JPH10310600A - 新規生理活性ペプチド及びその用途 - Google Patents
新規生理活性ペプチド及びその用途Info
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- JPH10310600A JPH10310600A JP10131506A JP13150698A JPH10310600A JP H10310600 A JPH10310600 A JP H10310600A JP 10131506 A JP10131506 A JP 10131506A JP 13150698 A JP13150698 A JP 13150698A JP H10310600 A JPH10310600 A JP H10310600A
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Abstract
Gln-Gly-Ser-Gly-を示す)で表わされる生理活性ペプチ
ド又はその塩、及びこれを含有する循環器系疾患治療
剤。 【効果】 優れた平滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及
びナトリウム利尿作用、血圧降下作用を有し、かつヒト
由来であるため安全性が高く、心臓性浮腫、腎臓性浮
腫、肝性浮腫、肺浮腫、高血圧症、うっ血性心不全、急
性及び慢性腎不全等の治療薬として有用である。
Description
チド及びその用途に関し、更に詳細には、ヒト型脳性ナ
トリウム利尿ペプチド及びこれを含有する高血圧症、浮
腫性疾患、心不全、腎不全等の循環器系疾患治療剤に関
する。
決定され、その構造及び生理活性作用が心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド(以下ANPと略す)とよく似ていること
から、脳性ナトリウム利尿ペプチド(Brain Natriureti
c Peptide;以下BNPと略す)と命名された〔須藤ら,Na
ture,332,78-80(1988)〕。BNPは生体の体液容量、電
解質バランス及び血圧の調節に関与しており、これによ
り生体ではANPとBNPによる2重の調節機構が存在するこ
とが示された。
され、ブタBNPの前駆体の構造が明らかにされている
〔前川ら;Biochem. Biophys. Res. Commun., 157(1),
410-416(1988)〕。更にこのブタBNPのcDNAをプローブと
してヒトBNPのcDNAがクローニングされ、その構造解析
によりヒトBNPのアミノ酸配列が推定されている。
Pが単離もしくは合成された報告はなく、どのような作
用あるいは活性を有しているのか不明である。従ってこ
のヒトBNPを合成し、その生物活性を公知のナトリウム
利尿ペプチドと比較し、その有用性を探索することは、
医薬品開発上、抗体産生等の副作用を回避する意味で重
要である。
BNPのアミノ酸配列の推定に基づき、新規物質であるヒ
トBNP誘導体を合成し、その薬理作用についてさらに検
討を進めたところ、これらの物質が既知のナトリウム利
尿ペプチドが有する平滑筋弛緩作用、ナトリウム利尿作
用を有することを見出し、本発明を完成した。
r-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-を示す)で表わさ
れる生理活性ペプチド又はその塩、及びこれを含有する
循環器系疾患治療剤を提供するものである。
Gly-であるペプチド(1)をヒトBNP-26と称し、XがH-Ser
-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-であるペプチド(1)
をヒトBNP-32と称することがある。
称は、当該分野において一般に使用されるものであり、
次の意味を有する。
常用される固相法又は液相法〔例えば、泉屋信夫ら著
「ペプチド合成」1984年,丸善(株)発行;日本化学会
編「生化学実験講座(I)/タンパク質の化学」4巻,20
8〜495頁,1977年,東京化学同人発行等〕によって製造
することができる。
を合成する場合、使用するアミノ酸のα-アミノ基は9-
フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)、ア
スパラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基(tB
u基)、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6-
トリメチルベンゼンスルホニル基(Mtr基)、セリンの
水酸基はtert-ブチル基(tBu基)、システインのチオー
ル基はアセトアミドメチル基(Acm基)、ヒスチジンの
イミダゾール基はトリチル基(Trt基)、リジンのε-ア
ミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基(Boc基)で保
護することが好ましい。また、使用する不溶性樹脂は、
p-アルコキシベンジルアルコール樹脂(Wang Resin)が
好ましい。保護アミノ酸の縮合はジシクロヘキシルカル
ボジイミド(DCC)法、1,3-ジイソプロピルカルボジイ
ミド(DIC)による活性エステル法、DCCによる酸無水物
法、ジフェニルリン酸アジド法(DPPA)法等を用いるの
が好ましい。しかし、アミノ酸の保護基は上記のものに
限定されるものではなく、例えば使用するアミノ酸のα
-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基(Boc基)
で保護してもよい。
は、例えば以下のようにして行なわれる。まずC末端ア
ミノ酸であるHisの保護誘導体Fmoc-His(Trt)-OHをp-ア
ルコキシベンジルアルコール樹脂に導入し、以後対応す
る保護アミノ酸を順次結合させ、保護ペプチド樹脂を合
成する。次いで、ピペリジン及びトリフルオロ酢酸(TF
A)による処理、ピペリジン及びトリメチルシリルブロ
マイド(TMSBr)による処理〔Chem. Pharm. Bull., 35
(9), 3880(1987)〕等により、樹脂からのペプチドの切
断とAcm基以外の保護基の除去を同時に行ない、システ
インのチオール基にAcm基を有するペプチド〔CYS(Acm)-
ペプチド〕を得る。次にこれをヨウ素で酸化することに
より、チオールの保護基を脱離させると同時に、ペプチ
ド分子内の2つのシステインのチオール基によるジスル
フィド結合を形成させることにより、粗合成ペプチドを
得る。
例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等により行うこと
ができる。
酸、燐酸等の無機酸や蟻酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、
フマル酸、マレイン酸等の有機酸を用いて、常法に従っ
て酸付加塩とすることができる。
ては、ペプチド系医薬の投与に使用されている方法、す
なわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは舌下
投与、鼻内投与、直腸投与を採用することができる。ま
たこのペプチドを危険な又は有害な副作用を生じさせる
ことなく投与できる量は、0.5μg/kg〜100mg/kgの範囲
が好ましい。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
α-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基(Fmoc基)で保護し、活性な側鎖のうち、アス
パラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基(tBu
基)で、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6
-トリメチルベンゼンスルホニル基(Mtr基)で、セリン
の水酸基はtert-ブチル基(tBu基)で、システインのチ
オール基はアセトアミドメチル基(Acm基)で、ヒスチ
ジンのイミダゾール基はトリチル基(Trt基)で、リジ
ンのε-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基(BO
C基)で保護した。また、樹脂としては、保護Hisを導入
したp-アルコキシベンジルアルコール樹脂1.0gを用い
た。
結合している保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基で
あるFmoc基をピペリジンで室温下6分間処理することを
2回繰り返し、ほぼ完全に除去した。ついでこの脱Fmoc
化で遊離したアミノ基を目的のペプチドのアミノ酸配列
における次に位置するアミノ酸のFmoc保護誘導体のカル
ボキシル基と縮合した。この保護アミノ酸の縮合におい
ては、Fmoc-アミノ酸1mmolを1-ヒドロキシベンズトリ
アゾールの存在下、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド
(DIC)と処理することにより縮合した。この操作によ
って反応が完結してしない場合は、同じ操作を繰り返し
た。なお、反応の進行及び完結はニンヒドリンによるカ
イザーテストでモニターした。
Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Ar
g(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly
-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mt
r)-His(Trt)-樹脂を合成した。この段階でこのものを一
部取り出し、前述の方法に従って保護ペプチドの末端の
アミノ基の保護基であるFmoc基を除去し、H-Gly-Ser(tB
u)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp
(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser
(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mt
r)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂(以下、保護ヒトBNP-26樹
脂という)を670mg得た。
-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(tBu)-Gl
y-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-
Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg
(Mtr)-His(Trt)-樹脂を得た。次いで前述の方法に従っ
て保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基であるFmoc基
を除去し、H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-
Ser(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Me
t-Asp(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)
-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Ar
g(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂(以下保護ヒトBNP-32
樹脂という)を1.5g得た。
反応器中に入れ、トリフルオロ酢酸(TFA)20ml、トリ
メチルシリルブロマイド(TMSBr)2.6ml及びエタンジチ
オール2.4mlを加え、0℃で3時間反応させた。反応終
了後、エーテル200mlで洗ってアニソールを除去し、1
N酢酸20mlで生成物を抽出した。樹脂及び不溶物を遠心
分離でとりのぞき、氷冷しながら1Mフッ化ナトリウム
(NaF)1mlを加え、5%アンモニア水でユニバーサル
試験紙上pH約8に調整して30分放置した。その後、再び
1N酢酸を加えてpH5に再調整し、更に水で10倍に希釈
した。これを60mlのODS樹脂〔LC-Sorb(ケムコ製)〕を
充填したカラム(φ3cm×8.5cm)に吸着させ、0.1N酢
酸でよく洗浄した後、0.1%TFAを含む60%アセトニトリ
ル200mlで溶出した。アセトニトリルを減圧下留去後、
凍結乾燥して300mgの粗Cys(Acm)-ヒトBNP-26を得た。
分けて逆相HPLCにかけた〔カラム:ヌクレオシル120-5C
18,φ20mm×250mm,流速5ml/分,溶媒系:(A) 水:
アセトニトリル:10%TFA=90:10:1,(B) 水:アセ
トニトリル:10%TFA=40:60:1,(A):(B)=90:10
から(A):(B)=55:45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を9回繰り返し57〜61分のところに溶出
されるメインピークを分取した。この分画を、減圧下ア
セトニトリルを留去後、凍結乾燥を行ない、Cys(Acm)-
ヒトBNP-26を96.0mg得た。
加えたもの(以下A液という)を用意した。
75mgを2N水酸化ナトリウム10mlに溶かし、水を加えて
50mlとしたもの(以下B液という)を用意した。
5mlに溶かしたものをA液30mlに室温下撹拌しながら滴
下し、20分間さらに撹拌した。その後、B液をヨウ素の
かっ色が消えるまで滴下した。このものに水500mlを加
えて希釈し、30mlのODS樹脂〔LC-Sorb(ケムコ製)〕を
充填したカラム(φ2cm×9.5cm)に吸着させた。これ
を0.1N酢酸でよく洗浄した後、0.1%TFAを含む60%ア
セトニトリル60mlで溶出した。アセトニトリルを減圧留
去後、凍結乾燥し、粗ヒトBNP-26を60.0mg得た。このも
のを1N酢酸4mlに溶かし、4回に分けて逆相HPLCにか
けた〔カラム:ヌクレオシル120-5C18,φ20mm×250m
m,流速5ml/分,溶媒系;(A) 水:アセトニトリル:1
0%TFA=90:10:1,(B) 水:アセトニトリル:10%TF
A=40:60:1,(A):(B)=90:10から(A):(B)=55:4
5までの120分間の直線グラジエント〕。この操作を4回
繰り返し、62〜66分のメインピークを分取した。この分
画を、減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾燥して、
25mgのヒトBNP-26を得た。
ソールと共にTFA、TMSBr及びエタンジオールにより、樹
脂からの脱離、脱保護を行ない、さらに逆相HPLCによる
精製によりCys(Acm)-ヒトBNP-32を60.0mg得た。
ドによる脱Acm、環化を行ない、粗ヒトBNP-32を20.0mg
得た。次にこのものを1N酢酸4mlに溶かし、4回に分
けて逆相HPLCにかけた〔カラム:ヌクレオシル120-5C1
8,φ20mm×250mm,流速5ml/分,溶媒系;(A) 水:ア
セトニトリル:10%TFA=90:10:1,(B) 水:アセト
ニトリル:10%TFA=40:60:1,(A):(B)=90:10か
ら(A):(B)=55:45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を4回繰り返し、61〜64分のメインピー
クを分取した。減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾
燥し、5mgのヒトBNP-32を得た。
学的性質は、次の通りであった。
液、酢酸に可溶。クロロホルム、ベンゼン、エチルエー
テル、ヘキサンに不溶。
果を次に示す。
本とした。これを、3mlオルガンバス中、95%O2−5%
CO2ガスを通じ、32℃に保温したクレブス−ヘンスレイ
ト栄養液〔カルバコール(2×108M)を含む〕2.5ml中
に浸した。この筋標本に0.5gの静圧をかけ、約30分静
置して筋の自動運動が安定したところで被験物質として
ヒトBNP-26を100ng投与し、投与後6〜8分間の筋の弛
緩を測定した。測定後すみやかにオルガンバスを洗い、
20〜30分おいて、被験物質としてヒトBNP-32を200ng用
いて上記操作を繰り返した。被験物質は所定量を生理食
塩水に溶解して用いた。
100〜200ngの投与で強い平滑筋弛緩活性を示した。
滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及びナトリウム利尿作
用、血圧降下作用を有し、かつヒト由来であるため安全
性が高く、例えば心臓性浮腫、腎臓性浮腫、肝性浮腫、
肺浮腫、高血圧症、うっ血性心不全、急性及び慢性腎不
全等の治療薬として有用である。
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項1】 一般式(1) 【化1】 (式中、XはH、H-Gly-Ser-Gly-又はH-Ser-Pro-Lys-Me
t-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-を示す)で表わされる生理活性
ペプチド又はその塩。 - 【請求項2】 請求項1記載の生理活性ペプチド又はそ
の塩を含有する循環器系疾患治療剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10131506A JP3025672B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10131506A JP3025672B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1059183A Division JP2883903B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-10 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12166699A Division JP3258639B2 (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10310600A true JPH10310600A (ja) | 1998-11-24 |
JP3025672B2 JP3025672B2 (ja) | 2000-03-27 |
Family
ID=15059628
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10131506A Expired - Lifetime JP3025672B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020101032A1 (ja) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | 味の素株式会社 | 分子内s-s結合を有する環化ペプチドの製造方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03505280A (ja) * | 1988-05-31 | 1991-11-21 | サイオス ノバ インコーポレイテッド | 新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術 |
-
1998
- 1998-05-14 JP JP10131506A patent/JP3025672B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03505280A (ja) * | 1988-05-31 | 1991-11-21 | サイオス ノバ インコーポレイテッド | 新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020101032A1 (ja) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | 味の素株式会社 | 分子内s-s結合を有する環化ペプチドの製造方法 |
JPWO2020101032A1 (ja) * | 2018-11-16 | 2021-10-07 | 味の素株式会社 | 分子内s−s結合を有する環化ペプチドの製造方法 |
US11939404B2 (en) | 2018-11-16 | 2024-03-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing cyclized peptide having intramolecular S-S bond |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3025672B2 (ja) | 2000-03-27 |
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