JP3600831B2 - トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ‐β）の免疫抑制効果の治療用アンチセンス−オリゴヌクレオチド類 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）の免疫抑制効果の治療用アンチセンス−オリゴヌクレオチド類
本発明は、トランスフォーミング成長因子（腫瘍増殖因子）−β（ＴＧＦ−β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体、ナンセンス−コントロール−ヌクレオチドとしてのオリゴヌクレオチド、ＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする少なくとも一つのアンチセンス−オリゴヌクレオチドまたはその有効な誘導体を含有する医薬組成物、並びに腫瘍の治療用及び／またはＴＧＦ−βの免疫抑制効果の治療用の医薬組成物の製造のためのアンチセンス−オリゴヌクレオチド類の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、例えば、ヒト神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）細胞により分泌される因子である。膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）等のヒト神経膠腫は、現在満足な治療方法が存在しないヒト腫瘍である。ＴＧＦ−βはそれぞれの腫瘍細胞の成長をオートクリン様式で支持する。この因子は、免疫抑制効果を示し、さもなければ神経膠腫細胞を破壊することができるであろうそのような細胞障害性Ｔ−リンパ球の増殖を減じる。
【０００３】
免疫応答性の抑制は、悪性神経膠腫の患者についてよく報告されてきた。これらの患者は、皮膚アネルギー（ａｎｅｒｇｙ）、抑制された抗体生産、循環Ｔ−細胞の数の減少を含む種々の免疫学的欠乏を表わす〔ブルクスＷ．Ｈ．、ネトスキーＭ．Ｇ．、ハーワイズＤ．Ａ．、ノーマンセルＤ．Ｅ．、初期の脳腫瘍患者の細胞伸介免疫、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３６：１９３１〜１９４７、１９７２及びローズマンＴ．、エリオットＬ．、ブルクスＷ．、神経膠腫によるＴ−細胞機能の調整、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：３７０〜３７４、１９９１）。更に最近の研究では、これらの損傷は、正常なＴ−細胞活性化に必要とされる生理学的経路の機能不全及びＴ−細胞の一部の量的及び質的欠陥に起因する可能性があることを示す。
【０００４】
第８２回アメリカ癌研究協会総会、米国テキサス州ヒューストン、１９９１年５月１５〜１８日、の会報Ｐｒｏｃ ＡＭ ＡＳＳＯＣ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ ＡＮＮＵ ＭＥＥＴ ３２（Ｏ）、１９９１、４２７には、因子−β−アンチセンス−オリゴヌクレオチド類が、ヒト黒色腫細胞を濃厚な血清下では阻害し、かつ無血清培養条件下では促進することが開示された。得られた結果は、培地中の血清の含有量に依存して、ＨＴＺ−１９−細胞の成長調整において、細胞性ＴＧＦ−β１に異なる役割があることを示す。加えて、これは外部から投与したＴＧＦ−β−アンチセンスの生物学的潜在力と欠点の可能性を示すかもしれない。
【０００５】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４（４）、１９９１、９２５〜９３０、ハズフィールドＪ．等「アンチセンストランスフォーミング成長因子β−１またはＲｂオリゴヌクレオチド類による初期のヒト造血機関の無活動からの開放」には、アンチセンストランスフォーミング成長因子β１またはＲｂオリゴヌクレオチド類による初期のヒト造血機関の無活動からの開放が開示されている。ＲｂアンチセンスＴＧＦ−βは、Ｒｂ遺伝子生成物との相互作用を介して、初期のヒト造血機関の循環状態を消極的に調整する。
【０００６】
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ＵＳＡ、Ｖｏ．８８、１９９１年２月、ワシントンＵＳＡ、１５１６〜１５２０頁、ポッツＪ．等「未発達心臓のアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドのトランスフォーミング成長因子−β３’への上皮間葉のトランスフォーメーション」には、未発達心臓の内皮細胞の上皮間葉のトランスフォーミング成長因子−β３へのトランスフォーメーションは、修飾されたアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドにより抑制されることが開示されている。このトランスフォーメーションは、心臓により生成するトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）分子の活性に依存する。ＴＧＦ−β１、−２、−３及び−４の非保存領域に発生させた修飾されたアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類は、この変化においてこれらのメンバーの可能な役割を試験するために製造された。その結果、ＴＧＦ−β群（ＴＧＦ−β３）のある特定のメンバーが上皮間葉トランスフォーメーションに不可欠であることが解明された。
【０００７】
ＷＯ−Ａ ９２／１７２０６には、治癒の間に傷痕組織の形成を抑制するために、医薬的に許容し得る担体と共に、最適の繊維的（ｆｉｂｒｏｔｉｃ）成長因子のみに対して特異的な成長因子中和剤または剤類の有効活性抑制量を含有する、傷の治療用組成物が開示されている。前記組成物の製造方法及び組織に損傷を受けた宿主に前記組成物を投与する方法も開示されている。
【０００８】
ＷＯ−Ａ９０／０９１８０には、オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）骨髄移植及び癌治療に有用な方法が開示されている。癌を有する患者の骨髄細胞は、骨髄提供者に逆に注入する前に悪性細胞の骨髄を空にするために、選ばれたアンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理する。
【０００９】
【非特許文献１】
ハズフィールドＪら、”Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β１ ｏｒ Ｒｂ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”、 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（４）１９９１、ｐ９２５〜ｐ９３０
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、免疫抑制と相関する癌細胞の治療方法を提供することである。本発明の他の目的は、免疫抑制に関係する腫瘍細胞の成長を抑制する効果のある薬剤を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、配列表中にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜５６及び１３７として規定された以下の核酸配列を含むか、または配列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７〜１３６として規定された以下の核酸配列を含有する、但し、おのおのの核酸はＤＮＡ−またはＲＮＡ−型構造を有する、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体により、上記に述べた問題点を解決することができる。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、成長因子−β１、β２及び／または−β３をコードする遺伝子領域とハイブリダイズする。このアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域及び／またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域およびコードしない遺伝子領域とハイブリダイズする。例えば、トランスフォーミング成長因子−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の幾つかは、トランスフォーミング成長因子をコードしない領域とハイブリダイズする一方、それぞれの配列のその他の部分がＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする。もちろん、アンチセンス−オリゴヌクレオチドが成長因子−βのみをコードする遺伝子領域とハイブリダイズすることも本発明の範囲内である。当業者には、ＴＧＦ−βの生成が減少または抑制されるかぎり、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドの後続部分を有する断片は、本発明に従って機能することも理解される。
【００１２】
本発明の好ましい具体化において、アンチセンス−オリゴヌクレオチドまたはその有効な誘導体はフォスフォチオエート−オリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１３】
本発明によれば、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、３’−５’方向のヌクレオチド鎖の成長により亜リン酸チオエステル化学を用いる固相合成により得ることができ、その中で各ヌクレオチドは、固相に共有結合した最初のヌクレオチドと結合し、以下の工程を含む。
原料ヌクレオチドの５’ＤＭＴ保護基を切断し、
鎖の増殖のための各ヌクレオチドを加え、
亜リン酸基を修飾した後に、未反応の５’−水酸基封鎖し、
固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、
次いで合成生成物を得る。
【００１４】
オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を図１に示す。同様に、アンチセンス オリゴ−リボヌクレオチド類のそれぞれの構造を図２に示す。オリゴヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド長鎖からの細部として理解されるべきものである。
【００１５】
図１において、ｌｉｔ．Ｂは、デオキシリボーズにＮ９（Ａ，Ｇ）、Ｎ１（Ｄ，Ｔ）を介して結合するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）等の有機塩基を意味する。これらの塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（ｍＲＮＡ−配列）である。用いた修飾；
１．全てのＲ１が
１．１ Ｒ１＝Ｏ
１．２ Ｒ１＝Ｓ
１．３ Ｒ１＝Ｆ
１．４ Ｒ１＝ＣＨ３
１．５ Ｒ１＝ＯＥｔ
で置換されるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、
【００１６】
２．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００１７】
【化１】
【００１８】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝６〜２０塩基の長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲
２．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
２．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
２．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
２．４ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｓ
の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド、
【００１９】
３．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００２０】
【化２】
【００２１】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲
３．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
３．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
３．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド、
【００２２】
４．Ｒ２において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
４．１ コレステロール
４．２ ポリ（Ｌ）リジ
４．３ トランスフェリン
と結合した化合物１．１〜１．５；２．１〜２．４；３．１〜３．３のいずれか、
【００２３】
５．Ｒ３において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
５．１ コレステロール
５．２ ポリ（Ｌ）リジン
５．３ トランスフェリン
と結合した化合物１．１〜１．５；２．１〜２．４；３．１〜３．３のいずれかである。
【００２４】
ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類（図２）の場合は、リボーズにＮ９（Ａ，Ｇ）またはＮ１（Ｕ，Ｃ）を介して結合した塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））である。この塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（ｍＲＮＡ配列）である。オリゴヌクレオチド配列において用いた修飾は以下のとおり：
【００２５】
６．全てのＲ１が
６．１ Ｒ１＝Ｏ
６．２ Ｒ１＝Ｓ
６．３ Ｒ１＝Ｆ
６．４ Ｒ１＝ＣＨ３
６．５ Ｒ１＝ＯＥｔ
で置換されたオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、
【００２６】
７．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００２７】
【化３】
【００２８】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜２０塩基の長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲
７．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
７．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
７．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
７．４ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｓ
の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴ−リボヌクレオチド、
【００２９】
８．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００３０】
【化４】
【００３１】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲
８．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
８．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
８．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴ−リボヌクレオチド、
【００３２】
９．Ｒ２において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
９．１ コレステロール
９．２ ポリ（Ｌ）リジン
９．３ トランスフェリン
と結合した化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３のいずれか、
【００３３】
１０．Ｒ３において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
１０．１ コレステロール
１０．２ ポリ（Ｌ）リジン
１０．３ トランスフェリンと結合した化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３のいずれか、
【００３４】
１１．全てのＲ４が
１１．１ Ｒ４＝Ｏ
１１．２ Ｒ４＝Ｆ
１１．３ Ｒ４＝ＣＨ３
で置換される化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３；９．１〜９．３；１０．〜１０．３のいずれかである。
【００３５】
アンチセンス−オリゴヌクレオチド類の修飾は、有利である。何故なら、これが自然に存在するヌクレオチド配列に有効な程、それらが応用された場合に、内因性の因子によって速く破壊されないからである。しかしながら、開示した配列を有する自然に存在するヌクレオチドもまた本発明に使用しうることが当業者には理解される。特に好ましい具体例において、上記修飾はフォスフォロチオエート修飾である。
【００３６】
本発明のオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成を、以下の詳細な説明中に例として述べる。
オリゴデオキシ−ヌクレオチドは、亜リン酸チオエステル化学を用いる保護ヌクレオチドオの段階的な５’付加により合成した。ヌクレオチドＡは５’−ジメトキシトリチル−デオキシアデノシン（Ｎ４−ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイト（０．１Ｍ）として導入され；Ｃは５’−ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（Ｎ４−ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトとして導入され；Ｇは５’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン（Ｎ８−イソブチリル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトとして導入され、かつＴは５’−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトである。これらのヌクレオチドは、好ましくは０．１Ｍの濃度のアセトニトリル溶液として用いられた。
【００３７】
合成は、殆どの３’−ヌクレオチドが長鎖アルキルアミンリンカーを介して共有結合する（平均担持３０μｍｏｌ／ｇ固体支持体）、直径ほぼ１５０μｍに調節された細孔ガラス粒子（細孔直径５０ｎｍ （５００Å））上で行う。
【００３８】
固体支持体は、円筒状の合成カラムに充填し、試薬類は十分流れることができるけれども、固体合成支持体は漏れないフィルターで、両末端をキャップした。
【００３９】
試薬類は、不活性ガスの加圧を利用して合成カラムに供給し、回収した。ヌクレオチド類は、３’→５’方向に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に付加した。おのおのヌクレオチドは以下の合成サイクルを一巡して結合した：
原料ヌクレオチドの５’ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）保護基をジクロロメタン中で３−クロロ酢酸を用いて開裂し、ついで無水アセトニトリルでカラムを洗浄した。そして同時に、配列に応じて、それらの保護誘導体の形態の塩基の一つをアセトニトリル中のテトラゾールに添加した。反応後、反応混合物を回収し、亜リン酸を、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中、硫黄（Ｓ８）混合物で酸化した。酸化反応の後、混合物を回収し、カラムをアセトニトリルで洗浄した。未反応の５’−水酸基は１−メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同時に添加して封鎖した。その後、合成カラムはアセトニトリルで洗浄し、次サイクルを開始した。
【００４０】
得られた合成生成物の処理及び精製操作は以下の通りである。
最後のヌクレオチドの付加後に、デオキシヌクレオチドをアンモニア溶液中でインキュベーションすることにより固体支持体から分離した。エキソキシクリック（ｅｘｏｘｙｃｌｉｃ）塩基の保護基は更にアンモニア中でインキュベーションすることにより除去した。そしてアンモニアを減圧留去した。依然として５’ＤＭＴ保護基を有する全長合成生成物は、シリカＣ１８固定相上で逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて短い破損不純物から分離した。生成物のピーク溶離液を採取し、減圧下で乾燥し、５’ＤＭＴ保護基を酢酸中でインキュベーションして開裂した。酢酸はその後減圧留去した。合成生成物は、脱イオン水に溶解し、ジエチルエーテルで３回抽出した。そして、生成物は減圧下で乾燥した。再度ＨＰＬＣ−ＡＸクロマトグラフィーを実施し、生成物のピークの溶離液は、脱イオン水に対する二度目の透析と同様に過剰のトリス緩衝液に対して透析した。最終生成物は凍結乾燥し、乾燥貯蔵した。
【００４１】
本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類は医薬組成物、すなわち医薬として用いることができる。この医薬は、トランスフォーミング成長因子−βの抑制、及びそれによる免疫抑制の減少および／または病気に起因するアンギオゲネシス（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制により、ＴＧＦ−βの発現が発病に関係する腫瘍の治療に用いることができる。アンチセンス−ＴＧＦ−β−オリゴヌクレオチド類の有効投与量の投与により引き起こされた免疫抑制の減少は、医薬の投与前の状態に比較して細胞障害性のリンパ球の大幅な増殖を伴って起こることがある。その結果、これらのリンパ球は、腫瘍細胞の数を減じるその細胞障害性活動を開始する。
【００４２】
本発明の医薬は、ＴＧＦ−βの内生の発現過剰の治療、残余腫瘍（ｒｅｓｔ ｔｕｍｏｒｓ）の治療、神経性維腫の治療、膠芽腫を含む悪性神経膠腫の治療、及び、食道癌及び胃癌の治療と同様に皮膚癌の治療と予防に有用である。
【００４３】
オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞を用いた剌激の際のヒトＴ−細胞の増殖と細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果を研究した。ＴＧＦ−β２−誘導フォスフォロチオエート誘導体Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、神経膠腫細胞内のＴＧＦ−βの蛋白発現を特異的に抑制するであろう。加えて、ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、Ｔ−細胞の増殖および細胞障害性に対するＴＧＦ−βの免疫抑制効果を、相当量、逆転（ｒｅｖｅｒｓ）する。
【００４４】
ヒト脳腫瘍患者におけるＴ−細胞の応答は、明らかに減り、腫瘍侵入リンパ球は、個々の患者の腫瘍の進行に単に付帯的な影響を有するにすぎないことが明らかにされてきた〔パルマＬ．、ジ ロレンゾＮ．、ガイデットＢ．、初期の膠芽腫および慢性神経膠腫へのリンパ球侵入物、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、４９：８５４〜８６１、１９７８、及びリドレイＡ．、カバナフＪ．Ｂ．、神経膠腫へのリンパ球の浸入、可能な宿主耐性の証拠、Ｂｒａｉｎ、４：１１７〜１２４、１９７１）。脳腫瘍から単離した腫瘍侵入リンパ球は機能上役に立たず、これらの免疫抑制効果は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ＴＧＦ−β２が原因であった〔ボードマーＳ．、ストロマーＫ．、フレイＫ．、シープルＣｈ．、デ トリボレットＮ．、ヘイドＩ．、フォンタナＡ．、膠芽腫における免疫抑制およびトランスフォーミング成長因子−β２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：３２２２〜３２２９、１９８９；コールウェルＷ．Ｔ．、ドレダフィＰ．、アプッゾＭ．Ｌ．Ｊ、アンテルＪ．Ｐ．、免疫機能の悪性神経膠腫調整：異なる溶解因子の相関的な寄与、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：８９〜９６、１９９１；カップナー Ｍ．Ｃ．、ハモウＭ．Ｆ．、サワムラＹ．、ボードナーＳ．、デ トリボレットＮ．、膠芽腫誘導トランスフォーミング成長因子β２によるリンパ球機能の抑制Ｎｅｕｒｏｓｕｎｇ．、７１：２１１〜２１７、１９８９；マクスウェスＭ．、ガラノポーラスＴ．、ネビル−ゴールデンＪ．、アントニアデスＨ．Ｎ．、免疫抑制及び免疫監視の損失に対する初期のヒト膠芽腫におけるトランスフォーミング成長因子β２の発現効果、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｎｇ．、７６：７９９〜８０４、１９９２；パーラディノＭ．Ａ．、モーリスＲ．Ｅ．、フレッシャー ターネスＨ．、レビンソンＡ．Ｄ．、トランスフォーミング成長因子β、新種の免疫調節分子、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５９：１８１〜１８７、１９９０；ローズマンＴ．、エリオット Ｌ．、ブルックスＷ．、神経膠腫によるＴ−細胞機能の調整、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１２：３７０〜３７４、１９９１〕。
【００４５】
図３は、血清を含まない神経膠腫培養細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のＩＧＦ−βウェスタン・ブロット解析を示す。レーン２（ＨＴＺ−１５３）、３（ＨＴＺ−２０９）および４（ＨＴＺ−２４３）は、ＴＧＦ−β２特異抗体で、それぞれの細胞溶解物のブロット部分を示す。レーン１は、５０ｎｇ純粋ＴＧＦ−β２を用いたＴＧＦ−βポジティブコントロールを表す。ＴＧＦ−β２−アンチセンス処理細胞は、レーンＡに示す。未処理のコントロール細胞は、レーンＢに示す。細胞はアンチセンス−オリゴヌクレオチドで４８時間（最終濃度１μＭ）処理した。
【００４６】
図４は、神経膠腫細胞中のＩＧＦ−β１−ｍＲＮＡ発現を示す。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）由来の、細胞質ＲＮＡ２０μＭを含有した。ＲＮＡの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブロット点はメチレンブルーで着色した（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）。
【００４７】
図５は、神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β２オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）由来の、細胞質ＲＮＡ２０μＭを含有した。ＲＮＡの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブロット点はメチレンブルーで着色した（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）。
【００４８】
図６は、ＴＧＦ−β２−Ｓ−ＯＤＮ処理後の神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す。未処理の神経膠腫細胞Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）、または、血清含有培養条件下、１μＭ（最終濃度）のＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで４８時間処理した神経膠腫細胞Ａ’、Ｂ’およびＣ’の細胞質ＲＮＡを分離し、ノーザン・ブロット解析を行ったものである。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β２オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、２０μＭの細胞質ＲＮＡを含有した。
【００４９】
図７は、オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞へのＰＢＭＣ’ｓの細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびＴＧＦ−β中和抗体の効果（ターゲット／エフェクター １：１０）を示す。ＩＬ−１α及び１１−２を用いたＰＢＭＣ’ｓの培養６日後、細胞を集め、洗浄し、照射し（３０Ｇｙ）、そして、ターゲット／エフェクター比１：１０、１：５、１：１で、オートロガス神経膠腫細胞に添加したものである。神経膠腫ターゲットは、ＴＧＦ−β−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓまたはＴＧＦ−β抗体で前処理した。細胞障害性は、修飾微小細胞毒性分析を用いて算定した。データは、３重反復検体を意味し、誤差棒はＳＥを表す。データの点数は、腫瘍ターゲットを培地のみで処理した個々のコントロールを反映する。細胞障害性の参照としてのＳ−ＯＤＮ’ｓ（１μＭ、５μＭ）またはＴＧＦ−β抗体（１００μｇ／ｍｌ）。それによって、抗体またはＳ−ＯＤＮ’ｓ単独のターゲット細胞への影響を除外することができた。
【００５０】
図８は、リンパ球、神経膠腫細胞およびオートロガス神経膠腫細胞と共に培養したリンパ球（ＭＬＴＣ）の増殖に対するＴＧＦ−β２−特異的およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓの投与依存効果を示す。Ａ：ＨＴＺ−１５３、Ｂ：ＨＴＺ−２０９、Ｃ：ＨＴＺ−２４３。ＰＢＭＣ’ｘは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−２で６日間前もって活性化し、さらにオートロガス照射（６０Ｇｙ）と、ＴＧＦ−β２−（Ｎｏ．６）及びナンセンスＳ−ＯＤＳＮ（Ｎｏ．５）処理神経膠腫細胞（ＭＬＴＣ）
を用いて更に６日間インキュベートした。同時に、神経膠腫細胞（腫瘍）および前もって活性化したＰＢＭＣ’ｓ（リンパ液）の一部は、ＴＧＦ−β２−特異的（Ｌｙ：Ｎｏ．２、Ｔｕ：Ｎｏ．４）およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓ（Ｌｙ：Ｎｏ．１、Ｔｕ：Ｎｏ．３）で３時間、インキュベートして、推定上のＳ−ＯＤＮ’ｓのエフェクター細胞またはターゲット細胞への単独の影響を評価した。リンパ球と神経膠腫細胞の増殖は３Ｈ Ｔｄｒ取り込み検査を用いて評価した。データは３重反復検体法で示し、誤差棒はＳＥを表す。本発明は以下の制限されることのない例により更に説明される。
【００５１】
【実施例】
（実施例１）腫瘍細胞（オートロガス・ターゲット細胞）の特定
３人の高度の悪性神経膠腫〔ＨＴＺ−１５３及びＨＴＺ−２０９、膠芽腫、ＨＴＺ−２４３、悪性アストロシトマ（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、Ｇｒ．ＩＩＩ−ＷＨＯ〕患者の腫瘍細胞およびそれぞれのオートロガスリンパ球について調査した。標準腫瘍細胞種は、牛胎児血清２０％（ＦＣＳ、Ｓｅｒｏｍｅｄ、ベルリン、ドイツ）、Ｌ−グルタミン１μＭ、ＭＥＭビタミン溶液及び非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランド、英国）（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリーオスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの最小栄養培地中で決定した。他のターゲット細胞はＫ５６２（ＮＫ−感受性エリスロマイロイド（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ）白血病細胞ライン、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）を含んだ。腫瘍細胞種は、ＧＦＡＰ、サイトケラチン、ニュウロフィラメント、デスミン、ビメンチン、ＮＳＥ、ＨＬＡ、ＤｒＯ、Ｗ６／３２（クラスＩ抗原）、β２−マイクロブロブリン、フィブロネクチン、ラミニンン、Ｋｉ ６７（ダコパッツ、グラストラッブ、デンマーク）及びアンチ−ＴＧＦ−β（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ．、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）に対するモノまたはポリクロノール抗体を用い、ラブテック組織培養スライド（マイルス・ラボラトリ−Ｉｎｃ．、ナッパービル、ＩＬ、ＵＳＡ）において、ＰＡＰ−法（ボーネＪ．Ａ．、ハンドブック・オブ・イミュノパーオキシダーゼ・ステイニング・メソッド、ＤＡＫＯ社、カルピンテリアＣＡ、ＵＳＡ、１９８３）を用いる免疫細胞化学により特定した。ＴＧＦ−β特異的免疫細胞化学は、最終濃度１μＭのＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよび最終濃度１μＭのナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓ処理コントロールを用いて神経膠腫培養スライドを４８時間インキュベーシションした後に行った。
【００５２】
（実施例２）リンパ球（エフェクター細胞）の特定
全神経膠腫患者からの抹消血液単核は、手術日にフィコル−ハイパク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（ファルマシア、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）傾斜遠心分離を用いてヘパリン添加した静脈血から採取し、標準状態で液体窒素中に凍結保存した（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリ−オスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６）。リンパ球はＲＰＭＩ １６４０（フロウ・ラボラトリーＩｎｃ．、スコットランド、英国）中で、１０％ヒト鬱血ＡＢ−血清（フロウ・ラボラトリーＩｎｃ．、マクリーン、ＶＡ、ＵＳＡ）及びＬ−グルタミン２ｍＭと共に培養した。天然のおよび活性化した（下記参照）抹消血液単核は、以下の抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＨＬＡ ＤＲ（ベクトン・ディキンソン、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａ ＵＳＡ）に対するモノクローナル抗体と、アルカリフォスファターゼおよびモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼ複合体を用いる、免疫細胞化学により特定した（ＡＰＡＡＰ−法、Ｄａｋｏｒａｔｔｓ ＧｍｂＨ、ハンブルグ、ドイツ）（コーデルＪ．Ｌ．、ファリニＢ．、イーバーＷ．Ｎ．等、アルカリフォスファターゼとモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼの免疫複合体（ＡＰＡＡＰ−錯体）を用いるモノクローナル抗体の免疫酵素標識、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３２：２１９〜２２９、１９８４）。
【００５３】
（実施例３）ＬＡＫ−細胞生成
神経膠腫患者からの抹消血液単核細胞の増殖及び細胞障害性の応答が抑制されるので、細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、底の浅い組織培養プレート（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、インターロイキン−１α（Ｒ＆ＤシステムズＩｎｃ．ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）およびインターロイキン−２（１００Ｕ／ｍｌ）（ＢＩＯＴＥＳＴ、ＡＧ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍ．ドイツ）を用いて生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で６日間、前もって活性化した。
【００５４】
（実施例４）増殖検定
混合リンパ球−腫瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）１５×１０３に、致死照射（６０Ｇｙ、６４Ｃｏ−源）した腫瘍細胞を活性化剤として供給し、９６ウェルの平底組織培養プレート（ＮＵＮＣ、コペンハーゲン、デンマーク）の中で、６日間２５×１０３の前もって活性化した単核細胞（ＬＡＫ−細胞、上記参照）と共に培養した。ＭＬＴＣ−実験において、前培養の間、同様の培地条件を用いた。アンチセンス実験において、ＴＧＦ−β２−特異性フォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ）及びナンセンスオリゴデオキシヌクレオチド類（前記参照）をＭＬＴＣ検定の１２時間前に培地に添加した。抗−ＴＧＦ−β中和抗体（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）をＭＬＴＣの２時間前に培地に添加した。
【００５５】
（実施例５）細胞毒性検定
細胞毒性実験は修飾微小細胞毒性検定（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリーオスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６） により行った。簡潔には、１．５×１０３ターゲット細胞を、９６ウェル平底組織培養プレートに接種した。プレーティングから１２時間後、ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびナンセンスオリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンスコントロール）を培地に添加した。抗−ＴＧＦ−β中和抗体及び正常兎血清（抗体コントロール、Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）をプレーティングから２２時間後に培地に添加した。種々の比（ターゲット／エフェクターの比１：１、１：５、１：１０）の前もって活性化したエフェクター細胞（ＬＡＫ−細胞）を照射（３０Ｇｙ）し、プレーティングから２４時間後にそれぞれのターゲットに添加し、３日間、標準培養条件下（１０％の鬱血ＡＢ−Ｒ血清及び２ＰμＭＭのＬ−グルタミンを含有る１６４０培地）にした。細胞毒性実験の間、細胞毒素は培地に添加しなかった。統計上のデータの評価値はこの時点で最適であることが判明したため、３日間のインキュベーション期間を選択した。ターゲット細胞の死滅はトリパン・ブルー染料（データは示さず）の混入により示された。ＬＡＫ−細胞処理したターゲット中のターゲット細胞の増殖は、標準３Ｈ−チミジン取り込み検定（６−３Ｈ−チミジン、１μＣｉ／ウェル、比活性２７ｃｌ／ｍｍｏｌ）により評価した。取り込まれた３Ｈ−チミジンを計量する液体シンチレーションは１８時間の細胞培養の後に行った。比細胞毒性は：
〔ｃｐｍ（コントロール）−ｃｐｍ（プローブ）／ｃｐｍ（コントロール）〕×１００％
より算出した。
【００５６】
（実施例６）ノーザンおよびウェスタンブロット解析
細胞質ＲＮＡは、１μＭ（最終濃度）のＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで、４８時間処理した神経膠腫細胞及び０．５％ＮＰ−４０含有緩衝液中の未処理コントロールを溶解することにより調製した（サンブルックＪ．、フリシュＥ．Ｆ．、マニアティスＴ．、モレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）。ノーザンハイブリダイゼーシヨン用に、２０μｇの変性ＲＮＡアリコートを、１％のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動により分離した。固定化したＲＮＡの質および量は、移動の後、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｂｕｃｈｌｅｒ、Ｂａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）のメチレン−ブル−染色により確認した。ブロットは一昼夜、特異的ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２合成オリゴヌクレオチド プローブ（４０−マー、オンコゲン・サイエンス、シアトル、ＵＳＡ）ハイブリダイズし、５’をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア、フライブルグ、ドイツ）を用いて（γ−３２Ｐ）−ＡＴＰでラベルし、Ｘ−線フィルムに暴露した。
【００５７】
ウェスタンブロット用に、ＴＧＦ−β−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓでそれぞれ処理した未処理の神経膠腫細胞を１０％Ｆむ培地で生育させ、洗浄し、更に、２４時間前記無血清培地で培養した。細胞は、ＮＰ−４０Ｗを含有する溶解バッファーを用いて溶解した。３０μｇの全細胞蛋白質は１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルの各レーンに充填した。分別した蛋白質は、次いでニトロセルロース メンブランに２０分間、０．８ｍＡ／／ｃｍ２で上記のように電気ブロットした（トウビンＨ．、スターヘリンＴ．、ゴードンＪ．、蛋白質のＰＡＧＥからニトロセルロース膜への電気泳動転写、操作及び幾つかの応用、Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６：４３５０〜４３５４、１９７９。フィルターは、ＴＧＦ−β２のポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）でブローブした。５０μｇのＴＧＦ−βをコントロールとして用いた。
【００５８】
（実施例７）フォスフォロチオエートで修飾したアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ）
ＴＧＦ−β２−特異的アンチセンス オリゴデオキシヌクレオチド類（ＴＧＦ−β２ｍＲＮＡプライマー シークエンス オリゴヌクレオチド シークエンス：ＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＧＴのアンチセンス方向）および特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓと同様のＧＣ−含量で無作為化したナンセンス シークエンス（ナンセンス オリゴヌクレオチド シークエンス：ＧＴＣＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣ）は、アプライド バイオシステムズ モデル３８０ Ｂ ＤＮＡシンセサイザー〔シュリンゲンシューペンＫ．Ｈ．、ブリッシュＷ．、フォスフォロチオエート オリゴマーズ．腫瘍細胞中のオンコジーン発現の抑制剤および遺伝子機能解析手段：エリクソンＲ．、アイザントＪ．（Ｅｄｓ．）アンチセンス核酸による遺伝子調節、ラヴァン・プレス・ニュー・ヨーク１９９２〕で合成した。Ｓ−ＯＤＮ’ｓは３３％アンモニアを用いて固体支持体より除去した。依然として５’トリエチル保護基を有するオリゴヌクレオチド類は、アクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）ＲＰ−３００、Ｃ８−カラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）で逆相ＨＰＬＣにより精製した。溶剤：Ａ−０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ７、Ｂ−アセトニトリル。勾配３〜３５％ Ｂ ３０分以上直線的な。全長生成物に相当する、オリゴヌクレオチド類のトリチルを有するフラクションは、８０％酢酸／ＥＴＯＨ中、２０分間脱トリチル化し、ジエチルエーテルで２回抽出し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５（ファルマシア）カラムで脱塩し、エタノールで沈殿させ（２×）、最後に０．Ｍトリス／ＨＣＬ ｐＨ７．６で希釈した。Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、ポリアクリルアミド−ゲル−電気泳動により全長物質の８５％以上であると判定された。
【００５９】
（実施例８）腫瘍細胞のキャラクタリゼーション
全神経膠腫細胞培養物は、β−ミクログロブリン、フィブロネクチン及びＫＩ−６７と同様に、ＧＦＡＰ、ＴＧＦ−β、ビメンチン及びＨＬＡ−クラスＩ抗原を発現し、デスミン、ＨＬＡ−クラスＩＩ抗原（ポジティブ：ＨＴＺ−２０９）およびＮＳＥ（ポジティブ：ＨＴＺ−２０９、ＨＴＺ−２４３）については矛盾の多い（ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）な発現がみられた。これら腫瘍細胞のグリアル（ｇｌｉａｌ）起源を示す、サイトケラチン、ラミニン及び神経繊維については発現は見られなかった。
【００６０】
腫瘍細胞溶解物のウェスタンブロット解析はＨＴＺ−１５３、ＨＴＺ−２０９及びＨＴＺ−２４３細胞がＴＧＦ−β２蛋白質を生成したことを示した（図３）。
全ての３つの腫瘍由来の細胞障害性ＲＮＡ’ｓのノーザンブロット解析は、ＴＧＦ−β１（２．３ｋＢ）およびＴＧＦ−β２（４．１ｋＢ）（図５及び５）についてのメッセージを示した。ＴＧＦ−β２についてのメッセージは、全ての３つの腫瘍においてかなりよく表され（図４）、しかし、腫瘍ＨＴＺ−２０９は残りの腫瘍と比較してかすかなＴＧＦ−β２シグナルを示した（図５）。
【００６１】
（実施例９）ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓでの神経膠腫細胞の処理によるＴＧＦ−β発現の調節
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ処理のＴＧＦ−β２ｍＲＮＡ−および神経膠腫細胞内の蛋白質発現に対する効果はノーザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティングおよび免疫細胞化学により解析した。ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ（４８時間で最終濃度１μＭ）で処理した神経膠腫細胞のノーザン・ブロット解析は矛盾した結果を示した。即ち、ＨＴＺ−１５３はＴＧＦ−β２におけるメッセージの増加を示したが、腫瘍ＨＴＺ−２０９及びＨＴＺ−２４３は、アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類処理の結果起こる検出可能なメッセージを示さなかった（図６）。ウェスタンブロット解析は、Ｓ−ＯＤＮ処理後の全ての３つの腫瘍についてＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓシグナルの減少を示した（図３）。
【００６２】
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ（４８時間で最終濃度１μＭ）で処理した神経膠腫培養物の免疫着色は、ナンセンスＳ−ＯＤＮ処理及び未処理コントロールに比較して、ＴＧＦ−β依存性の免疫反応性の減少を全て３つの腫瘍について示した。正常マウス血清及びヒトＡＢ−血清を用いたコントロールはネガティブであった（スライドは示していない）。
【００６３】
（実施例１０）リンパ球のキャラクタリゼーション
以下の腫瘍依存性のリンパ球増殖及び神経膠腫細胞障害性の実験に用いたオウトロガス エフェクターリンパ球は通常のリンパ球識別抗原によりキャラクタライズした。キャラクタリゼーション実験のデータは表１に示し、細胞数は、天然の（０日）及び活性化した（６日）エフェクター細胞増殖及び細胞毒性実験に使用したリンパ球サブセットの表現型を反映する。ＣＤ３＋細胞のパーセンテージは培養時間の間に８５％に増加した。ＣＤ４＋も同様である（８０％まで）。ＣＤ８＋（１８％まで）細胞、ＣＤ２５＋（６０％まで）細胞、ＣＤ１６＋細胞のフラクションは、培養の最初の６日の間に最高５０％（ＨＴＺ−２４３）まで増加した。
【００６４】
（実施例１１）細胞毒性実験
腫瘍患者の生来のＰＢＭＣ’ｓを、オートロガス ターゲットに低い細胞障害性活性を示すわれわれの研究において調査した（ターゲット／エフェクター比１：１０で２０％以下）。予備実験はオートロガス エフェクターＰＢＭＣ’ｓの前活性化が、細胞を１０Ｕ／ＭＬ ＩＬ−１α及び１００Ｕ／ＭＬ ＩＬ−２で、６日間インキュベートした場合、最も効果的であることを示した。これらのＬＡＫ細胞は、全て更に細胞毒性／増殖実験に使用した。
ターゲット／エフェクター比が１／１０のとき、ＬＡＫ細胞はオートロガスターゲット システムにおいて２５％までの細胞障害性活性を達成した（図７）。中性化したＴＧＦ−β抗体（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）との腫瘍細胞の前培養は、３０〜５０％（未処理コントロールより５〜３０％増加）の細胞障害性という結果を示した。腫瘍細胞をＴＧＦ−β２特異的アンチセンスＳ−ＯＤＮ’ｓと前培養した場合、細胞障害性は投与のしかたに依存して最高７９％（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ５μＭ、未処理コントロールより２５〜６０％増加）及び６７％（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ１μＭ、未処理オートロガス リンパ球より１５〜４５％増加）増加する。全ての３つのエフェクター細胞数は、Ｋ５６２細胞系に対する細胞毒性検定によって検出されたように、６０％〜７０％の範囲の、高いＮＫ−活性を示した。
【００６５】
（実施例１２）増殖実験
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで処理したオウトロガス腫瘍細胞（ＭＬＴＣ）で刺激した際のリンパ球増殖は、腫瘍ＨＴＺ−１５３（図８ａ）および腫瘍ＨＴＺ−２０９（図８ｂ）では増加したが、しかし、ＨＴＺ−２４３（図８ｃ）細胞に影響は見られなかった。最終濃度（ｆ．ｃ．）１μＭでのナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓはリンパ球増殖を変化させなかった（図８）。ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓの効果が、０．１μＭから１μＭまで投与のしかたに依存して観察され、より高い濃度（５μＭ）は、ＰＢＭＣ’ｓおよび腫瘍細胞に対して非特異的障害性を示した（図８）：Ｓ−ＯＤＮで処理したＭＬＴＣ’ｓ及び腫瘍細胞中のＰＢＭＣ’ｓの増殖（図８）：Ｓ−ＯＤＮで処理したＭＬＴＣ’ｓ中のＰＢＭＣ’ｓの増殖は、オリゴヌクレオチド濃度１μＭ以上について永続的に低かった。高濃度の中性化したＴＧＦ−β抗体（１００μｇ／ｍｌ）はリンパ球増殖を高めなかった。ＴＧＦ−β２−特異的アンチセンスＳ−ＯＤＮ’ｓは、培養したリンパ球数（境界効果）またはＳ−ＯＤＮ’ｓ濃度５μＭ（最終濃度）での最高７５％を達成するオートロガスターゲット細胞（図８）に対しても抑制効果がなかった。大きくはない抑制効果が無作為化したコントロールナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓに観察された（平均２０％、最終濃度５μＭで４０％まで）。
【００６６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を示す図面である。
【図２】ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類の化学構造を示す図面である。
【図３】血清を含まない神経膠腫培養細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のＩＧＦ−βウェスタン・ブロット解析を示す写真である。
【図４】神経膠腫細胞中のＩＧＦ−β１−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図５】神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図６】ＴＧＦ−β２−Ｓ−ＯＤＮ処理後の神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図７】オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞へのＰＢＭＣ’ｓの細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびＴＧＦ−β中和抗体の効果（ターゲット／エフェクター １：１０）を示すグラフである。
【図８】リンパ球、神経膠腫細胞およびオートロガス神経膠腫細胞と共に培養したリンパ球（ＭＬＴＣ）の増殖に対するＴＧＦ−β２−特異的およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓの投与依存効果を示すグラフである。
図８ａ：腫瘍ＨＴＺ−１５３細胞の場合
図８ｂ：腫瘍ＨＴＺ−２０９細胞の場合
図８ｃ：腫瘍ＨＴＺ−２４３細胞の場合
【発明の属する技術分野】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）の免疫抑制効果の治療用アンチセンス−オリゴヌクレオチド類
本発明は、トランスフォーミング成長因子（腫瘍増殖因子）−β（ＴＧＦ−β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体、ナンセンス−コントロール−ヌクレオチドとしてのオリゴヌクレオチド、ＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする少なくとも一つのアンチセンス−オリゴヌクレオチドまたはその有効な誘導体を含有する医薬組成物、並びに腫瘍の治療用及び／またはＴＧＦ−βの免疫抑制効果の治療用の医薬組成物の製造のためのアンチセンス−オリゴヌクレオチド類の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、例えば、ヒト神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）細胞により分泌される因子である。膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）等のヒト神経膠腫は、現在満足な治療方法が存在しないヒト腫瘍である。ＴＧＦ−βはそれぞれの腫瘍細胞の成長をオートクリン様式で支持する。この因子は、免疫抑制効果を示し、さもなければ神経膠腫細胞を破壊することができるであろうそのような細胞障害性Ｔ−リンパ球の増殖を減じる。
【０００３】
免疫応答性の抑制は、悪性神経膠腫の患者についてよく報告されてきた。これらの患者は、皮膚アネルギー（ａｎｅｒｇｙ）、抑制された抗体生産、循環Ｔ−細胞の数の減少を含む種々の免疫学的欠乏を表わす〔ブルクスＷ．Ｈ．、ネトスキーＭ．Ｇ．、ハーワイズＤ．Ａ．、ノーマンセルＤ．Ｅ．、初期の脳腫瘍患者の細胞伸介免疫、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３６：１９３１〜１９４７、１９７２及びローズマンＴ．、エリオットＬ．、ブルクスＷ．、神経膠腫によるＴ−細胞機能の調整、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：３７０〜３７４、１９９１）。更に最近の研究では、これらの損傷は、正常なＴ−細胞活性化に必要とされる生理学的経路の機能不全及びＴ−細胞の一部の量的及び質的欠陥に起因する可能性があることを示す。
【０００４】
第８２回アメリカ癌研究協会総会、米国テキサス州ヒューストン、１９９１年５月１５〜１８日、の会報Ｐｒｏｃ ＡＭ ＡＳＳＯＣ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ ＡＮＮＵ ＭＥＥＴ ３２（Ｏ）、１９９１、４２７には、因子−β−アンチセンス−オリゴヌクレオチド類が、ヒト黒色腫細胞を濃厚な血清下では阻害し、かつ無血清培養条件下では促進することが開示された。得られた結果は、培地中の血清の含有量に依存して、ＨＴＺ−１９−細胞の成長調整において、細胞性ＴＧＦ−β１に異なる役割があることを示す。加えて、これは外部から投与したＴＧＦ−β−アンチセンスの生物学的潜在力と欠点の可能性を示すかもしれない。
【０００５】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４（４）、１９９１、９２５〜９３０、ハズフィールドＪ．等「アンチセンストランスフォーミング成長因子β−１またはＲｂオリゴヌクレオチド類による初期のヒト造血機関の無活動からの開放」には、アンチセンストランスフォーミング成長因子β１またはＲｂオリゴヌクレオチド類による初期のヒト造血機関の無活動からの開放が開示されている。ＲｂアンチセンスＴＧＦ−βは、Ｒｂ遺伝子生成物との相互作用を介して、初期のヒト造血機関の循環状態を消極的に調整する。
【０００６】
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ＵＳＡ、Ｖｏ．８８、１９９１年２月、ワシントンＵＳＡ、１５１６〜１５２０頁、ポッツＪ．等「未発達心臓のアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドのトランスフォーミング成長因子−β３’への上皮間葉のトランスフォーメーション」には、未発達心臓の内皮細胞の上皮間葉のトランスフォーミング成長因子−β３へのトランスフォーメーションは、修飾されたアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドにより抑制されることが開示されている。このトランスフォーメーションは、心臓により生成するトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）分子の活性に依存する。ＴＧＦ−β１、−２、−３及び−４の非保存領域に発生させた修飾されたアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類は、この変化においてこれらのメンバーの可能な役割を試験するために製造された。その結果、ＴＧＦ−β群（ＴＧＦ−β３）のある特定のメンバーが上皮間葉トランスフォーメーションに不可欠であることが解明された。
【０００７】
ＷＯ−Ａ ９２／１７２０６には、治癒の間に傷痕組織の形成を抑制するために、医薬的に許容し得る担体と共に、最適の繊維的（ｆｉｂｒｏｔｉｃ）成長因子のみに対して特異的な成長因子中和剤または剤類の有効活性抑制量を含有する、傷の治療用組成物が開示されている。前記組成物の製造方法及び組織に損傷を受けた宿主に前記組成物を投与する方法も開示されている。
【０００８】
ＷＯ−Ａ９０／０９１８０には、オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）骨髄移植及び癌治療に有用な方法が開示されている。癌を有する患者の骨髄細胞は、骨髄提供者に逆に注入する前に悪性細胞の骨髄を空にするために、選ばれたアンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理する。
【０００９】
【非特許文献１】
ハズフィールドＪら、”Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β１ ｏｒ Ｒｂ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”、 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（４）１９９１、ｐ９２５〜ｐ９３０
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、免疫抑制と相関する癌細胞の治療方法を提供することである。本発明の他の目的は、免疫抑制に関係する腫瘍細胞の成長を抑制する効果のある薬剤を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、配列表中にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜５６及び１３７として規定された以下の核酸配列を含むか、または配列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７〜１３６として規定された以下の核酸配列を含有する、但し、おのおのの核酸はＤＮＡ−またはＲＮＡ−型構造を有する、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体により、上記に述べた問題点を解決することができる。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、成長因子−β１、β２及び／または−β３をコードする遺伝子領域とハイブリダイズする。このアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域及び／またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域およびコードしない遺伝子領域とハイブリダイズする。例えば、トランスフォーミング成長因子−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の幾つかは、トランスフォーミング成長因子をコードしない領域とハイブリダイズする一方、それぞれの配列のその他の部分がＴＧＦ−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする。もちろん、アンチセンス−オリゴヌクレオチドが成長因子−βのみをコードする遺伝子領域とハイブリダイズすることも本発明の範囲内である。当業者には、ＴＧＦ−βの生成が減少または抑制されるかぎり、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドの後続部分を有する断片は、本発明に従って機能することも理解される。
【００１２】
本発明の好ましい具体化において、アンチセンス−オリゴヌクレオチドまたはその有効な誘導体はフォスフォチオエート−オリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１３】
本発明によれば、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、３’−５’方向のヌクレオチド鎖の成長により亜リン酸チオエステル化学を用いる固相合成により得ることができ、その中で各ヌクレオチドは、固相に共有結合した最初のヌクレオチドと結合し、以下の工程を含む。
原料ヌクレオチドの５’ＤＭＴ保護基を切断し、
鎖の増殖のための各ヌクレオチドを加え、
亜リン酸基を修飾した後に、未反応の５’−水酸基封鎖し、
固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、
次いで合成生成物を得る。
【００１４】
オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を図１に示す。同様に、アンチセンス オリゴ−リボヌクレオチド類のそれぞれの構造を図２に示す。オリゴヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド長鎖からの細部として理解されるべきものである。
【００１５】
図１において、ｌｉｔ．Ｂは、デオキシリボーズにＮ９（Ａ，Ｇ）、Ｎ１（Ｄ，Ｔ）を介して結合するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）等の有機塩基を意味する。これらの塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（ｍＲＮＡ−配列）である。用いた修飾；
１．全てのＲ１が
１．１ Ｒ１＝Ｏ
１．２ Ｒ１＝Ｓ
１．３ Ｒ１＝Ｆ
１．４ Ｒ１＝ＣＨ３
１．５ Ｒ１＝ＯＥｔ
で置換されるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、
【００１６】
２．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００１７】
【化１】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝６〜２０塩基の長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲
２．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
２．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
２．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
２．４ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｓ
の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド、
【００１９】
３．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００２０】
【化２】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲
３．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
３．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
３．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド、
【００２２】
４．Ｒ２において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
４．１ コレステロール
４．２ ポリ（Ｌ）リジ
４．３ トランスフェリン
と結合した化合物１．１〜１．５；２．１〜２．４；３．１〜３．３のいずれか、
【００２３】
５．Ｒ３において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
５．１ コレステロール
５．２ ポリ（Ｌ）リジン
５．３ トランスフェリン
と結合した化合物１．１〜１．５；２．１〜２．４；３．１〜３．３のいずれかである。
【００２４】
ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類（図２）の場合は、リボーズにＮ９（Ａ，Ｇ）またはＮ１（Ｕ，Ｃ）を介して結合した塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））である。この塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（ｍＲＮＡ配列）である。オリゴヌクレオチド配列において用いた修飾は以下のとおり：
【００２５】
６．全てのＲ１が
６．１ Ｒ１＝Ｏ
６．２ Ｒ１＝Ｓ
６．３ Ｒ１＝Ｆ
６．４ Ｒ１＝ＣＨ３
６．５ Ｒ１＝ＯＥｔ
で置換されたオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、
【００２６】
７．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００２７】
【化３】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜２０塩基の長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲
７．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
７．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
７．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
７．４ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｓ
の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴ−リボヌクレオチド、
【００２９】
８．Ｒ１が一つのオリゴヌクレオチド；
【００３０】
【化４】
上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、
ｐ＝核酸内リン酸
ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲
８．１ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝Ｏ
８．２ Ｒ１ａ＝ＣＨ３； Ｒ１ｂ＝Ｏ
８．３ Ｒ１ａ＝Ｓ； Ｒ１ｂ＝ＣＨ３
の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴ−リボヌクレオチド、
【００３２】
９．Ｒ２において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
９．１ コレステロール
９．２ ポリ（Ｌ）リジン
９．３ トランスフェリン
と結合した化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３のいずれか、
【００３３】
１０．Ｒ３において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物
１０．１ コレステロール
１０．２ ポリ（Ｌ）リジン
１０．３ トランスフェリンと結合した化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３のいずれか、
【００３４】
１１．全てのＲ４が
１１．１ Ｒ４＝Ｏ
１１．２ Ｒ４＝Ｆ
１１．３ Ｒ４＝ＣＨ３
で置換される化合物６．１〜６．５；７．１〜７．４；８．１〜８．３；９．１〜９．３；１０．〜１０．３のいずれかである。
【００３５】
アンチセンス−オリゴヌクレオチド類の修飾は、有利である。何故なら、これが自然に存在するヌクレオチド配列に有効な程、それらが応用された場合に、内因性の因子によって速く破壊されないからである。しかしながら、開示した配列を有する自然に存在するヌクレオチドもまた本発明に使用しうることが当業者には理解される。特に好ましい具体例において、上記修飾はフォスフォロチオエート修飾である。
【００３６】
本発明のオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成を、以下の詳細な説明中に例として述べる。
オリゴデオキシ−ヌクレオチドは、亜リン酸チオエステル化学を用いる保護ヌクレオチドオの段階的な５’付加により合成した。ヌクレオチドＡは５’−ジメトキシトリチル−デオキシアデノシン（Ｎ４−ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイト（０．１Ｍ）として導入され；Ｃは５’−ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（Ｎ４−ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトとして導入され；Ｇは５’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン（Ｎ８−イソブチリル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトとして導入され、かつＴは５’−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルフォスフォルアミダイトである。これらのヌクレオチドは、好ましくは０．１Ｍの濃度のアセトニトリル溶液として用いられた。
【００３７】
合成は、殆どの３’−ヌクレオチドが長鎖アルキルアミンリンカーを介して共有結合する（平均担持３０μｍｏｌ／ｇ固体支持体）、直径ほぼ１５０μｍに調節された細孔ガラス粒子（細孔直径５０ｎｍ （５００Å））上で行う。
【００３８】
固体支持体は、円筒状の合成カラムに充填し、試薬類は十分流れることができるけれども、固体合成支持体は漏れないフィルターで、両末端をキャップした。
【００３９】
試薬類は、不活性ガスの加圧を利用して合成カラムに供給し、回収した。ヌクレオチド類は、３’→５’方向に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に付加した。おのおのヌクレオチドは以下の合成サイクルを一巡して結合した：
原料ヌクレオチドの５’ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）保護基をジクロロメタン中で３−クロロ酢酸を用いて開裂し、ついで無水アセトニトリルでカラムを洗浄した。そして同時に、配列に応じて、それらの保護誘導体の形態の塩基の一つをアセトニトリル中のテトラゾールに添加した。反応後、反応混合物を回収し、亜リン酸を、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中、硫黄（Ｓ８）混合物で酸化した。酸化反応の後、混合物を回収し、カラムをアセトニトリルで洗浄した。未反応の５’−水酸基は１−メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同時に添加して封鎖した。その後、合成カラムはアセトニトリルで洗浄し、次サイクルを開始した。
【００４０】
得られた合成生成物の処理及び精製操作は以下の通りである。
最後のヌクレオチドの付加後に、デオキシヌクレオチドをアンモニア溶液中でインキュベーションすることにより固体支持体から分離した。エキソキシクリック（ｅｘｏｘｙｃｌｉｃ）塩基の保護基は更にアンモニア中でインキュベーションすることにより除去した。そしてアンモニアを減圧留去した。依然として５’ＤＭＴ保護基を有する全長合成生成物は、シリカＣ１８固定相上で逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて短い破損不純物から分離した。生成物のピーク溶離液を採取し、減圧下で乾燥し、５’ＤＭＴ保護基を酢酸中でインキュベーションして開裂した。酢酸はその後減圧留去した。合成生成物は、脱イオン水に溶解し、ジエチルエーテルで３回抽出した。そして、生成物は減圧下で乾燥した。再度ＨＰＬＣ−ＡＸクロマトグラフィーを実施し、生成物のピークの溶離液は、脱イオン水に対する二度目の透析と同様に過剰のトリス緩衝液に対して透析した。最終生成物は凍結乾燥し、乾燥貯蔵した。
【００４１】
本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類は医薬組成物、すなわち医薬として用いることができる。この医薬は、トランスフォーミング成長因子−βの抑制、及びそれによる免疫抑制の減少および／または病気に起因するアンギオゲネシス（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制により、ＴＧＦ−βの発現が発病に関係する腫瘍の治療に用いることができる。アンチセンス−ＴＧＦ−β−オリゴヌクレオチド類の有効投与量の投与により引き起こされた免疫抑制の減少は、医薬の投与前の状態に比較して細胞障害性のリンパ球の大幅な増殖を伴って起こることがある。その結果、これらのリンパ球は、腫瘍細胞の数を減じるその細胞障害性活動を開始する。
【００４２】
本発明の医薬は、ＴＧＦ−βの内生の発現過剰の治療、残余腫瘍（ｒｅｓｔ ｔｕｍｏｒｓ）の治療、神経性維腫の治療、膠芽腫を含む悪性神経膠腫の治療、及び、食道癌及び胃癌の治療と同様に皮膚癌の治療と予防に有用である。
【００４３】
オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞を用いた剌激の際のヒトＴ−細胞の増殖と細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果を研究した。ＴＧＦ−β２−誘導フォスフォロチオエート誘導体Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、神経膠腫細胞内のＴＧＦ−βの蛋白発現を特異的に抑制するであろう。加えて、ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、Ｔ−細胞の増殖および細胞障害性に対するＴＧＦ−βの免疫抑制効果を、相当量、逆転（ｒｅｖｅｒｓ）する。
【００４４】
ヒト脳腫瘍患者におけるＴ−細胞の応答は、明らかに減り、腫瘍侵入リンパ球は、個々の患者の腫瘍の進行に単に付帯的な影響を有するにすぎないことが明らかにされてきた〔パルマＬ．、ジ ロレンゾＮ．、ガイデットＢ．、初期の膠芽腫および慢性神経膠腫へのリンパ球侵入物、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、４９：８５４〜８６１、１９７８、及びリドレイＡ．、カバナフＪ．Ｂ．、神経膠腫へのリンパ球の浸入、可能な宿主耐性の証拠、Ｂｒａｉｎ、４：１１７〜１２４、１９７１）。脳腫瘍から単離した腫瘍侵入リンパ球は機能上役に立たず、これらの免疫抑制効果は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ＴＧＦ−β２が原因であった〔ボードマーＳ．、ストロマーＫ．、フレイＫ．、シープルＣｈ．、デ トリボレットＮ．、ヘイドＩ．、フォンタナＡ．、膠芽腫における免疫抑制およびトランスフォーミング成長因子−β２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：３２２２〜３２２９、１９８９；コールウェルＷ．Ｔ．、ドレダフィＰ．、アプッゾＭ．Ｌ．Ｊ、アンテルＪ．Ｐ．、免疫機能の悪性神経膠腫調整：異なる溶解因子の相関的な寄与、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：８９〜９６、１９９１；カップナー Ｍ．Ｃ．、ハモウＭ．Ｆ．、サワムラＹ．、ボードナーＳ．、デ トリボレットＮ．、膠芽腫誘導トランスフォーミング成長因子β２によるリンパ球機能の抑制Ｎｅｕｒｏｓｕｎｇ．、７１：２１１〜２１７、１９８９；マクスウェスＭ．、ガラノポーラスＴ．、ネビル−ゴールデンＪ．、アントニアデスＨ．Ｎ．、免疫抑制及び免疫監視の損失に対する初期のヒト膠芽腫におけるトランスフォーミング成長因子β２の発現効果、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｎｇ．、７６：７９９〜８０４、１９９２；パーラディノＭ．Ａ．、モーリスＲ．Ｅ．、フレッシャー ターネスＨ．、レビンソンＡ．Ｄ．、トランスフォーミング成長因子β、新種の免疫調節分子、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５９：１８１〜１８７、１９９０；ローズマンＴ．、エリオット Ｌ．、ブルックスＷ．、神経膠腫によるＴ−細胞機能の調整、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１２：３７０〜３７４、１９９１〕。
【００４５】
図３は、血清を含まない神経膠腫培養細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のＩＧＦ−βウェスタン・ブロット解析を示す。レーン２（ＨＴＺ−１５３）、３（ＨＴＺ−２０９）および４（ＨＴＺ−２４３）は、ＴＧＦ−β２特異抗体で、それぞれの細胞溶解物のブロット部分を示す。レーン１は、５０ｎｇ純粋ＴＧＦ−β２を用いたＴＧＦ−βポジティブコントロールを表す。ＴＧＦ−β２−アンチセンス処理細胞は、レーンＡに示す。未処理のコントロール細胞は、レーンＢに示す。細胞はアンチセンス−オリゴヌクレオチドで４８時間（最終濃度１μＭ）処理した。
【００４６】
図４は、神経膠腫細胞中のＩＧＦ−β１−ｍＲＮＡ発現を示す。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）由来の、細胞質ＲＮＡ２０μＭを含有した。ＲＮＡの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブロット点はメチレンブルーで着色した（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）。
【００４７】
図５は、神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β２オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）由来の、細胞質ＲＮＡ２０μＭを含有した。ＲＮＡの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブロット点はメチレンブルーで着色した（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）。
【００４８】
図６は、ＴＧＦ−β２−Ｓ−ＯＤＮ処理後の神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す。未処理の神経膠腫細胞Ａ（ＨＴＺ−１５３）、Ｂ（ＨＴＺ−２０９）およびＣ（ＨＴＺ−２４３）、または、血清含有培養条件下、１μＭ（最終濃度）のＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで４８時間処理した神経膠腫細胞Ａ’、Ｂ’およびＣ’の細胞質ＲＮＡを分離し、ノーザン・ブロット解析を行ったものである。それぞれのレーンは、３２ＰでラベルしたＴＧＦ−β２オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、２０μＭの細胞質ＲＮＡを含有した。
【００４９】
図７は、オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞へのＰＢＭＣ’ｓの細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびＴＧＦ−β中和抗体の効果（ターゲット／エフェクター １：１０）を示す。ＩＬ−１α及び１１−２を用いたＰＢＭＣ’ｓの培養６日後、細胞を集め、洗浄し、照射し（３０Ｇｙ）、そして、ターゲット／エフェクター比１：１０、１：５、１：１で、オートロガス神経膠腫細胞に添加したものである。神経膠腫ターゲットは、ＴＧＦ−β−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓまたはＴＧＦ−β抗体で前処理した。細胞障害性は、修飾微小細胞毒性分析を用いて算定した。データは、３重反復検体を意味し、誤差棒はＳＥを表す。データの点数は、腫瘍ターゲットを培地のみで処理した個々のコントロールを反映する。細胞障害性の参照としてのＳ−ＯＤＮ’ｓ（１μＭ、５μＭ）またはＴＧＦ−β抗体（１００μｇ／ｍｌ）。それによって、抗体またはＳ−ＯＤＮ’ｓ単独のターゲット細胞への影響を除外することができた。
【００５０】
図８は、リンパ球、神経膠腫細胞およびオートロガス神経膠腫細胞と共に培養したリンパ球（ＭＬＴＣ）の増殖に対するＴＧＦ−β２−特異的およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓの投与依存効果を示す。Ａ：ＨＴＺ−１５３、Ｂ：ＨＴＺ−２０９、Ｃ：ＨＴＺ−２４３。ＰＢＭＣ’ｘは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−２で６日間前もって活性化し、さらにオートロガス照射（６０Ｇｙ）と、ＴＧＦ−β２−（Ｎｏ．６）及びナンセンスＳ−ＯＤＳＮ（Ｎｏ．５）処理神経膠腫細胞（ＭＬＴＣ）
を用いて更に６日間インキュベートした。同時に、神経膠腫細胞（腫瘍）および前もって活性化したＰＢＭＣ’ｓ（リンパ液）の一部は、ＴＧＦ−β２−特異的（Ｌｙ：Ｎｏ．２、Ｔｕ：Ｎｏ．４）およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓ（Ｌｙ：Ｎｏ．１、Ｔｕ：Ｎｏ．３）で３時間、インキュベートして、推定上のＳ−ＯＤＮ’ｓのエフェクター細胞またはターゲット細胞への単独の影響を評価した。リンパ球と神経膠腫細胞の増殖は３Ｈ Ｔｄｒ取り込み検査を用いて評価した。データは３重反復検体法で示し、誤差棒はＳＥを表す。本発明は以下の制限されることのない例により更に説明される。
【００５１】
【実施例】
（実施例１）腫瘍細胞（オートロガス・ターゲット細胞）の特定
３人の高度の悪性神経膠腫〔ＨＴＺ−１５３及びＨＴＺ−２０９、膠芽腫、ＨＴＺ−２４３、悪性アストロシトマ（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、Ｇｒ．ＩＩＩ−ＷＨＯ〕患者の腫瘍細胞およびそれぞれのオートロガスリンパ球について調査した。標準腫瘍細胞種は、牛胎児血清２０％（ＦＣＳ、Ｓｅｒｏｍｅｄ、ベルリン、ドイツ）、Ｌ−グルタミン１μＭ、ＭＥＭビタミン溶液及び非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランド、英国）（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリーオスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの最小栄養培地中で決定した。他のターゲット細胞はＫ５６２（ＮＫ−感受性エリスロマイロイド（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ）白血病細胞ライン、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）を含んだ。腫瘍細胞種は、ＧＦＡＰ、サイトケラチン、ニュウロフィラメント、デスミン、ビメンチン、ＮＳＥ、ＨＬＡ、ＤｒＯ、Ｗ６／３２（クラスＩ抗原）、β２−マイクロブロブリン、フィブロネクチン、ラミニンン、Ｋｉ ６７（ダコパッツ、グラストラッブ、デンマーク）及びアンチ−ＴＧＦ−β（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ．、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）に対するモノまたはポリクロノール抗体を用い、ラブテック組織培養スライド（マイルス・ラボラトリ−Ｉｎｃ．、ナッパービル、ＩＬ、ＵＳＡ）において、ＰＡＰ−法（ボーネＪ．Ａ．、ハンドブック・オブ・イミュノパーオキシダーゼ・ステイニング・メソッド、ＤＡＫＯ社、カルピンテリアＣＡ、ＵＳＡ、１９８３）を用いる免疫細胞化学により特定した。ＴＧＦ−β特異的免疫細胞化学は、最終濃度１μＭのＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよび最終濃度１μＭのナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓ処理コントロールを用いて神経膠腫培養スライドを４８時間インキュベーシションした後に行った。
【００５２】
（実施例２）リンパ球（エフェクター細胞）の特定
全神経膠腫患者からの抹消血液単核は、手術日にフィコル−ハイパク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（ファルマシア、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）傾斜遠心分離を用いてヘパリン添加した静脈血から採取し、標準状態で液体窒素中に凍結保存した（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリ−オスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６）。リンパ球はＲＰＭＩ １６４０（フロウ・ラボラトリーＩｎｃ．、スコットランド、英国）中で、１０％ヒト鬱血ＡＢ−血清（フロウ・ラボラトリーＩｎｃ．、マクリーン、ＶＡ、ＵＳＡ）及びＬ−グルタミン２ｍＭと共に培養した。天然のおよび活性化した（下記参照）抹消血液単核は、以下の抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＨＬＡ ＤＲ（ベクトン・ディキンソン、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａ ＵＳＡ）に対するモノクローナル抗体と、アルカリフォスファターゼおよびモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼ複合体を用いる、免疫細胞化学により特定した（ＡＰＡＡＰ−法、Ｄａｋｏｒａｔｔｓ ＧｍｂＨ、ハンブルグ、ドイツ）（コーデルＪ．Ｌ．、ファリニＢ．、イーバーＷ．Ｎ．等、アルカリフォスファターゼとモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼの免疫複合体（ＡＰＡＡＰ−錯体）を用いるモノクローナル抗体の免疫酵素標識、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３２：２１９〜２２９、１９８４）。
【００５３】
（実施例３）ＬＡＫ−細胞生成
神経膠腫患者からの抹消血液単核細胞の増殖及び細胞障害性の応答が抑制されるので、細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、底の浅い組織培養プレート（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、インターロイキン−１α（Ｒ＆ＤシステムズＩｎｃ．ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）およびインターロイキン−２（１００Ｕ／ｍｌ）（ＢＩＯＴＥＳＴ、ＡＧ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍ．ドイツ）を用いて生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で６日間、前もって活性化した。
【００５４】
（実施例４）増殖検定
混合リンパ球−腫瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）１５×１０３に、致死照射（６０Ｇｙ、６４Ｃｏ−源）した腫瘍細胞を活性化剤として供給し、９６ウェルの平底組織培養プレート（ＮＵＮＣ、コペンハーゲン、デンマーク）の中で、６日間２５×１０３の前もって活性化した単核細胞（ＬＡＫ−細胞、上記参照）と共に培養した。ＭＬＴＣ−実験において、前培養の間、同様の培地条件を用いた。アンチセンス実験において、ＴＧＦ−β２−特異性フォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ）及びナンセンスオリゴデオキシヌクレオチド類（前記参照）をＭＬＴＣ検定の１２時間前に培地に添加した。抗−ＴＧＦ−β中和抗体（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）をＭＬＴＣの２時間前に培地に添加した。
【００５５】
（実施例５）細胞毒性検定
細胞毒性実験は修飾微小細胞毒性検定（ボクダンＵ．、フレイシェルＢ．、ラプニアクＨ．Ｔ．Ｒ．、アリーオスマンＦ．、ヒト神経膠腫におけるＴ−細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、７０：５０１〜５０７、１９８６） により行った。簡潔には、１．５×１０３ターゲット細胞を、９６ウェル平底組織培養プレートに接種した。プレーティングから１２時間後、ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびナンセンスオリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンスコントロール）を培地に添加した。抗−ＴＧＦ−β中和抗体及び正常兎血清（抗体コントロール、Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）をプレーティングから２２時間後に培地に添加した。種々の比（ターゲット／エフェクターの比１：１、１：５、１：１０）の前もって活性化したエフェクター細胞（ＬＡＫ−細胞）を照射（３０Ｇｙ）し、プレーティングから２４時間後にそれぞれのターゲットに添加し、３日間、標準培養条件下（１０％の鬱血ＡＢ−Ｒ血清及び２ＰμＭＭのＬ−グルタミンを含有る１６４０培地）にした。細胞毒性実験の間、細胞毒素は培地に添加しなかった。統計上のデータの評価値はこの時点で最適であることが判明したため、３日間のインキュベーション期間を選択した。ターゲット細胞の死滅はトリパン・ブルー染料（データは示さず）の混入により示された。ＬＡＫ−細胞処理したターゲット中のターゲット細胞の増殖は、標準３Ｈ−チミジン取り込み検定（６−３Ｈ−チミジン、１μＣｉ／ウェル、比活性２７ｃｌ／ｍｍｏｌ）により評価した。取り込まれた３Ｈ−チミジンを計量する液体シンチレーションは１８時間の細胞培養の後に行った。比細胞毒性は：
〔ｃｐｍ（コントロール）−ｃｐｍ（プローブ）／ｃｐｍ（コントロール）〕×１００％
より算出した。
【００５６】
（実施例６）ノーザンおよびウェスタンブロット解析
細胞質ＲＮＡは、１μＭ（最終濃度）のＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで、４８時間処理した神経膠腫細胞及び０．５％ＮＰ−４０含有緩衝液中の未処理コントロールを溶解することにより調製した（サンブルックＪ．、フリシュＥ．Ｆ．、マニアティスＴ．、モレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）。ノーザンハイブリダイゼーシヨン用に、２０μｇの変性ＲＮＡアリコートを、１％のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動により分離した。固定化したＲＮＡの質および量は、移動の後、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｂｕｃｈｌｅｒ、Ｂａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）のメチレン−ブル−染色により確認した。ブロットは一昼夜、特異的ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２合成オリゴヌクレオチド プローブ（４０−マー、オンコゲン・サイエンス、シアトル、ＵＳＡ）ハイブリダイズし、５’をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア、フライブルグ、ドイツ）を用いて（γ−３２Ｐ）−ＡＴＰでラベルし、Ｘ−線フィルムに暴露した。
【００５７】
ウェスタンブロット用に、ＴＧＦ−β−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓでそれぞれ処理した未処理の神経膠腫細胞を１０％Ｆむ培地で生育させ、洗浄し、更に、２４時間前記無血清培地で培養した。細胞は、ＮＰ−４０Ｗを含有する溶解バッファーを用いて溶解した。３０μｇの全細胞蛋白質は１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルの各レーンに充填した。分別した蛋白質は、次いでニトロセルロース メンブランに２０分間、０．８ｍＡ／／ｃｍ２で上記のように電気ブロットした（トウビンＨ．、スターヘリンＴ．、ゴードンＪ．、蛋白質のＰＡＧＥからニトロセルロース膜への電気泳動転写、操作及び幾つかの応用、Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６：４３５０〜４３５４、１９７９。フィルターは、ＴＧＦ−β２のポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤシステムスＩｎｃ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）でブローブした。５０μｇのＴＧＦ−βをコントロールとして用いた。
【００５８】
（実施例７）フォスフォロチオエートで修飾したアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ）
ＴＧＦ−β２−特異的アンチセンス オリゴデオキシヌクレオチド類（ＴＧＦ−β２ｍＲＮＡプライマー シークエンス オリゴヌクレオチド シークエンス：ＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＧＴのアンチセンス方向）および特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓと同様のＧＣ−含量で無作為化したナンセンス シークエンス（ナンセンス オリゴヌクレオチド シークエンス：ＧＴＣＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣ）は、アプライド バイオシステムズ モデル３８０ Ｂ ＤＮＡシンセサイザー〔シュリンゲンシューペンＫ．Ｈ．、ブリッシュＷ．、フォスフォロチオエート オリゴマーズ．腫瘍細胞中のオンコジーン発現の抑制剤および遺伝子機能解析手段：エリクソンＲ．、アイザントＪ．（Ｅｄｓ．）アンチセンス核酸による遺伝子調節、ラヴァン・プレス・ニュー・ヨーク１９９２〕で合成した。Ｓ−ＯＤＮ’ｓは３３％アンモニアを用いて固体支持体より除去した。依然として５’トリエチル保護基を有するオリゴヌクレオチド類は、アクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）ＲＰ−３００、Ｃ８−カラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）で逆相ＨＰＬＣにより精製した。溶剤：Ａ−０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ７、Ｂ−アセトニトリル。勾配３〜３５％ Ｂ ３０分以上直線的な。全長生成物に相当する、オリゴヌクレオチド類のトリチルを有するフラクションは、８０％酢酸／ＥＴＯＨ中、２０分間脱トリチル化し、ジエチルエーテルで２回抽出し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５（ファルマシア）カラムで脱塩し、エタノールで沈殿させ（２×）、最後に０．Ｍトリス／ＨＣＬ ｐＨ７．６で希釈した。Ｓ−ＯＤＮ’ｓは、ポリアクリルアミド−ゲル−電気泳動により全長物質の８５％以上であると判定された。
【００５９】
（実施例８）腫瘍細胞のキャラクタリゼーション
全神経膠腫細胞培養物は、β−ミクログロブリン、フィブロネクチン及びＫＩ−６７と同様に、ＧＦＡＰ、ＴＧＦ−β、ビメンチン及びＨＬＡ−クラスＩ抗原を発現し、デスミン、ＨＬＡ−クラスＩＩ抗原（ポジティブ：ＨＴＺ−２０９）およびＮＳＥ（ポジティブ：ＨＴＺ−２０９、ＨＴＺ−２４３）については矛盾の多い（ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）な発現がみられた。これら腫瘍細胞のグリアル（ｇｌｉａｌ）起源を示す、サイトケラチン、ラミニン及び神経繊維については発現は見られなかった。
【００６０】
腫瘍細胞溶解物のウェスタンブロット解析はＨＴＺ−１５３、ＨＴＺ−２０９及びＨＴＺ−２４３細胞がＴＧＦ−β２蛋白質を生成したことを示した（図３）。
全ての３つの腫瘍由来の細胞障害性ＲＮＡ’ｓのノーザンブロット解析は、ＴＧＦ−β１（２．３ｋＢ）およびＴＧＦ−β２（４．１ｋＢ）（図５及び５）についてのメッセージを示した。ＴＧＦ−β２についてのメッセージは、全ての３つの腫瘍においてかなりよく表され（図４）、しかし、腫瘍ＨＴＺ−２０９は残りの腫瘍と比較してかすかなＴＧＦ−β２シグナルを示した（図５）。
【００６１】
（実施例９）ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓでの神経膠腫細胞の処理によるＴＧＦ−β発現の調節
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ処理のＴＧＦ−β２ｍＲＮＡ−および神経膠腫細胞内の蛋白質発現に対する効果はノーザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティングおよび免疫細胞化学により解析した。ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ（４８時間で最終濃度１μＭ）で処理した神経膠腫細胞のノーザン・ブロット解析は矛盾した結果を示した。即ち、ＨＴＺ−１５３はＴＧＦ−β２におけるメッセージの増加を示したが、腫瘍ＨＴＺ−２０９及びＨＴＺ−２４３は、アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類処理の結果起こる検出可能なメッセージを示さなかった（図６）。ウェスタンブロット解析は、Ｓ−ＯＤＮ処理後の全ての３つの腫瘍についてＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓシグナルの減少を示した（図３）。
【００６２】
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓ（４８時間で最終濃度１μＭ）で処理した神経膠腫培養物の免疫着色は、ナンセンスＳ−ＯＤＮ処理及び未処理コントロールに比較して、ＴＧＦ−β依存性の免疫反応性の減少を全て３つの腫瘍について示した。正常マウス血清及びヒトＡＢ−血清を用いたコントロールはネガティブであった（スライドは示していない）。
【００６３】
（実施例１０）リンパ球のキャラクタリゼーション
以下の腫瘍依存性のリンパ球増殖及び神経膠腫細胞障害性の実験に用いたオウトロガス エフェクターリンパ球は通常のリンパ球識別抗原によりキャラクタライズした。キャラクタリゼーション実験のデータは表１に示し、細胞数は、天然の（０日）及び活性化した（６日）エフェクター細胞増殖及び細胞毒性実験に使用したリンパ球サブセットの表現型を反映する。ＣＤ３＋細胞のパーセンテージは培養時間の間に８５％に増加した。ＣＤ４＋も同様である（８０％まで）。ＣＤ８＋（１８％まで）細胞、ＣＤ２５＋（６０％まで）細胞、ＣＤ１６＋細胞のフラクションは、培養の最初の６日の間に最高５０％（ＨＴＺ−２４３）まで増加した。
【００６４】
（実施例１１）細胞毒性実験
腫瘍患者の生来のＰＢＭＣ’ｓを、オートロガス ターゲットに低い細胞障害性活性を示すわれわれの研究において調査した（ターゲット／エフェクター比１：１０で２０％以下）。予備実験はオートロガス エフェクターＰＢＭＣ’ｓの前活性化が、細胞を１０Ｕ／ＭＬ ＩＬ−１α及び１００Ｕ／ＭＬ ＩＬ−２で、６日間インキュベートした場合、最も効果的であることを示した。これらのＬＡＫ細胞は、全て更に細胞毒性／増殖実験に使用した。
ターゲット／エフェクター比が１／１０のとき、ＬＡＫ細胞はオートロガスターゲット システムにおいて２５％までの細胞障害性活性を達成した（図７）。中性化したＴＧＦ−β抗体（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）との腫瘍細胞の前培養は、３０〜５０％（未処理コントロールより５〜３０％増加）の細胞障害性という結果を示した。腫瘍細胞をＴＧＦ−β２特異的アンチセンスＳ−ＯＤＮ’ｓと前培養した場合、細胞障害性は投与のしかたに依存して最高７９％（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ５μＭ、未処理コントロールより２５〜６０％増加）及び６７％（Ｓ−ＯＤＮ’ｓ１μＭ、未処理オートロガス リンパ球より１５〜４５％増加）増加する。全ての３つのエフェクター細胞数は、Ｋ５６２細胞系に対する細胞毒性検定によって検出されたように、６０％〜７０％の範囲の、高いＮＫ−活性を示した。
【００６５】
（実施例１２）増殖実験
ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓで処理したオウトロガス腫瘍細胞（ＭＬＴＣ）で刺激した際のリンパ球増殖は、腫瘍ＨＴＺ−１５３（図８ａ）および腫瘍ＨＴＺ−２０９（図８ｂ）では増加したが、しかし、ＨＴＺ−２４３（図８ｃ）細胞に影響は見られなかった。最終濃度（ｆ．ｃ．）１μＭでのナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓはリンパ球増殖を変化させなかった（図８）。ＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓの効果が、０．１μＭから１μＭまで投与のしかたに依存して観察され、より高い濃度（５μＭ）は、ＰＢＭＣ’ｓおよび腫瘍細胞に対して非特異的障害性を示した（図８）：Ｓ−ＯＤＮで処理したＭＬＴＣ’ｓ及び腫瘍細胞中のＰＢＭＣ’ｓの増殖（図８）：Ｓ−ＯＤＮで処理したＭＬＴＣ’ｓ中のＰＢＭＣ’ｓの増殖は、オリゴヌクレオチド濃度１μＭ以上について永続的に低かった。高濃度の中性化したＴＧＦ−β抗体（１００μｇ／ｍｌ）はリンパ球増殖を高めなかった。ＴＧＦ−β２−特異的アンチセンスＳ−ＯＤＮ’ｓは、培養したリンパ球数（境界効果）またはＳ−ＯＤＮ’ｓ濃度５μＭ（最終濃度）での最高７５％を達成するオートロガスターゲット細胞（図８）に対しても抑制効果がなかった。大きくはない抑制効果が無作為化したコントロールナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓに観察された（平均２０％、最終濃度５μＭで４０％まで）。
【００６６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を示す図面である。
【図２】ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類の化学構造を示す図面である。
【図３】血清を含まない神経膠腫培養細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のＩＧＦ−βウェスタン・ブロット解析を示す写真である。
【図４】神経膠腫細胞中のＩＧＦ−β１−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図５】神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図６】ＴＧＦ−β２−Ｓ−ＯＤＮ処理後の神経膠腫細胞中のＴＧＦ−β２−ｍＲＮＡ発現を示す写真である。
【図７】オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）培養した神経膠腫細胞へのＰＢＭＣ’ｓの細胞障害性に対するＴＧＦ−β２−特異的Ｓ−ＯＤＮ’ｓおよびＴＧＦ−β中和抗体の効果（ターゲット／エフェクター １：１０）を示すグラフである。
【図８】リンパ球、神経膠腫細胞およびオートロガス神経膠腫細胞と共に培養したリンパ球（ＭＬＴＣ）の増殖に対するＴＧＦ−β２−特異的およびナンセンスＳ−ＯＤＮ’ｓの投与依存効果を示すグラフである。
図８ａ：腫瘍ＨＴＺ−１５３細胞の場合
図８ｂ：腫瘍ＨＴＺ−２０９細胞の場合
図８ｃ：腫瘍ＨＴＺ−２４３細胞の場合
Claims (11)
- 配列表中SEQ ID NO.57、70、71、72、76、79、83、85、104、105、113、119及び133に規定された核酸配列からなる、但し各々の核酸はDNA−またはRNA−型構造を有する、トランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。
- 前記核酸がトランスフォーミング成長因子−β2をコードする遺伝子領域とハイブリダイズする請求項１に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。
- 前記核酸がTGF−βをコードする遺伝子部分の複数の領域及び／またはTGF−βをコードするおよびコードしない遺伝子部分の複数の領域とハイブリダイズする請求項１または２に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。
- アンチセンス−オリゴヌクレオチドがフォスフォロチオエート オリゴデオキシヌクレオチドである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。
- ヌクレオチド鎖を3'−5'方向に成長させることによる亜リン酸トリエステル化学を用いる固相合成法、但し、前記合成法中、各ヌクレオチドが固相に共有結合している第１のヌクレオチドと結合し、前記合成法は
−原料ヌクレオチドの5'DMT保護基を切断し、
−鎖増殖用原料ヌクレオチドを添加し、
−亜リン酸基を修飾し、次いで未反応5'−水酸基を封鎖し、かつ
−固相支持体から切断し、
−次いで合成生成物を得る
の工程を含む、により得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。 - SEQ ID NO. 57、70、71、72、76、79、83、85、104、105、113、119及び133のオリゴヌクレオチド類がTGF−β2のアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類である請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−核酸を含有する組成物。
- TGF−βの発現が病原性及び／または病気に起因するアンギオゲネシス（angiogenesis）の抑制に関連する腫瘍の治療用の請求項７に記載の組成物。
- TGF−βの免疫抑制効果の治療用、細胞障害性のリンパ球の増殖の増大、TGF−βの内因性発現過多の治療用、神経線維腫の治療用、膠芽腫を含む悪性神経膠腫の治療用の請求項７に記載の組成物。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−TGF−β−オリゴヌクレオチド類を含有する、TGF−βを抑制し、かつ、それによる免疫抑制および／または病気に起因するアンギオゲネスの抑制の減少により、TGF−βの発現が病原性に関係する腫瘍を治療するための組成物。
- 免疫抑制の減少が、アンチセンス−TGF−β−オリゴヌクレオチド類の投与前の状態に比較して細胞障害性のリンパ球の増殖の増大を伴い、その結果、始まった細胞障害性の活動が腫瘍細胞の数を減らす請求項１０に記載の組成物。
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