CN114573686A - 含有二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术药物领域。本发明为含有二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽及其应用，涉及三种分别具有抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)和弹性蛋白酶等小肠蛋白代谢酶活性的线性多肽分子，这些多肽分子可广泛地与其它具有治疗疾病活性的多肽或蛋白类药物融合形成杂交肽；杂交肽能抑制代谢酶的降解进而提高治疗疾病的多肽或蛋白类药物的稳定性，不仅可提高直接注射给药的疗效，还可以促进多肽或蛋白类药物在小肠的直接给药吸收，实现蛋白多肽类药物口服给药。

Description

含有二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，涉及具有抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)和弹性蛋白酶等丝氨酸代谢酶活性的三种类型多肽分子及其被聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化或酰基化修饰的类似物；本发明还涉及具有抑制丝氨酸蛋白酶活性肽的应用，这些多肽分子及其被聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化或酰基化修饰的类似物可与具有治疗疾病活性的蛋白、多肽或糖蛋白的N-或C-端融合、或者插入蛋白或多肽分子内融合形成杂交肽，杂交肽依然保持抑制丝氨酸代谢酶的活性，从而提高其体内给药的稳定性和疗效。
背景技术
生物活性蛋白质和多肽已被广泛用于治疗多种慢性和潜在威胁生命的疾病例如癌症、炎性疾病和糖尿病。蛋白质和多肽可呈现出特异性结合，对靶标分子有高特异性的相互作用和对非靶分子具有很低的特异性。长期用药多肽和蛋白也可以显示在组织中低积累，从而降低用药的副作用。此外，多肽在体内分解为其组成的氨基酸，从而降低有毒的代谢中间体导致的并发症风险。目前，由于蛋白和多肽在胃肠道中的稳定性和分子大小相关的吸收障碍导致的生物利用度低的问题，蛋白和多肽类药物的皮下或静脉内给药仍然是最广泛使用的给药途径。虽然广泛使用的、方便的口服药物途径对患者特别有吸引力，但需要克服胃肠道消化酶水解和肠上皮细胞的低渗透性两个主要的障碍1，2。
为解决蛋白和多肽的口服传递相关的挑战，例如在胃肠道中的稳定性和穿过小肠上皮细胞层的低渗透吸收，已发展了很多包括吸收促进剂、蛋白酶抑制剂和可降解的载体材料等共同口服给药的药物制剂技术，同时结合肠溶包被和纳米颗粒技术，这些技术有助于生物分子克服蛋白酶降解和渗透吸收的障碍。
小肠的微观解剖结构和生理功能表明，小肠是口服递送蛋白和多肽药物的最理想的释放点，因为它拥有近200m2小肠绒毛吸收表面，负责多达90％身体营养物质的吸收和转运。利用肠溶包被的药物递送系统，可以避免生物药物在通过胃时的酶降解，直接到达小肠吸收。在生物药物口服给药的实例中遇到的另一个难题是小肠的内腔内含有胰腺或小肠黏膜细胞分泌的高浓度蛋白裂解酶，获得具有适当口服活性药物的关键是保护治疗性的蛋白和多肽免于小肠内腔内蛋白酶的分解。在最近的研究报道中，许多胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂、胰腺蛋白酶抑制剂和抑肽酶的应用，降低这些酶的降解效应，提高了胰岛素的口服生物利用度3。
由于多肽类蛋白酶抑制剂具有低毒性和强的抑制活性，目前它能够很大程度上作为辅助剂克服治疗性的蛋白多肽药物口服给药的酶解障碍。在这些多肽类蛋白酶抑制剂中，一个选自大豆胰蛋白酶抑制剂家族的BBI家族抑制剂含有2个抑制蛋白酶的活性环(Loop)，抑制人胰蛋白酶和糜蛋白酶；此外，BBI家族的蛋白酶抑制剂还显示出对弹性蛋白酶的抑制活性。它们的多功能特性适用于胰腺分泌代谢酶所导致的多重酶解问题。因此，这类蛋白酶抑制剂已被广泛地用作治疗性蛋白多肽的蛋白酶抑制剂，在PCT专利WO2014191545、WO2019239405和WO2017161184中有公开描述。
对比BBI多肽抑制剂，向日葵胰蛋白酶抑制剂-1(SFTI-1)是一个从向日葵种子中分离的仅含有14个氨基酸残基的头尾环化的环肽，PCT专利公开号WO2020023386也描述了其可作为蛋白酶抑制剂，即一种口服药物组分用于糖尿病的治疗。SFTI-1形成一个刚性结构，包含2个短的β-折叠、一个分子内二硫键和头尾环化。这些结构特点有助于稳定SFTI-1的蛋白酶抑制活性环(Loop)，构成了其对胰蛋白酶极强的抑制活性(Ki＜0.1nM)的分子结构基础4。SFTI-1可工程化合成为许多治疗性靶点的丝氨酸蛋白酶抑制剂，工程化改造为包括蛋白裂解酶(matriptase)5，6、mesotrypsin7和激肽释放酶相关-蛋白酶4(KLK4)8，9等癌症相关的蛋白酶抑制剂。SFTI-1也工程化改造为与皮肤病相关的蛋白酶如KLK510，11，12，13和KLK714的抑制剂。此外，SFTI-1突变体已设计为铁超载障碍的靶蛋白酶matriptase-215、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶Furin16、与慢性炎症相关的组织蛋白酶G(cathepsin G)17，18、特异性的类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶样的蛋白酶319、与纤维蛋白溶解相关的纤维蛋白酶20以及与免疫功能相关的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(chymase)21等蛋白酶抑制剂。除此之外，SFTI-1分子较小和耐受酶解的结构特点，使得其作为一个很好的蛋白质工程分子骨架，具有新的功能肽段可嫁接到SFTI-1的分子结构中，工程化合成放射性治疗物22、促血管生成的化合物23、缓激肽B1受体拮抗剂24、皮质素受体激动剂25，以及衍生自膜联蛋白A1(annexin A1)、α-纤维蛋白原表位和CD2粘附结构域的其它肽段嫁接到SFTI-1支架中可用于治疗炎性肠病(IBDs)26和类风湿性关节炎27，28。然而，这些工程化产生的蛋白酶抑制环(Loop)或嫁接的活性表位长度限制于少于10个氨基酸残基。SFTI-1分子中骨架还没有用于较长的多肽如胰高血糖素样肽-1或蛋白如抗体的工程改造。
多肽类蛋白酶抑制剂和生物药物分子可同时包装成纳米颗粒系统，高效地保护药物分子免受酶解破坏，提高多肽和蛋白的肠道吸收。然而，多肽类蛋白酶抑制剂的一个严重不足是它们也有较高的毒性，尤其是需要长期给药，同时在胃肠道中蛋白酶抑制剂可能干扰正常的蛋白消化和吸收，可能引起人胃肠道可逆的或不可逆的结构和功能损伤。多肽类蛋白酶抑制剂是专一性的，仅在特定的时间点和位点发挥作用，且生物药物和多肽类蛋白酶抑制剂必需同时透过代谢吸收位点。此外，多肽类蛋白酶抑制剂的使用可能增加整个药物在吸收位点的数量且不利于药物穿过生物膜。多肽类蛋白酶抑制剂的存在将影响胃肠道营养的正常吸收，甚至刺激代谢酶的过度分泌和表达而产生反馈调节，长期处理将导致脾增大和细胞增长。
发明内容
本发明提供一种含有分子内二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽，通过简化现有SFTI-1多肽类蛋白酶抑制剂的活性环(Loop)结构，获得抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽，这些多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学可接受的盐可以作为胰蛋白酶或糜蛋白酶或弹性蛋白酶的抑制剂，也可以与具有药物治疗活性的多肽或蛋白融合形成杂交肽，所形成的杂交肽依然保持对胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶的抑制活性，同时增强了其耐受其它代谢酶降解的稳定性和提高了其体内药理活性。
本发明提供了具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽，如通式I或II所示结构的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐：
Cys6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1′-Xaa2′-Xaa3′-Xaa4′-Xaa5′-Cys6′-Xaa7′(I)；
Xaa4-Cys3-Xaa2-Xaa1-Xaa1′-Xaa2′-Xaa3′-Xaa4′-Xaa5′-Cys6′-Xaa7′-Xaa8′(II)；
其中，Cys3、Cys6或Cys6′各自独立地选自半胱氨酸或高半胱氨酸；所述多肽通过Cys6和Cys6′或者Cys3和Cys6′之间的一个二硫键环化；
其中，当Xaa1选自Lys或Arg时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp或Gly；
Xaa4选自Arg、Lys、Ser、Ala或Thr；
Xaa5选自Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln或Nle；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala或Met；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala或Hyp；
Xaa5′选自Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg或Gly；
Xaa7′选自Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser或Hyp；
Xaa8′不存在；
当Xaa1选自Tyr或Phe时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met或Arg；
Xaa5选自Gly、Pro、Hyp或Ala；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp或Glu；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala、Gly或Hyp；
Xaa5′选自Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu或Gly；
Xaa7′选自Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser或His；
Xaa8′选自Gly、Ala或不存在；
当Xaa1选自Ala或Leu时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ile、Leu、Val、Ala或Tyr；
Xaa5选自Gly、Pro、Hyp或Ala；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Asn、Tyr或Ala；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Hyp或Ala；
Xaa5′选自Ile或Gln；
Xaa7′选自Gln、Tyr、Arg、His或Asn；
Xaa8′不存在；
其中所述的多肽不包括序列为SEQ ID NO：1的多肽。
此后提供氨基酸的列表1，所述氨基酸或其残基适合于本发明的目的，其中缩写对应于通常采用的由IUPAC有机化学命名委员会和IUPAC-IUB生物化学命名委员会提议的命名惯例：
表1.氨基酸命名表
Figure BSA0000226789550000051
Figure BSA0000226789550000061
在本发明的一个具体实施方案中，具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，优选是具有抑制胰蛋白酶活性。
其中，Xaa1选自Lys或Arg；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Tyr、Gly、Nle、Ser、Thr或Gln；
Xaa4选自Arg、Lys、Ser、Ala或Thr；
Xaa5选自Ala、Gly、Pro、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln或Nle；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Leu、Nle或Ala；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro或Ala；
Xaa5′选自Ile、Ala或Gln；
Xaa7′选自Phe或Tyr；
Xaa8′不存在。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有抑制胰蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70。
在本发明的另一个更优选的具体实施方案中，具有抑制胰蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：66和SEQ ID NO：67。
在本发明的另一个具体实施方案中，具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，优选是具有抑制糜蛋白酶活性。
其中，Xaa1选自Tyr或Phe；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala或Abu；
Xaa4选自Ser、Ala、Phe或Thr；
Xaa5选自Ala、Gly或Pro；
Xaa1′选自Ser；
Xaa2′选自Ile、Ala或Asn；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala或Hyp；
Xaa5′选自Ile或Gln；
Xaa7′选自Tyr、Phe、Asn、Gln或His；
Xaa8′选自Gly、Ala或不存在。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有抑制糜蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：113、SEQ IDNO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133。
在本发明的另一个更优选的具体实施方案中，具有抑制糜蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：85和SEQ IDNO：90。
在本发明的另一个具体实施方案中，具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，优选是具有抑制类糜蛋白酶样的弹性蛋白酶活性。
其中，Xaa1选自Ala或Leu；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ile、Leu、Val、Ala或Tyr；
Xaa5选自Gly、Pro、Ala或Hyp；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile或Asn；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro或Hyp；
Xaa5′选自Ile或Gln；
Xaa7′选自Gln或Tyr；
Xaa8′不存在。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有抑制弹性蛋白酶活性的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：162。
在本发明的另一个更优选的具体实施方案中，具有抑制弹性蛋白酶活性的肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，可选自：SEQ ID NO：145、SEQ IDNO：155和SEQ ID NO：156。
本发明提供了一种通式I或II所示结构的多肽或其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物，包括被聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化或酰基化修饰的类似物。
本发明的一个具体实施方案中，提供了丝氨酸蛋白酶的抑制剂，优选抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶。
本发明也提供了另一个抑制丝氨酸蛋白酶的多肽类蛋白酶抑制剂的应用方法。这些多肽类蛋白酶抑制剂与治疗性蛋白和多肽的N-端或C-端融合，或者插入到治疗性蛋白和多肽分子内部，形成杂交肽，具有通式III、IV、V结构：
B-L-A(III)；
A-L-B(IV)；
A1-L1-B-L2-A2(V)；
其中，
杂交肽的分子量范围是1.5-30kDa；
B是一个含有分子内二硫键且具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或或其药学上可接受的盐；
L是接头，其任选地含有1、2、3、4或5个甘氨酸或脯氨酸残基；
A是生物活性寡肽；
A1、A2分别是生物活性寡肽的N-端和C-端肽段；
L1或L2是接头，其任选地含有1、2、3、4或5个甘氨酸或脯氨酸残基或不存在。
在一个方面，本发明提供了一个治疗性胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐的应用方法，与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽，选自SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209。所述的杂交肽用于治疗II型糖尿病和/或肥胖症。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗性活性肽(SEQ ID NO：210)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐的应用方法，该活性肽具有抑制枯草杆菌素/kexin 9型前蛋白转化酶与低密度脂蛋白受体(LDLR)的相互作用；与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽，选自SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ IDNO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：232和SEQ ID NO：233。所述的杂交肽用于治疗家族性高胆固醇血症。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗性活性肽鲑鱼降钙素(SEQ ID NO：234)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐的应用方法，与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽，选自SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：237。所述的杂交肽用于治疗骨相关疾病与钙紊乱如骨质疏松症和/或骨关节炎。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗性活性肽(SEQ ID NO：238)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐的应用方法，该活性肽具有抑制IL-17A和IL-17RA之间的相互作用；与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽，选自SEQ ID NO：239、SEQID NO：240和SEQ ID NO：241。所述的杂交肽用于治疗炎症性疾病，包括炎症性肺病、哮喘、慢性阻塞性肺病、炎症性肠病、关节炎、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、银屑病、系统性硬化症。
本发明还提供了一种多肽组合物的应用方法，它可以包含至少一种或多种具有通式I或II所示结构的多肽或其类似物或其药学上可接受的盐，也可以包含一种或多种以上所述的杂交肽、所述杂交肽的类似物或其药学上可接受的盐。
在本发明的一个优选的实施方案中，具有治疗性胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽的组合物，可选自：SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。
在本发明的一个优选的实施方案中，具有治疗性活性肽(SEQ ID NO：210)、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽的组合物，可选自：SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NOs：214-216、SEQ ID NO：218、SEQ ID NOs：224-233。
在本发明的一个优选的实施方案中，具有治疗性活性肽鲑鱼降钙素(SEQ ID NO：234)、其N-端、C-端或侧链被修饰的突变体及其药学上可接受的盐与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽的组合物，可选自SEQ ID NOs：235-237。
在本发明的另一个优选的实施方案中，具有治疗性活性肽(SEQ ID NO：238)、其N-端、C-端或侧链被修饰的突变体或其药学上可接受的盐与多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽的组合物，可选自SEQ ID NOs：239-241。
在一个方面，本发明提供了可共同给药的组合物，进一步含有药学上可接受的载体、稀释剂、分散剂、促进剂和/或赋性剂，可促进生物活性杂交肽或药学上可接受的盐穿过小肠上皮的透过吸收。
在另一方面，本发明提供了生物活性杂交肽或药学上可接受的盐的给药方式，适合于注射给药和/或口服给药。
在一个实施方案中，本发明提供了一种保护性的药物递送工具包括肠溶衣包被的胶囊、微囊或微粒，有效地转运生物活性杂交肽或生物治疗剂到达小肠吸收部位，阻断生物活性杂交肽或药学上可接受的盐与胃蛋白酶的接触和降解。
在另一个实施方案中，本发明中多肽类蛋白酶抑制剂、治疗性的寡肽和杂交肽如上所述的SEQ ID NOs：1-241可利用经典的固相或液相化学合成等熟知的多肽合成技术获得或者通过重组DNA技术合成。
有益技术效果：本发明可提高多种治疗疾病的生物活性肽的体内稳定性，促进其口服给药的实现，可以提高患者用药的依从性和减少副作用，具有有益的经济学价值。
为了更容易理解和将本发明投入实践中，现将参考附图仅以示例的方式描述其一个或多个优选实施例。
附图说明
本发明的各种特征在所附权利要求书中具有特殊性。参考以下详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施例中利用本发明的原理，所述附图包括：
图1.胰蛋白酶的米氏常数Km的测定.利用Prism软件、以底物BApNA的浓度对初速度V0作图，即得到胰蛋白酶水解底物BApNA的米氏常数Km值。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图2.胰蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的胰蛋白酶抑制肽(BT1、BT2、BT3和BT45)，检测它们对胰蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图3.胰蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的胰蛋白酶抑制肽(BT1、BT5、BT6和BT7)，检测它们对胰蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图4.胰蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的胰蛋白酶抑制肽(BT45、BT9、BT10、BT11、BT15、BT16、BT17、BT27和BT28)，检测它们对胰蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图5.胰蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的胰蛋白酶抑制肽(BT9、BT25、BT26、BT35、BT47、BT50、BT53和BT54)，检测它们对胰蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图6.胰蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的胰蛋白酶抑制肽(BT9、BT25、BT26、BT66和BT67)，检测它们对胰蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图7.糜蛋白酶的米氏常数Km的测定.利用Prism软件、以底物AAPFpNA的浓度对初速度V0作图，即得到糜蛋白酶水解底物AAPFpNA的米氏常数Km值。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图8.糜蛋白酶抑制肽抑制活性的测定。通过加入不同浓度的糜蛋白酶抑制肽(CH1、CH4、CH5和CH7)，检测它们对糜蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图9.糜蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的糜蛋白酶抑制肽(CH5、CH10、CH11、CH13、CH17、CH18、CH19、CH23和CH24)，检测它们对糜蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图10.糜蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的糜蛋白酶抑制肽(CH10、CH26、CH27、CH31、CH32、CH33、CH34和CH35)，检测它们对糜蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图11.糜蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的糜蛋白酶抑制肽(CH10、CH47、CH49、CH51、CH52和CH53)，检测它们对糜蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图12.弹性蛋白酶的米氏常数Km的测定.利用Prism软件、以底物AAApNA的浓度对初速度V0作图，即得到弹性蛋白酶水解底物AAApNA的米氏常数Km值。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图13.弹性蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的弹性蛋白酶抑制肽(EC1、EC2、EC7和EC12)，检测它们对弹性蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图14.弹性蛋白酶抑制肽抑制活性的测定.通过加入不同浓度的弹性蛋白酶抑制肽(EC12、EC18、EC19、EC22、EC23和EC29)，检测它们对弹性蛋白酶的抑制作用，并测定它们50％抑制酶活性的浓度(IC50值)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图15.DPP-IV对GLP-1及其类似物的酶解作用分析.25μM的GLP-1及其类似物和0.5ng/μL的DPP-IV在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中、于37℃共孵育12h。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出50μL，加入10％(v/v)的TFA终止反应，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。A，SEQ ID NO：186-190，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：193；B，SEQ ID NO：194-201；C，SEQ ID NO：202-205；D，SEQ ID NO：206-209。
图16.NEP24.11对GLP-1及其类似物的酶解作用分析.30μM的GLP-1及其类似物和1.0ng/μL的NEP24.11在50mM HEPES、50mM NaCl缓冲液(pH 7.4)中、于37℃共孵育8h。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出50μL，加入10％(v/v)的TFA终止反应，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。A，SEQ ID NO：186-193；B，SEQ ID NO：194-201。
图17.胰蛋白酶对GLP-1及其类似物的酶解作用分析.60μM的GLP-1及其类似物和2.0ng/μL的胰蛋白酶在50mM Tris、20mM CaCl2缓冲液(pH 7.8)中、于37℃共孵育9min或60min。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出25μL，加入10％(v/v)的TFA终止反应，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。A，SEQ ID NO：186-193；B，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：200；C，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：201。
图18.糜蛋白酶对GLP-1及其类似物的酶解作用分析.60μM的GLP-1及其类似物和1.0ng/μL的糜蛋白酶在50mM Tris、20mM CaCl2缓冲液(pH 7.8)中、于37℃共孵育9min或60min。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出25μL，加入10％(v/v)的TFA终止反应，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。A，SEQ ID NO：186-193；B，SEQ ID NO：194-201；C，SEQ ID NO：202-205。
图19.弹性蛋白酶对GLP-1及其类似物的酶解作用分析.60μM的GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：206-209)和10ng/μL的弹性蛋白酶在50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中、于37℃共孵育60min。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出25μL，加入10％(v/v)的TFA终止反应，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。
图20.人血清对GLP-1及其类似物的酶解作用.30μM的GLP-1及其类似物和25％(v/v)的人血清在50mM Tris缓冲液(pH 7.0)中、于37℃共孵育12h。以0时原型多肽的量作为100％，在不同的时间点取出100μL反应液，加入300μL预冷的无水甲醇终止反应。样品依次经过高速离心、取上清、冷冻干燥后，加入60μL、50％(v/v)甲醇/水溶液复溶样品，利用反相高效液相色谱测定该时间点多肽相对于原型多肽的剩余百分数(％)。实验设置三个重复，计算值以“平均值±标准差”表示。A，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：198，SEQID NO：200；B，SEQ ID NO：202-205；C，SEQ ID NO：206-209。
图21.GLP-1类似物皮下给药的体内降血糖活性.正常ICR小鼠，皮下注射给GLP-1及其类似物或相应体积的生理盐水(1.0μmol/kg，n＝10)，30min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并于给糖后30min，60min和120min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。计算值以“平均值±标准误”表示，p＜0.05被认为具有统计学差异。A，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：200；B，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：201；C，SEQ ID NO：202-205；D，SEQ ID NO：206-209。
图22.GLP-1类似物十二指肠给药的体内降血糖活性.正常ICR小鼠，经吸入乙醚麻醉后，手术取出十二指肠，注入GLP-1及其类似物或相应体积的生理盐水(10.0μmol/kg，n＝9-11)，最后缝合伤口。15min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并于给糖后15min，30min和60min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。计算值以“平均值±标准误”表示，p＜0.05被认为具有统计学差异。A，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：200；B，SEQ ID NO：202-205；C，SEQ IDNO：206-209。
图23.GLP-1类似物十二指肠组合给药的体内降血糖活性及其量效关系.正常ICR小鼠，经吸入乙醚麻醉后，手术取出十二指肠，注入不同剂量(2.5、5.0、10.0μmol/kg，n＝9-11)或不同比例组合(5.0+5.0μmol/kg、5.0+5.0+5.0μmol/kg，n＝14-15)的GLP-1类似物或相应体积的生理盐水，最后缝合伤口。15min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并于给糖后15min，30min和60min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。计算值以“平均值±标准误”表示，p＜0.05被认为具有统计学差异。A，SEQ ID NO：200的量效关系；B，SEQ ID NO：204的量效关系；C，双组合物(SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：204)及三组合物(SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208)的量效关系。
具体实施方式
为简化SFTI-1天然多肽类蛋白酶抑制剂的结构，提高其活性Loop的特异性和丝氨酸蛋白酶抑制活性，采用理性设计的方式，筛选鉴定了三个系列含有分子内二硫键的多肽，分别特异性地抑制胰腺分泌的胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的酶解活性。这三个蛋白酶的代谢酶活性是治疗性多肽蛋白在小肠上皮吸收进入血液循环发挥作用的主要制约因素。因此，本发明选取了4个治疗性多肽为实验目标，实验验证这三类不同蛋白酶抑制活性的多肽是否可以作为通用的分子骨架与治疗性多肽形成融合的杂交肽，是否能提高杂交肽中治疗性多肽的耐受代谢酶酶解的稳定性，是否可以促进所形成的杂交肽在小肠上皮的吸收和体内药理活性。实验结果证实这三类具有不同蛋白酶抑制活性的多肽分子骨架可广泛地用于提高治疗性多肽蛋白的稳定性和体内疗效。
利用体外酶抑制活性测定的方法，首先是设计合成一个截短的仅含有二硫键的单环SFTI-1突变体BT45(SEQ ID NO：45)，实验验证了其抑制常数(Ki)与仅含有二硫键的单环SFTI-1(BT1，SEQ ID NO：1)相同(6.4nM)，结果确定了截短的突变体BT45肽段是抑制胰蛋白酶的最核心的肽段(分子骨架)。为探索研究P3位点的突变是否会严重影响核心骨架的胰蛋白酶抑制活性，于是把Cys突变为Gly、Ala同时添加了二硫键之间的氨基酸残基，即扩展二硫键之间的环(Loop)，研究结果证实具有胰蛋白酶抑制活性的分子骨架可以改变，即获得BT2(SEQ ID NO：2)、BT3(SEQ ID NO：3)；在此基础上，在另一个优化的实验方案中获得胰蛋白酶抑制活性增强的分子骨架获得SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。结合上述截短的核心骨架和二硫键之间的肽段延伸，进行一系列的氨基酸位点突变，经过优化获得分子骨架SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70，这些多肽分子骨架具有很好的抑制胰蛋白酶活性。
丝氨酸蛋白酶抑制肽的P1位点决定不同丝氨酸蛋白酶的专一性，其中糜蛋白酶(Chymotrypsin)的P1位点为Tyr、Phe，弹性蛋白酶的P1位点为Ala、Leu。仅有少数几篇文献报道了有关抑制胰腺分泌的糜蛋白酶29，30，31和弹性蛋白酶32的活性多肽分子骨架，但抑制活性较弱。本发明依据抑制胰蛋白酶的核心分子骨架为基础，通过替换P1位点改变抑制肽分子骨架的蛋白酶专一性，再进行不同识别位点的替换和抑制活性评价，经过一系列的优化实验，获得了抑制糜蛋白酶的多肽分子骨架为：SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133；获得抑制猪胰腺弹性蛋白酶的多肽分子骨架为：SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：162。
定义：
除非本文特别定义，否则本文中使用的所有术语具有与本发明领域的普通技术人员所理解的相同的含义。提供以下定义是为了提供在描述本发明的说明书和权利要求中使用的术语的清晰度。
单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确指示。
术语“包括”用来意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
本文使用的术语“氨基酸”或“任意氨基酸”指任意且所有氨基酸，包括天然存在的氨基酸(例如α-氨基酸)、非自然(Unnatural)氨基酸和非天然(non-natural)氨基酸。其包括D-氨基酸和L-氨基酸。天然氨基酸包括天然存在的那些氨基酸，例如，组合为肽链以形成大量蛋白质的结构单元的20种氨基酸，这些氨基酸主要是L-立体异构体。“非自然的”或“非天然的”氨基酸是非蛋白质氨基酸(即不是天然编码的或者不存在于遗传密码子中的那些)，其为自然发生的或是化学合成的。这些“非自然的”或“非天然的”氨基酸具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与一个氢结合的碳、羧基、氨基和R基结合的碳，例如高半胱氨酸、正亮氨酸、羟脯氨酸和2-氨基丁酸，当参与分子内肽键时保留着与天然氨基酸相同的基本化学结构。
技术人员清楚的是，本文公开的多肽序列从左至右进行显示，其中序列的左端为多肽的N-端，序列的右端为多肽的C-端。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用，广义上是指两个或更多个氨基酸通过肽键连接在一起的序列。应理解两个术语既不暗示特定长度的氨基酸聚合物，也不旨在暗示或区分多肽是否是使用重组技术、化学合成或酶合成产生的或是否为天然存在的。
本文使用的术语“药学可接受的盐”表示本发明的多肽或化合物的盐或两性离子形式，其为水溶性或油溶性或可分散的，其适合于疾病的治疗，而无过分的毒性、刺激性和过敏反应；其与合理的益处/风险比相称，并且其对于它们的预期用途是有效的。所述盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，或者通过使氨基与合适的酸反应单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、盐酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、酒石酸盐。
如本文所用，本文中的术语“抑制环(Loop)”是指反应环，遵循Schecter和Berger的命名法33，在通式I和II中“抑制环”具有分子内二硫键并涵盖底物-蛋白酶相互作用位点。对应于通式I和II中Xaa1残基的P1位点是蛋白酶特异性的主要决定因素。
如本文所使用的，术语“分子骨架”是指并且可与“抑制环”互换使用，其对应于通式I和II中Xaa1残基的P1位点决定不同蛋白酶的专一性。在一些实施例中，所述分子骨架是一种突变体骨架，其包含诸如替代天然氨基酸或非天然氨基酸的修饰。
本文使用的术语“接头”广义上是指促进转折结构形成的一个富含甘氨酸或脯氨酸的肽段，能够将两个多肽连接在一起并形成一个化学结构。
如本领域的技术人员将理解的，具有多个半胱氨酸残基的多肽经常在两个这种半胱氨酸残基之间形成二硫键。本文所示的所有这种多肽定义为任选地包括一个或更多个这种二硫键。
本文所用的术语“蛋白酶抑制剂”或“酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的多肽分子。在本发明的一个方面，蛋白酶抑制剂抑制来自丝氨酸蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)类的蛋白酶。在本发明的另一个方面，蛋白酶抑制剂抑制哺乳动物胃肠道中发现的胰蛋白酶。
治疗性多肽：
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种具有抗糖尿病活性的内源性激素。GLP-1被外肽酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶24.11(neutral endopeptidase(NEP)24.11)灭活。完整活性的GLP-I在体内的有效半衰期约为90秒。为了提高其血液循环中的稳定性，一种抑制肽diprotin A(IPI)34和/或Opiorphin(QRFSR)35通过接头(Linker)如“GG”(两个甘氨酸肽段)连接在GLP-1的N-端。作为候选的GLP-1类似物进一步与本发明中公开的多肽抑制剂(分子骨架)融合，研究通过口服给药测试其降血糖效果。在一个实施方案中，首先进行皮下注射给药实验证实GLP-1类似物SEQ ID NO：184、SEQ ID NOs：186-209具有降血糖活性，在另一个十二指肠给药的实验方案中，实验结果证实SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：202、SEQ IDNO：204、SEQ ID NO：205具有可经十二指肠上皮吸收进入血循环的降血糖活性，从本质上可通过肠溶胶囊给药来实现GLP-1类似物经口服给药的降血糖作用。在另一个实施方案中，提供了含有不同蛋白酶抑制肽的GLP-1类似物具有组合效应。
枯草杆菌素/kexin 9型前蛋白转化酶(PCSK9)通过介导LDL受体(LDLR)蛋白降解调节低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的水平。由于PCSK9是通过抑制PCSK9-LDLR的蛋白-蛋白相互作用(PPI)来控制血浆LDL-C水平的一个重要靶点，因此抑制PCSK9结合LDLR的主要策略是利用拮抗PCSK9的LDLR结合位点有效降低LDL-C水平36。尽管这些单抗药物代表着抑制PCSK9的成功策略，但不能满足患者长期治疗的依从性问题。为了提高患者的依从性，抑制肽Pep2-837已被鉴定，但仅确认了体外的生化分析和细胞水平的活性研究。选择Pep2-8的类似物(SEQ ID NO：210，PCSK9_1)作为候选治疗性多肽，进一步与本发明中公开的多肽抑制剂(分子骨架)融合，研究通过口服给药测试其治疗高胆固醇血症的疗效。在一个实施方案中，通过体外的抑制PCSK9-LDLR分子作用实验证实了SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218具有较好的抑制作用；在另一个实施方案中，利用高血脂模型采用皮下注射给药方式评价SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218，这些多肽具有很好的体内降血脂活性。在又一个实施方案中，利用高血脂模型采用肠溶胶囊灌胃给药，结果证实了SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：224-233具有经小肠上皮吸收进入血循环的降血脂活性。
人降钙素(hCT)是一种多肽激素，含有32个氨基酸残基，主要由甲状腺滤泡旁细胞产生。许多降钙素同系物已被分离出来，如鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，sCT)、鳗鱼降钙素、猪降钙素和鸡降钙素。其中，sCT比hCT更有效、更持久，已被广泛应用于骨质疏松症、骨转移、paget病、高钙血症休克和癌症晚期慢性疼痛的治疗。降钙素目前只有溶液形式，可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射或鼻内给药等方式给药。然而，这些降钙素的给药方式明显不如口服给药方便，并造成更多的病人不适。通常这种不便或不适会导致患者严重不遵守治疗方案。为了克服这些局限性并提供更好的耐受性治疗形式，sCT类似物作为候选治疗性多肽，进一步与本发明中公开的多肽抑制剂(分子骨架)融合，通过口服给药证实其具有治疗骨质疏松症或骨关节炎的效应。
白细胞介素-17A(IL-17A)是活化的Th17细胞、CD8+ T细胞、y6 T细胞和NK细胞等分泌的一种细胞因子，可调节抗菌肽(防御素)等介质的产生，多种细胞类型的促炎细胞因子和趋化因子，如成纤维细胞和滑膜细胞，参与中性粒细胞生物学、炎症、器官破坏和宿主防御。IL-17A通过与白细胞介素-17受体A(IL-17RA)和受体C(IL-17RC)相互作用介导其作用。IL-17A的不适当或过量产生与各种疾病和疾病的病理学有关，包括类风湿性关节炎、气道过敏症(包括哮喘等过敏性气道疾病)、皮肤过敏(包括特应性皮炎)、系统性硬化症，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，肺部疾病包括慢性阻塞性肺病。抗IL-17A的抗体如Secukizumab、Ixekizumab和Bimekizumab已被用于治疗IL-17A介导的炎症性的紊乱和疾病。由于抗体疗法的药代动力学、疗效和安全性将取决于特定成分，因此需要改进适合于治疗IL-17A介导疾病的抗体药物。针对结构上IL-17A/IL-17RA相互作用的大而浅的界面，开发针对蛋白质相互作用的小分子化合物很困难。一个与IL-17A有高亲和力的多肽拮抗剂与抗IL-22抗体融合形成双特异性的融合体进行了研究。但不幸的是，这些研究结果揭示了在细胞培养中抗IL-17A的抑制肽稳定性差的问题38，39。选择IL-17A多肽拮抗剂的一个类似物(SEQ ID NO：238)作为候选治疗性多肽，进一步与本发明中公开的多肽抑制剂(分子骨架)结合，通过口服给药测试体内治疗类风湿性关节炎、抗炎疗效。在一个实施方案中，利用耳肿模型采用皮下注射给药方式评价SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240具有很好的抗炎活性；在另一个实施方案中，利用骨关节炎和风湿性关节炎模型采用肠溶胶囊灌胃给药，结果证实了SEQ ID NOs：239-241具有经小肠上皮吸收进入血循环的抗炎活性。在又一个实施方案中，利用溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患者结肠模型采用肠溶胶囊灌胃给药，结果证实了SEQ ID NOs：239-241具有抑制溃疡性结肠炎的抗炎活性。
本发明所获得的多肽类蛋白酶抑制剂可广泛应用于提高治疗性多肽或蛋白质抗消化酶的稳定性。其中，治疗性的多肽或蛋白并不仅限于本发明中公开的作为示例而选择的多肽。所述的治疗性肽或蛋白可选自于以下序列：如具有抗菌、抗病毒和免疫调节活性的LL-37(SEQ ID NO：242，LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)及其类似物；富含正电荷的阳离子抗菌肽Histatin 5(SEQ ID NO：243，DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY)、indolicidin(SEQ ID NO：244，ILPWKWPWWPWRR)和Pexiganan(SEQ ID NO：245，GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK)及其类似物；抗真菌肽MAF-1A(SEQ ID NO：246，KKFKETADKLIESALQQLESSLAKEMK)；抗HIV多肽药物Sifuvirtide(SEQ ID NO：247，SWETWEREIENYTRQIYRILEESQEQQDRNERDLLE)和Enfuvirtide(SEQ ID NO：248，YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF)及其类似物；抗HBV多肽C1-1(SEQ ID NO：249，SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY)及其类似物；抗HCV活性多肽p14(SEQ ID NO：250，RRGRTGRGRRGIYR)、E2-550(SEQ ID NO：251，SWFGCTWMNSTGFTKTC)和C5A(SEQ ID NO：252，SWLRDIWDWICEVLSDFK)及其类似物；抗幽门螺旋杆菌的活性肽cagL-cagL(SEQ ID NO：253，KNKNFIKGIRKLMLAHNK)、CagA-ASPP2(SEQ ID NO：254，GPNIQKLLYQRTTIAAMETI)和P1(SEQ IDNO：255，TGTLLLILSDVNDNAPIPEPR)及其类似物；治疗I型糖尿病的DiaPep 277(SEQ ID NO：256，VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED)及其类似物；治疗II型糖尿病的艾塞那肽(exendin-4，SEQ ID NO：257，HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)及其类似物；降血脂的活性多肽EGF-A1(SEQ ID NO：258，GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDI)、EGF-A5(SEQ ID NO：259，GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECL)和BMS-962476(SEQ ID NO：260，PYKHSGYYHRP)及其类似物；抗炎活性肽Tag7(SEQ ID NO：261，ALRSNYVLKGHRDVQRTLSPG)和ZDC(SEQ ID NO：262，FNMQQRFYLHPNENAKKSRD)及其类似物；抑制肿瘤发生或发展的活性多肽如肿瘤血管生成抑制内皮素(endostatin，SEQ ID NO：263，CPAASARDFQPVLHLVALCSPLSGGMRGIR)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)抑制肽(SEQ ID NO：264，GLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN)、Bcl-2 BH3(SEQ ID NO：265，EDIIRNIARHLAQVGDSNDRSIW)、免疫监测点抑制肽(herpes virus entrymediator，HVEM)(SEQ ID NO：266，ECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEP)、肿瘤因子相互作用的拮抗肽如拮抗p53/MDM2的pDI(SEQ ID NO：267，LTFEHYWAQLTS)、拮抗Bak/Bcl-2的PPKID4(SEQID NO：268，GPSQPTYPGDDAPVRRLSFFYILLDLYLDAPGVC)等及其类似物。上述这些治疗性活性多肽与本发明中获得的多肽类蛋白酶抑制剂形成的杂交肽，可不限于皮下注射给药或口服给药或局部外用。
多肽合成
根据本发明的多肽可以通过各种方法制备。例如，多肽可通过常用的固相合成方法合成，例如涉及本领域公知的α-氨基的t-BOC或FMOC保护的方法。在这里，氨基酸按顺序添加到一个不断增长的氨基酸链中。固相合成方法特别适合于大规模生产中合成多肽或相对较短的多肽，例如长度高达约70个氨基酸的多肽。
酶抑制活性的测定
测定合成的各种活性多肽类蛋白酶抑制剂(分子骨架)的抑制常数。分别使用显色底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(AAPFpNA)、Nα-苯甲酰-L-精氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐(BApNA)和N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺(AAApNA)通过竞争性结合来测定猪α-糜蛋白酶、牛胰蛋白酶和猪胰弹性蛋白酶的抑制活性。对猪α-糜蛋白酶和牛胰蛋白酶的抑制活性相关实验测定在20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)中进行，对猪弹性蛋白酶的抑制活性相关实验测定在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行。用280nm处的光密度(OD)测定多肽浓度。酶水解底物的米氏常数(Km)由405nm处的底物水解初始速率计算得出。在完全水解后的405nm处测定底物的吸光度值。所有数据均采用非线性回归处理。
肠溶胶囊
本发明的固体口服药物组合物包括剂型，这个固体口服药物组合物的剂型为肠溶胶囊。这种胶囊不限于用于包封口服给药的药物制剂的相对稳定的壳。两种主要类型的胶囊是硬壳胶囊，其通常用于干燥、粉末状成分、微型丸粒或迷你片剂和软壳胶囊，主要用于油和溶解或悬浮在油中的活性成分。硬壳和软壳胶囊都可以由胶凝剂的水溶液制成，如动物蛋白，例如明胶，或植物多糖或它们的衍生物，例如角叉菜胶，和修饰形式的淀粉和纤维素。可将其它成分添加到胶凝剂溶液中，例如增塑剂、甘油和/或山梨醇，以降低胶囊的硬度，着色剂，防腐剂，崩解剂，润滑剂和表面处理剂。本发明的胶囊由聚甲基丙烯酸/丙烯酸酯包被形成肠溶胶囊。其中靶向十二指肠和小肠的胶囊包材选自Eudragit L100或L100-55；靶向结肠的包材选自Eudragit S100，可根据本领域公知的方法制备包衣，例如肠溶包衣或改性的肠溶包衣。
制备固体口服药物组合物的方法
本发明的固体口服药物组合物可如本领域已知的那样制备。所述固体口服药物组合物可如本文实施例中所述制备。
参考文献：
1.Drucker DJ.Advances in oral peptide therapeutics.Nat Rev DrugDiscov，2020，19，277-289.
2.Ibrahim YHY，Regdon G Jr，Hamedelniel EI，Sovány T.Review of recentlyused techniques and materials to improve the efficiency of orallyadministered proteins/peptides.Daru，2020，28，403-416.
3.Renukuntla J，Vadlapudi AD，Patel A，Boddu SHS，Mitra AK.Approaches forenhancing oral bioavailability of peptides and proteins.Int J Pharm，2013，447，75-93.
4.Luckett S，Garcia RS，Barker JJ，Konarev AV，Shewry PR，Clarke AR，BradyRL.High-resolution structure of a potent，cyclic proteinase inhibitor fromsunflower seeds.J Mol Biol，1999，290，525-533.
5.Fittler H，Avrutina O，Glotzbach B，Empting M，Kolmar H.Combinatorialtuning of peptidic drug candidates：high-affinity matriptase inhibitorsthrough incremental structure-guided optimization.Org Biomol Chem，2013，11，1848-1857.
6.Quimbar P，Malik U，Sommerhoff CP，Kaas Q，Chan LY，Huang YH，GrundhuberM，Dunse K，Craik DJ，Anderson MA，Daly NL.High-affinity cyclic peptidematriptase inhibitors.J Biol Chem，2013，288，13885-13896.
7.de Veer SJ，Li CY，Swedberg JE，Schroeder CI，Craik DJ.Engineeringpotent mesotrypsin inhibitors based on the plant-derived cyclic peptide，sunflower trypsin inhibitor-1.Eur J Med Chem.2018，155，695-704.
8.Swedberg JE，Nigon LV，Reid JC，de Veer SJ，Walpole CM，Stephens CR，Walsh TP，Takayama TK，Hooper JD，Clements JA，Buckle AM，Harris JM.Substrate-guided design of a potent and selective kallikrein-related peptidaseinhibitor for kallikrein 4.Chem Biol，2009，16，633-643.
9.Swedberg JE，de Veer SJ，Sit KC，Reboul CF，Buckle AM，HarrisJM.Mastering the canonical loop of serine protease inhibitors：enhancingpotency by optimising the internal hydrogen bond network.PLoS One，2011，6，e19302.
10.de Veer SJ，Swedberg JE，Akcan M，Rosengren KJ，Brattsand M，Craik DJ，Harris JM.Engineered protease inhibitors based on sunflower trypsininhibitor-1(SFTI-1)provide insights into the role of sequence andconformation in Laskowski mechanism inhibition.Biochem J，2015a，469，243-253.
11.de Veer SJ，Swedberg JE，Brattsand M，Clements JA，Harris JM.Exploringthe active site binding specificity of kallikrein-related peptidase 5(KLK5)guides the design of new peptide substrates and inhibitors.Biol Chem，2016，397，1237-1249.
12.Shariff L，Zhu Y，Cowper B，Di W，Macmillan D.Sunflower trypsininhibitor(SFTI-1)analogues of synthetic and biological origin via N→S acyltransfer：potential inhibitors of human Kallikrein-5(KLK5).Tetrahedron，2014，70，7675-7680.
13.Li CY，de Veer SJ，White AM，Chen X，Harris JM，Swedberg JE，CraikDJ.Amino Acid Scanning at P5′within the Bowman-Birk Inhibitory Loop RevealsSpecificity Trends for Diverse Serine Proteases.J Med Chem，2019，62，3696-3706.
14.de Veer SJ，Furio L，Swedberg JE，Munro CA，Brattsand M，Clements JA，Hovnanian A，Harris JM.Selective substrates and inhibitors for kallikrein-related peptidase 7(KLK7)shed light on KLK proteolytic activity in thestratum corneum.J Invest Dermatol，2017，137，430-439.
15.Gitlin A，Debowski D，Karna N，Legowska A，Stirnberg M，Gutschow M，Rolka K.Inhibitors of matriptase-2 based on the trypsin inhibitor SFTI-1.Chembiochem，2015，16，1601-1607.
16.Fittler H，Depp A，Avrutina O，Dahms SO，Than ME，Empting M，KolmarH.Engineering a constrained peptidic scaffold towards potent and selectivefurin inhibitors.Chembiochem，2015，16，2441-2444.
17.Swedberg JE，Li CY，de Veer SJ，Wang CK，Craik DJ.Design of Potent andSelective Cathepsin G Inhibitors Based on the Sunflower Trypsin Inhibitor-1Scaffold.J Med Chem，2017，60，658-667.
18.Legowska A，Debowski D，Lesner A，Wysocka M，Rolka K.Introduction ofnon-natural amino acid residues into the substrate-specific P1 position oftrypsin inhibitor SFTI-1 yields potent chymotrypsin and cathepsin Ginhibitors.Bioorg Med Chem，2009，17，3302-3307.
19.Tian S，Swedberg JE，Li CY，Craik DJ，de Veer SJ.Iterativeoptimization of the cyclic peptide SFTI-1 yields potent inhibitors ofneutrophil proteinase 3.ACS Med Chem Lett，2019，10，1234-1239.
20.Swedberg JE，Wu G，Mahatmanto T，Durek T，Caradoc-Davies TT，WhisstockJC，Law RHP，Craik DJ.Highly potent and selective plasmin inhibitors based onthe sunflower trypsin inhibitor-1 scaffold attenuate fibrinolysis in plasma.JMed Chem，2019，62，552-560.
21.Choi Yi Li，Kuok Yap，Joakim E Swedberg，David J Craik，Simon J deVeer.Binding Loop Substitutions in the Cyclic Peptide SFTI-1 Generate Potentand Selective Chymase Inhibitors.J Med Chem，2020，63，816-826.
22.Boy RG，Mier W，Nothelfer EM，Altmann A，Eisenhut M，Kolmar H，Tomaszowski M，
Figure BSA0000226789550000241
S，Haberkorn U.Sunflower trypsin inhibitor 1 derivativesas molecular scaffolds for the development of novel peptidicradiopharmaceuticals.Mol Imaging Biol，2010，12，377-385.
23.Chan LY，Gunasekera S，Henriques ST，Worth NF，Le SJ，Clark RJ，CampbellJH，Craik DJ，Daly NL.Engineering Pro-Angiogenic Peptides Using Stable，Disulfide-Rich Cyclic Scaffolds.Blood，2011，118，6709-6717.
24.Qiu YB，Taichi M，Wei N，Yang H，Luo KQ，Tam JP.An Orally ActiveBradykinin B1 Receptor Antagonist Engineered as a Bifunctional Chimera ofSunflower Trypsin Inhibitor.J Med Chem，2017，60，504-510.
25.Durek T，Cromm PM，White AM，Schroeder CI，Kaas Q，Weidmann J，Fuaad AA，Cheneval O，Harvey PJ，Daly NL，Zhou Y，Dellsen D，Osterlund T，Larsson N，Knerr L，Bauer U，Kessler H，Cai M，Hruby VJ，Plowright AT，Craik DJ.Development of NovelMelanocortin Receptor Agonists Based on the Cyclic Peptide Framework ofSunflower Trypsin Inhibitor-1.J Med Chem，2018，61，3674-3684.
26.Cobos Caceres C，Bansal PS，Navarro S，Wilson D，Don L，Giacomin P，Loukas A，Daly NL.An engineered cyclic peptide alleviates symptoms ofinflammation in a murine model of inflammatory bowel disease.J Biol Chem，2017，292，10288-10294.
27.Sable R，Durek T，Taneja V，Craik DJ，Pallerla S，Gauthier T，JoisS.Constrained Cyclic Peptides as Immunomodulatory Inhibitors of the CD2：CD58Protein-Protein Interaction.ACS Chem Biol，2016，11，2366-2374.
28.Gunasekera S，Fernandes-Cerqueira C，Wennmalm S，
Figure BSA0000226789550000251
H，SommarinY，Catrina AI，Jakobsson PJ，
Figure BSA0000226789550000252
U.Stabilized Cyclic Peptides as Scavengersof Autoantibodies：Neutralization of Anticitrullinated Protein/PeptideAntibodies in Rheumatoid Arthritis.ACS Chem Biol，2018，13，1525-1535.
29.McBride JD，Brauer AB，Nievo M，Leatherbarrow RJ.The role ofthreonine in the P2 position of Bowman-Birk proteinase inhibitors：studies onP2 variation in cyclic peptides encompassing the reactive site loop.J MolBiol，1998，282：447-458.
30.McBride JD，Freeman N，Domingo GJ，Leatherbarrow RJ.Selection ofchymotrypsin inhibitors from a conformationally-constrained combinatorialpeptide library.J Mol Biol，1996，259：819-827.
31.McBride JD，Freeman HN，Leatherbarrow RJ.Identification ofchymotrypsin inhibitors from a second-generation template assistedcombinatorial peptide library.J Pept Sci，2000，6：446-452.
32.McBride JD，Freeman HN，Leatherbarrow RJ.Selection of human elastaseinhibitors from a conformationally constrained combinatorial peptidelibrary.Eur J Biochem，1999，266：403-412.
33.Schechter I，Berger A.On the size of the active site inproteases.I.Papain.Biochem Biophys Res Commun，1967，27：157-162.
34.Umezawa H，Aoyagi T，Ogawa K，Naganawa H，Hamada M，TakeuchiT.Diprotins A and B，inhibitors of dipeptidyl aminopeptidase IV，produced bybacteria.J Antibiot(Tokyo)，1984，37：422-425.
35.Wisner A，Dufour E，Messaoudi M，Nejdi A，Marcel A，Ungeheuer MN，etal.Human Opiorphin，a natural antinociceptive modulator of opioid-dependentpathways.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103：17979-17984.
36.Lammi C，Sgrignani J，Arnoldi A，Grazioso G.BiologicalCharacterization of Computationally Designed Analogs of peptide TVFTSWEEYLDWV(Pep2-8)with Increased PCSK9Antagonistic Activity.Sci Rep，2019，9：2343.
37.Zhang Y，Eigenbrot C，Zhou L，Shia S，Li W，Quan C，et al.Identificationof a small peptide that inhibits PCSK9protein binding to the low densitylipoprotein receptor.J Biol Chem，2014，289：942-955.
38.Vugmeyster Y，Zhang YE，Zhong X，Wright J，Leung SS.Pharmacokineticsof anti-IL17A and anti-IL22peptide-antibody bispecific genetic fusions inmice.Int Immunopharmacol，2014，18：225-227.
39.Liu S，Deshamais J，Sahasrabudhe PV，Jin P，Li W，Oates BD，etal.Inhibiting complex IL-17A and IL-17RA interactions with a linearpeptide.Sci Rep，2016，6：26071.
引用以下实施例来说明本发明的实施方案并且仅为了更好的理解本发明，但不应被解释为限制本发明的范围或精神。
实施例
实施例1 多肽固相合成
按照每条多肽氨基酸残基的序列，委托吉尔生化(上海)有限公司或北京中科亚光生物科技有限公司进行多肽合成，采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相化学合成方法从C-端到N-端逐一合成；当氨基酸侧链保护的线性肽合成完成后，从树脂上切切割线性肽，去除线性肽中氨基酸残基的保护基，再进行分子内巯基的氧化环化形成二硫键，最后利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽。
一、原料
(1)树脂：Fmoc-L-丙氨酸-王氏树脂(Fmoc-Ala-Wang resin)、Fmoc-N-(2，2，4，6，7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸-王氏树脂(Fmoc-Arg(Pbf)-Wang resin)、Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺-王氏树脂(Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin)、Fmoc-O-叔丁基-L-天冬氨酸-王氏树脂(Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin)、Fmoc-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺-王氏树脂(Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin)、Fmoc-L-甘氨酸-王氏树脂(Fmoc-Gly-Wang resin)、Fmoc-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-王氏树脂(Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin)、Fmoc-L-苯丙氨酸-王氏树脂(Fmoc-Phe-Wang resin)、Fmoc-L-脯氨酸-王氏树脂(Fmoc-Pro-Wang resin)、Fmoc-O-叔丁基-L-丝氨酸-王氏树脂(Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin)、Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸-王氏树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin)、Fmoc-L-缬氨酸-王氏树脂(Fmoc-Val-Wangresin)、Fmoc-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸-2-氯-三苯甲基树脂(Fmoc-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resin)、Fmoc-L-脯氨酸-2-氯-三苯甲基树脂(Fmoc-Pro-2-Cl-Trt resin)、Fmoc-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Rink Amide AM树脂(Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin)、Fmoc-L-脯氨酸-Rink Amide AM树脂(Fmoc-Pro-Rink Amide-AM Resin)、Fmoc-L-苯丙氨酸-RinkAmide AM树脂(Fmoc-Phe Rink Amide-AM Resin)。
(2)氨基酸：Fmoc-L-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、Fmoc-N-(2，2，4，6，7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺(Fmoc-Asn(Trt)-OH)、Fmoc-O-叔丁基-L-天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、Fmoc-S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Acm)-OH)、Fmoc-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)、Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、Fmoc-L-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N-Fmoc-N′-三苯甲基-L-组氨酸(Fmoc-His(Trt)-OH)、Fmoc-L-异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、Fmoc-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、Fmoc-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、Fmoc-L-甲硫氨酸(Fmoc-Met-OH)、Fmoc-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、Fmoc-L-脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、Fmoc-O-叔丁基-L-丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、Fmoc-O-叔丁基-L-苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、Fmoc-N-叔丁氧羰基-L-色氨酸(Fmoc-Trp(Boc)-OH)、Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、Fmoc-L-缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、Fmoc-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸(Fmoc-homoCys(Trt)-OH)、Fmoc-L-2-氨基丁酸(Fmoc-Abu-OH)、Fmoc-三苯甲基-L-4-羟基脯氨酸(Fmoc-Hyp(Trt)-OH)和Fmoc-L-正亮氨酸(Fmoc-Nle-OH)。
(3)试剂：哌啶、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)、4-Picoline(4-甲基吡啶)、DIEA(二异丙基乙胺)、HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、TBTU(O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸)、DIC(二异丙基碳二亚胺)，TFA(三氟乙酸)、EDT(1，2乙二硫醇)、TIPS(三异丙基硅烷)、TA(苯甲硫醚)、苯酚、乙醚、DMSO(二甲亚砜)、纯水。
二、合成方法1
SEQ ID NO：9(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
(1)以Fmoc-Phe-Wang resin为起始原料，合成规模为0.1mmol。从C-端向N-端方向合成，首先用哌啶/DMF(1∶3，v/v)去除N-端Fmoc保护基，使N-端成为自由氨基。用4倍当量Fmoc-Cys(Trt)-OH溶解到HOBt/DIC与树脂进行接枝，引入C-端第二个氨基酸残基(Cys)得到Fmoc-Cys(Trt)-Phe-Wang resin。如此先去保护、再反复依次连接多肽序列的每个氨基酸残基，最终得到带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin。以上每步反应后都需用DMF和DCM轮流交替洗涤树脂6次，取树脂进行Kaiser Test检测反应，若某个氨基酸缩合反应不完全，重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。
(2)脱去Fmoc，再使用切割试剂(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水、TIPS按一定比例混合)在30℃下切割3h，将目标多肽从树脂上裂解下来并除去氨基酸侧链保护基，滤液加入到大量冷的乙醚中使多肽沉淀析出，然后离心。用乙醚洗涤数次后冻干，得到多肽粗品，Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe。
(3)取上述多肽粗品溶于DMSO/H2O(1∶4，v/v)溶液中，浓度为4mg/mL。24h后取反应液进行HPLC跟踪，如果氧化反应完全直接进行纯化处理，如果氧化反应不完全则延长反应时间直到反应完全。
(4)利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽，其化学结构由MALDI-TOF质谱表征，SEQ ID NO：9的实测分子量为1391.06Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：1(Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Asp)
SEQ ID NO：1选取Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Asp(OtBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为1532.31Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：10
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Ala-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：10按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Ala-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为1364.72Da([M+H]w)。
SEQ ID NO：211
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：211按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wangresin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2956.82Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：212
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：212选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为3013.20Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：214
(Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：214选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为3012.71Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：215
(Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：215选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为3082.43Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：216
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：216选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与氨基酸序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，最终得到目的肽段，其实测分子量为3105.15Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：218
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：218选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2977.09Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：224
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：224选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Pbe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段。
SEQ ID NO：225
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：225选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2766.11Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：226
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：226选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Tbr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2999.12Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：227
(Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：227选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段。
SEQ ID NO：228
(Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：228选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2999.34Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：229
(Trp-Glu-Glu-Ala-Leu-Asp-Trp-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：229选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-T hr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2822.72Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：230
(Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：230选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段。
SEQ ID NO：231
(Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Thr-Val-Phe-Thr-Ser)
SEQ ID NO：231选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Val-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2891.97Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：232
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：232选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段。
SEQ ID NO：233
(Thr-Val-Phe-Thr-Ser-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Trp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Asp-Trp-Val)
SEQ ID NO：233选取Fmoc-Val-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Thr(tBu)-Val-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2858.21Da([M+H]+)。
三、合成方法2
SEQ ID NO：45(Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
(1)称取Fmoc-Phe-Wang resin，放到玻璃反应柱加DCM溶胀30min，减压抽掉DCM。
(2)用DMF洗涤树脂3遍，加入哌啶/DMF(1∶4，v/v)溶液反应20min除去保护基Fmoc，减压抽掉溶液，用DMF洗涤6遍。
(3)分别称取第二个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU加入到树脂中，DMF溶解并加入DIEA，反应30min，取树脂做Kaiser Test检验反应，观察到溶液亮黄、树脂黄时，说明反应完全，减压抽掉溶剂。
(4)重复步骤(2)和(3)，最终得到带有保护基团的肽段，即Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，然后用DMF、DCM和甲醇各洗三遍，抽干树脂。
(5)加入裂解液(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水按一定比例混合)去除树脂和氨基酸侧链保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干。
(6)用H2O/乙腈(9∶1，v/v)溶解，体积放大到100mL，加入稀氨水调至碱性(pH≈8)，取小样测试巯基活性，黄色说明巯基存在，加入双氧水2-3滴，反应5-10min，再次检测，溶液呈现透明，说明氧化完全(90％以上)，加冰醋酸调至酸性(pH≈6)，其化学结构由质谱表征，结果正确后利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽。
(7)SEQ ID NO：45的实测分子量为1262.40Da([M+3H]3+＝421.80)。
SEQ ID NO：16
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Leu-Pro-Ala-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：16按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Pro-Ala-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1365.09Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：17
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Arg-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：17按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1418.88Da([M+2H]2+＝710.44)。
SEQ ID NO：25
(Cys-Gly-Thr-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：25按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1335.00Da([M+2H]2+＝668.50)。
SEQ ID NO：27
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ala-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：27按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ala-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1374.80Da([M+2H]2+＝688.40)。
SEQ ID NO：28
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Nle-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：28按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Nle-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1390.00Da([M+2H]2+＝696.00)。
SEQ ID NO：35
(Cys-Gly-Arg-Abu-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：35按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Abu-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1404.50Da([M+2H]2+＝703.25)。
SEQ ID NO：46
(Cys-Hyp-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：46按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Hyp(Trt)-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1446.60Da([M+3H]3+＝483.20)。
SEQ ID NO：47
(Cys-Gly-Arg-Ser-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：47按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1407.00Da([M+3H]3+＝470.00)。
SEQ ID NO：49
(Cys-Gly-Arg-Ile-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：49按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ile-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1432.50Da([M+3H]3+＝478.50)。
SEQ ID NO：50
(Cys-Gly-Arg-Nle-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：50按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Nle-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1432.50Da([M+3H]3+＝478.50)。
SEQ ID NO：51
(Cys-Gly-Arg-Val-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：51按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1418.40Da([M+3H]3+＝473.80)。
SEQ ID NO：53
(Cys-Gly-Arg-Tyr-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：53按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1482.90Da([M+3H]3+＝495.30)。
SEQ ID NO：54
(Cys-Gly-Arg-Gln-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：54按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1447.50Da([M+3H]3+＝483.50)。
SEQ ID NO：55
(Cys-Gly-Arg-Asn-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：55按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1433.40Da([M+3H]3+＝478.80)。
SEQ ID NO：57
(Cys-Gly-Arg-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：57按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1505.70Da([M+3H]3+＝502.90)。
SEQ ID NO：60
(Cys-Gly-Arg-Gly-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：60按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1376.20Da([M+2H]2+＝689.10)。
SEQ ID NO：65
(Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Leu-Pro-Pro-Gln-Cys-Ser)
SEQ ID NO：65选取Fmoc-Ser(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1216.80Da([M+3H]3+＝406.60)。
SEQ ID NO：66
(Cys-Pro-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：66按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1430.10Da([M+3H]3+＝477.70)。
SEQ ID NO：67
(Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：67按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1404.30Da([M+3H]3+＝469.10)。
SEQ ID NO：69
(Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Hyp-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：69按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1420.80Da([M+3H]3+＝474.60)。
SEQ ID NO：70
(Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Hyp-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：70按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1420.80Da([M+3H]3+＝474.60)。
SEQ ID NO：85
(Phe-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：85选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1360.02Da([M+K+H]2+＝700.01)。
SEQ ID NO：90
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：90选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1375.55Da([M+Na]+＝1398.55)。
SEQ ID NO：91
(Ser-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：91选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1300.55Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：98
(Ala-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Ala-Lys-Cys-Phe)
SEQ ID NO：98按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1200.80Da([M+2H]2+＝601.40)。
SEQ ID NO：105
(Gly-Thr-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Asn-Pro-Asn)
SEQ ID NO：105选取Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1461.00Da([M+2H]2+＝731.50)。
SEQ ID NO：106
(Gly-Thr-Cys-Thr-Phe-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Asn)
SEQ ID NO：106选取Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1249.50Da([M+Na]+＝1272.50)。
SEQ ID NO：113
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr)
SEQ ID NO：113选取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1318.80Da([M+2H]2+＝660.40)。
SEQ ID NO：114
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Ala)
SEQ ID NO：114选取Fmoc-Ala-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ala-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1390.80Da([M+2H]2+＝696.40)。
SEQ ID NO：115
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Arg)
SEQ ID NO：115选取Fmoc-Arg(Pbf)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1312.20Da([M+2H]2+＝657.10)。
SEQ ID NO：131
(Pro-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr)
SEQ ID NO：131选取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1268.80Da([M+2H]2+＝635.40)。
SEQ ID NO：132
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Hyp-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：132选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1392.40Da([M+2H]2+＝697.20)。
SEQ ID NO：133
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Hyp-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：133选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1392.00Da([M+2H]2+＝697.00)。
SEQ ID NO：134
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr)
SEQ ID NO：134选取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1193.20Da([M+2H]2+＝597.60)。
SEQ ID NO：145
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：145选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1143.50Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：151
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Gln)
SEQ ID NO：151选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1157.60Da([M+2H]2+＝579.80)。
SEQ ID NO：155
(Val-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：155选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Val-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1129.10Da([M+2H]2+＝565.55)。
SEQ ID NO：156
(Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：156选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1143.15Da([M+H]+)。
SEQ ID NO：158
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Asn-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：158选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wa ng resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1143.80Da([M+2H]2+＝572.90)。
SEQ ID NO：162
(Tyr-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：162选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1193.30Da([M-H]-＝1192.30)。
SEQ ID NO：163
(Cys-Gly-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：163选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1270.80Da([M+2H]2+＝636.40)。
SEQ ID NO：164
(Cys-Gly-Ile-Abu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：164选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Abu-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1285.70Da([M+H]+＝1285.70)。
SEQ ID NO：165
(Cys-Gly-Ile-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：165选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Nle-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1312.80Da([M+2H]2+＝657.40)。
SEQ ID NO：166
(Cys-Gly-Ile-Leu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：166选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Leu-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1313.00Da([M+2H]2+＝657.50)。
SEQ ID NO：167
(Cys-Gly-Ile-Ser-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：167选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1287.00Da([M+2H]2+＝644.50)。
SEQ ID NO：168
(Cys-Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：168选取Fmoc-Gin(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段。
SEQ ID NO：169
(Cys-Gly-Ile-Phe-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：169选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Phe-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1346.80Da([M+2H]2+＝674.40)。
SEQ ID NO：170
(Cys-Gly-Ile-Tyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：170选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段。
SEQ ID NO：171
(Cys-Gly-Ile-Asn-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：171选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段。
SEQ ID NO：172
(Cys-Gly-Ile-Gln-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：172选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1327.80Da([M+2H]2+＝664.90)。
SEQ ID NO：173
(Cys-Gly-Ile-His-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：173选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1337.00Da([M+2H]2+＝669.50)。
SEQ ID NO：174
(Cys-Gly-Ile-Arg-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：174选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段。
SEQ ID NO：175
(Cys-Gly-Ile-Lys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：175选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1328.00Da([M+2H]2+＝665.00)。
SEQ ID NO：176
(Cys-Gly-Ile-Trp-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：176选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Trp(Boc)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段。
SEQ ID NO：177
(Cys-Pro-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：177选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1311.70Da([M+H]+＝1311.70)。
SEQ ID NO：178
(Cys-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：178选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1285.40Da([M+2H]2+＝643.70)。
SEQ ID NO：179
(Cys-Hyp-Ile-Ala-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：179选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Hyp(Trt)-Ile-Ala-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1327.20Da([M+2H]2+＝664.60)。
SEQ ID NO：180
(Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Hyp-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：180选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Hyp(Trt)-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1159.20Da([M+2H]2+＝580.60)。
SEQ ID NO：181
(Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Hyp-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：181选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Hyp(Trt)-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为1158.60Da([M-H]-＝1157.60)。
SEQ ID NO：194
(Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：194选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为5492.00Da([M+8H]8+＝687.50)。
SEQ ID NO：195
(Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：195选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，并氧化形成二硫键，最终分离、纯化得到目的肽段，其实测分子量为5842.40Da([M+8H]8+＝731.30)。
SEQ ID NO：196
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro)
SEQ ID NO：196选取Fmoc-Pro-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：9所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5437.75Da([M+5H]5+＝1088.55)。
SEQ ID NO：197
(Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro)
SEQ ID NO：197选取Fmoc-Pro-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5789.70Da([M+6H]6+＝965.95)。
SEQ ID NO：198
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：198选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Pbe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5465.85Da([M+5H]5+＝1094.17)。
SEQ ID NO：199
(Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：l 99选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5815.56Da([M+6H]6+＝970.26)。
SEQ ID NO：200
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：200选取Fmoc-Phe-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5465.60Da([M+7H]7+＝781.80)。
SEQ ID NO：201
(Gly-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：201选取Fmoc-Phe-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5816.70Da([M+6H]6+＝970.45)。
SEQ ID NO：202
(Ser-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：202选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5333.10Da([M-3H]3-＝1776.70)。
SEQ ID NO：203
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：203选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Al a-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5391.00Da([M+5H]5+＝1079.20)。
SEQ ID NO：204
(Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：204选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5395.20Da([M-3H]3-＝1797.40)。
SEQ ID NO：205
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：205选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Al a-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5450.50Da([M+5H]5+＝1091.10)。
SEQ ID NO：206
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：206选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5268.50Da([M+5H]5+＝1054.70)。
SEQ ID NO：207
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr)
SEQ ID NO：207选取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5267.00Da([M+5H]5+＝1054.40)。
SEQ ID NO：208
(Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
SEQ ID NO：208选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5218.00Da([M+5H]5+＝1044.60)。
SEQ ID NO：209
(Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Leu-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：209选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Gly-Ile-Pro-Ile-G ly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Leu-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5218.00Da([M+5H]5+＝1044.60)。
SEQ ID NO：239
(Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
SEQ ID NO：239选取Fmoc-Phe-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为3122.40Da([M+4H]4+＝781.60)。
SEQ ID NO：240
(Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：240选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为3108.00Da([M+3H]3+＝1037.00)。
SEQ ID NO：241
(Ile-His-Val-Thr-Ile-Pro-Ala-Asp-Leu-Trp-Asp-Trp-Ile-Asn-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：241选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：45所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Ile-His(Trt)-Val-Thr(tBu)-Ile-Pro-Ala-Asp(OtBu)-Leu-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为2874.90Da([M+3H]3+＝959.30)。
四、合成方法3
SEQ ID NO：29(Hcy-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Hcy)
(1)称取Fmoc-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resin，放到玻璃反应柱加DCM溶胀30min，减压抽掉DCM。
(2)用DMF洗涤树脂3遍，加入哌啶/DMF(1∶4，v/v)溶液反应20min除去保护基Fmoc，减压抽掉溶液，用DMF洗涤6遍。
(3)分别称取第二个氨基酸Fmoc-Phe-OH、TBTU加入到树脂中，DMF溶解并加入DIEA，反应30min，取树脂做Kaiser Test检验反应，观察到溶液亮黄、树脂黄时，说明反应完全，减压抽掉溶剂。
(4)重复步骤(2)和(3)，最终得到带有保护基团的肽段，即Fmoc-homoCys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-homoCys(Trt)-2-Cl-Trt resin，脱去Fmoc，然后用DMF、DCM和甲醇各洗三遍，抽干树脂。
(5)加入裂解液(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水按一定比例混合)去除树脂和氨基酸侧链保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干。
(6)用H2O/乙腈(9∶1，v/v)溶解，体积放大到100mL，加入稀氨水调至碱性(pH≈8)，取小样测试巯基活性，黄色说明巯基存在，加入双氧水2-3滴，反应5-10min，再次检测，溶液呈现透明，说明氧化完全(90％以上)，加冰醋酸调至酸性(pH≈6)，其化学结构由质谱表征，结果正确后利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽。
(7)SEQ ID NO：29的实测分子量为1489.00Da([M+2H]2+＝745.50)。
SEQ ID NO：33
(Hcy-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Gly-Hcy)
SEQ ID NO：33按照SEQ ID NO：29所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-homoCys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Ala-Phe-Gly-homoCys(Trt)-2-Cl-Trtresin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为1546.60Da([M+2H]2+＝774.30)。
五、合成方法4
SEQ ID NO：234
(Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro)
(1)称取Fmoc-Pro-2-Cl-Trt resin，放到玻璃反应柱加DCM溶胀30min，减压抽掉DCM。
(2)用DMF洗涤树脂3遍，加入哌啶/DMF(1∶4，v/v)溶液反应20min除去保护基Fmoc，减压抽掉溶液，用DMF洗涤6遍。
(3)分别称取第二个氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU加入到树脂中，DMF溶解并加入DIEA，反应30min，取树脂做Kaiser Test检验反应，观察到溶液亮黄、树脂黄时，说明反应完全，减压抽掉溶剂。
(4)重复步骤(2)和(3)，最终得到带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-2-Cl-Trt resin，脱去Fmoc，然后用DMF、DCM和甲醇各洗3遍，抽干树脂。
(5)加入裂解液(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水按一定比例混合)去除树脂和所有保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干。
(6)用H2O/乙腈(9∶1，v/v)溶解，体积放大到100mL，加入稀氨水调至碱性(pH≈8)，取小样测试巯基活性，黄色说明巯基存在，加入双氧水2-3滴，反应5-10min，再次检测，溶液呈现透明，说明氧化完全(90％以上)，加冰醋酸调至酸性(pH≈6)，其化学结构由质谱表征，结果正确后利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽。
(7)SEQ ID NO：234的实测分子量为3349.00Da([M+5H]5+＝670.80)。
六、合成方法5
SEQ ID NO：235
(Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Cys-Ala-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
(1)称取Fmoc-Phe-Wang resin，放到玻璃反应柱加DCM溶胀30min，减压抽掉DCM。
(2)用DMF洗涤树脂3遍，加入哌啶/DMF(1∶4，v/v)溶液反应20min除去保护基Fmoc，减压抽掉溶液，用DMF洗涤6遍。
(3)分别称取第二个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU加入到树脂中，DMF溶解并加入DIEA，反应30min，取树脂做Kaiser Test检验反应，观察到溶液亮黄、树脂黄时，说明反应完全，减压抽掉溶剂。
(4)重复步骤(2)和(3)，最终得到带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Cys(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang resin，脱去Fmoc，然后用DMF、DCM和甲醇各洗三遍，抽干树脂。
(5)加入裂解液(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水按一定比例混合)去除树脂和所有保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干。
(6)利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化样品，纯化第一次收好峰，液体加入稀氨水调至碱性(pH≈8)，取小样测试巯基活性，黄色说明巯基存在，加入双氧水2-3滴，反应5-10min，再次检测，溶液呈现透明，说明第一次氧化完全(90％以上)，加冰醋酸调至酸性(pH≈6)，再次纯化样品并收峰。
(7)第二次收峰的溶液加入含碘的甲醇溶液(1g碘/100mL甲醇)，缓慢滴入直至颜色不变，偏深棕色，其化学结构由质谱表征，观察直至反应完全后纯化，得到最终的目的多肽。
(8)SEQ ID NO：235的实测分子量为4792.80Da([M+6H]6+＝799.80)。
SEQ ID NO：236
(Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly)
SEQ ID NO：236选取Fmoc-Gly-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：235所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为4764.50Da([M+5H]5+＝953.90)。
SEQ ID NO：237
(Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Gly-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly-Ile-Cys-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Gln)
SEQ ID NO：237选取Fmoc-Gln(Trt)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：235所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Gly-Ile-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为4531.50Da([M+5H]5+＝907.30)。
七、合成方法6
乙酰化和酰胺化的SEQ ID NO：194
(Ac-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2)
(1)以Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin为起始原料，合成规模为0.1mmol。从C-端向N-端方向合成，首先用哌啶/DMF(1∶3，v/v)去除N-端Fmoc保护基，使N-端成为自由氨基。用4倍当量Fmoc-Gly-OH溶解到HOBt/DIC与树脂进行接枝，引入C-端第二个氨基酸残基(Gly)得到Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin。如此先去保护、再反复依次连接以后的每个氨基酸残基，并在肽链连接最后一步用HOBt/DIC的反应方法去除最后一个氨基酸残基的Fmoc，采用过量lO倍的乙酸酐与过量20倍的DIEA溶于DMF的溶液，进行乙酸化反应，整条多肽合成完成后得到带有保护基团的肽段，即Ac-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Rink-Amide Am resin。以上每步反应后都需用DMF和DCM轮流交替洗涤树脂6次以上，并且都通过Kaiser Test检测来对反应进行控制，若某个氨基酸缩合反应不完全，重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。
(2)使用切割试剂(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水、TIPS按一定比例混合)在30℃下切割3h，将目标多肽从树脂上裂解下来并除去氨基酸侧链保护基，滤液加入到大量冷的乙醚中使多肽沉淀析出，然后离心。用乙醚洗涤数次后冻干，得到多肽粗品Ac-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2。
(3)取上述多肽粗品溶于DMSO/H2O(1∶4，v/v)溶液中，浓度为4mg/mL。24h后取反应液进行HPLC跟踪，如果反应完全直接进行纯化处理，如果反应不完全则延长反应时间直到反应完全。
(4)利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽，其化学结构由MALDI-TOF质谱表征，乙酰化和酰胺化的SEQ ID NO：194的实测分子量为5533.01([M+H]+)。
乙酰化和酰胺化的SEQ ID NO：196
(Ae-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Cys-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Pro-NH2)
SEQ ID NO：196选取Fmoc-Pro-Rink Amide-AM resin为起始原料，按照SEQ IDNO：194所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Pro-Rink Amide-AM resin，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5476.14([M+H]+)。
乙酰化和酰胺化的SEQ ID NO：198
(Ac-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-NH2)
SEQ ID NO：198选取Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin为起始原料，按照SEQID NO：194所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Ac-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Rink Amide AM resin，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5506.83([M+H]+)。
乙酰化和酰胺化的SEQ ID NO：200
(Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe-NH2)
SEQ ID NO：200选取Fmoc-Phe-Rink Amide AM resin为起始原料，按照SEQ IDNO：194所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Ac-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-L ys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Rink Amide AM resin，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段，其实测分子量为5507.42([M+H]+)。
八、合成方法7
N-端PEG修饰的SEQ ID NO：200
(PEG-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-Ala-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys-Phe)
(1)称取Fmoc-Phe-Wang resin，放到玻璃反应柱DCM溶胀30min，减压抽掉DCM。
(2)用DMF洗涤树脂3遍，加入哌啶/DMF(1∶4，v/v)溶液反应20min除去保护基Fmoc，减压抽掉溶液，用DMF洗涤6遍。
(3)分别称取第一个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU加入到树脂中，DMF溶解并加入DIEA，反应30min，取树脂做Kaiser Test检验反应，观察到溶液亮黄、树脂黄时，说明反应完全，减压抽掉溶剂。
(4)步骤(2)和(3)，直至接到最后一个原料Fmoc-PEG8-CH2CH2COOH，反应8小时，脱去N端Fmoc，即得到N-端被PEG修饰和侧链带有保护基的肽段PEG-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Ile-Cys(Trt)-Phe-Wang树脂，然后用DMF、DCM和甲醇各洗三遍，抽干树脂。
(5)加入裂解液(TFA、EDT、TA、苯酚、纯水按一定比例混合)去除树脂和氨基酸侧链保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干。
(6)用H2O/乙腈(9∶1，v/v)溶解，体积放大到100mL，加入稀氨水调至碱性(pH≈8)，取小样测试巯基活性，黄色说明巯基存在，加入双氧水2-3滴，反应5-10min，再次检测，溶液呈现透明，说明氧化完全(90％以上)，加冰醋酸调至酸性(pH≈6)，其化学结构由质谱表征，结果正确后利用高压液相色谱反相C18柱色谱纯化获得目标多肽。
N-端PEG修饰的SEQ ID NO：204
(PEG-Phe-Cys-Thr-Tyr-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Cys-Tyr-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Lys)
N-端PEG修饰的SEQ ID NO：204，选取Fmoc-Lys(Boc)-Wang resin为起始原料，按照SEQ ID NO：200所述的方法进行合成，先依次添加与多肽序列相应的氨基酸原料、合成带有保护基团的肽段，即Fmoc-PEG-Phe-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Pro-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Ile-Pro-Ile-Gly-Gly-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Wang resin，脱去Fmoc，再加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，氧化形成二硫键，最终得到目的肽段。
实施例2 抑制胰蛋白酶的多肽分子的设计及抑制活性评价
米氏常数Km值的测定：
(1)在96孔板中加入200μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，37℃预热15min。再加入5μL不同浓度的底物(p-Nitroanilide，pNA)(终浓度0.5％DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃孵育120min，测定OD405nm的吸光度值。205μL反应体系中，pNA的终浓度分别为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2、0.25mM。每个浓度做三个复孔，以pNA浓度对OD405nm值作图，求得标准曲线。
(2)在96孔板中加入190μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)及10μL、1μM的胰蛋白酶，37℃预热15min。再加入5μL不同浓度的底物BApNA(终浓度0.5％DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃反应120min，测定OD405nm的吸光度值。205μL反应体系中，BApNA的终浓度分别为0、0.125、0.2、0.33、0.5、0.75、1.0和1.25mM。每个浓度做三个复孔，以时间对OD405nm值作图，求得相应的曲线。以曲线的斜率除以标准曲线的斜率和酶浓度，得到初速度V0(mM/(min*mM protein)。利用Prism软件、以底物BApNA的浓度对初速度V0作图，即得到胰蛋白酶水解BApNA的米氏常数Km值。
抑制常数Ki值的测定：
(1)将不同浓度的抑制胰蛋白酶的多肽抑制剂(BTs)、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)加入预冷的96孔板中，总体积190μL，37℃、500rpm预热5min。加入10μL、1μM的胰蛋白酶，37℃、500rpm孵育10min。加入5μL、50mM的底物BApNA，500rpm混匀1min，置于37℃反应260min，测定OD405nm的吸光度值。每个浓度做三个复孔，空白对照只加反应缓冲液和底物，作为最小吸收值(Min OD405nm)；阴性对照只加反应缓冲液、酶和底物，作为最大吸收值(Max OD405nm)。
(2)205μL反应体系中，胰蛋白酶的终浓度约50nM，BApNA的终浓度约1.22mM。
(3)数据统计
酶的剩余活性(％)＝(1-(Max OD405nm-Sample OD405nm)/(Max OD405nm-MinOD405nm))*100
以底物浓度对酶的剩余活性作图，求得BTs骨架抑制胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)，再代入公式Ki＝IC50/(1+S/Km)(S、IC50和Km分别是底物浓度、半数抑制浓度和米氏常数)即可求得BTs骨架抑制胰蛋白酶的抑制常数Ki。
结果：
利用不同的BApNA浓度对一定浓度的胰蛋白酶催化水解产生pNA测定OD405nm的吸光度值，参照标准曲线，利用Prism软件、以底物BApNA的浓度对初速度V0作图，即得到胰蛋白酶水解BApNA的米氏常数Km值为0.33mM(R2＝0.9966)(图1)。采用理性设计的方法，设计合成线性和N-/C-截短的SFTI-1多肽类似物BT1和BT45，实验测定线性和N-/C-截短的SFTI-1多肽类似物BT1和BT45对胰蛋白酶的抑制常数(Ki)相同(表2)，均为6.4nM(图2和表3)，与文献披露的研究结果一致[Korsinczky ML，Schirra HJ，Rosengren KJ，West J，Condie BA，Otvos L，et al.Solution structures by 1H NMR of the novel cyclic trypsininhibitor SFTI-1from sunflower seeds and an acyclic permutant.J Mol Biol，2001，311：579-591.]。结果证实了线性SFTI-1的N-端和C-端分别截短1个(G)和2个(FD)氨基酸残基不影响胰蛋白酶抑制活性；同时设计合成了突变P3位点的BT2和BT3，测定其抑制常数(Ki)(表2)分别为650nM和140nM(图2和表3)，尽管这2个多肽抑制活性降低，但说明基于SFTI-1的抑制活性环P3的位点可以耐受突变，同时二硫键之间的肽段(环)可延长。随后对二硫键之间的环进行优化设计合成了BT5、BT6和BT7，测定其抑制常数(Ki)(图3、表2和表4)分别为30nM、60nM和50nM。然后把简化的结构和P3位点突变后的扩环组合在一起，设计合成一系列针对P1′-P7′等位点的氨基酸残基替换的突变体(BT8-BT36)(表2)，其抑制常数(Ki)测定结果表明P7′位点苯丙氨酸的缺失(BT8，IC50＞50μM)和P3′位点脯氨酸的替换为丙氨酸(BT20，IC50＞50μM)极大地降低其胰蛋白酶抑制活性；其中在BT45基础上扩环衍生的BT9呈现出较好的抑制活性(Ki＝10nM)位点，其它位点的替换呈现出不同的影响，其中BT10的P4′位点是脯氨酸突变为丙氨酸的突变体，对其抑制活性影响较小(Ki＝20nM)，其次是BT17的P1位点赖氨酸突变为精氨酸突变体的抑制活性相对于BT9活性降低近12倍，再次是其它位点P1′(BT27、BT22)和P2′(BT28、BT16、BT14、BT21)；而P5′(BT15、BT12)和P7′(BT12、BT18、BT19、BT24)的氨基酸替换也呈现出较大的影响；此外，在BT9的基础上进一步扩展二硫键之间的环长，依然保持较好的抑制活性(BT11、BT13、BT32、BT33、BT29)(图4、表2和表5)。
针对BT9的P2(BT26)、P3(BT35)、P4(BT25)、P5(BT66)位点的突变研究发现其可以被其它氨基酸残基取代，其中P3位点的丙氨酸替换为γ-氨基酸丁酸，则呈现出与BT9几乎等效的抑制活性，于是进一步合成了一系列的针对P3位点的BT47-BT60系列的骨架分子，其中BT47、BT50、BT53、BT54呈现出较好的抑制活性(图5、表2和表6)。针对P5位点的甘氨酸替换同为促进β-折叠形成的脯氨酸，其依然呈现出较好的抑制活性，于是合成BT66-BT80系列的骨架多肽分子，其中BT66、BT67呈现出较高的胰蛋白酶抑制活性(图6、表2和表7)。
表2.胰蛋白酶的抑制肽的分子结构及其活性
Figure BSA0000226789550000721
Figure BSA0000226789550000731
Figure BSA0000226789550000741
a：表中的抗胰蛋白酶骨架的分子内两个半胱氨酸之间形成了二硫键。
N.A.：活性弱的分子不再测定Ki值。
表3.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000742
Figure BSA0000226789550000751
表4.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000752
表5.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000753
表5.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000754
Figure BSA0000226789550000761
表5.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000762
表6.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000763
表6.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000764
Figure BSA0000226789550000771
表7.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000772
表7.胰蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000773
实施例3 抑制糜蛋白酶的多肽分子的设计及抑制活性评价
米氏常数Km值的测定：
(1)往96孔板中加入190μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，37℃预热15min。再加入2μL不同浓度的底物pNA(DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃孵育20min，测定OD405nm的吸光度值。200μL反应体系中，pNA的终浓度分别为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.25、和0.3mM。每个浓度做三个复孔，以pNA浓度对OD405nm值作图，求得标准曲线。
(2)往96孔板中加入190μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)及8μL、0.75μM的糜蛋白酶，37℃预热5min。再加入2μL不同浓度的底物AAPFpNA(DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃反应20min，测定OD405nm的吸光度值。200μL反应体系中，AAPFpNA的终浓度分别为0、0.125、0.25、0.285、0.33、0.4和0.5mM。每个浓度做三个复孔，以时间对OD405nm值作图，求得相应的曲线。以曲线的斜率除以标准曲线的斜率和酶浓度，得到初速度V0(mM/(min*mM protein))。利用Prism软件、以底物AAPFpNA的浓度对初速度V0作图，即得到糜蛋白酶水解AAPFpNA的米氏常数Km值。
抑制常数Ki值的测定：
(1)将不同浓度的CHs骨架、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)加入预冷的96孔板中，总体积190μL，37℃预热5min(500rpm离心1min，静置4min)。加入8μL、750nM的糜蛋白酶，37℃孵育10min(500rpm离心1min，静置9min)。加入2μL、50mM的底物AAPFpNA，500rpm混匀1min，置于37℃反应90min，测定OD405nm的吸光度值。每个浓度做三个复孔，空白对照只加缓冲液和底物，作为最小吸收值(Min OD405nm)；阴性对照只加缓冲液、酶和底物，作为最大吸收值(Max OD405nm)。
(2)200μL反应体系中，糜蛋白酶的终浓度约30nM，AAPFpNA的终浓度约0.5mM。
(3)数据统计
酶的剩余活性(％)＝(1-(Max OD405nm-Sample OD405nm)/(Max OD405nm-MinOD405nm))*100
以底物浓度对酶的剩余活性作图，求得CHs骨架抑制糜蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)，再代入公式Ki＝IC50/(1+S/Km)(S、IC50和Km分别是底物浓度、半数抑制浓度和米氏常数)即可求得CHs骨架抑制糜蛋白酶的抑制常数Ki。
结果：
利用不同的AAPFpNA浓度对一定浓度的糜蛋白酶催化水解产生pNA测定OD405nm的吸光度值，参照标准曲线，利用Prism软件、以底物AAPFpNA的浓度对初速度V0作图，即得到糜蛋白酶水解AAPFpNA的米氏常数Km值为0.38mM(R2＝0.9988)(图7)。
基于BBI和SFTI-1衍生的抑制糜蛋白酶的活性肽研究较少，其中有文献报道CH4的类似物对胰蛋白酶具有较好的抑制活性[McBride JD，Freeman N，Domingo GJ，Leatherbarrow RJ.Selection of chymotrypsin inhibitors from aconformationally-constrained combinatorial peptide library.J Mol Biol，1996，259：819-827.]，本发明结合丝氨酸蛋白酶具有P1位点的特异性和胰蛋白酶抑制肽研究的结果合成了CH1、CH4和CH5，其抑制糜蛋白酶的抑制常数Ki分别为0.46μM、0.55μM、0.08μM；同时也参照胰蛋白酶的二硫键之间的环可延申的特点，也合成了类似的多肽CH2、CH3、CH6、CH7、CH8和CH9，其中只有CH7和CH9具有一定的抑制糜蛋白酶活性，说明糜蛋白酶在结构上可能区别胰蛋白酶，二硫键之间的扩环结构不适用于糜蛋白酶抑制肽的结构优化(图8、表8和表9)。
结合糜蛋白酶P1位点的特异性和CH5具有较好的抑制活性，针对P1和P4位点合成一系列的类似物及其二硫键扩环的类似物，测定其糜蛋白酶抑制常数，结果表明CH10具有较好的抑制活性(Ki＝30nM)，对比CH11、CH17、CH18和CH19抑制活性，P1位点优选是酪氨酸，P4优选疏水性氨基酸残基；而相应的二硫键之间扩环的类似物CH13、CH23和CH24呈现出较好的抑制活性(图9和表8)。针对P4′、P5′和P7′位点氨基酸残基的替换对糜蛋白酶抑制活性的影响合成了CH26-CH35的多肽类似物，抑制常数的测定结果表明P4′、P5′和P7′位点氨基酸的替换影响其活性较大，其中CH26、CH33、CH34和CH35呈现出较好的抑制活性，同样二硫键扩环的多肽类似物CH27、CH31和CH32也呈现出一定的抑制活性(图10、表8和表10)。此外，还合成CH36-CH53组合不同位点替换的类似物，抑制常数的测定结果表明CH47、CH49、CH51、CH52和CH53呈现出较好的糜蛋白酶抑制活性(图11和表8)。
表8.糜蛋白酶的抑制肽的分子结构及其活性
Figure BSA0000226789550000791
Figure BSA0000226789550000801
Figure BSA0000226789550000811
a：表中的抗糜蛋白酶骨架的分子内两个半胱氨酸之间形成了二硫键。
N.A.：活性弱的分子不再测定Ki值。
表9.糜蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000812
表10.糜蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000813
Figure BSA0000226789550000821
*：CH10在0.0001μM浓度几乎没有抑酶活性，但有两个复孔由于加样误差很大，故舍弃这两个复孔的值。
表10.糜蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000822
实施例4 抑制胰腺弹性蛋白酶的多肽分子的设计及抑制活性评价
米氏常数Km值的测定：
(1)往96孔板中加入198μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，37℃预热15min。再加入2μL不同浓度的底物pNA(DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃孵育30min，测定OD405nm的吸光度值。200μL反应体系中，pNA的终浓度分别为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175和0.2mM。每个浓度做三个复孔，以pNA浓度对OD405nm值作图，求得标准曲线。
(2)往96孔板中加入190μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)及8μL、4.375μM的Elastase，37℃预热5min。再加入2μL不同浓度的底物AAApNA(DMSO配置)，500rpm混匀1min，置于37℃反应30min，测定OD405nm的吸光度值。200μL反应体系中，AAApNA的终浓度分别为0、0.125、0.166、0.2、0.25、0.33、0.6、0.75和1.25mM。每个浓度做三个复孔，以时间对OD405nm值作图，求得相应的曲线。以曲线的斜率除以标准曲线的斜率和酶浓度，得到初速度V0(mM/(min*mM protein)。利用Prism软件、以底物AAApNA的浓度对初速度V0作图，即得到弹性蛋白酶水解AAApNA的米氏常数Km值。
抑制常数Ki值的测定：
(1)将不同浓度的ECs骨架、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)加入预冷的96孔板中，总体积190μL，37℃预热5min(500rpm、1min，静置4min)。加入8μL、12.5μM的弹性蛋白酶，37℃孵育10min(500rpm、1min，静置9min)。加入2μL、100mM的底物AAApNA，500rpm混匀1min，置于37℃反应60min，测定OD405nm的吸光度值。每个浓度做三个复孔，空白对照只加缓冲液和底物，作为最小吸收值(Min OD405nm)；阴性对照只加缓冲液、酶和底物，作为最大吸收值(MaxOD405nm)。
(2)200μL反应体系中，弹性蛋白酶的终浓度约0.5μM，AAApNA的终浓度约1mM。
(3)数据统计
酶的剩余活性(％)＝(1-(Max OD405nm-Sample OD405nm)/(Max OD405nm-MinOD405nm))*100
以底物浓度对酶的剩余活性作图，求得ECs骨架抑制弹性蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)，再代入公式Ki＝IC50/(1+S/Km)(S、IC50和Km分别是底物浓度、半数抑制浓度和米氏常数)即可求得ECs骨架抑制Elastase的抑制常数Ki。
结果：
利用不同的AAApNA浓度对一定浓度的弹性蛋白酶催化水解产生pNA测定OD405nm的吸光度值，参照标准曲线，利用Prism软件、以底物AAApNA的浓度对初速度V0作图，即得到弹性蛋白酶水解AAApNA的米氏常数Km值为0.40mM(R2＝0.9885)(图12)。
有关胰腺弹性蛋白酶的活性肽研究报道极少，其中仅有文献报道EC1的类似物对胰腺弹性蛋白酶具有较好的抑制活性[McBride JD，Freeman HN，LeatherbarrowRJ.Selection of human elastase inhibitors from a conformationally constrainedcombinatorial peptide library.Eur J Biochem，1999，266：403-412.]，本发明结合丝氨酸蛋白酶具有P1位点的特异性及其胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制肽研究的结果合成了EC1-EC12的弹性蛋白酶抑制肽，测定弹性蛋白酶抑制常数Ki的结果表明P1位点优选是丙氨酸的EC1和EC12具有较好的抑制弹性蛋白酶活性，分析EC12较EC1和EC2有更好的抑制活性，表明P5′和P7′位点的氨基酸替换对其抑制活性影响较大，而对应二硫键扩环的类似物仅EC7呈现出较弱的抑制活性(图13和表11)。然后，合成了组合不同位点替换的类似物EC13-EC29，抑制常数的测定结果表明EC23(Ki＝70nM)的抑制活性较EC12(Ki＝110nM)有一定的提高，而EC25-EC28抑制活性降低表明P1′位置的氨基酸替换影响较大，其中P4、P5′和P7′的替换对其抑制活性有影响，但相对P1′位置较小(图14、表11和表12)。此后，在EC23的基础上合成了EC30-EC45及其含有羟脯氨酸的类似物EC46-EC48。
表11.弹性蛋白酶的抑制肽的分子结构及其活性
Figure BSA0000226789550000841
Figure BSA0000226789550000851
a：表中的抗弹性蛋白酶骨架的分子内两个半胱氨酸之间形成了二硫键。
N.A.：活性弱的分子不再测定Ki值。
表12.弹性蛋白酶的抑制肽的活性测定
Figure BSA0000226789550000852
表12.弹性蛋白酶的抑制肽的活性测定(续表)
Figure BSA0000226789550000861
实施例5 提高胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对体内代谢酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶24.11(NEP24.11)的稳定性
为提高GLP-1在血循环中的稳定性，设计合成含有抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)和抑制NEP24.11的Opiorphin(QRFSR)两个肽段的GLP-1类似物(杂交肽)，其结构序列见表13。
GLP-1及其类似物(杂交肽)对DPP-IV的耐受性：
为考察GLP-1及其类似物对DPP-IV的耐受性，实验过程如下：
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入5μL、250μM GLP-1或GLP-1类似物，45μL、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)及7.5μL、10％TFA，8000rpm离心30s混匀。
DPP-IV对GLP-1及其类似物(杂交肽)的酶解动力学：①取三个无菌的EP管，每个EP管中加入30μL、250μM GLP-1或GLP-1类似物及240μL、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。②在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.005μg/μL的DPP-IV酶液。③将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入30μL DPP-IV酶液并混匀。开始计时，于反应的0.5、2.0、4.0、8.0和12.0h分部取出50μL反应液，加入7.5μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。在50μL反应体系中，GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是25μM，DPP-IV的终浓度是0.5ng/μL。每个时间点有三次重复，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。
结果：为了排除具有较高活性的胰蛋白酶抑制肽对DPP-IV酶水解GLP-1及其类似物的影响，合成了BT43(SEQ ID NO：43)部分肽段的GLP-1类似物SEQ ID NO：189、SEQ IDNO：190、SEQ ID NO：191和SEQ ID NO：193(表13)。利用HPLC色谱分析方法测定实验样品在DPP-IV作用不同时间后剩余的原型样品比率，结果表明直接在GLP-1的N-端引入7个甘氨酸，能形成对GLP-1耐受DPP-IV酶解的保护作用(G7-GLP-1，SEQ ID NO：186)，作用12h后，G7-GLP-1还剩余约34.5％；GLP-1(7-37)约4h后已基本被降解了；而引入含有抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)的D-GLP-1(SEQ ID NO：187)则呈现出较好的耐受DPP-IV酶解的稳定性，作用12h后，还剩余85.6％(图15A和表14)。在GLP-1的N-/C端引入胰蛋白酶的抑制肽(SEQID NO：194-201)的GLP-1类似物都呈现出较好地耐受DPP-IV酶解的稳定性(图15B和表14)。在GLP-1的N-/C-端引入糜蛋白酶的抑制肽(SEQ ID NO：202-205)的GLP-1类似物也都呈现出较好地耐受DPP-IV酶解的稳定性(图15C和表14)。同样在GLP-1的N-/C端引入弹性蛋白酶的抑制肽(SEQ ID NO：206-209)的GLP-1类似物都呈现出较好的耐受DPP-IV酶解的稳定性(图15D和表14)。实验结果说明引入抑制不同代谢酶的活性肽骨架D、N、T、BT、CH和EC均能提高GLP-1对DPP-IV的耐受性。
表13.GLP-1及其类似物的结构
Figure BSA0000226789550000871
Figure BSA0000226789550000881
a：表中，抗DPP-IV、NEP24.11、胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架分别命名为D、N、T、BT、CH和EC，用直线、波浪线、虚线、双直线和斜体标示。另外，多肽序列中的抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架的分子内两个半胱氨酸之间均形成了二硫键。
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：186-189)对二肽基肽酶IV的稳定性分析
Figure BSA0000226789550000891
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：190-193)对二肽基肽酶IV的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000892
N.A.：未测定。
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：194-197)对二肽基肽酶IV的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000893
Figure BSA0000226789550000901
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：198-201)对二肽基肽酶IV的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000902
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：202-205)对二肽基肽酶IV的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000903
表14.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：206-209)对二肽基肽酶IV的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000904
GLP-1及其类似物(杂交肽)对NEP24.11的耐受性：
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入6μL、250μM GLP-1或GLP-1类似物，44μL、50mM HEPES和50mM NaCl缓冲液(pH 7.4)及7.5μL、10％TFA，8000rpm离心30s混匀。
NEP24.11对GLP-1及其类似物(杂交肽)的酶解动力学：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入30μL、250μM GLP-1或GLP-1类似物及215μL、50mM HEPES和50mM NaCl缓冲液(pH7.4)。同时，在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.04μg/μL的NEP24.11酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入5μLNEP24.11酶液并混匀。开始计时，于反应的0.5、2.0、4.0和8.0h分部取出50μL反应液，加入7.5μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。在50μL反应体系中，GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是30μM，NEP24.11的终浓度是1.0ng/μL。每个时间点有三次重复，利用RP-HPLC检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。
结果：经NEP24.11酶解8h后，GLP-1(7-37)和G7-GLP-1几乎完全被降解。含有抑制NEP24.11的Opiorphin(QRFSR)肽段N-GLP-1(SEQ ID NO：188)的稳定性提高最多，剩余量约56.4％，说明该Opiorphin(QRFSR)肽段的确能发挥抑制NEP24.11的作用。由于NEP24.11的酶切位点散在分布于整个GLP-1分子中，故含有两个或三个抑酶骨架的分子可能由于空间位阻的作用，对NEP24.11均具有不同程度的耐受作用，耐受性最强的D-GLP-1-BT1(SEQ IDNO：196)，与酶作用8h后剩余量接近80％(表15)。其NEP24.11酶解GLP-1及其类似物的动力学过程见图16。实验结果说明引入抑制代谢酶的D、N、T和BT肽段均可以提高GLP-1对NEP24.11的耐受性。
表15.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：186-189)对中性内肽酶24.11的稳定性分析
Figure BSA0000226789550000911
Figure BSA0000226789550000921
表15.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：190-193)对中性内肽酶24.11的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000922
表15.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：194-197)对中性内肽酶24.11的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000923
表15.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：198-201)对中性内肽酶24.11的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000924
实施例6.提高胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对胰腺胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶酶解的稳定性
GLP-1及其类似物(杂交肽)对胰蛋白酶酶解的稳定性分析：
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入1.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物，23.5μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)及3.75μL、10％TFA，8000rpm离心30s混匀。
GLP-1类似物SEQ ID NO：186-193不含有胰蛋白酶的抑制肽分子骨架，胰蛋白酶酶解过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入9μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及135μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。同时，在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.05μg/μL的胰蛋白酶酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入6μL胰蛋白酶并混匀。开始计时，于反应的1.5、3.0、4.5、6.0和9.0min分部取出25μL反应液，加入3.75μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。
GLP-1类似物SEQ ID NO：194-201含有胰蛋白酶的抑制肽分子骨架，胰蛋白酶酶解过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入13.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及202.5μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。同时，在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.05μg/μL的胰蛋白酶酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入9μL胰蛋白酶并混匀。开始计时，于反应的1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0和60.0min分部取出25μL反应液，加入3.75μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。
上述两类实验样品在25μL反应体系中，GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是60μM胰蛋白酶的终浓度是2.0ng/μL。每个时间点有三次重复，利用RP-HPLC检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。
结果：不含有胰蛋白酶的抑制肽分子骨架的GLP-1类似物SEQ ID NO：186-193对胰蛋白酶酶解的耐受性较差，在9分钟时基本上被降解；尽管BT43(SEQ ID NO：43)胰蛋白酶抑制活性较弱，但含有BT43(SEQ ID NO：43)部分抑制肽段的GLP-1类似物呈现出一定的耐受性(图17A和表16)。结果说明该抑制肽骨架可在某种程度上提高GLP-1分子对胰蛋白酶的耐受性，其它抑制肽分子骨架的引入对其无效。DNT-GLP-1(SEQ ID NO：193)也被降解完，其原因是二级结构有较大变化引起的。而引入了抑制蛋白酶骨架BT1和BT9的GLP-1类似物SEQID NO：194-201经胰蛋白酶酶解60分钟后原型分子的剩余量大于75％，说明该抑制肽分子使得GLP-1对胰蛋白酶的耐受性有较大提高(图17B、图17C和表16)。
表16.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：186-189)对胰蛋白酶酶的稳定性分析
Figure BSA0000226789550000941
表16.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：190-193)对胰蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000942
表16.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：194-197)对胰蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000943
Figure BSA0000226789550000951
表16.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：198-201)对胰蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000952
GLP-1及其类似物(杂交肽)对糜蛋白酶酶解的稳定性分析：
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入1.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物，23.5μL、50mM Tris和20mM CaCl2(pH 7.8)缓冲液及3.75μL、10％TFA，8000rpm离心30s混匀。
GLP-1类似物SEQ ID NO：186-201不含有糜蛋白酶抑制肽分子骨架，GLP-1及其类似物对糜蛋白酶酶解过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入9μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及138μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。同时，在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.05μg/μL的糜蛋白酶酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入3μL糜蛋白酶酶液并混匀。开始计时，于反应的1.5、3.0、4.5、6.0和9.0min分部取出25μL反应液，加入3.75μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。
GLP-1类似物SEQ ID NO：202-205含有糜蛋白酶抑制肽分子骨架，糜蛋白酶酶解过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入13.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及207μL、20mM CaCl2、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。同时，在另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.05μg/μL的糜蛋白酶酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入4.5μL糜蛋白酶酶液并混匀。开始计时，于反应的1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0和60.0min分部取出25μL反应液，加入3.75μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。
上述两类实验样品在25μL反应体系中，GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是60μM，糜蛋白酶的终浓度是1.0ng/μL。每个时间点有三次重复，利用RP-HPLC检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。
结果：GLP-1经糜蛋白酶酶解9min后，全部降解了，两次实验结果一致。GLP-1类似物SEQ ID NO：186-201不含有糜蛋白酶抑制肽分子，其对糜蛋白酶酶解的稳定性较低，而引入含有BT43(SEQ ID NO：43)部分抑制肽段的GLP-1类似物SEQ ID NO：189-191和SEQ IDNO：193相对于GLP-1分子呈现出一定的耐受性，在经糜蛋白酶酶解处理9分钟后有50％以上的剩余原型肽(图18A&18B和表17)；而只有特异性地引入糜蛋白酶抑制骨架的GLP-1类似物SEQ ID NO：202-204经60分钟的糜蛋白酶酶解处理依然有大于60％的剩余原型肽，但GLP-1类似物SEQ ID NO：205例外，该杂交肽的原型肽分子与酶解产物难以实现基线分离，计算误差导致其糜蛋白酶酶解处理后的剩余量偏低(图18C和表17)。
表17.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：186-189)对糜蛋白酶酶的稳定性分析
Figure BSA0000226789550000961
表17.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：190-193)对糜蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000962
Figure BSA0000226789550000971
表17.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：194-197)对糜蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000972
*，未实现基线分离，峰面积与实际不符，不作统计。
表17.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：198-201)对糜蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000973
-，未积分。
表17.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：202-205)对糜蛋白酶酶的稳定性分析(续表)
Figure BSA0000226789550000974
Figure BSA0000226789550000981
*，未实现基线分离。
GLP-1及其类似物(杂交肽)对弹性蛋白酶酶解的稳定性分析：
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入1.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物，23.5μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)及3.75μL、10％TFA，8000rpm离心30s混匀。
GLP-1类似物SEQ ID NO：206-209含有弹性蛋白酶抑制肽分子，弹性蛋白酶酶解过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入13.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及207μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。同时，另一个无菌的EP管中配置一定体积的0.5μg/μL的弹性蛋白酶酶液。然后将含有多肽和酶的四个EP管同时置于37℃预热5min，往每份含多肽的EP管中分别加入4.5μL弹性蛋白酶酶液并混匀。开始计时，于反应的1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、15.0、30.0和60.0min分部取出25μL反应液，加入3.75μL、10％TFA终止反应，8000rpm离心30s混匀。在25μL反应体系中，GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是60μM，弹性蛋白酶的终浓度是10ng/μL。每个时间点有三次重复，利用RP-HPLC检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。
结果：基于含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制肽分子骨架的GLP-1类似物具有分子骨架靶向代谢酶酶解的稳定性，本实验方案仅仅评价含有弹性蛋白酶抑制肽分子的GLP-1类似物(SEQ ID NOs：206-209)对弹性蛋白酶酶解的耐受性。结果显示，GLP-1在酶解15min后即剩余约10％，而引入了含有弹性蛋白酶抑制肽分子的GLP-1类似物的剩余量均大于50％。酶解30min后，检测不到GLP-1原型分子。酶解60min后，N-端融合弹性蛋白酶抑制肽的GLP-1类似物(SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：208)剩余20％左右；而C-端融合弹性蛋白酶抑制肽的GLP-1类似物(SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209)剩余约45％左右，说明EC抑制肽分子引入GLP-1分子的C端能较好地提高其对弹性蛋白酶酶解的稳定性(图19和表18)。
表18.GLP-1及其类似物(SEQ ID NO：206-209)对弹性蛋白酶酶的稳定性分析
Figure BSA0000226789550000991
实施例7.胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物(杂交肽)的血清稳定性
对照实验：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入3μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物，25μL人血清(购自南京森贝伽生物科技有限公司)，72μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)及300μL预冷的无水甲醇，颠倒混匀后-20℃放置过夜。同时，取三个无菌的EP管，每个EP管中加入25μL人血清、75μL、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)及300μL预冷的无水甲醇，同法处理作为阴性对照，主要是排除甲醇沉淀后在目的多肽出峰时间处没有人血清自身所含蛋白或多肽的干扰。
血清稳定性实验过程如下：取三个无菌的EP管，每个EP管中加入16.5μL、1mM GLP-1或GLP-1类似物及396μL、50mM Tris(pH 7.0)缓冲液。同时，在另一个无菌的EP管中加入一定体积的人血清。然后将含有多肽和人血清的四个EP管置于37℃预热10min，往每份含多肽的EP管中分别加入137.5μL人血清并混匀，其GLP-1或GLP-1类似物的终浓度是0.03mM，人血清的终浓度是25％(v/v)。开始计时，在孵育时间为0.5、2.0、4.0、8.0和12.0h分别取出100μL反应液，加入300μL预冷的无水甲醇，颠倒混匀后-20℃放置过夜。所有样品18000g、4℃离心10min，取上清，用抽滤瓶抽干有机溶剂，冷冻干燥。加入60μL、50％(v/v)甲醇/水溶液溶解样品，18000g、4℃离心5min，取上清用于RP-HPLC分析。每个时间点有三次重复，利用RP-HPLC检测各时间点多肽的峰面积，计算检测时间T(h)样品的剩余峰面积和0h原型多肽的峰面积之比为多肽的剩余百分比(％)。阴性对照显示人血清自身所含的蛋白或多肽在该处理方法下对目的多肽的检测无干扰。
结果：GLP-1及其类似物与人血清共孵育12h后，GLP-1剩余约3.5％，这与文献报道其血浆半衰期仅1-2分钟不一致，其原因是其在体循环中主要由代谢酶DPP-IV和NEP24.11分解代谢，而这两个代谢酶是膜蛋白，正常血清中浓度极低，尤其是血循环中释放的NEP24.11可作为许多生理病理的生物标志物。而含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物均呈现出较高的血清稳定性，含有胰蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物无论是N-端融合(SEQ ID NO：194和SEQ ID NO：198)，还是C-端融合(SEQ IDNO：196和SEQ ID NO：200)均呈现出较好的血清稳定性；其中C端含有糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物(SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ IDNO：209)较N-端含有糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物(SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：208)血清中稳定性更高(图20和表19)。结果说明，融合有抑制丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物在血清环中除DPP-IV和NEP24.11外还对其它丝氨酸类代谢酶具有抑制作用，提高了其血清中的稳定性。
表19.GLP-1及其类似物在人血清中的稳定性
Figure BSA0000226789550001001
a：该时间点样品的剩余量不符合降解规律，故不作统计。
b：该时间点有两个样品未实现基线分离。
表19.GLP-1及其类似物在血清中的稳定性(续表)
Figure BSA0000226789550001002
Figure BSA0000226789550001011
表19.GLP-1及其类似物在血清中的稳定性(续表)
Figure BSA0000226789550001012
实施例8.GLP-1类似物(杂交肽)对正常ICR小鼠的体内降糖活性
皮下注射给药：
实验前一天，动物禁食15-16h，自由饮水。实验当天，动物按照体重随机分组，每组10只，首先从动物尾尖采0时血，然后各组动物按1μmol/kg皮下注射给予样品(GLP-1类似物SEQ ID NOs：194-201)或生理盐水，30min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在给糖后30min，60min和120min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。
AUC(mg×h/dL)＝(BG0+BG30)×30/60+(BG30+BG60)×30/60+(BG60+BG120)×60/60，其中BG0、BG30、BG60和BG120分别表示给予葡萄糖负荷后0min、30min、60min和120min的血糖。
结果：皮下注射给予同时含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT9(SEQ ID NO：9)、BT45(SEQ ID NO：45)和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：200)可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的30、60、120min血糖值和AUC(图21A和表20)。皮下注射给予同时含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT9(SEQ ID NO：9)、BT45(SEQ ID NO：45)和抑制NEP24.11的Opiorphin(QRFSR)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：201)可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的30、60min血糖值和AUC(图21B和表20)。以上结果说明，胰蛋白酶的抑制肽分子引入没有破坏GLP-1和受体的结合。
皮下注射给予同时含有糜蛋白酶的抑制肽分子CH4(SEQ ID NO：84)、CH10(SEQ IDNO：90)和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的GLP-1类似物SEQ IDNO：202-205，同样可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的30、60、120min血糖值和AUC值(图21C和表20)，说明糜蛋白酶的抑制肽分子的引入没有影响GLP-1和受体的结合。
皮下注射给予同时含有弹性蛋白酶的抑制肽分子EC1(SEQ ID NO：134)、EC12(SEQID NO：145)和抑制DPP-IV的diprotinA(IPI)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NOs：206-209)，也可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的30、60min血糖值和AUC值(图21D和表20)，说明弹性蛋白酶的抑制肽分子的引入没有影响GLP-1和受体的结合。
皮下注射给予乙酰化和酰胺化的GLP-1类似物SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：200，和其未修饰的分子相比，其降血糖活性无显著性差异。
表20.GLP-1类似物皮下给药的降血糖活性
Figure BSA0000226789550001021
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
表20.GLP-1类似物皮下给药的降血糖活性(续表)
Figure BSA0000226789550001031
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
表20.GLP-1类似物皮下给药的降血糖活性(续表)
Figure BSA0000226789550001032
Figure BSA0000226789550001041
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
表20.GLP-1类似物皮下给药的降血糖活性(续表)
Figure BSA0000226789550001042
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
十二指肠给药
药物递送技术可以采用肠溶包衣技术实现靶向小肠的口服给药，本发明为检测GLP-1小肠吸收的可行性，设计十二指肠给药，实验过程如下：实验前一天，动物禁食15-16h，自由饮水。实验当天，动物按照体重随机分组，每组9-11只或每组14-15只(组合给药)，首先从动物尾尖采0时血，然后用吸入乙醚的方式麻醉动物，在靠近胃下方用手术剪刀剪开一道小口，小心地取出十二指肠并按照10μmol/kg注入样品(GLP-1类似物SEQ ID NO：194-209)或生理盐水，最后缝合伤口。15min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在给糖后15min，30min和60min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。
AUC mg×h/dL)＝(BG0+BG15)×15/60+(BG15+BG30)×15/60+(BG30+BG60)×30/60，其中BG0、BG15、BG30和BG60分别表示给予葡萄糖负荷后0min、15min、30min和60min的血糖。
结果：十二指肠给予含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT9(SEQ ID NO：9)、BT45(SEQ IDNO：45)和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：200)，其中，D-GLP-1-BT9(SEQ ID NO：200)可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的15、30、60min血糖值和AUC值。和Nor组相比，BT1-D-GLP-1(SEQ ID NO：194)可以使得小鼠60min的血糖值下降23.2％，但该时间点的血糖值本身未通过统计学检验。给予BT9-D-GLP-1(SEQ ID NO：198)可以使得小鼠60min的血糖值和AUC值分别下降22.7％和20.1％，但该时间点的血糖值和AUC值也未通过统计学检验(图22A和表21)。结果表明，同时引入胰蛋白酶的抑制肽分子BT9和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段以提高GLP-1类似物的耐酶解稳定性而使其十二指肠给药能够发挥药效，且抑制肽分子BT9在GLP-1的C端直接与其相连时多肽的活性更强。十二指肠给予BT1-D-GLP-1和BT9-D-GLP-1在小鼠体内也显示了一定的降糖作用，而D-GLP-1-BT1(SEQ ID NO：196)可能由于空间结构改变较大影响了多肽的吸收而无活性。
十二指肠给予含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT9(SEQ ID NO：9)、BT45(SEQ ID NO：45)和抑酶NEP24.11的Opiorphin(QRFSR)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：199和SEQ ID NO：201)不能改善正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖水平。
十二指肠给予含有糜蛋白酶的抑制肽分子CH4(SEQ ID NO：84)、CH10(SEQ ID NO：90)和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NOs：202-205)，其中，CH4-D-GLP-1(SEQ ID NO：202)可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的30min血糖值和AUC值，其30min血糖值和AUC值分别降低32.3％和23.6％；CH10-D-GLP-1(SEQ ID NO：204)可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的15min血糖值和AUC值，其15min血糖值和AUC值分别降低20.4％和15.8％。D-GLP-1-CH10(SEQ ID NO：205)也可以显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的15min血糖值，血糖下降百分数为24.8％(图22B和表21)。结果表明，糜蛋白酶的抑制肽分子CH4、CH10和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的引入可以增强GLP-1类似物的稳定性而使其十二指肠给药能够被有效地吸收进入血循环而发挥药效。
十二指肠给药含有弹性蛋白酶的抑制肽分子EC1(SEQ ID NO：134)、EC12(SEQ IDNO：145)和抑制DPP-IV的diprotin A(IPI)肽段的GLP-1类似物(SEQ ID NOs：206-209)，结果表明四个GLP-1类似物均不能降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖值和AUC值，说明结构改造后这些GLP-1类似物耐受弹性蛋白酶酶解的稳定性增强，但该分子骨架肽难以抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的降解。但与Nor组相比，EC12-D-GLP-1(SEQ ID NO：208)在15、30和60min的血糖下降百分数分别为11.9％、19.9％和17.4％(图22C和表21)，具有一定的降血糖疗效，但没有统计学意义。
表21.GLP-1类似物十二指肠给药的降血糖活性
Figure BSA0000226789550001061
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
表21.GLP-1类似物十二指肠给药的降血糖活性(续表)
Figure BSA0000226789550001062
Figure BSA0000226789550001071
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
表21.GLP-1类似物十二指肠给药的降血糖活性(续表)
Figure BSA0000226789550001072
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
GLP-1类似物组合物经十二指肠给药的量效关系：
小肠内由胰腺分泌的蛋白酶主要有胰蛋白酶(占总蛋白的19％)、糜蛋白酶(占总蛋白的9％)和弹性蛋白酶[Whitcomb DC，Lowe ME.Human pancreatic digestiveenzymes.Dig Dis Sci.2007，52，1-17.]，为检测含有不同丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架的GLP-1类似物是否有组合效应，选取十二指肠单剂量(10μmol/kg)给药有效的GLP-1类似物D-GLP1-BT9(SEQ ID NO：200)和CH10-D-GLP-1(SEQ ID NO：204)进行了了量效关系实验，结果表明D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1的2.5或5.0μmol/kg给药剂量则无降血糖活性；然后分别使用单次给药无效剂量(5μmol/kg)的D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1组合物以及D-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1和EC12-D-GLP-1(SEQ ID NO：208)组合物进行十二指肠给药实验，结果是D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1组合物的5.0μmol/kg剂量在15分钟具有显著的降血糖作用(p＝0.0319)；虽然D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1组合物在30和60min依然保持一定的降血糖活性，但没有通过统计学意义。但最让人惊讶的发现是三个5.0μmol/kg剂量的D-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1和EC12-D-GLP-1组合物却显著地降低ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的15(p＝0.0035)、30(p＝0.0087)和60min(p＝0.0083)的血糖值和AUC值(p＝0.0069)(图23和表22)。结果说明含有不同丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物具有组合效应，也提示了多肽/蛋白的十二指肠口服给药需要多重的丝氨酸蛋白酶抑制剂，才可以抑制多肽/蛋白的降解，进而促进多肽/蛋白在小肠上皮的有效吸收。
表22.GLP-1类似物十二指肠给药的降血糖活性
Figure BSA0000226789550001081
****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 v.s.Nor.
GLP-1类似物靶向十二指肠口服给药的降血糖作用：
肠溶胶囊的制备：按照摩尔比5∶1～10∶1称取γ-环糊精和实验样品肽，用超纯水溶解并用磁力搅拌溶解3-6h，冷冻干燥；然后使用漏斗装药器装填M型号的硬胶囊(MCapsules，Torpac，USA)；再使用浸涂的方法进行肠溶包衣的包被。
实验前一天，动物禁食15-16h，自由饮水。实验当天，动物按照体重随机分组，每组10-15只，包被的肠溶胶囊使用喂药器进行给药，分别给予含辅料剂的空胶囊(Con)、GLP-1(7-37)、D-GLP1-BT9(SEQ ID NO：200)、CH10-D-GLP-1(SEQ ID NO：204)、含有D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1的组合物、含有D-GLP1-BT9、CH10-D-GLP-1和EC12-D-GLP-1(SEQ ID NO：208)的组合物，单个多肽药物的剂量均为20μmol/kg，两个多肽组合物的剂量分别为10、20、30μmol/kg(其中单个多肽比例为1∶1)，三个多肽组合物的剂量分别为15、30、45μmol/kg(其中单个多肽比例为1∶1∶1)。给药15min后灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，在给糖后15min，30min、60min、90min和120min分别尾尖采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖，计算各时刻血糖值及血糖曲线下面积(AUC)。
AUC mg×h/dL)＝(BG0+BG15)×7.5/60+(BG15+BG30)×15/60+(BG30+BG60)×30/60+(BG60+BG90)×30/60+(BG90+BG120)×30/60，其中BG0、BG30、BG45、BG60、BG90和BG120分别表示给予葡萄糖负荷后0min、15min、30min、60min、90min和120min的血糖。
结果：无论是单个多肽药物，还是组合物均显著地降低ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的15min、30min、60min和90min的血糖值和AUC值(表23)。其中PEG修饰的D-GLP1-BT9和CH10-D-GLP-1组合给药同样显示出较好的降血糖活性。
实施例9.丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架提高靶向PCSK9抑制肽的体内活性
基于含有丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物的体内活性研究，为进一步研究这些多肽分子骨架是否可广泛地用于提高其它治疗性多肽的疗效，以具有抑制PCSK9-LDLR蛋白-蛋白相互作用的PCSK9_1(SEQ ID NO：210)为研究目标设计合成一系列靶向PCSK9-LDLR相互作用的多肽(表24)。
体外抑制活性：
多肽PCSK9_1-14(SEQ ID NOs：210-223)用纯水或DMSO溶解。85μL ReactionBuffer、5μL 1mM多肽样品和10μL 750ng/mL PCSK9蛋白室温预孵育20min后再加入96孔板中，按照PCSK9-LDLR in vitro Binding Assay Kit(CY-8150)试剂盒(MBL公司，中国北京)说明书测定OD450/540nm的值。溶剂对照：将多肽替换成5μL溶剂。100μL反应体系中，多肽的终浓度为50μM，PCSK9的终浓度为75ng/mL。
多肽的抑制率(％)＝(OD450/540nm(溶剂对照)-OD450/540nm(样品))/OD450/540nm(溶剂对照)*100
结果：在终浓度为50μM时，含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT9多肽PCSK9_2、PCSK9_3、PCSK9_5、PCSK9_6、PCSK9_7、PCSK9_8和含有胰蛋白酶的抑制肽分子BT45的PCSK9_9相对于文献报道的样品PCSK9_1具有较好抑制PCSK9-LDLR相互作用的活性(表25)。结果说明胰蛋白酶的抑制肽分子(BT9和BT45)可以提高多肽Pep2-8(PCSK9_1)抑制PCSk9-LDLR相互作用的2-3倍；尤其是PCSK9_9多肽分子中插入胰蛋白酶的抑制肽分子与糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制肽分子具有很高的相似性，预示着糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制肽分子同样可以提高Pep2-8(PCSK9_1)抑制PCSK9-LDLR相互作用的活性。
表24.Pep2-8及其类似物的氨基酸序列
Figure BSA0000226789550001101
Figure BSA0000226789550001111
a：表中，抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架分别命名为BT、CH和EC，用虚线、双直线和斜体标示。另外，多肽序列中的这三个骨架的分子内两个半胱氨酸之间均形成了二硫键。
表25.Pep2-8类似物对PCSK9-LDLR相互作用的抑制活性
Figure BSA0000226789550001112
体内降血脂活性：
模型制备和验证：正常ICR小鼠禁食过夜，自由饮水，次日腹腔注射泊洛沙姆407(P407，500mg/kg)，24h后血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显升高。临床药物瑞百安(Repatha)皮下注射40mg/kg剂量24h后，再腹腔注射P407，并在注射P407后24h测定血清TC和LDL-C水平(表26)。结论：腹腔注射P407可明显诱导ICR小鼠形成高TC和LDL-C模型，皮下注射瑞百安(40mg/kg)可显著降低小鼠血清TC和LDL-C水平。
表26.上市药物瑞百安对P407诱导的高血脂小鼠血清TC和LDL-C水平的影响
Figure BSA0000226789550001121
***p＜0.001，**p＜0.01 vs Con.
皮下注射PCSK9抑制肽的降脂作用：
实验多肽样品使用PEG400配制，PCSK9样品皮下注射的终浓度为2μmol/kg，PEG400的终浓度为20％(w/v)。对照组为含PEG400的生理盐水。正常ICR小鼠禁食过夜，自由饮水，次日所有小鼠按照体重随机分组，分别为模型对照组(Con)和给药组，各给药组剂量均为2μmol/kg。接着各组小鼠腹腔注射P407(500mg/kg)，2h后添加饲料喂养小鼠。取6只小鼠，未注射P407，作为正常对照组(Nor)。24h后，模型组小鼠皮下注射给予PEG400-生理盐水，给药组小鼠给予各个多肽，然后于给药后30min取血，测定血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
结果表明，与Nor组相比，Con组小鼠血清TC和LDL水平均明显升高，提示高脂模型形成。与Con组相比，PCSK9_2单次皮下注射具有降低小鼠血清TC和LDL水平的趋势；PCSK9_7单次皮下注射可显著降低小鼠血清LDL水平，但对血清TC水平无影响；PCSK9_9单次皮下注射可显著降低小鼠血清TC和LDL水平(表27)。
表27.皮下注射PCSK9抑制肽对P407诱导的高血脂小鼠血清TC和LDL-C水平的影响
Figure BSA0000226789550001122
Figure BSA0000226789550001131
***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 vs Con.
PCSK9抑制肽靶向十二指肠给药的降脂作用：
肠溶胶囊的制备：按照摩尔比5∶1～10∶1称取γ-环糊精和实验样品肽，用超纯水溶解并用磁力搅拌溶解3-6h，冷冻干燥；然后使用漏斗装药器装填M型号的硬胶囊(MCapsules)；最后使用浸涂法进行肠溶包衣的包被。正常ICR小鼠禁食过夜，次日所有小鼠按照体重随机分为6组，分别为模型对照组(Con)、PCSK9_1、PCSK9_9、PCSK9_9CH、PCSK9_9EC和含有三个丝氨酸蛋白酶的抑制肽骨架的组合物PCSK9_9C*，单体多肽药物的剂量均为20μmol/kg，组合物设3个剂量即15、30、45μmol/kg。各组小鼠腹腔注射P407(500mg/kg)，2h后添加饲料喂养小鼠。取6只小鼠，未注射P407，作为正常对照组(Nor)。24h后，模型组小鼠使用不锈钢喂药器给药，然后于给药后1.5h、2h、2.5h、3h取血，测定血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
结果：与Nor组相比，Con组小鼠血清TC和LDL水平均明显升高，提示高脂模型形成。与Con组相比，具有相同治疗性活性肽结构的单体多肽分子PCSK9_9、PCSK9_9CH和PCSK9_9EC口服灌胃给药，具有降低小鼠血清TC和LDL水平的作用；PCSK9_9C*口服灌胃给药可显著降低小鼠血清TC和LDL水平(表28)。
PCSK9抑制肽对胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的稳定性分析
参照实施例5中的实验方法，对具有口服给药活性的PCSK9抑制肽进行体外的耐受胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的稳定性分析。
结果：PCSK9_1对糜蛋白酶和弹性蛋白酶不稳定，而对胰蛋白酶非常稳定，原因是分子内不含有碱性氨基酸；PCSK9_9、PCSK9_9CH和PCSK_9EC分别耐受抑制肽分子骨架所对应的蛋白酶降解，同时也对另外的两个蛋白酶有一定的抑制作用(表29)。
实施例10.丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架促进蛙鱼降钙素类似物口服吸收的体内活性
鲑鱼降钙素是治疗老年性骨质疏松和骨关节炎的一种多肽药物，效果是比较确切的。临床用药剂型是注射液和鼻喷雾剂，为确认丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架是否可提高鲑鱼降钙素口服给药的疗效，设计合成含有不同蛋白酶的抑制肽分子骨架的鲑鱼降钙素类似物(表30)。
表30.鲑鱼降钙素类似物的氨基酸序列.
Figure BSA0000226789550001141
a：表中，抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架分别命名为BT、CH和EC，用虚线、双直线和斜体标示。另外，多肽序列中的这三个骨架的分子内两个半关氨酸之间均形成了二硫键。
蛙鱼降钙素类似物对胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的稳定性分析
参照实施例5中的实验方法对具有口服给药活性的蛙鱼降钙素类似物进行体外的耐受胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶酶解的稳定性
结果：鲑鱼降钙素对胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶不稳定，作用30min后绝大部分被降解；Cal-BT、Cal-CH和Cal-EC分别耐受抑制肽分子骨架所对应的蛋白酶降解，同时也对另外的两个蛋白酶有一定的抑制作用(表31)。
鲑鱼降钙素类似物口服给药的降血钙作用：
肠溶胶囊的制备：按照摩尔比5∶1～10∶1称取γ-环糊精和实验样品肽，用超纯水溶解并用磁力搅拌溶解3-6h，冷冻干燥；然后使用漏斗装药器装填M型号的硬胶囊(MCapsules，Torpac，USA)；最后用浸涂法进行肠溶包衣的包被。
实验方法：取同一性别的35只健康SD大鼠，体重200±25g，实验前禁食8-12h，自由饮用蒸馏水，大鼠随机分为6组(每组5只)，分别给予降钙素、降钙素类似物、降钙素类似物的组合物和辅料剂对照，口服剂量为1-50μmol/kg；同时皮下注射0.05-0.5μmol/kg的降钙素，对照组注射生理盐水溶液。
分别于预定的时间点由大鼠尾静脉取血：0、1、2、4、6、8、10、12、24h，每次取血0.3mL。血样于30min内以4,000rpm离心，分离取出血清，用邻甲酚酞络合酮法(OCPC)进行血清钙离子浓度测定。
以0h的血清钙离子浓度为基准，其他时间的血钙浓度换算为0h血钙浓度的百分比值，以时间为X轴，血钙浓度百分比(％)为Y轴，描绘降钙素体内药效试验的血钙曲线。
结果：空白组各时间点的血钙水平都没有显著性差别，鲑鱼降钙素口服给药呈可忽略的降血钙作用；而含有丝氨酸蛋白酶抑制肽分子骨架的降钙素类似物经口服给药后3h血钙明显下降，4h后达最低值，持续作用时间至少达8-12h。给药1h后，大鼠血钙达最低值，但回升较快，6h时即恢复正常水平，对降钙素微粒组和空白微粒组大鼠给药后的血药浓度进行组间的配对比较，表明大鼠口服降钙素类似物微粒后有极明显的降低血钙作用(表32)。
鲑鱼降钙素类似物口服给药的药效：
血清中I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)和II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)的水平是定量评价骨关节破坏的生物标志物。
肠溶胶囊的制备：按照摩尔比5∶1～10∶1称取γ-环糊精和实验样品肽，用超纯水溶解并用磁力搅拌溶解3-6h，冷冻干燥；然后使用漏斗装药器装填M型号的硬胶囊(MCapsules，Torpac，USA)；最后用浸涂法进行肠溶包衣的包被。
实验方法：取同一性别的50只健康SD大鼠，体重200±25g；将0.05mL木瓜蛋白酶溶液注射至右侧和左侧大鼠的膝关节腔，注射后24-48h和3d后各重复注射1次，共注射3次。实验前禁食8-12h，自由饮用蒸馏水，造模后的大鼠随机分为9组(每组5只)，分别给予降钙素、降钙素类似物、降钙素类似物的组合物和辅料剂对照，口服剂量为剂量为5-25μmol/kg。分别于预定的时间点由大鼠尾静脉取血：0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12h，每次取血0.05mL。采用大鼠I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)和II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)酶联检测试剂盒检测血清中CTX-I和CTX-II水平。
结果：鲑鱼降钙素直接口服给药无效；而含有丝氨酸蛋白酶抑制肽分子骨架的降钙素类似物经口服给药对骨关节炎的两个生物标志物，即对骨吸收和软骨降解二者之减少展示很好的疗效(表33)。
实施例11.丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架提高靶向白介素-17A(IL-17A)抑制肽的体内活性
基于含有丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子的GLP-1类似物的体内活性研究，为进一步研究这些多肽分子骨架是否可广泛地用于提高其它治疗性多肽的疗效，以具有抑制白介素-17A(IL-17A)作用的17A(SEQ ID NO：238)为研究目标设计合成一系列靶向IL-17A的抑制肽(表34)。
表34.IL-17A抑制肽的氨基酸序列
Figure BSA0000226789550001161
a：表中，抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架分别命名为BT、CH和EC，用虚线、双直线和斜体标示。另外，多肽序列中的抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的骨架的分子内两个半胱氨酸之间均形成了二硫键。
IL-17A抑制肽对胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的稳定性分析：
参照实施例5中的实验方法对17A及其类似物进行体外的耐受胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的稳定性分析。
结果：17A对糜蛋白酶和弹性蛋白酶不稳定，而对胰蛋白酶非常稳定，原因是分子内不含有碱性氨基酸；17A-BT、17A-CH和17A-EC分别耐受抑制肽分子骨架所对应的蛋白酶降解，同时也对另外的两个蛋白酶有一定的抑制作用(表35)。
IL-17A抑制肽的抗炎活性：
IL-17A是许多慢性炎症反应的炎症因子，为快速评价分析其抗炎效应，先采用小鼠耳肿胀模型进行抗炎活性的初步筛选。实验过程如下：昆明雄性小鼠(18-20g)每组10只，苦味酸标记。各组小鼠均于右耳正反两面涂抹巴豆油，正反两面各10μL。造模后立刻皮下注射阳性药苏金组(5mg/kg)、17A、17A-BT、17A-CH和17A-EC抑制肽(30mg/kg)；模型对照组(Con)注射相应体积的生理盐水。致炎4小时后，将各组小鼠颈椎脱臼处死，然后用打孔器在左右耳相对称部位打下耳片，用天平称重，记录其质量，计算肿胀度和肿胀率：
肿胀率＝((右耳质量-左耳质量)/左耳质量)*100％
结果：靶向IL-17A抑制肽17A-BT和17A-CH在皮下注射给药30mg/kg剂量能较显著抑制巴豆油引起的耳肿炎症反应，17A和17A-EC没有抑制作用，说明含有丝氨酸蛋白酶的抑制肽分子骨架能很好地提高IL-17A抑制肽血循环中的稳定性，进而提高其体内疗效(表36)。
表36.IL-17A抑制肽对小鼠耳肿炎症反应的抑制活性
Figure BSA0000226789550001171
Figure BSA0000226789550001181
***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 vs Con.
IL-17A抑制肽的抗类风湿关节炎活性：
胶原诱发性关节炎(CIA)是广泛接受的人类类风湿性关节炎的小鼠模型。将抗IL-17A抑制肽给予表现CIA的小鼠，以评价抗IL-17A疗法治疗类风湿性关节炎的的能力。
小鼠适应性饲养一周后，随机分为5组，每组7只。正常对照组小鼠常规饲养，无处理。其余各组小鼠从尾根部注射100μL用弗氏佐剂乳化的牛II型胶原；注射21天后进行第二次冲击免疫，注射部位在尾根部2cm处，注射方法同上。小鼠分为正常对照组(Normal组)、CIA模型组(Control组)、阳性药组(Positive组)、IL-17A抑制肽17A-BT和17A-CH组合物组及IL-17A抑制肽17A-BT、17A-CH和17A-EC组合物组。每天一次，连续给药28天。给药方法：正常对照组及CIA模型组，每组小鼠用喂药器灌胃给予含辅料剂的胶囊。阳性药以及各给药组，按要求在第2次免疫处理后次日(22天)开始连续给药28天。
检测指标：
(1)体重测量：自初次免疫开始，每周测定各组小鼠的体重，共计7周。
(2)关节炎症指数评分：初次免疫后21天并进行二次冲击免疫后，每周一次观察各组小鼠的关节肿胀程度并进行关节肿胀指数评分。评分标准为：0分(无红肿)，1分(小趾关节轻度红肿)，2分(趾关节和足趾肿胀)，3分(踝关节以下足爪肿胀)，4分(包括全踝关节在内的全足关节肿胀)。对每只小鼠的四肢分别观察，记录其累积分数。
(3)足爪CT：实验结束时，以戊巴比妥麻醉小鼠，通过小动物三维光学活体成像技术及X光电脑断层扫描仪(IVIS spectrum，P.E.USA)，观测四肢足爪的骨质变化情况，是否有骨质溶解、骨质密度变化等现象发生。
(4)病理学检查关节组织：在二次加强免疫后第28天，颈部脱臼处死动物。分别选取各组小鼠关节，10％福尔马林固定和脱钙处理，石蜡包埋，常规切片，HE染色，加封玻片保存。观察骨关节周围软组织、滑膜、软骨组织及骨和骨髓的变化。进行组织学评分，评分参数包括组织肿胀，炎性细胞浸润，滑膜组织增生和组织坏死。评分标准为：0分(正常)，1分(轻度病变)，2分(中度病变)，3分(重度病变)。关节炎症指数评分、步态评分及组织学评分均由不知道本研究方案的实验员完成。
(5)血清细胞因子检测：实验结束后，提取各组小鼠血清，ELISA试剂盒检测细胞因子在血清中的含量。
结果：CIA小鼠体重较正常对照组体重降低，而给药治疗组体重略有降低，无显著性统计学差异；用IL-17A抑制肽治疗的CIA小鼠显示关节炎评分降低，关节肿胀，软骨表面破裂，关节腔结缔组织增生较少。CII免疫诱导血清中IL-1β、IL-17A、IL-6、TNF-α和anti-CCP抗体显著升高；而经IL-17A抑制肽治疗的CIA小鼠血清IL-1β、IL-17A、IL-6、TNF-α和anti-CCP呈剂量依赖性的降低(表37)。
IL-17A抑制肽的抗溃疡性结肠炎活性：
C57小鼠，随机分为5组，每组7只。正常对照组小鼠常规饲养，无处理。右旋糖酐硫酸钠(DSS)结肠炎模型小鼠按照标准程序进行，在雄性C57BL/6小鼠的饮用水中注射1.5-3％的DSS，持续5-7天(急性方案)，然后循环使用常规水和DSS水(慢性方案)。小鼠分为正常对照组(Normal组)、UC模型组(Control组)、阳性药组(Positive组)、IL-17A抑制肽17A-BT和17A-CH组合物组及IL-17A抑制肽17A-BT、17A-CH和17A-EC组合物组。每天一次，连续给药7天。给药方法：正常对照组及UC模型组，每组小鼠用喂药器灌胃给予含辅料剂的胶囊。阳性药以及各给药组开始连续给药7天。检测指标：处死小数后，取结肠测量长度，同时评价疾病活动指数(DAI)。取部分结肠10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，加封玻片保存。观察并进行组织学评分。同时，收集各组小鼠血清，ELISA试剂盒检测细胞因子在血清中的含量。
结果：DSS诱导的UC小鼠体重较正常对照组体重降低，而IL-17A抑制肽给药治疗能逆转体重的降低；IL-17A抑制肽能有效减轻DSS引起的出血评分和大便评分的增加；IL-17A抑制肽治疗能降低IL-17、IFN-γ、IL-6、IL-1β和TNF-α的血清中的水平；而IL-12、IL-23和(TGF)-β血清中的水平显著性降低(表38)。
实施例12.浸涂法包被肠溶胶囊
在胶囊(size M，Torpac)中填满溴酚蓝粉末作为肠溶衣包被的示踪剂，将2/3的胶囊表面在包衣材料Eudragit L100-55混合物(Eudragit L100-55/0.9g，PEG 400/0.14g，吐温80/0.01g，丙酮/3.8mL，异丙醇/5.7mL，水/0.5mL)中浸润15s，干燥30min。再颠倒过来，将剩余的1/3的胶囊表面同法操作，重复浸涂3次，于通风橱中室温干燥72h。然后把包被肠溶衣的胶囊浸润在pH 1.6的模拟胃液(gastric fluid)中2小时，或者浸润在pH 6.5的模拟肠液(intestinal fluid)中1小时，随着浸润时间延长监测胶囊崩解释放溴酚蓝的量，即测定422nM的光吸收，确定胶囊包封的效果。结果表明胶囊包衣的厚度0.16±0.05nm；胶囊孵育模拟胃液2小时后释放溴酚蓝为2.8～6.5％(92～97％保持完整)，胶囊孵育模拟肠液1小时后释放溴酚蓝为44-51.3％。
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Claims (34)

1.包含如通式I或II所示结构的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐：
Cys6-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1′-Xaa2′-Xaa3′-Xaa4′-Xaa5′-Cys6′-Xaa7′(I)；
Xaa4-Cys3-Xaa2-Xaa1-Xaa1′-Xaa2′-Xaa3′-Xaa4′-Xaa5′-Cys6′-Xaa7′-Xaa8′(II)；
其中，Cys3、Cys6或Cys6′各自独立地选自半胱氨酸或高半胱氨酸；所述多肽通过Cys6和Cys6′或者Cys3和Cys6′之间的一个二硫键环化；
其中，当Xaa1选自Lys或Arg时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro、Hyp或Gly；
Xaa4选自Arg、Lys、Ser、Ala或Thr；
Xaa5选自Gly、Pro、Ala、Hyp、Val、Leu、Ile、Abu、Ser、Arg、Lys、Glu、Qln或Nle；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Leu、Nle、Arg、Phe、Tyr、Asn、Val、Met、Thr、His、Lys、Ser、Ala或Met；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala或Hyp；
Xaa5′选自Ile、Leu、Ala、Gln、Met、Phe、Asp、Glu、His、Tyr、Ser、Thr、Val、Asn、Lys、Arg或Gly；
Xaa7′选自Phe、Tyr、Asn、Ala、Trp、His、Gln、Ser或Hyp；
Xaa8′不存在；
当Xaa1选自Tyr或Phe时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ser、Ala、Phe、Thr、Lys、Tyr、Leu、Ile、Val、Met或Arg；
Xaa5选自Gly、Pro、Hyp或Ala；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Asn、His、Asp、Tyr、Trp或Glu；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala、Gly或Hyp；
Xaa5′选自Ile、Leu、Gln、Met、Arg、Phe、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Ala、Ser、Thr、Val、Asp、Asn、Glu或Gly；
Xaa7′选自Tyr、Phe、Asn、Val、Arg、Ile、Gln、Ser或His；
Xaa8′选自Gly、Ala或不存在；
当Xaa1选自Ala或Leu时；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ile、Leu、Val、Ala或Tyr；
Xaa5选自Gly、Pro、Hyp或Ala；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Asn、Tyr或Ala；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Hyp或Ala；
Xaa5′选自Ile、Gln；
Xaa7′选自Gln、Tyr、Arg、His或Asn；
Xaa8′不存在；
其中所述的多肽不包括序列为SEQ ID NO：1的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
其中，Xaa1选自Lys或Arg；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Tyr、Gly、Nle、Ser、Thr或Gln；
Xaa4选自Arg、Lys、Ser、Ala或Thr；
Xaa5选自Ala、Gly或Pro；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile、Leu、Nle或Ala；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro或Ala；
Xaa5′选自Ile、Ala或Gln；
Xaa7′选自Phe或Tyr；
Xaa8′不存在。
3.根据权利要求1或2所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的多肽：
SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69和SEQID NO：70。
4.根据权利要求1所述的的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
其中，Xaa1选自Tyr或Phe；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala或Abu；
Xaa4选自Ser、Ala、Phe或Thr；
Xaa5选自Ala、Gly或Pro；
Xaa1′选自Ser；
Xaa2′选自Ile、Ala或Asn；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro、Ala或Hyp；
Xaa5′选自Ile或Gln；
Xaa7′选自Tyr、Phe、Asn、Gln或His；
Xaa8′选自Gly或不存在。
5.根据权利要求1或4所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的多肽：
SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：105、SEQ IDNO：106、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133。
6.根据权利要求1所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
其中，Xaa1选自Ala或Leu；
Xaa2选自Thr或Ala；
Xaa3选自Ala、Abu、Gly、Tyr、Nle、Ser、Gln、Leu、Ile、Val、Phe、Asn、His、Trp、Glu、Pro或Arg；
Xaa4选自Ile、Leu、Val、Ala或Tyr；
Xaa5选自Gly、Pro、Ala或Hyp；
Xaa1′选自Ser或Ala；
Xaa2′选自Ile或Asn；
Xaa3′选自Pro或Hyp；
Xaa4′选自Pro或Hyp；
Xaa5′选自Ile或Gln；
Xaa7′选自Gln或Tyr；
Xaa8′不存在。
7.根据权利要求1或6所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的多肽：SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：145、SEQID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：162。
8.根据权利要求1-7任一项所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述N-端、C-端或侧链被修饰的类似物为通式I或II所示结构的多肽被聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化或酰基化修饰的类似物。
9.权利要求1-8中任一项所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，在制备丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶的抑制剂中的应用。
10.权利要求1-8中任一项所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐可以与生物活性寡肽形成具有通式III、IV或V所示结构的杂交肽，
B-L-A(III)；
A-L-B(IV)；
A1-L1-B-L2-A2(V)；
其中，
杂交肽的分子量范围是1.5-30kDa；
B是权利要求1-8中任一项所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐；
L是接头，其任选地含有1、2、3、4或5个甘氨酸或脯氨酸残基；
A是生物活性寡肽，可选自可治疗疾病的蛋白质、多肽和糖蛋白；
A1、A2分别是生物活性寡肽的N-端和C-端的肽段；
L1、L2是接头，其任选地含有1、2、3、4或5个甘氨酸或脯氨酸残基或者不存在。
11.根据权利要求10所述的杂交肽，其特征在于，所述生物活性寡肽选自胰高血糖素样肽-1、其类似物或其肽段。
12.根据权利要求10或11所述的杂交肽，其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的肽：SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ IDNO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209。
13.权利要求11或12的杂交肽在制备治疗II型糖尿病和/或肥胖症的药物中的应用。
14.根据权利要求10所述的杂交肽，其特征在于，所述生物活性寡肽选自序列为SEQ IDNO：210的肽及其突变体。
15.根据权利要求10或14所述的杂交肽，其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的肽：SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：224、SEQ IDNO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：232和SEQ ID NO：233。
16.权利要求14或15的杂交肽在制备治疗家族性高胆固醇血症的药物中的应用。
17.根据权利要求10所述的杂交肽，其特征在于，所述生物活性寡肽选自鲑鱼降钙素、其类似物或其突变体，所述鲑鱼降钙素具有SEQ ID NO：234所示序列。
18.根据权利要求10或17所述的杂交肽，其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的肽：SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：237。
19.权利要求17或18的杂交肽在制备治疗骨质疏松症和/或骨关节炎的药物中的应用。
20.根据权利要求10所述的杂交肽，其特征在于，所述生物活性寡肽选自序列为SEQ IDNO：238的肽、其类似物或其突变体。
21.根据权利要求10或20所述的杂交肽，其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其选自具有以下序列的肽：SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240和SEQ ID NO：241。
22.权利要求20或21的杂交肽在制备治疗炎症性肺病、哮喘、慢性阻塞性肺病、炎症性肠病、关节炎、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、银屑病、系统性硬化症的药物中的应用。
23.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-8中任一项所述的多肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐，和/或一种或多种权利要求10、11、12、14、15、17、18、20、21中任一项所述的杂交肽、其N-端、C-端或侧链被修饰的类似物或其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，包括1、2或3个以下杂交肽的组合：一条杂交肽选自SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ IDNO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200或SEQ ID NO：201，优选SEQ ID NO：200；另一条杂交肽选自SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204或SEQ ID NO：205，优选SEQ IDNO：204；再一条杂交肽选自SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208或SEQ ID NO：209，优选SEQ ID NO：208。
25.权利要求24的组合物在制备治疗II型糖尿病和/或肥胖症药物中的应用。
26.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，包括1、2或3个以下杂交肽的组合：一条杂交肽选自SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：216或SEQ ID NO：218；另一条杂交肽选自SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：230或SEQ ID NO：232；再一条杂交肽选自SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：231或SEQ ID NO：233。
27.权利要求26的组合物在制备治疗家族性高胆固醇血症的药物中的应用。
28.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，其包含SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236或SEQ ID NO：237。
29.权利要求28的组合物在制备治疗骨质疏松症和/或骨关节炎的药物中的应用。
30.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，其包含SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240或SEQ ID NO：241。
31.权利要求30的组合物在制备治疗炎症性肺病、哮喘、慢性阻塞性肺病、炎症性肠病、关节炎、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、银屑病、系统性硬化症的药物中的应用。
32.根据权利要求23、24、26、28、30中任一项所述的组合物，其进一步含有药学上可接受的药物载体、分散剂、赋性剂和/或吸收促进剂。
33.根据权利要求23、24、26、28、30中任一项所述的组合物，其中所述组合物适用于注射给药和/或口服给药。
34.根据权利要求23、24、26、28、30中任一项所述的组合物，其中所述组合物制成肠溶胶囊、微囊或微粒。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115331728A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 杭州力文所生物科技有限公司 一种稳定折叠的富含二硫键的多肽设计方法及其电子设备

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217690B2 (en) * 2003-10-07 2007-05-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Compositions of sunflower trypsin inhibitors
CN105111280B (zh) * 2005-02-17 2020-01-24 波利弗尔有限公司 具有蛋白酶抑制活性的模板固定的β-发夹肽模拟物
HUP0900319A2 (en) * 2009-05-25 2011-01-28 Eotvos Lorand Tudomanyegyetem New peptides, method of producing therof and use thereof
CN102690352A (zh) * 2011-03-21 2012-09-26 天津拓飞生物科技有限公司 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途
TR201905612T4 (tr) * 2012-12-05 2019-05-21 Univ Heidelberg Ruprecht Karls Proteinlerin ve çok değerlikli, hücreye nüfuz eden peptitlerin konjugatları ve bunların kullanımları.
WO2020037173A1 (en) * 2018-08-17 2020-02-20 New Jersey Institute Of Technology Self-assembling multi-domain peptide based hydrogels

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115331728A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 杭州力文所生物科技有限公司 一种稳定折叠的富含二硫键的多肽设计方法及其电子设备

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