaa3とCys6'の間のジスルフィド結合を介して環化され、
    Xaa6がシステイン又はホモシステインの場合、前記ポリペプチドは、Xaa6とCys6'の間のジスルフィド結合を介して環化される。）
  2. 前記ポリペプチドが下記の一般式Iに示される構造を有する、請求項1に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    Cys6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7' （I）
    （式中、Cys6又はCys6'は、システイン又はホモシステインから独立して選択され、前記ポリペプチドは、Cys6とCys6'の間のジスルフィド結合によって環化され、
    そのうち、Xaa1がLys又はArgから選択される場合、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp又はGlyから選択され、
    Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
    Xaa5は、Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln又はNleから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala又はMetから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg又はGlyから選択され、
    Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser又はHypから選択され、
    Xaa1がTyr又はPheから選択される場合、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
    Xaa4は、Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
    Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp又はGluから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu又はGlyから選択され、
    Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser又はHisから選択され、
    Xaa1は、Ala又はLeuから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
    Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
    Xaa5は、Gly、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Asn、Tyr又はAlaから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Glnから選択され、
    Xaa7'は、Gln、Tyr、Arg、His又はAsnから選択される。）
  3. 式中、Xaa1は、Lys又はArgから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Tyr、Gly、Nle、Ser、Thr又はGlnから選択され、
    Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
    Xaa5は、Ala、Gly又はProから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Leu、Nle又はAlaから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro又はAlaから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Ala又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Phe又はTyrから選択されることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  4. 次の配列を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする、請求項3に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78及びSEQ ID NO：79
  5. 式中、Xaa1は、Tyr又はPheから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala又はAbuから選択され、
    Xaa4は、Ser、Ala、Phe又はThrから選択され、
    Xaa5は、Ala、Gly又はProから選択され、
    Xaa1'は、Serから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Ala又はAsnから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Gln又はHisから選択されることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  6. 式中、Xaa1は、Ala又はLeuから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa3は、Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro又はArgから選択され、
    Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
    Xaa5は、Gly、Pro、Ala又はHypから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile又はAsnから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Gln又はTyrから選択されることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  7. 前記ポリペプチドが下記の一般式IIに示される構造を有する、請求項1に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    Xaa4-Cys3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Cys6'-Xaa7'-Xaa8' （II）
    （式中、Cys3又はCys6'は、システイン又はホモシステインから独立して選択され、前記ポリペプチドは、Cys3とCys6'の間のジスルフィド結合によって環化され、
    そのうち、Xaa1がLys又はArgから選択される場合、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala又はMetから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg又はGlyから選択され、
    Xaa7'は、Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser又はHypから選択され、
    Xaa8'は、存在せず、
    Xaa1がTyr又はPheから選択される場合、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met又はArgから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp又はGluから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala、Gly又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu又はGlyから選択され、
    Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser又はHisから選択され、
    Xaa8'は、Gly、Alaから選択されるか又は存在せず、
    Xaa1がAla又はLeuから選択される場合、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Asn、Tyr又はAlaから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Hyp又はAlaから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Glnから選択され、
    Xaa7'は、Gln、Tyr、Arg、His又はAsnから選択され、
    Xaa8'は存在しない。）
  8. 式中、Xaa1は、Lys又はArgから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Arg、Lys、Ser、Ala又はThrから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Leu、Nle又はAlaから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro又はAlaから選択され、
    Xaa5'は、Ile、Ala又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Phe又はTyrから選択され、
    Xaa8'は、存在しないことを特徴とする、請求項7に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  9. 次の配列を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする、請求項8に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 65又はSEQ ID NO: 66
  10. 式中、Xaa1は、Tyr又はPheから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Ser、Ala、Phe又はThrから選択され、
    Xaa1'は、Serから選択され、
    Xaa2'は、Ile、Ala又はAsnから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro、Ala又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Tyr、Phe、Asn、Gln又はHisから選択され、
    Xaa8'は、Glyから選択されるか又は存在しないことを特徴とする、請求項7に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  11. 次の配列を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする、請求項10に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132及びSEQ ID NO: 133
  12. 式中、Xaa1は、Ala又はLeuから選択され、
    Xaa2は、Thr又はAlaから選択され、
    Xaa4は、Ile、Leu、Val、Ala又はTyrから選択され、
    Xaa1'は、Ser又はAlaから選択され、
    Xaa2'は、Ile又はAsnから選択され、
    Xaa3'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa4'は、Pro又はHypから選択され、
    Xaa5'は、Ile又はGlnから選択され、
    Xaa7'は、Gln又はTyrから選択され、
    Xaa8'は、存在しないことを特徴とする、請求項7に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
  13. 次の配列を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする、請求項12に記載のポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩。
    SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158及びSEQ ID NO: 162
  14. セリンプロテアーゼファミリーでのトリプシン、キモトリプシン又はエラスターゼの阻害剤の調製における、請求項1に記載のいずれかのポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩の適用。
  15. 一般式III、IV又はVで示される構造を有するハイブリッドペプチド。
    B-L-A （III）
    A-L-B （IV）
    A1-L1-B-L2-A2 （V）
    （式中、
    ハイブリッドペプチドの分子量範囲は1.5-30 kDaであり、
    Bは、請求項1に記載のいずれかのポリペプチド、そのN末端、C末端又は側鎖がペグ化、リン酸化、アミド化又はアシル化によって修飾されているアナログ又はその薬学的に許容される塩であり、
    Lはリンカーで、1、2、3、4又は5つのグリシン又はプロリン残基を任意に含み、
    Aは、生理活性オリゴペプチドであり、疾患を治療できるタンパク質、ポリペプチド及び糖タンパク質から選択でき、
    A1、A2は、それぞれ生理活性オリゴペプチドAのN末端とC末端のペプチドセグメントであり、
    L1、L2は、リンカーであり、1、2、3、4又は5つのグリシン又はプロリン残基を任意に含むか、又は存在しない。）
  16. 前記生理活性オリゴペプチドがグルカゴン様ペプチド-1、そのアナログ又はそのペプチドセグメントから選択されることを特徴とする、請求項15に記載のハイブリッドペプチド。
  17. 以下の配列を有するペプチドから選択される、請求項16に記載のハイブリッドペプチド。
    SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208及びSEQ ID NO: 209
  18. 2型糖尿病及び/又は肥満症の治療のための薬剤の調製における、請求項16又は17に記載のハイブリッドペプチドの適用。
  19. 前記生理活性オリゴペプチドが配列SEQ ID NO: 210のペプチド、その変異体から選択されることを特徴とする、請求項15に記載のハイブリッドペプチド。
  20. 以下の配列を有するペプチドから選択される、請求項19に記載のハイブリッドペプチド。
    SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及びSEQ ID NO: 233
  21. 家族性高コレステロール血症の治療薬の調製における、請求項19又は20に記載のハイブリッドペプチドの適用。
  22. 前記生理活性オリゴペプチドがサケカルシトニン、そのアナログ又は変異体から選択され、前記サケカルシトニンがSEQ ID NO: 234に示される配列を有することを特徴とする、請求項15に記載のハイブリッドペプチド。
  23. 以下の配列を有するペプチドから選択される、請求項22に記載のハイブリッドペプチド。
    SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236及びSEQ ID NO: 237
  24. 骨粗鬆症及び/又は変形性関節症を治療するための薬剤の調製における、請求項22又は23に記載のハイブリッドペプチドの適用。
  25. 前記生理活性オリゴペプチドが、配列SEQ ID NO: 238のペプチド、そのアナログ又はその変異体から選択されることを特徴とする、請求項15に記載のハイブリッドペプチド。
  26. 以下の配列を有するペプチドから選択される、請求項25に記載のハイブリッドペプチド。
    SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240及びSEQ ID NO: 241
  27. 炎症性肺疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、全身性硬化症の治療薬の調製における、請求項25又は26に記載のハイブリッドペプチドの適用。
  28. 請求項15に記載のハイブリッドペプチド及び薬学的に許容される薬物担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
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